專利名稱：一種用于檢測抗膜突蛋白抗體的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測抗膜突蛋白抗體的試劑盒。
背景技術(shù)：
自身免疫病(autoimmune diseases,AID)是以自身免疫應答反應導致組織器官損 傷和相應功能障礙為主要發(fā)病機制的一類疾病。自身免疫疾病有器官特異性和非器官特異 性兩大類。而彌漫性結(jié)締組織病，簡稱結(jié)締組織病(connective tissue disease, CTD)屬 于非器官特異性自身免疫病。該類疾病往往具有下列共同特點患者血液中常常出現(xiàn)高滴 度的自身抗體和(或)與自身組織成分起反應的致敏淋巴細胞；而患者體內(nèi)產(chǎn)生的自身抗 體或致敏淋巴細胞，與相應的自身組織抗原結(jié)合，通過不同的方式造成組織器官的免疫損 傷和功能障礙而致病。同時往往自身免疫應答反應的強度與自身免疫病的病情密切相關(guān)。 因而，結(jié)締組織病自身抗體反應的特異性和致病性顯示其在對該疾病的診斷分類、病情評 估、以及判斷預后中的價值。肺臟受累是結(jié)締組織病常見的并發(fā)癥之一，幾乎所有CTD均有肺臟受累，并且可 能為CTD的首發(fā)癥狀。該類并發(fā)癥起病隱匿，早期診斷困難，并且往往治療效果不佳，是 導致CTD患者死亡的重要原因之一。但是，目前臨床中常用的自身抗體檢測指標均不能 夠提示CTD相關(guān)肺臟受累，并且臨床上沒有一項血清學指標用于診斷結(jié)締組織病相關(guān)肺 臟受累。其中以肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)和間質(zhì)性肺病 (interstitial lungdisease, ILD)為甚，目前已經(jīng)成為風濕免疫科和呼吸內(nèi)科醫(yī)師面臨的 一大難題。CTD肺臟受累(主要包括PAH和ILD)的病因未明，但是血管炎癥是其免疫病理 機制之一。許多研究表明，白細胞，內(nèi)皮細胞和細胞外基質(zhì)的相互作用在免疫系統(tǒng)的功能 中發(fā)揮重要作用。這些相互作用對于CTD相關(guān)肺臟損傷同樣重要，其中抗內(nèi)皮細胞的自 身抗體(Anti-endothelial cell antibodies, AECA)也參與血管損傷。有研究發(fā)現(xiàn)在系 統(tǒng)性硬化癥中AECA與血沉增快、肺動脈高壓、肺纖維化、乃至肺泡-毛細血管受損密切相 關(guān)(參見 SavageCOS, Pottinger BE. Vascular damage in Wegener' s granulomatosis and microscopic polyarteritispresence of anti-endothelial cell antibodies and their relation to anti-neutrophil cytoplasmanti-bodies. Clin Exp Immunol 1991 ； 85 14-19)。近年來一些研究發(fā)現(xiàn)，AECA與CTD相關(guān)的PAH有較為密切的關(guān)系，應用ELISA 法石if 究 SSc (systemic scleroderma,系統(tǒng)性硬皮病)、MCTD (mixed connective tissue disease,混合性結(jié)締組織病)及SLE (Systemic LupusErythematosus,系統(tǒng)性紅斑狼瘡) 患者，發(fā)現(xiàn)合并PAH組AECA陽性率明顯高于無PAH組，已有研究應用免疫印跡法發(fā)現(xiàn)SSc 患者AECA-75KD條帶出現(xiàn)的頻率較高，但由于AECA識別的抗原是分子量范圍廣泛的一組 蛋白質(zhì)，在探討其致病機制方面存在很大困難。本發(fā)明者以EA. hy926細胞為底物，通過細 胞-ELISA法和免疫印跡法檢測患者血清AECA，結(jié)果顯示CTD患者AECA陽性率明顯高于 IPAH患者、COPD患者，但在CTD患者各不同組之間無明顯差異。通過應用SDS-PAGE、雙向電泳、免疫印跡、質(zhì)譜分析等一系列方法鑒定得到CTD相關(guān)PAH患者的靶抗原(78KD內(nèi)皮細 胞蛋白質(zhì))成分為膜突蛋白(membrane—organizing extension spike protein,moesin)； 并利用免疫組化方法在人肺微血管內(nèi)皮細胞水平進行證實。膜突蛋白是1988年在牛的子宮平滑肌細胞中被首次發(fā)現(xiàn)的，理論分子量為68KD， 實際分子量為78KD，等電點6. 