一種dna探針組合和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種DNA探針組合和包括該DNA探針組 合的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]微小RNA(miRNA)是一類小分子調(diào)控RNA，在腫瘤的發(fā)生與控制方面發(fā)揮著重要的 作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者的循環(huán)核酸中存在源自腫瘤的miRNA分子，這一現(xiàn)象提示循環(huán) miRNA分子可能成為無(wú)創(chuàng)診斷癌癥的一個(gè)有效的方法。研究表明miR-21，miR-145，miR-222， miR-223，miR-29a，miR-10b在肝癌腫瘤患者血清中明顯過(guò)度表達(dá)，是評(píng)估療效的潛在生物 標(biāo)志物。miR-16的表達(dá)穩(wěn)定，可作為內(nèi)參。
[0003]目前已有的血清中miRNA的檢測(cè)方法主要是實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)，所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒 光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
[0004] 但是這個(gè)方法需要先對(duì)miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并且RT-PCR的過(guò)程需要完成高溫變性， 低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)。操作繁瑣，并且需要使用大型昂貴的儀器。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種DNA探針組合和包括該DNA探 針組合的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明的發(fā)明人擬利用RCA技術(shù)對(duì)血清中miRNA進(jìn)行檢測(cè)，DNA滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)技術(shù) 是一種等溫信號(hào)擴(kuò)增方法，可在室溫下進(jìn)行，使用兩個(gè)引物就可實(shí)現(xiàn)指數(shù)滾環(huán)擴(kuò)增，可用于 極微量生物標(biāo)記物的檢測(cè)。RCA能直接擴(kuò)增DNA或者RNA分子，所以將其用于血清中miRNA的 檢測(cè)具有快速、靈敏、特異的特點(diǎn)。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)如果只對(duì)某一特定的miRNA表達(dá)量進(jìn)行 分析，很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。
[0007] 基于此，本發(fā)明提供一種DNA探針組合，該DNA探針組合包括：
[0008] (1 )miR-223探針，所述miR-223探針為40-80nt的通過(guò)以下DNA序列5 '端和3 '端連 接而成的環(huán)狀DNA模板：
[0009] 5'-GACAAACTGACA(SEQ ID N0:l)XiTGGGGTATTT-3(SEQ ID Ν0:2)'，Χι為任意序列 的DNA片段；
[0010] 和（2)miR-16探針，所述miR-16探針為40-80nt的通過(guò)以下DNA序列5'端和3'端連 接而成的環(huán)狀DNA模板：
[0011] 5'-TACGTGCTGCTA(SEQ ID N0:3)X2CGCCAATATT(SEQ ID N0:4)-3'，X2為任意序列 的DNA片段；
[0012] 以及以下探針中的至少兩種：
[0013] (3)miR-21探針，所述miR-21探針為40-80nt的通過(guò)以下DNA序列5'端和3'端連接 而成的環(huán)狀DNA模板：
[0014] 5'-TGATAAGCTA(SEQIDN0:5)X3TCAACATCAGTC(SEQIDN0:6)-3'，X3為任意序列 的DNA片段；
[0015] (4)miR-29a探針，所述miR-29a探針為40-80nt的通過(guò)以下DNA序列5'端和3'端連 接而成的環(huán)狀DNA模板：
[0016] 5'-AGATGGTGCTA(SEQIDN0:7)X4TAACCGATTTC(SEQIDN0:8)-3'，X4為任意序列 的DNA片段；
[0017] (5)miR-222探針，所述miR-222探針為40-80nt的通過(guò)以下DNA序列5'端和3'端連 接而成的環(huán)狀DNA模板：
[0018] 5'-CAGATGTAGCT(SEQIDN0:9)X5ACCCAGTAGC(SEQIDN0:10)-3'，X5為任意序列 的DNA片段；
[0019] (6)miR-145探針，所述miR-145探針為40-80nt的的通過(guò)以下DNA序列5'端和3'端 連接而成的環(huán)狀DNA模板：
[0020] 5'-GGAAAACTGGAC(SEQIDN0:11)X6AGGGATTCCTG(SEQIDN0:12)-3'，X6為任意序 列的DNA片段；
[0021] (7)miR-10b探針，所述miR-10b探針為40-80nt的通過(guò)以下DNA序列5'端和3'端連 接而成的環(huán)狀DNA模板：
