專利名稱：一種磁性dna熒光探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)，具體為一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的磁 性DNA熒光探針及其制備方法。該DNA探針可用于液體環(huán)境中檢測某些具 有特征DNA序列的小分子生命物質(zhì)。
背景技術(shù)：
近些年分子生物學迅猛發(fā)展，新技術(shù)不斷出現(xiàn)，應用也日益廣泛，特別 是快速、簡便、準確地檢測基因序列在醫(yī)學臨床檢驗學、免疫學、生物學等 研究領(lǐng)域中的潛在應用前景已引起國際科學界的廣泛關(guān)注。對于具有特定 DNA序列的生命物質(zhì)的檢測，傳統(tǒng)的方法主要是采用放射性標記和聚合酶鏈 式反應(PCR)的方法。由于其技術(shù)復雜，設備昂貴，使DNA檢測技術(shù)的廣 泛應用受到極大的限制。除了PCR技術(shù)在不斷改進外， 一些新的檢測方法和 技術(shù)也不斷地被開發(fā)，例如生物傳感技術(shù)等。目前DNA生物傳感器是依據(jù) DNA雜交原理，利用每種生物所具有的保守DNA鏈段的特點，通過人工設 計并合成一段與其互補的DNA探針進行檢測。根據(jù)其檢測方法不同，DNA 生物傳感器可分為光學DNA生物傳感器，壓電晶體DNA生物傳感器和電化 學DNA生物傳感器等類型。其中光學DNA生物傳感器具有非破壞性的操作 優(yōu)勢、較高的信號產(chǎn)生與讀取速度，使其應用領(lǐng)域得到了極大地擴展，成為 應用最為普遍的生物傳感器，具有廣闊的應用和發(fā)展前景。
光學DNA (生物)傳感器主要有熒光光纖DNA傳感器、熒光探針DNA 傳感器、表面增強拉曼DNA傳感器和表面等離子共振DNA傳感器等。
基于熒光標記的檢測體系近年來在DNA芯片的應用已經(jīng)獲得認可。許多 檢測方法都可以采用熒光進行，而這些檢測方法主要依賴于DNA有機熒光 分子標記的供一受體對之間的能量轉(zhuǎn)移。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析法由于其采用的儀器簡單、靈敏度高，所 需樣品量少，分析速度快等優(yōu)點，與色譜分離手段相結(jié)合，己成為一種有效的痕量及超痕量分析技術(shù)。由于FRET對距離具有敏感性，能量轉(zhuǎn)移熒光分 析非常適合于對環(huán)境、生物醫(yī)學科學和臨床化學等方面復雜、低含量組分的 分析，而且可以對無標記的目標DNA序列進行檢測。因此，基于這種原理的 分析方法己被廣泛地用于生物大分子結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、反應機理以及定量分析等 方面的研究，是基因工程中的一種新手段。
對于一個成功的基于FRET的生物傳感(或稱做檢測)體系，首要的關(guān) 鍵影響因素就是能量供體和受體(材料)的選擇。
在能量供體方面，目前大多采用有機染料作為能量的供體(甚至做能量 受體)。因為有機熒光分子對生物有很好的相容性，例如帕克，布勞德和尤 瑟卡斯等研究者先后對有機染料為能量供-受體對進行了研究，其研究結(jié)果分 別發(fā)表在《臨床微生物學》(Park etal.Clin.Microbio.， 2000, 2829-2836)，《生 物技術(shù)動向》(Brudeetal. Trends in Biotechnol.， 2002, 20, 249-256)，《分析化 學》(Ysourkas et al. Anal. Chem., 2003， 75, 3697-3703)等權(quán)威刊物上。但采用 這種供一受體對仍存在以下不足l.它們的激發(fā)光譜都較窄，很難同時激發(fā) 多種組分；2.有機染料的有機熒光分子光譜較寬，分布不對稱，給區(qū)分不同 探針分子的有機熒光分子來源帶來困難，無法同時檢測多種組分；3.需要特 定的波長激發(fā)才能發(fā)出熒光，若同時檢測多種疾病，就需要用不同波長的光 激發(fā)。這樣就會造成檢測體系中的能量過多，不利于檢測；同時不同波長激 發(fā)之間的重疊也會使各個能量供體和受體之間的能量轉(zhuǎn)移變得不明顯，增加 數(shù)據(jù)分析的復雜性；4.有機染料最嚴重的缺陷是光化學穩(wěn)定性差，光漂白與 光解作用會使每個染料探針能夠發(fā)出的熒光光子平均數(shù)量較少，光解產(chǎn)物又 往往會對生物體產(chǎn)生殺傷作用。
無機納米粒子由于其獨特的物理化學性能，已經(jīng)成為在生物分子的檢測 和標記方面的研究熱點。量子點發(fā)射光譜呈對稱分布且寬度窄，顏色可調(diào)(不 同大小的納米晶體能被單一波長的光激發(fā)而發(fā)出不同顏色的光)，并具有較高 的量子效率(quantum yields;又稱量子產(chǎn)率)和良好的化學、光學穩(wěn)定性， 其熒光壽命是普通有機染料分子的100倍以上，作為能量供體已廣泛應用于 熒光共振能量轉(zhuǎn)移研究中。目前，國內(nèi)外已有關(guān)于使用量子點作為熒光檢測和熒光標記以及微生物傳感器研究方面的報道，例如瓦格尼爾等研究者分別
對其進行了研究，表征，其研究結(jié)果發(fā)表在《納米通訊》雜志上(Wargnieret al，NanoLett., 2004, 78,451-457)。但是，采用有機熒光分子作為探針的能量 供-受體對也會使探針存在上述的諸多缺點。金等研究者發(fā)現(xiàn)使用單層巰基乙 酸包覆的核殼型CdSe/ZnS半導體發(fā)光納米粒子(即核-殼型量子點)為能量 供體，使用有機物DABCYL作為能量受體(即淬滅劑)時，其體系的發(fā)射光 譜和吸收光譜有近90%的重疊，并成功地構(gòu)建了共振能量體系，.這個結(jié)果發(fā) 表在《傳感器與傳動器》雜志上(Kim et al, Sensors and Actuators B， 2004, 102， 315-319)。和有機染料相比，使用CdSe/ZnS為能量供體使其熒光壽命有了較 大提高。不足之處在于，采用DABCYL作為淬滅劑，所得到的有效信號較低， 和背景信號(噪聲信號)相比，其能量轉(zhuǎn)移效率有待進一步提高；同時 DABCYL作為一種有機熒光染料仍然不可避免的存在上述的缺點。
在能量受體選擇方面也有較大進展。有研究者發(fā)現(xiàn)納米級別的金具有高 的消光系數(shù)、寬的吸收光譜，對有機、無機熒光能量供體具有較高的淬滅效 果，在分子生物學、基因工程學、生物診斷等領(lǐng)域得到了廣泛的應用。凱迪 等研究者在《分子和細胞探測器》上發(fā)表了其研究成果(Cadyetal，Mol.Cell. Probe.，2007, 21, 116-124)，分別采用Iowa Black、 Au、 DABCYL為能量受體 (淬滅劑)，以單層巰基乙酸包覆的核殼型CdSe/ZnS半導體納米粒子為發(fā)光 粒子，對能量供體和受體的連接以及淬滅機制進行了優(yōu)化和討論。在對比實 驗中發(fā)現(xiàn)，不同的能量供 一 受體體系與目標DNA雜交后，熒光強度是不同的， 順序為量子點-IowaBladO量子點-Au 〉量子點-DABCYL，這表明量子點-Au 體系中量子點的發(fā)光效率有待于進一步改善。
