一種解鏈?zhǔn)剿馓结槍崟r熒光pcr的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及核酸擴增PCR技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種解鏈?zhǔn)剿馓结?及實時熒光PCR技術(shù)。
【背景技術(shù)】：
[0002] 核酸擴增PCR技術(shù)是隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的進步而一起發(fā)展、成熟的，早在1953 年，核酸DNA雙螺旋模型及其中心法則開創(chuàng)了現(xiàn)代分子生物學(xué)及奠定了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction，PCR)的基礎(chǔ)，甚至Khorana于1971年就直接提出了核酸體 外擴增的設(shè)想："經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該 過程便可克隆tRNA基因"。1983年，美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Kary Mullis在 研究核酸測序方法時產(chǎn)生了核酸擴增的靈感：于試管中模擬天然的DNA體內(nèi)復(fù)制過程。提 供一種合適的條件模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù) 性及延伸的溫度與時間，就可成幾何級數(shù)地擴增已知兩端序列的一段DNA分子。經(jīng)過一系 列探索、發(fā)展和耐熱聚合酶、熱循環(huán)儀的發(fā)明、應(yīng)用，Cetus公司于1987年申請了首個PCR發(fā) 明專利（US Patent 4,683,202)〇
[0003] PCR技術(shù)以其獨有的高靈敏度、強特異性、簡便快速和純度要求低的特點而成為生 命科學(xué)研究的核心基礎(chǔ)技術(shù)。但傳統(tǒng)的PCR(又稱為終末PCR)需將產(chǎn)物凝膠電泳檢測進 行結(jié)果分析，傳統(tǒng)的PCR由于PCR產(chǎn)物量變異大的局限性，只能檢測反應(yīng)終末產(chǎn)物的定性 而不能精確定量，同時也沒有解決氣霧膠污染、引物二聚體、非特異性擴增等難題，因此傳 統(tǒng)的PCR結(jié)合產(chǎn)物凝膠電泳檢測方法不適用于臨床檢驗等應(yīng)用檢測。1992年Higuchi等 首次提出了采用動態(tài)PCR方法和封閉式熒光檢測方式對目的基因數(shù)量進行分析，為解決傳 統(tǒng)PCR的難題提出了新思路。1996年由美國Applied Biosystems公司推出實時熒光定量 PCR技術(shù)，所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指實時熒光PCR定量分析是通過實時檢測擴增產(chǎn) 物量（產(chǎn)物標(biāo)記熒光強度）與起始靶基因量直接相關(guān)而定量。擴增產(chǎn)物量增加的熒光信號 達到對數(shù)期的循環(huán)數(shù)Ct值（Cycle threshold)與祀模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在負相關(guān)線 性關(guān)系。即起始模板稀釋一倍達到同樣對數(shù)期熒光強度所需的擴增循環(huán)就要增加一個循環(huán) 數(shù)（Ct)。該技術(shù)實行完全閉管式操作，避免了傳統(tǒng)PCR開蓋引起的產(chǎn)物污染問題，減少了假 陽性結(jié)果的出現(xiàn)，同時也避免了對環(huán)境的污染。相比于傳統(tǒng)PCR電泳的方法，該技術(shù)操作簡 便，檢測結(jié)果以更客觀的數(shù)據(jù)形式展現(xiàn)，從而對樣本進行陽性、陰性和可疑的判定，保證了 結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0004] 實時熒光定量PCR擴增產(chǎn)物增加的信號既可通過染料法來顯示，又可采用帶淬滅 基團的探針法來檢測。染料法即在PCR反應(yīng)體系中，加入過量熒光染料（如SYBR Green I)，熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的染料分子不會發(fā) 射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。非特異的染料法 成本較低，但面臨著類似于傳統(tǒng)PCR非特異性擴增產(chǎn)物干擾的假陽性問題。探針法即PCR 擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分 別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被 淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的Y -3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團 和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一 個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。與染料法相比，探針法 在一定程度上避免了假陽性問題的出現(xiàn)，其特異性有引物和探針雙重保證，進一步增加了 結(jié)果的可信度。