[0022] 5'-TTCTACAGGGTA(SEQIDN0:13)X7CACAAATTCGG(SEQIDN0:14)-3'，X7為任意序 列的DNA片段。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，各探針長(zhǎng)度為50_70nt。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明，各個(gè)探針中的任意序列可以為具有隨機(jī)任意組合的一段DNA。

[0039] 理論上，用于檢測(cè)的DNA探針數(shù)目越多，得到的結(jié)果的可靠性越高，但是基于簡(jiǎn)便 性的要求，所述DNA探針組合中的DNA探針數(shù)目至少為4個(gè)即可。
[0040] 本發(fā)明的上述DNA探針均為針對(duì)肝癌miRNA序列而設(shè)計(jì)。
[0041] 本發(fā)明還提供一種試劑盒，該試劑盒包括以下組分：
[0042] (1)上述的DNA探針組合；
[0043] (2)RCA指數(shù)擴(kuò)增引物；
[0044] (3)DNA聚合酶；
[0045] (4)dNTP；
[0046] (5)RCA反應(yīng)液；
[0047] (6)DNA熒光染料；
[0048]其中，所述DNA探針組合中的各個(gè)DNA探針以相互獨(dú)立的形式提供。
[0049] 本發(fā)明中，所述"各個(gè)DNA探針以相互獨(dú)立的形式提供"的含義是指各個(gè)DNA探針不 混合在一起，并不排除每個(gè)DNA探針與其他組分混合在一起的情形。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒包括的上述組分可以全部單獨(dú)提供，也可以部分組合提 供，例如，每個(gè)探針可以與用于RCA指數(shù)擴(kuò)增的引物、dNTP和RCA反應(yīng)液共同以檢測(cè)溶液的形 式提供，根據(jù)本發(fā)明，所述檢測(cè)溶液的數(shù)目與所述DNA探針組合中DNA探針的數(shù)目相同。
[0051] 本發(fā)明的檢測(cè)原理如下：針對(duì)待檢測(cè)的miRNA，分別設(shè)計(jì)了可以特異性與目標(biāo) miRNA結(jié)合的DNA環(huán)狀模板，以及用于RCA指數(shù)擴(kuò)增的引物。miRNA結(jié)合到環(huán)狀DNA上后，在DNA 聚合酶的作用下被延伸，產(chǎn)物是具有大量重復(fù)序列（與環(huán)狀DNA完全互補(bǔ)）的線狀單鏈DNA。 用于RCA指數(shù)擴(kuò)增的引物是一條與環(huán)狀DNA的一段序列完全一致的引物（10-20個(gè)堿基），該 引物與第一次線性RCA產(chǎn)物結(jié)合并酶促延伸，置換下游雜交到擴(kuò)增產(chǎn)物上的其它拷貝段的 引物，其產(chǎn)物又可作為與環(huán)狀DNA模板互補(bǔ)的引物。這樣在很短的時(shí)間內(nèi)，產(chǎn)物呈指數(shù)擴(kuò)增。 [0052]最后將可以嵌入雙鏈DNA的熒光染料加入擴(kuò)增體系中，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱對(duì)比 來(lái)判斷血清中miRNA的含量高低。
[0053] 本發(fā)明中，所述RCA是指滾環(huán)擴(kuò)增(rollingcircleamplification，RCA)，該術(shù)語(yǔ) 的含義和技術(shù)步驟為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。
[0054]根據(jù)本發(fā)明，所述DNA探針組合中每個(gè)探針的量為0.1-lnmol;形成的所述檢測(cè)溶 液中，每個(gè)DNA探針的濃度為ΙΟΟ-ΙΟΟΟηΜ即可滿足檢測(cè)要求，進(jìn)一步優(yōu)選為200-600nM。
[0055] 本發(fā)明中的所述DNA聚合酶優(yōu)選為Phi29DNA聚合酶。
[0056]根據(jù)本發(fā)明，所述DNA熒光染料的作用是對(duì)DNA進(jìn)行快速檢測(cè)，因此，可實(shí)現(xiàn)該目的 的DNA熒光染料皆可用于本發(fā)明。優(yōu)選地，所述DNA熒光染料為SybrGreenDNA染料。該染料 可通過(guò)商購(gòu)獲得。
[0057]根據(jù)本發(fā)明，所述RCA反應(yīng)液可以為商購(gòu)DNA聚合酶時(shí)所帶的反應(yīng)緩沖液，也可以 為根據(jù)該反應(yīng)原理配置而成的反應(yīng)液。
[0058]根據(jù)本發(fā)明的原理，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)合適的RCA指數(shù)擴(kuò)增引物，如上所 述，所述RCA指數(shù)擴(kuò)增引物是一條與環(huán)狀DNA的一段序列完全一致的引物，通常為10-20個(gè)堿 基。根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施方式，每條探針序列都有一段共有的序列，可基于該序列設(shè)計(jì) RCA指數(shù)擴(kuò)增引物，例如，可以為5 ' -ATCAAAGCCCATACTACA-3 '（SEQIDNO: 22)。
[0059] 本發(fā)明的試劑盒可以實(shí)現(xiàn)肝癌的早期測(cè)定，操作簡(jiǎn)便，成本低。指數(shù)擴(kuò)增的RCA反 應(yīng)靈敏度高，特異性好。多個(gè)生物標(biāo)記物miRNA的同時(shí)