近年有研究表明，量子點-Au傳感體系還存在如下不足采用CdTe、 CdS、 ZnS或者CdTe/ZnS、 CdTe/CdS等核殼型量子點為能量供體，在進行實際生物 檢測時，往往得不到足夠的熒光強度，嚴重地限制了傳感體系的靈敏度。其 他相關(guān)的研究也存在相似問題，而且由于能量供-受體本身問題以及供-受體對 設計存在缺陷，造成其量子效率普遍較低，傳感體系靈敏度不高。所以，上 述能量供一受體體系及探針還有待于改進。由于金是貴重金屬，在實用化過程中，以金為能量受體存在成本較高的問題。所以研發(fā)使用一種高效、價廉 的化合物作為能量受體(淬滅劑)是很有必要的。
對于一個成功的基于FRET的生物傳感(或稱做檢測)體系，另外的一 個影響因素就是，在傳感體系制備過程中最終獲得的DNA探針的純度問題。 DNA探針的純度越高，F(xiàn)RET的生物傳感體系的靈敏度就會越高，特異性就 越好。采用離心的方法雖可以部分地實現(xiàn)提純的目的，但是效率很低，耗時 費力，要獲得較好的分離效果，最短的分離時間也要1小時左右。另外，可 以采用電泳的方法進行分離，但是，分辨率低，實際應用效果很差，而且成 本較高。以上兩種方法在工業(yè)應用上存在著很大困難。
所以，要實現(xiàn)工業(yè)/家庭的大量實際應用，上述的能量供一受體體系及探 針純度都還有待于改進和提高。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，設計一種磁性 DNA熒光探針及其制備方法。該探針具有磁性、易分離純化，檢測限低、測 量靈敏度高，對被檢測DNA特異性好，實用性強和成本低等特點，可以簡便、 快速地檢測某一特定序列的DNA。該制備方法具有工藝簡單，操作簡便，條 件溫和，靈活性高等特點。
本發(fā)明解決所述探針技術(shù)問題的技術(shù)方案是設計一種磁性DNA熒光 探針，其特征在于該探針采用磁性核-殼型量子點CdTe/MNs納米粒子做發(fā)射 熒光的能量供體，且CdTe/MNs納米粒子與單鏈3'-NH2-DNA相連接，構(gòu)成 CdTe/MNs-DNA;采用納米氧化鎳做吸收熒光的能量受體，且納米氧化鎳與 單鏈5'-NH2-DNA相連接，構(gòu)成nNiO-DNA;所述的單鏈5'-NH2-DNA與單 鏈3，-NH2-DNA互補，并使CdTe/MNs-DNA與nNiO-DNA雜交制成。
本發(fā)明解決所述制備方法技術(shù)問題的技術(shù)方案是設計一種本發(fā)明所述 DNA熒光探針的制備方法，該制備方法包括
首先，制備CdTe/MNs-DNA，包括5個步驟
(1)制備磁性納米粒子MNs采用醇-水法制備磁性納米粒子MNs:配制體積比為0.1:4-l:0.4的醇/水混 合物，得到溶液A，在溶液A中溶解濃度為0.01-2.0mol/L的N產(chǎn)的鹽，得到溶 液B;另取溶液A，配制濃度為0.01-llmol/L的草酸7jC溶液，得到溶液C;將 溶液C緩慢滴加到溶液B中，并快速攪拌，開始出現(xiàn)沉淀時，控制pH值在l-13 之間，滴加完畢后，反應10-300分鐘，得到含有沉淀物的溶液D;然后將溶 液D進行離心分離，得到沉淀物，用雙蒸水洗滌，在10-150。C下干燥0.1-24h 后，將其置于馬弗爐中，于200-600。C下煅燒0.1-24h，得黑色粉體E;用1M 鹽酸清洗黑色粉體E，直至洗液為無色，即得具有磁性的鎳納米粒子(MNs)， 所制備的MNs粒徑為5-15nm;
(2) 制備CdTe熒光量子點溶液 采用常規(guī)方法制備CdTe熒光量子點溶液；
(3) 制備CdTe/MNs原液
制備CdTe/MNs原液采用常規(guī)方法;但所述磁性Ni納米粒子的表面修飾劑 為含有氮元素的鹽類或者是酸類，反應溶液pH控制在2-13之間，Ni.'CdTe摩 爾配比為0.01:1-1:0.01之間，反應溫度為20-98。C，反應時間為0.1-24h，反應 所得CdTe/MNs的粒徑在10-30nm之間；
(4) 制備CdTe/MNs-DNA溶液
將l-10ml的CdTe/MNs原液和IOD的3，-NH2-DNA混合，力口入 3'-NH2-DNA量l-100倍的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞氨鹽酸鹽，在 Tris-HCl溶液中反應O. 1 -72h，即得到CdTe/MNs-DNA溶液；
(5) CdTe/MNs-DNA溶液純化
使用0.01-0.3T的永磁鐵對具有磁性的CdTe/MNs-DNA在l-30min內(nèi)完成 分離、濃縮過程，去除掉未雜交到粒子表面的單鏈DNA，同時將 CdTe/MNs-DNA的有效濃度濃縮提高為原來的l-20倍；
其次，制備nNiO-DNA溶液，包括2個步驟
(6) 制備nNiO
nNiO的制備方法與前述(1)即醇-水法制備磁性納米粒子MNs的方法 基本相同，區(qū)別僅是在最后一步得到黑色粉體E后，將其分散到溶液A中，
9震蕩使其均一，然后放到0.01-0.3T磁鐵上，在磁場作用下，Ni粒子被吸引到 容器底部，而NiO仍然懸浮在溶液中，去除底部的Ni粒子，獲得懸浮在溶 液中的顆粒即為nNiO;
(7) 制備nNiO-DNA溶液
將l-10ml的nNiO溶液與l-5ml， pH=3-10， 0.05-5.0mol/L的同時含有氨 基和羧基的有機化合物溶液按1:5-10:1的體積比混合，磁力攪拌，室溫下反 應5-300min，然后加入IOD的單鏈5'-NH2-DNA混合，加入單鏈5，-NH2-DNA 量1-200倍的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞氨鹽酸鹽，在Tris-HCl溶液中 反應0.1-72h，即得到nNiO-DNA溶液；所述同時含有氨基和羧基的有機化合 物是指氨基丙烯酸，賴氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，蘇氨酸，異亮氨 酸，天冬氨酸或谷氨酸；
再次，制備DNA熒光探針
(8) 將所述制備的CdTe/MNs-DNA溶液與nNiO-DNA溶液按1:(0.1-20)
的體積比例混合，然后將混合液加入到l-200ml的磷酸鹽雜交緩沖液(PBS) 中，在10-90 。C下雜交0.5-24小時，即得到DNA熒光探針； 最后，DNA熒光探針純化
(9) 將得到的DNA熒光探針使用0.01-0.3T的永磁鐵在l-30min內(nèi)完成 雜交后熒光探針的分離、濃縮，去除掉未成功雜交的nNiO-DNA，同時同時 控制濃縮時間和磁場強度，將熒光探針的有效濃度濃縮提高為原來的1-20倍。