[0005] 被淬滅的熒光探針即可以通過降解而激活，如1995年美國PE公司研制出了 Taq 酶水解的熒光標(biāo)記探針及實時熒光定量PCR技術(shù)（Livak KJ，et al.，1995, Genome Res : 4 :357-362)，于1997年申請了水解探針（商品名：TaqMan) PCR發(fā)明專利（US Patent 6, 485, 903)，以及Epoch公司在水解熒光探針基礎(chǔ)上增加結(jié)合效率的MGB探針（US Patent 7, 205, 105)。相較于TaqMan探針，該探針大大改善了本底信號的干擾，其較短的探針設(shè)計 不但增強了淬滅效果，降低了熒光背景，同時能夠較好地區(qū)分等位基因，可以檢測單個堿基 的突變（SNP)。2009年，美國的Igor V. Kutyavin提出了一種新的PCR檢測技術(shù)-Snake系 統(tǒng)，該系統(tǒng)通過在一條引物5'端添加一段與該條引物擴增產(chǎn)物探針5'端結(jié)合位點前面序 列相同的特定堿基片段，使再一次擴增的產(chǎn)物自身3'端能夠形成莖環(huán)狀二級結(jié)構(gòu)，再與探 針結(jié)合后可作為Taq酶最佳的水解底物，增強了 Taq酶5' 一 3'外切核酸酶的效率。不同 于TaqMan，Snake系統(tǒng)可以使用較短的探針來改善熒光背景，在信號的產(chǎn)生和序列檢測，尤 其是單核苷酸檢測方面有較強的優(yōu)勢。
[0006] 被淬滅的焚光探針也可以通過二級結(jié)構(gòu)改變而激活，分子信標(biāo)Molecular beacon(Tyagi S，et al，1996, Nat Biotechnol 14 :303-308)正是這樣一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雜 交探針，于1999年申請了 Molecular beacon發(fā)明專利（US Patent 05925517)，這一結(jié)構(gòu) 使熒光基團與淬滅基團緊密接觸，從而有效的解決了 TaqMan較高的背景熒光問題。其它雙 雜交（FRET)探針，蝎形（Scorpion)探針，Sunrise_Primer，Lux Pimers等使用范圍局限于 一定的應(yīng)用，不明顯優(yōu)于水解探針TaqMan方法，且與本發(fā)明路線、原理不同。目前臨床檢驗 使用最廣的是水解探針TaqMan實時熒光PCR，而基礎(chǔ)科研還是廣泛使用基于熒光染料SYBR Green I的實時熒光PCR0
[0007] 常規(guī)PCR檢測終末反應(yīng)-平臺期擴增產(chǎn)物，一般只需擴增25至30個循環(huán)；而實時 熒光PCR檢測的是對數(shù)初期的循環(huán)數(shù)Ct值，TaqMan等標(biāo)記探針PCR至少需要擴增40個循 環(huán)，基于熒光染料SYBR Green I的實時熒光PCR為了發(fā)揮更高靈敏度通常需要擴增45個 循環(huán)。因此實時熒光PCR技術(shù)存在著更嚴(yán)重的引物二聚體非特異性擴增問題，過量的一對 引物3'末端互補延伸產(chǎn)生二聚體，再大量被非特異性擴增。引物二聚體一般借助3'末端 多個互補堿基配對、互為引物延伸形成二聚體，引物對之間多個連續(xù)互補序列可通過常規(guī) 引物設(shè)計方法避免，但有1-2個互補序列不可避免，由于DNA鏈可彎曲轉(zhuǎn)向，末端少數(shù)堿基 互補可借助3'末端外的多個不連續(xù)互補堿基的合力結(jié)合、延伸產(chǎn)生二聚體，在隨后熱循環(huán) 中以二聚體為模板結(jié)合引物大量非特異性擴增、并結(jié)合染料。在不加模板的基于染料SYBR Green I實時熒光PCR實驗中，絕大多數(shù)一對引物產(chǎn)生二聚體的循環(huán)閾值（Ct值）一般在30 個循環(huán)左右（Jannine Brownie，et al，1997，Nucleic Acids Research 25:3235-3241)，嚴(yán) 重干擾低濃度靶分子定量和弱陽性誤讀。
[0008] 其實常被忽略的是TaqMan等探針實時熒光PCR亦存在引物二聚體問題，只是不見 引物二聚體發(fā)射熒光，但會耗盡PCR系統(tǒng)成份，降低擴增效率及靈敏度。更嚴(yán)重的是TaqMan 等探針與過量引物之間亦會雜交互補、延伸，在不加模板，僅加一對引物與TaqMan探針的 SYBR Green I實時PCR的Ct值提前至35~25個循環(huán)左右，說明引物加探針PCR會形成一 些"帶探針序列的二聚體、三聚體"，隨后非特異性擴增的"二、三聚體"競爭結(jié)合大量TaqMan 探針，導(dǎo)致弱陽性模板不易結(jié)合探針而可能漏檢。TaqMan-分子信標(biāo)的使用，在一定程度上 解決了熒光基線的問題，增加了探針的特異性，但直接首尾端的互補，并沒有杜絕引物和探 針的聚合現(xiàn)象（孔德明等，2003,化學(xué)學(xué)報，755-759)。為了消除或減少引物與探針結(jié)合、延 伸的非特異性擴增干擾，本發(fā)明"一種解鏈?zhǔn)剿馓结槍崟r熒光PCR"整合了 5'端TaqMan 探針的熒光標(biāo)記和結(jié)合探針中部序列的3'端分子信標(biāo)Molecular Beacon標(biāo)記淬滅基團的 技術(shù)路線，并對其結(jié)構(gòu)進行調(diào)整，使探針分子之間相互結(jié)合，從而消除或減少與引物聚合的 非特異性問題。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0009] 為了克服標(biāo)記探針與引物對間形成聚合體造成的TaqMan實時熒光PCR的非特異 性干擾靶擴增，以及引物非特異性竟?fàn)幗Y(jié)合導(dǎo)致弱陽性標(biāo)本容易漏檢的局限。本發(fā)明"一 種解鏈?zhǔn)剿馓结槍崟r熒光PCR"，其綜合了水解熒光探針TaqMan和分子信標(biāo)Molecular Beacon的原理技術(shù)，并對其結(jié)構(gòu)進行調(diào)整，探針5'端具有與水解熒光探針TaqMan的相同 作用機理，利用Taq酶5' -3'外切酶活性水解與靶序列雜交的探針而切割釋放報告熒光基 團；探針3'端靶序列外添加5~8個與離5'端3~14個后面的中部序列反向互補的堿 基再標(biāo)記淬滅熒光基團。由于環(huán)狀結(jié)合部分較短雜交使自身較難形成鍋柄樣結(jié)構(gòu)，但兩探 針兩段結(jié)合力大而很容易互補結(jié)合，這樣不僅加強抑制本底熒光，也規(guī)避了探針與過量引 物間形成非特異性雜交延伸的聚合體，兼容了 Molecular beacon本底低和TaqMan靈敏、 特異的優(yōu)點，從而消除