本發(fā)明通過DNA雜交技術(shù)，將nNiO-DNA和半導體發(fā)光納米粒子 CdTe/MNs-DNA連接起來，構(gòu)建了磁性DNA熒光探針。與現(xiàn)有技術(shù)相比， 本發(fā)明熒光探針采用半導體發(fā)光納米粒子CdTe/MNs作為能量供體，具有量 子點所具備的較寬的光譜激發(fā)范圍等優(yōu)良性能，可自由地選擇激發(fā)波長，有 利于保證供體發(fā)射波長與受體吸收波長的良好重疊，增加共振能量的轉(zhuǎn)移效 率；采用磁性MNs為核制備CdTe/MNs，使得能量給體以及合成的探針具有 磁響應性能，使CdTe/MNs具有了多功能性，可以實現(xiàn)在普通磁鐵磁場作用 下實現(xiàn)CdTe/MNs分離、濃縮和靶向定位等功能，磁性分離及濃縮后的能量 給體CdTe/MNs以及CdTe/MNs-DNA具有更高的熒光強度，經(jīng)過磁分離的CdTe/MNs-DNA以及最終制備的熒光探針具有更高純度，提高了單位體積內(nèi) 探針的數(shù)量，有利于提高探針的檢測限和檢測的特異性。nNiO作為能量受體, 可對CdTe/MNs所發(fā)出的能量進行有效淬滅，檢測速度快，并可實現(xiàn)多重標 記，而且成本低廉，有利于產(chǎn)品的工業(yè)化和家庭化應用。本發(fā)明熒光探針能 夠得到nM級的靈敏度和可檢測一個錯配堿基特異性的精度。該制備方法具 有操作簡便(全部在水相合成)，工藝簡單(關(guān)鍵步驟只涉及到了層層自組裝、 DNA雜交和熒光檢測步驟)，條件溫和(在20-100度的水中進行，磁力攪拌， 常壓反應)，靈活性高(粒子的直徑、能量供體的發(fā)光強度、DNA長度、能 量供受-體對的距離、能量供受體-對的比例、能量供受體-對在水相中的濃度 以及發(fā)光強度等均可調(diào))等特點。
具體實施例方式
以下結(jié)合實施例進一步詳細描述本發(fā)明
本發(fā)明設計的磁性DNA熒光探針(簡稱探針)，其特征在于該探針采用 磁性核-殼型量子點CdTe/MNs納米粒子做發(fā)射熒光的能量供體，且CdTe/MNs 納米粒子與單鏈3'-NH2-DNA相連接，構(gòu)成CdTe/MNs-DNA;采用納米氧化 鎳做吸收熒光的能量受體，且納米氧化鎳與單鏈5'-NH2-DNA相連接，構(gòu)成 nNiO-DNA;所述的單鏈5'-NH2-DNA與單鏈3'-NH2-DNA互補，并使 CdTe/MNs-DNA與nNiO-DNA雜交制成。
所述的單鏈DNA序列可以根據(jù)A-T， G-C對應的原則得出。
上述DNA鏈段可以是下述DNA編碼序列
具有沙門氏桿菌特征的DNA編碼序列，例如 5，-CTGATGCCTCCCTGCCCCACCAGTATTCGCTGATGGCCGGCAGGG AGTGCCAG-3'等；
可以是具有志賀氏桿菌特征的DNA編碼序列，例如 5，-ATGAAGAAAGGTGATGCGGCTGAACATGCAGAGCACCATATGAAAG
C CACTGAACGCACCGATAACCTGGCTGATGCCG CCTGA-3，等；
ii可以是具有鼠疫桿菌特征的DNA編碼序列，例如
5 ，-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAD-3 ，； 5 ，-AGTAAGCAAGAGAGAGCCGGGGGG畫3 ，等；
可以是具有弓形蟲特征的DNA編碼序列，例如
G-3，；
5'-GCAGGGCGACAGAGATGGATGTCACCATGATTGGTCTCCAGAATGCA G GA AAGTCTTCGT TGTTGCGCGTGCTTGCGGTA畫3 ，；
T ATCTGGAGGAACTGGC AAAAGG-3 ，等；
可以是具有肝炎病毒特征的DNA編碼序列，例如
A AGGACTTAATCTGGGTTGTA-3 ，；
5'-ATAATGCATCCTCAAGTGGTCATCTTAAGCCTCATCCTACATCTGGCA
G誦3，等;
可以是具有冠狀病毒特征的DNA編碼序列，例如 5 ，誦AGGTGATGACGAATTTATTGAGTAA-3 ，；
5,-ATGATTCAAACTCCAACATCTTTTCTAATAGTGTTAATTCTTCTTTGGT
T CTGCTTTGGC ACAGTCTAGA CTAA-3 ，等；
可以是具有肺炎球菌特征的DNA編碼序列，例如 5'-ATGTGTCCTCAGAAGCTAACCATCTCCTGGTTTGCCATCGTTTTGCTG GT GTCTCCACTCATGGCC ATGT GGGAGCTGGA GAAAGACG-3 ，；
T TCCAGCCTTAGACCTTCTGATTAAG-3'; 5,-ATTGAGATGA AGCGATATGC TGTGCCCTTA G-3，等；
可以是具有流感病毒特征的DNA編碼序列，例如GG TAACGGTGCGGGCTGA陽3，等；
或者是具有特征DNA編碼序列的病毒，細菌或微生物等。 本發(fā)明同時設計了本發(fā)明所述探針的制備方法(簡稱制備方法)，該制備 方法首先合成磁性的Ni納米粒子(magnetic nano-particles; MNs)，經(jīng)過表面 改性后作為磁性核，然后通過層層自組裝的方法在核的外部包裹一層CdTe 納米粒子，形成核-殼型量子點CdTe/MNs，作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移的能量供 體。利用該方法制備得到的CdTe/MNs具有較強的熒光和較高的量子效率。 其次，采用醇-水法制備磁性納米氧化鎳(nNiO)，作為能量受體。然后將能 量供體、能量受體分別和單鏈DNA相連，通過DNA雜交技術(shù)合成熒光探針。 本發(fā)明制備方法的具體工藝包括以下步驟 首先，制備CdTe/MNs-DNA，包括5個步驟
(1) 制備磁性納米粒子MNs;采用醇-水法制備磁性納米粒子MNs:配制 體積比為0.1:4-l:0.4的醇/水混合物，得到溶液A，在溶液A中溶解濃度為 0.01-2.0mol/L的N產(chǎn)的鹽，得到溶液B;另取溶液A，配制濃度為0.01-llmol/L 的草酸水溶液，得到溶液C;將溶液C緩慢滴加到溶液B中，并快速攪拌，開 始出現(xiàn)沉淀時，控制pH值在l-13之間，滴加完畢后，反應10-300分鐘，得到 含有沉淀物的溶液D;對溶液D進行離心分離，得到沉淀物，用雙蒸水洗滌， 在10-15(TC下干燥0.1-24h后，將其置于馬弗爐中，于200-600'C下煅燒 0.1-24h，得黑色粉體E;用1M鹽酸清洗黑色粉體E,直至洗液為無色，即得 具有磁性的鎳納米粒子(MNs)，所制備的MNs粒徑為5-15nm。
(2) 制備CdTe熒光量子點溶液；制備CdTe熒光量子點溶液的方法為現(xiàn)有 技術(shù)(可參考許世超等，表面修飾CdTe量子點的合成及其光學特性，影像科 學與光化學，2009， 27， 161-167; 一文獻l);
(3) 制備CdTe/MNs原液
制備CdTe/MNs原液的方法也為現(xiàn)有技術(shù)(可以參考許世超等，CdTe⑨Fe304磁性復合納米粒子的合成與表征，納米技術(shù)與精密工程，2009， 2， 110-114;—文獻2)。但所述的磁性Ni納米粒子表面修飾劑(作為磁性的 核與具有熒光特性的CdTe量子點的殼之間的鏈接劑)與上述現(xiàn)有技術(shù)不同， 本發(fā)明所涉及的磁性Ni納米粒子表面修飾劑為含有氮元素的鹽類或者是酸 類。反應溶液pH控制在2-13之間，Ni:CdTe摩爾配比為0.01:l-l:0.01之間，反 應溫度為20-98"C，反應時間為0.1-24h，反應所得CdTe/MNs的粒徑在10-30nm 之間；
(4) 制備CdTe/MNs-DNA溶液
將l-10ml的CdTe/MNs原液和IOD的3，-NH2-DNA混合，力口入 3'-NH2-DNA量l-100倍的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞氨鹽酸鹽，在 Tris-HCl溶液中反應0.1-72h，即得到CdTe/MNs-DNA溶液；
(5) CdTe/MNs-DNA溶液純化
使用0.01-0.3T的永磁鐵對具有磁性的CdTe/MNs-DNA在l-30min內(nèi)完成 分離、濃縮過程，去除掉未雜交到粒子表面的單鏈DNA，同時將 CdTe/MNs-DNA的有效濃度濃縮提高為原來的l-20倍；
其次，制備nNiO-DNA溶液，包括2個步驟
(6) 制備nNiO
nNiO的制備方法與前述(1)即醇-水法制備磁性納米粒子MNs的方法 基本相同，區(qū)別僅是最后一步即得到黑色粉體E后，將其分散到溶液A中， 震蕩使其均一，然后放到0.01-0.3T磁鐵上，由于Ni粒子具有磁性，而NiO 不具有磁性，因此在磁場作用下，Ni粒子與NiO粒子會分離開，Ni粒子被 吸引到容器底部，而NiO粒子仍然懸浮在溶液中，去掉底部的Ni粒子，獲 得懸浮在溶液中的顆粒即為nNiO;
(7) 制備nNiO-DNA溶液
將l-10ml的nNiO溶液與l-5ml， pH=3-10， 0.05-5.0mol/L的同時含有氨 基和羧基的有機化合物溶液按1:5-10:1的體積比混合，磁力攪拌，室溫下反 應5-300min，然后加入10D的單鏈5'-NH2-DNA混合，加入單鏈5'-NH2-DNA 量1-200倍的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞氨鹽酸鹽，在Tris-HCl溶液中反應0.1-72h，即得到nNiO-DNA溶液；所述同時含有氨基和羧基的有機化合 物是指氨基丙烯酸，賴氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，蘇氨酸，異亮氨 酸，天冬氨酸或谷氨酸；
所述的Tris-HCl溶液制備方法為現(xiàn)有技術(shù)。實施例的具體方法是將0.9 一90g的Tris堿溶于750ml的水中，并使用磷酸或者鹽酸將其調(diào)節(jié)到所需的 pH值即得；
再次，(8)制備DNA熒光探針
將所述制備的CdTe/MNs-DNA溶液與nNiO-DNA溶液按l:(0.1-20)的體 積比例混合，然后將混合液加入到l-200ml的磷酸鹽雜交緩沖液(PBS)，在 10-90 。C下雜交0.5-24小時，即得到DNA熒光探針；
本發(fā)明所述PBS雜交緩沖液的制備方法為現(xiàn)有技術(shù)。實施例制備PBS雜 交緩沖液的具體方法是
① .將l-100mg的Na2HP04'12H20溶于100ml雙蒸水中；
② .將l-100mg的NaH2P0V12H2O溶于100ml雙蒸水中；
③ .取(1)溶液61ml和(2)溶液39ml混勻即得。 最后，(9) DNA熒光探針純化
將得到的DNA熒光探針使用0.01-0.3T的永磁鐵在l-30min內(nèi)完成雜交 后熒光探針的分離、濃縮，去除掉未成功雜交的nNiO-DNA，同時同時控制 濃縮時間和磁場強度，將熒光探針的有效濃度濃縮提高為原來的1-20倍。
本發(fā)明制備方法通過改變所述CdTe/MNs上所連接的單鏈DNA序列的長 度(例如在DNA序列與CdTe/MNs相連的一端加入1-10個堿基)，即可以調(diào) 節(jié)所述CdTe/MNs和nNiO之間的距離，從而得到不同強度的熒光；所述的堿 基可以是A、 T、 G或C中的任意一個，或者是它們之間的任意組合。
本發(fā)明探針的工作原理是當CdTe/MNs和nNiO相互靠近，滿足熒光 共振能量轉(zhuǎn)移條件時，CdTe/MNs (能量供體)和nNiO (能量受體)相接觸， CdTe/MNs發(fā)出的熒光被轉(zhuǎn)移到nNiO上，并以熱能的形式散發(fā)出去，導致 nNiO將CdTe/MNs的熒光能量吸收(或稱作淬滅)，因而檢測不到或者僅有 很低的熒光信號。當體系中存在大量與探針上DNA序列互補的DNA序列時，探針上的兩條DNA鏈就會分離，轉(zhuǎn)而與體系中與之互補的DNA鏈雜交，使 所述能量供體和能量受體的距離增大，能量供體發(fā)出的熒光就不能被淬滅， 此時可以檢測到熒光信號。依據(jù)此理，本發(fā)明探針可以根據(jù)熒光的強弱，來 檢測目標DNA，從而應用于基因組的突變檢測以及微生物病原體基因的檢測 和分析。
本發(fā)明FRET體系的能量供一受體對滿足了以下幾個必要條件(l)供一 受體要相互比較接近(l-10nm); (2)供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜要重 疊；(3)供一受體的躍遷偶極距近乎平行。
本發(fā)明探針可用來檢測目標DNA，即利用本發(fā)明的探針中已知的特征 DNA序列來檢測目標DNA。如果目標DNA與探針中的單鏈DNA完全互補， 則體系的熒光會增強，從而達到檢測未知DNA序列的目的。具體檢測方法為 向探針溶液中加入目標DNA， 10-90 。C反應0.5-24小時，用熒光分光光度計 分別測試探針以及加入目標DNA后體系的熒光強度(熒光強度的變化)，如 果熒光強度增強，就證明有目標DNA存在。熒光分光光度計的激發(fā)波長為 300-400nm，掃描范圍200-700謹，掃描速率0.1-10nm/s。
探針對目標DNA檢測的最低限(檢測限)，是指理論上所合成的探針能 夠檢測到目標DNA的最低濃度。檢測限越低，探針的靈敏度就越高。檢測限 受到熒光強度變化的影響，而熒光強度又受到合成條件，例如pH、溫度、回 流時間、Ni/CdTe摩爾比例、nNiO-DNA加入量等影響，因此，有必要對每一 個實施例中所合成的探針進行檢測限的測定，以便衡量探針的靈敏度。具體 檢測方法為現(xiàn)有技術(shù)(可參考許世超等，燈塔探針對弓形蟲DNA的檢測， SPIE國際會議論文集，7157巻，1571U-71571U-6 (2008); Xu Shichao, Yao Cuicui, Wei Shuoming, et al. Detection of 7bxo/ /oswa go/W// with a DNA molecular beacon probe, Proceedings of the SPIE, 7157， 71571U-71571U-6 (2008); _文獻3)。
本發(fā)明未述及之處適用于現(xiàn)有技術(shù)。
以下是本發(fā)明的具體實施例。所述的實施例僅是用于進一步具體描述本 發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的權(quán)利要求。實施例1
1. DNA序列
檢測鼠疫特征DNA序列之一
序列l(wèi): 5'端用氨基標記的單鏈DNA (記作S》，
5 ，-AGTAAGCAAGAGAGAGCCGGGGGG-(CH2)6-NH2-3 ，； 序列2: 3'端用氨基修飾的單鏈DNA (與S〗互補，記作S2)，
5 ，畫NH2-(CH2)6-CCCCGGCTCTCTCTTGCTTACT-3 ，； 序列3:目標DNA(與S,互補，記作Ss),
5'畫CCCCCCGGCTCTCTCTTGCTTACT陽3，。
2. 制備方法
首先，制備CdTe/MNs-DNA (Sl);具體方法為
(1) 采用醇-水法制備磁性納米粒子MNs，方法如下 配制體積比為0.1:l的醇/水混合物溶液，得溶液A;在溶液A中溶解濃度
為0.01mol/L的Ni(NO3)2，得到溶液B;另取溶液A，配制濃度為0.01m,ol/L草 酸水溶液，得到溶液C;將溶液C緩慢滴加到溶液B中，并快速攪拌，開始出 現(xiàn)沉淀時，控制pH值在3，滴加完畢后，反應15分鐘，得到含有沉淀的溶液 D;對溶液D進行離心分離，得到沉淀，并用雙蒸水洗滌，在l(TC下干燥0.1h 后，將其置于馬弗爐中，于20(TC下煅燒0.1h，得黑色粉體E;用1M的鹽酸 清洗黑色粉體E，直至洗液為無色，即得具有磁性的鎳納米粒子(MNs)。所 制備的MNs平均粒徑為5nm。
(2) 制備CdTe熒光量子點溶液。所涉及方法為現(xiàn)有技術(shù)(參考文獻l);
(3) CdTe/MNs原液的制備。CdTe/MNs原液制備工藝為現(xiàn)有技術(shù)(參考 文獻2)，但是磁性納米粒子的表面修飾劑為己二胺，反應溶液pH控制在2， Ni:CdTe摩爾配比為0.01: 1，反應溫度為2(TC，反應時間為0.1h，反應所得 CdTe/MNs的平均粒徑在1 Onm;
(4) 制備CdTe/MNs-DNA溶液將l-10ml的CdTe/MNs原液禾口IOD的 3，-NH2-DNA (Sl)混合，加入3，-NH2-DNA (Sl)量l倍的l-乙基-3-(3-二甲 基氨丙基)碳二亞氨鹽酸鹽，在Tris-HCl溶液中反應12h，即可得到CdTe/MNs-DNA溶液；
(5) 使用0.01T的永磁鐵對具有磁性的CdTe/MNs-DNA進行分離(5min 內(nèi)完成)、濃縮，去除掉未雜交到粒子表面的單鏈DNA，同時將 CdTe/MNs-DNA的有效濃度濃縮提高l倍。
其次，制備nNiO-DNA (S2)溶液；具體方法為
(6) 制備nNiO。 nNiO的制備方法和醇-水法制備磁性納米粒子MNs相 似，只是在最后一步得黑色粉體E后，將其分散到醇/水混合物中(即溶液A)， 震蕩使均一，然后用磁鐵分離出放在溶液底部分離出具有磁性的粒子，剩余 的在溶液中懸浮的顆粒即為nNiO。
(7) 將lml的nNiO溶液與lml， pH=3， 0.05mol/L的氨基丙烯酸的溶液 混合，磁力攪拌，室溫下反應5min，然后加入IOD的5'-NH2-DNA (S2) 混合，加入5，-NH2-DNA (S2)量1倍的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞氨 鹽酸鹽，在Tris-HCl溶液中反應0.1h，即得到nNiO-DNA溶液。
再次，(8)制備DNA熒光探針將所述制備的CdTe/MNs-DNA與 nNiO-DNA溶液按1:0.1的體積比例混合，然后將混合液加入到lml磷酸鹽雜 交緩沖液(PBS)，在20。C下雜交0.5小時，即得到DNA熒光探針。
最后，(9)DNA熒光探針純化將得到的DNA熒光探針使用0.01T的永 磁鐵對雜交后獲得的熒光探針進行分離(15min內(nèi)完成)、濃縮，去除掉未成 功雜交的nNiO-DNA，控制濃縮時間為10min和磁鐵的磁強度在O.OIT，熒光
探針的有效濃度濃縮提高1倍。 3.目標DNA檢測
把1 OD的目標DNA (S3)加入到10mlT=45 °C、 pH=7.5的探針溶液中， 反應lh，測得熒光強度由10增強為25，此條件下加入不同OD數(shù)的目標DNA， 按照參考文獻3中的檢測方法，測定檢測限為2.1xl(^M。 實施例2 l.DNA序列
檢測肺炎球菌特征DNA序列之一
序列l(wèi): 5'端用氨基標記的單鏈DNA (記作S。，
185，-ATTGAGATGAAGCGATATGCTGTGCCCTTAG-(CH2)6-NH2-3,; 序列2: 3'端用氨基修飾的單鏈DNA (與S,互補，記作S2)，
5，- NH2-(CH2)6-TTCACAGCATATCGCTTCATCTCTCAAT-3，； 序列3:目標DNA (與S!完全互補，記作S》，
5，- CTAAGGGCACAGCATATCGCTTCATCTCTCAAT陽3，。
2.制備方法
(1) 采用醇-水法制備磁性納米粒子MNs,方法如下 配制體積比為0.1:0.4的醇/水混合物溶液A，在其中溶解濃度為0.02mol/L
的Ni(N03)2的鹽并得到溶液B;另取溶液A，配制濃度為0.2mol/L草酸水溶液 得到溶液C。將溶液C緩慢滴加到溶液B中并快速攪拌，開始出現(xiàn)沉淀時控制 pH值在4，滴加完畢后反應30分鐘，得到含有沉淀的溶液D。對溶液D進行離 心分離，得到沉淀，并用雙蒸水洗滌，在50'C下干燥0.4h后將其置于馬弗爐 中，于30(TC下煅燒4h，得黑色粉體E。用1M的鹽酸清洗黑色粉體E，直至洗 液為無色即得具有磁性的鎳納米粒子(MNs)。所制備的MNs平均粒徑為 7nm。
(2) 制備CdTe熒光量子點溶液。所涉及方法為現(xiàn)有技術(shù)(參考文獻l)。
(3) CdTe/MNs原液的制備。采用現(xiàn)有技術(shù)方法制備(參考文獻2)，但是 磁性納米粒子的表面修飾劑為丁二胺。反應溶液pH控制在3， Ni:CdTe摩爾配 比為0.01:0.02，反應溫度為3(TC,反應時間為4h。反應所得CdTe/MNs的平 均粒徑在10nm。
(4) 制備CdTe/MNs-DNA溶液將l-10ml的CdTe/MNs原液和IOD的 3，-NHrDNA (Sl)混合，加入3，-NH2-DNA (Sl)量4倍的l-乙基-3-(3-二甲 基氨丙基)碳二亞氨鹽酸鹽，在Tris-HCl溶液中反應12h，即可得到DNA修飾 的能夠發(fā)出粉紅色熒光的CdTe/MNs-DNA溶液；
(5) 使用0.01T的永磁鐵對具有磁性的CdTe/MNs-DNA進行分離(15min 內(nèi)完成)、濃縮，去除掉未雜交到粒子表面的單鏈DNA，同時將 CdTe/MNs-DNA的有效濃度提高(濃縮)2倍。
其次，制備nNiO-DNA (S2)溶液；具體方法為(6) 制備nNiO。 nNiO的制備方法和醇-水法制備磁性納米粒子MNs相 似，只是在最后一步得黑色粉體E后，將其分散到醇/水混合物中(即溶液A)， 震蕩使均一，然后用磁鐵分離出放在溶液底部分離出具有磁性的粒子，剩余 的在溶液中懸浮的顆粒即為nNiO。
(7) 將lml的nNiO溶液與2ml， pH=4， 0.5mol/L的苯丙氨酸溶液混合， 磁力攪拌，室溫下反應50min，然后加入IOD的5，-NH2-DNA (S2)混合， 加入5，-NH2-DNA (S2)量40倍的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞氨鹽酸 鹽，在Tris-HCl溶液中反應16h即得到nNiO-DNA溶液。
再次，(8)制備DNA熒光探針將所述制備的CdTe/MNs-DNA與 nNiO-DNA溶液按1:1的體積比例混合，然后將混合液加入到20ml的磷酸鹽 雜交緩沖液(PBS),在40。C下雜交2小時，即可得到DNA熒光探針。
最后，(9)將得到的DNA熒光探針使用0.1T的永磁鐵對雜交后獲得的 熒光探針進行分離、濃縮(控制時間5min內(nèi)，磁鐵磁強度為0.1T)，去除掉 未成功雜交的nNiO-DNA,熒光探針的有效濃度濃縮提高了 2倍。 3.目標DNA檢觀lJ
把1 OD的目標DNA (S3)加入到20ml T=45 °C、 pH=7.5的探針溶液中 反應lh，測得熒光強度增強，由10增強為35。此條件下加入不同OD數(shù)的 目標DNA，按照參考文獻3中的檢測方法，測定檢測限為6.5xlO—"M。 實施例3
1. DNA序列
檢測冠狀病毒特征DNA序列之一
序列l(wèi): 5'端用氨基標記的單鏈DNA (記作S》。
5 ，- AGGTGATGACGAATTTATTGAGTAA-(CH2)6-NH2-3 ，； 序列2: 3'端用氨基修飾的單鏈DNA (與Si互補，記作S》，
5，- NH2-(CH2)6-AATAAATTCGTCATCACCT-3，； 序列3:目標DNA (與Si完全互補，記作S3)，
5 ，- TTACTCAATAAATTCGTCATCACCT-3 ，。
2. 制備方法(1) 采用醇-水法制備磁性納米粒子MNs，方法如下 配制體積比為0.5:2的醇/水混合物溶液A，在其中溶解濃度為0.02mol/L的
NiCl2并得到溶液B;另取溶液A，配制濃度為0.8mol/L草酸水溶液得到溶液C。 將溶液C緩慢滴加到溶液B中并快速攪拌，開始出現(xiàn)沉淀時控制pH值在5，滴 加完畢后反應50分鐘，得到含有沉淀的溶液D。對溶液D進行離心分離，得 到沉淀，并用雙蒸水洗滌，在6(TC下干燥4h后將其置于馬弗爐中，于350'C 下煅燒4h，得黑色粉體E。用1M的鹽酸清洗黑色粉體E，直至洗液為無色即 得具有磁性的鎳納米粒子(MNs)。所制備的MNs平均粒徑為8nm。
(2) 制備CdTe熒光量子點溶液。所涉及方法為現(xiàn)有技術(shù)(參考文獻l。
(3) CdTe/MNs原液的制備。采用現(xiàn)有技術(shù)制備(參考文獻2)，但是磁性 納米粒子的表面修飾劑為間苯二胺。反應溶液pH控制在5， Ni:CdTe摩爾配比 為0.01:0.5，反應溫度為40'C，反應時間為6h。反應所得CdTe/MNs的平均粒 徑在15腿。
(4) 制備CdTe/MNs-DNA溶液將lml的CdTe/MNs原液和IOD的 3，-NHrDNA (Sl)混合，加入3，-NH2-DNA (S1)量10倍的l-乙基-3-(3-二甲 基氨丙基)碳二亞氨鹽酸鹽，在Tris-HCl溶液中反應12h，即可得到 CdTe/MNs-DNA溶液；
(5) 使用0.2T的永磁鐵對具有磁性的CdTe/MNs-DNA進行分離(2.5min 內(nèi)完成)、濃縮，去除掉未雜交到粒子表面的單鏈DNA，同時將 CdTe/MNs-DNA的有效濃度濃縮提高4倍。
其次，制備nNiO-DNA (S2)溶液；具體方法為
(6) 制備nNiO。 nNiO的制備方法和醇-水法制備磁性納米粒子MNs相 似，只是在最后一步得黑色粉體E后，將其分散到醇/水混合物中(即溶液A)， 震蕩使均一，然后用磁鐵分離出放在溶液底部分離出具有磁性的粒子，剩余 的在溶液中懸浮的顆粒即為nNiO。
(7) 將lml的nNiO溶液與3ml， pH=4， 0.5mol/L的苯丙氨酸溶液混合， 磁力攪拌，室溫下反應50min，然后加入IOD的5，-NHrDNA (S2)混合， 加入5，-NH2-DNA (S2)量100倍的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞氨鹽酸鹽，在Tris-HCl溶液中反應24h即得到nNiO-DNA溶液。
再次，(8)制備DNA熒光探針將所哮制備的CdTe/MNs-DNA與 nNiO-DNA溶液按1:2的體積比例混合，然后將混合液加入到20ml的磷酸鹽 雜交緩沖液(PBS)，在50。C下雜交4小時，即可得到DNA熒光探針。
最后，(9)將得到的DNA熒光探針使用0.1T的永磁鐵對雜交后獲得的 熒光探針進行分離(控制時間10min內(nèi)，磁鐵磁強度為0.1T)、濃縮，去除掉 未成功雜交的nNiO-DNA控制濃縮時間和磁鐵的磁強度，熒光探針的有效濃 度濃縮提高了4倍。 3.目標DNA檢測
把IOD的目標DNA (S3)加入到20mlT二45。C、 pH=7.5的探針溶液中 反應lh，測得熒光強度增強，由10增強為50。此條件下加入不同OD數(shù)的 目標DNA，按照參考文獻3中的檢測方法，測定檢測限為9.5xlO〃M。 實施例4
1. DNA序列檢測肝炎毒特征DNA序列之一
序列l(wèi): 5'端用氨基標記的單鏈DNA (記作S》，
5，畫ATAATGCATCCTCAAGTGGTCATCTTAAGCCTCATCCTAC
ATCTGGCA G-(CH2)6-NH2-3 ，； 序列2: 3'端用氨基修飾的單鏈DNA (與Si互補，記作S2)，
NHr(CH2)6-TGTAGGATGAGGCTTAAGATGACCACTTGAGGA TGCATTAT畫3，； 序列3:目標DNA (與Si完全互補，記作S》，
5'誦CTGCCAGATGTAGGATGAGGCTTAAGATGACCACTTGA GGATGCATTAT畫3'。
2. 制備方法
(1)采用醇-水法制備磁性納米粒子MNs，方法如下 配制體積比為0.5:4的醇/水混合物溶液A，在其中溶解濃度為2mol/L的NiCl2的鹽并得到溶液B;另取溶液A，配制濃度為0.3mol/L草酸水溶液得到 溶液C。將溶液C緩慢滴加到溶液B中并快速攪拌，開始出現(xiàn)沉淀時控制pH 值在5，滴加完畢后反應50分鐘，得到含有沉淀的溶液D。對溶液D進行離心 分離，得到沉淀，并用雙蒸水洗滌，在6(TC下干燥5h后將其置于馬弗爐中， 于40(TC下煅燒6h，得黑色粉體E。用1M的鹽酸清洗黑色粉體E，直至洗液為 無色即得具有磁性的鎳納米粒子(MNs)。所制備的MNs平均粒徑為8nm。
(2) 制備CdTe熒光量子點溶液。所涉及方法為現(xiàn)有技術(shù)(參考文獻l)。
(3) CdTe/MNs原液的制備。采用現(xiàn)有技術(shù)制備(工藝參考文獻2)，但是 磁性納米粒子的表面修飾劑為間苯二胺。反應溶液pH控制在8， Ni:CdTe摩爾 配比為0.5:0.01，反應溫度為60。C，反應時間為12h。反應所得CdTe/MNs的 平均粒徑在20nm。
(4) 制備CdTe/MNs-DNA溶液將lml的CdTe/MNs原液禾口 IOD的 3，-NH2-DNA (Sl)混合，加入3，-NH2-DNA (Sl)量80倍的l-乙基-3-(3-二甲 基氨丙基)碳二亞氨鹽酸鹽，在Tris-HCl溶液中反應48h ，即可得到 CdTe/MNs-DNA溶液；
(5) 使用0.3T的永磁鐵對具有磁性的CdTe/MNs-DNA進行分離(1.5min 內(nèi)完成)、濃縮，去除掉未雜交到粒子表面的單鏈DNA，同時將 CdTe/MNs-DNA的有效濃度濃縮提高4倍。
其次，制備nNiO-DNA (S2)溶液；具體方法為
(6) 制備nNiO。 nNiO的制備方法和醇-水法制備磁性納米粒子MNs相 似，只是在最后一步得黑色粉體E后，將其分散到醇/水混合物中(即溶液A)， 震蕩使均一，然后用磁鐵分離出放在溶液底部分離出具有磁性的粒子，剩余 的在溶液中懸浮的顆粒即為nNiO。
(7) 將10ml的nNiO溶液與3ml， pH=4， 2.5mol/L的谷氨酸溶液混合， 磁力攪拌，室溫下反應150min，然后加入10D的5'-NH2-DNA (S2)混合， 加入5，-NH2-DNA (S2)量80倍的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞氨鹽酸 鹽，在Tris-HCl溶液中反應48h即得到nNiO-DNA溶液。
再次，(8)制備DNA熒光探針將所述制備的CdTe/MNs-DNA與nNiO-DNA溶液按1:10的體積比例混合，然后將混合液加入到200ml的磷酸 鹽雜交緩沖液(PBS)，在80。C下雜交14小時，即可得到DNA熒光探針。
最后，(9)將得到的DNA熒光探針使用0.1T的永磁鐵對雜交后獲得的 熒光探針進行分離(控制時間15min內(nèi)，磁鐵磁強度為0.1T)、濃縮，去除掉 未成功雜交的nNiO-DNA，控制濃縮時間和磁鐵的磁強度，熒光探針的有效 濃度濃縮提高6倍。 3.目標DNA檢測
把10D的目標DNA (S3)加入到20mlT:45。C、 pH=7.5的探針溶液中 反應lh,測得熒光強度增強由10增強為65，此條件下加入不同OD數(shù)的目 標DNA，按照參考文獻3中的檢測方法，測定檢測限為1.5xl(T9M。
1. DNA序列
檢測弓形蟲特征DNA序列之一
序列l(wèi): 5'端用氨基標記的單鏈DNA (記作S》，
5'國ATGGCGGGTATCTTTCGCACGATCTATGACTGGCTCCTGA
GATGTTCTG-(CH2)6-NHr3 ，； 序列2: 3'端用氨基修飾的單鏈DNA (與Si互補，記作S》，
5，-NH2-(CH2)6-CAGGAGCCAGTCATAGATCGTGCGAAAGAT
ACCCGCCAT國3，；
序列3:目標DNA (與Si完全互補，記作Ss)，
5，國CAGAACATCTCAGGAGCCAGTCATAGATCGTGCGAAAGA TACCCGCCAT-3'。
2. 制備方法
(1)采用醇-水法制備磁性納米粒子MNs，方法如下 配制體積比為1:0.4的醇/水混合物溶液A，在其中溶解濃度為lmol/L的 NiCl2的鹽并得到溶液B;另取溶液A，配制濃度為5mol/L草酸水溶液得到溶 液C。將溶液C緩慢滴加到溶液B中并快速攪拌，開始出現(xiàn)沉淀時控制pH值 在13，滴加完畢后反應300分鐘，得到含有沉淀的溶液D。對溶液D進行離心分離，得到沉淀，并用雙蒸水洗滌，在15(TC下干燥24h后將其置于馬弗爐中， 于600。C下煅燒24h，得黑色粉體E。用1M的鹽酸清洗黑色粉體E，直至洗液 為無色即得具有磁性的鎳納米粒子(MNs)。所制備的MNs平均粒徑為12nm。
(2) 制備CdTe熒光量子點溶液。所涉及方法為現(xiàn)有技術(shù)(參考文獻l)。
(3) CdTe/MNs原液的制備。采用現(xiàn)有技術(shù)制備(工藝參考文獻2)，但是 磁性納米粒子的表面修飾劑為辛二胺。反應溶液pH控制在13， Ni:CdTe摩爾 配比為l:O.Ol，反應溫度為98。C，反應時間為24h。反應所得CdTe/MNs的平 均粒徑在25nm。
(4) 制備CdTe/MNs-DNA溶液將lml的CdTe/MNs原液和IOD的 3，-NHrDNA (Sl)混合，加入3，-NH2-DNA (Sl)量50倍的l-乙基-3-(3-二甲 基氨丙基)碳二亞氨鹽酸鹽，在Tris-HCl溶液中反應72h，即可得到 CdTe/MNs-DNA溶液；
(5) 使用0.01T的永磁鐵對具有磁性的CdTe/MNs-DNA進行分離(40min 內(nèi)完成)、濃縮，去除掉未雜交到粒子表面的單鏈DNA，同時將 CdTe/MNs-DNA的有效濃度濃縮提高20倍。
其次，制備nNiO-DNA (S2)溶液；具體方法為
(6) 制備nNiO。 nNiO的制備方法和醇-水法制備磁性納米粒子MNs相 似，只是在最后一步得黑色粉體E后，將其分散到醇/水混合物中(即溶液A)， 震蕩使均一，然后用磁鐵分離出放在溶液底部分離出具有磁性的粒子，剩余 的在溶液中懸浮的顆粒即為nNiO。
(7) 將8ml的nNiO溶液與2ml， pH=10， 5mol/L的異亮氨酸溶液混合， 磁力攪拌，室溫下反應300min，然后加入IOD的5'-NH2-DNA (S2)混合， 加入5，-NH2-DNA (S2)量20倍的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞氨鹽酸 鹽，在Tris-HCl溶液中反應72h即得到nNiO-DNA溶液。
再次，(8)制備DNA熒光探針將所述制備的CdTe/MNs-DNA與 nNiO-DNA溶液按1:20的體積比例混合，然后將混合液加入到100ml的磷酸 鹽雜交緩沖液(PBS)，在90。C下雜交24小時，即可得到DNA熒光探針。
最后，(9)將得到的DNA熒光探針使用0.01T的永磁鐵對雜交后獲得的熒光探針進行分離(控制時間40min內(nèi)，磁鐵磁強度為O.OIT)、濃縮，去除 掉未成功雜交的nNiO-DNA，控制濃縮時間和磁鐵的磁強度，熒光探針的有 效濃度濃縮提高20倍。 3.目標DNA檢測
把1 OD的目標DNA (S3)加入到40ml T=45 °C、 pH=7.5的探針溶液中 反應lh，測得熒光強度增強由10增強為200，此條件下加入不同OD數(shù)的目 標DNA，按照參考文獻3中的檢測方法，測定檢測限為9.8xl(^M。
監(jiān)測生物是否發(fā)生變異
1. DNA序列
序列l(wèi)，與實施例l相同(S卩。 序列2，與實施例l相同(S2)。 序列3，與實施例l相同(S3)。
序列4:與S3有一個錯配堿基的目標單鏈DNA (S4)， 5，-CCCCCCGGCTCTCTC4TGCTTACT國3， o
2. 制備方法
(1) CdTe/MNs-DNA (SI)溶液的制備，所應用的所有溶液及緩沖液的 pH為5.0，其他與實施例l相同。
(2) nNiO-DNA (S2)溶液的制備，與實施例5相同。
(3) DNA熒光探針的制備，與實施例5相同。
3. 目標DNA檢測
把1 OD的目標DNA (S3或S4)分別加入到10mlT=25°C， pH=5.0的 探針溶液中，測得加入S3的體系熒光強度由IO增強至150。測得加入S4的 體系熒光強度由10增強至15，變化幅度遠小于加入S3體系的幅度。
加入所述S3和S4所獲得的熒光強度差表明，本發(fā)明探針具有良好的特 異性；同時，利用本發(fā)明探針可以監(jiān)測生物是否發(fā)生變異(特征DNA編碼序 列發(fā)生變化)。
權(quán)利要求
1.一種磁性DNA熒光探針，其特征在于該探針采用磁性核-殼型量子點CdTe/MNs納米粒子做發(fā)射熒光的能量供體，且CdTe/MNs納米粒子與單鏈3’-NH2-DNA相連接，構(gòu)成CdTe/MNs-DNA；采用納米氧化鎳做吸收熒光的能量受體，且納米氧化鎳與單鏈5’-NH2-DNA相連接，構(gòu)成nNiO-DNA；所述的單鏈5’-NH2-DNA與單鏈3’-NH2-DNA互補，并使CdTe/MNs-DNA與nNiO-DNA雜交制成。
2. —種權(quán)利要求1所述DNA熒光探針的制備方法，該制備方法包括 首先，制備CdTe/MNs-DNA，包括5個步驟(1) 制備磁性納米粒子MNs采用醇-水法制備磁性納米粒子MNs:配制體積比為0.1:4-l:0.4的醇/水混 合物，得到溶液A，在溶液A中溶解濃度為0.01-2.0mol/L的N產(chǎn)的鹽，得到溶 液B;另取溶液A，配制濃度為0.01-llmol/L的草酸水溶液，得到溶液C;將溶 液C緩慢滴加到溶液B中，并快速攪拌，開始出現(xiàn)沉淀時，控制pH值在l-13 之間，滴加完畢后，反應10-300分鐘，得到含有沉淀物的溶液D;然后將溶液 D進行離心分離，得到沉淀物，用雙蒸水洗滌，在10-150。C下干燥0.1-24h后， 將其置于馬弗爐中，于200-600'C下煅燒0.1-24h，得黑色粉體E;用1M鹽酸清 洗黑色粉體E，直至洗液為無色，即得具有磁性的鎳納米粒子(MNs)，所制 備的MNs粒徑為5-15nm;(2) 制備CdTe熒光量子點溶液 采用常規(guī)方法制備CdTe熒光量子點溶液；(3) 制備CdTe/MNs原液制備CdTe/MNs原液采用常規(guī)方法；但所述磁性Ni納米粒子的表面修飾劑 為含有氮元素的鹽類或者是酸類，反應溶液pH控制在2-13之間，Ni:CdTe摩爾 配比為0.01:1-1:0.01之間，反應溫度為20-98。C，反應時間為0.1-24h，反應所 得CdTe/MNs的粒徑在10-30nm之間；(4) 制備CdTe/MNs-DNA溶液將l-10ml的CdTe/MNs原液和lOD的3，-NH2-DNA混合，加入3，-NH2-DNA量l-100倍的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞氨鹽酸鹽，在Tris-HC路液中反 應0.1-72h，即得至UCdTe/MNs-DNA溶液；(5) CdTe/MNs-DNA溶液純化使用0.01-0.3T的永磁鐵對具有磁性的CdTe/MNs-DNA在l-30min內(nèi)完成分 離、濃縮過程，去除掉未雜交到粒子表面的單鏈DNA，同時將CdTe/MNs-DNA 的有效濃度濃縮提高為原來的l-20倍；其次，制備nMO-DNA溶液，包括2個步驟(6) 制備nNiOnNiO的制備方法與前述(1)即醇-水法制備磁性納米粒子MNs的方法基 本相同，區(qū)別僅是在最后一步得到黑色粉體E后，將其分散到溶液A中， 震蕩使其均一，然后放到0.01-0.3T磁鐵上，在磁場作用下，Ni粒子被吸引到 容器底部，而NiO仍然懸浮在溶液中，去除底部的Ni粒子，獲得懸浮在溶液 中的顆粒即為nNiO;(7) 制備nNiO-DNA溶液將l-10ml的nNiO溶液與l-5ml， pH=3-10， 0.05-5.0mol/L的同時含有氨基 和羧基的有機化合物溶液按1:5-10:1的體積比混合，磁力攪拌，室溫下反應 5-300min，然后加入IOD的單鏈5'-NH2-DNA混合，加入單鏈5'-NH2-DNA 量1-200倍的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞氨鹽酸鹽，在Tris-HCl溶液中 反應0.1-72h，即得到nNiO-DNA溶液；所述同時含有氨基和羧基的有機化合 物是指氨基丙烯酸，賴氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，蘇氨酸，異亮氨酸， 天冬氨酸或谷氨酸；再次，(8)制備DNA熒光探針將所述制備的CdTe/MNs-DNA溶液與nNiO-DNA溶液按l:(0.1-20)的體積 比例混合，然后將混合液加入到l-200ml的磷酸鹽雜交緩沖液(PBS)中，在 10-90 。C下雜交0.5-24小時，即得到DNA熒光探針； '最后，(9) DNA熒光探針純化將得到的DNA熒光探針使用0.01-0.3T的永磁鐵在l-30min內(nèi)完成雜交后 熒光探針的分離、濃縮，去除掉未成功雜交的nNiO-DNA，同時控制濃縮時間和磁場強度，將熒光探針的有效濃度濃縮提高為原來的1-20倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及磁性DNA熒光探針及其制備方法。該探針采用磁性核-殼型量子點CdTe/MNs納米粒子做發(fā)射熒光的能量供體，且CdTe/MNs納米粒子與單鏈3’-NH₂-DNA相連接，構(gòu)成CdTe/MNs-DNA；采用納米氧化鎳做吸收熒光的能量受體，且納米氧化鎳與單鏈5’-NH₂-DNA相連接，構(gòu)成nNiO-DNA；單鏈5’-NH₂-DNA與單鏈3’-NH₂-DNA互補，并使CdTe/MNs-DNA與nNiO-DNA雜交制成。該制備方法包括1.制備磁性納米粒子MNs；2.制備CdTe熒光量子點溶液；3.制備CdTe/MNs原液；4.制備CdTe/MNs-DNA溶液；5.CdTe/MNs-DNA溶液純化；6.制備nNiO；7.制備nNiO-DNA溶液；8.制備DNA熒光探針；9.DNA熒光探針純化。
文檔編號G01N21/64GK101603085SQ20091006961
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日
發(fā)明者張紀梅, 許世超 申請人:天津工業(yè)大學