08，由577個氨基酸殘基組成，在細胞中以休眠和激活兩種狀 態(tài)存在，第558位蘇氨酸殘基(T)磷酸化被認為是其激活的方式。1991年Lankes WT等提出 膜突蛋白與細胞膜下根蛋白_埃茲蛋白共同構(gòu)成了 ERM蛋白家族(ezrin/radixin/moesin， 埃茲蛋白 / 根蛋白 / 膜突蛋白)(參見 Lankes WT, FurthmayrH. Moesin :amember of the protein 4. 1-talin-ezrin family ofproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 1991,88(19) 8297-301.)。膜突蛋白通過介導細胞質(zhì)膜與肌動蛋白細胞骨架的連接，在細胞的生長、運 動、遷移、有絲分裂以及信號轉(zhuǎn)導等方面發(fā)揮重要作用(參見Polesello C5Payre F. Small is beautiful :what flies tellus about ERM protein function in development. Trends Cell Biol，2004，14 :294-302.)。ERM蛋白可通過調(diào)節(jié)細胞皮質(zhì)層肌動蛋白的重新分布、參 與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑等作用，參與自身免疫病的發(fā)生、發(fā)展過程?？笶RM抗體與自身免疫病相關(guān)，一項關(guān)于類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)的研究發(fā)現(xiàn)，患者的 血清中存在抗ERM蛋白抗體，通過重組蛋白、原核表達，對71份RA血清檢測，發(fā)現(xiàn)12例 (17%)，11例(15%)，10例(14%)分別有抗H重組的)-埃茲蛋白，r-根蛋白和r-膜突 蛋白抗體?？箁-ERM的檢出率要低于RA33抗體(36%)和抗Sa的檢出率。在這項試驗中， 原發(fā)性干燥綜合征和SLE患者未發(fā)現(xiàn)抗ERM抗體陽性，正常人有一例陽性。RA患者中抗ERM 抗體的陽性情況與類風濕因子和抗核抗體無關(guān)(參見Wagatsuma M，Kimura M，Suzuki R， et al. Ezrin,radixin and moesin are possible auto-immune antigens in rheumatoid arthritis. Mol Immunol. 1996,33(15) :1171_1176.)。該項研究并未進一步探討抗膜突蛋 白(membrane—organizing extension spikeprotein，moesin)抗體在 RA 的發(fā)病機制，以及 RA相關(guān)肺臟損傷的發(fā)病機制中的作用，同時也未涉及抗moesin抗體在RA的早期診斷，判斷 預后方面的作用，并且至今，國內(nèi)外均無文獻報告相關(guān)內(nèi)容。Takamatsu 等在 2007 年(參見 Takamatsu H, Feng X，Chuhjo T, et al. Specific antibodiesto moesin, a membrane-cytoskeleton linker protein, are frequently detected in patients withacquired aplastic anemia. Blood,2007,109 :2514_2520.) 研究發(fā)現(xiàn)部分再生障礙性貧血患者存在抗膜突蛋白抗體，并認為這類再生障礙性貧血和 CTD存在相似的病理機制即某種因素破壞了機體對膜突蛋白的免疫耐受，導致特異性抗 膜突蛋白抗體的產(chǎn)生，進一步介導了造血細胞的損傷(參見Takamatsu H，Espinoza幾，Lu XZ, et al.Anti-moesin antibodies in theserum of patients with aplastic anemia stimulate peripheral blood mononuclear cells to secreteTNF— α and IFN- γ. J Immunol, 2009,182 :703-710. M Graham AiFord LMorrison R，et al. Anti-endothelial antibodies interfere in apoptotic cell clearance and promote thrombosis in patientswith antiphospholipid syndrome. J Immuno，2009，182 :1756_1762·)。大部分結(jié)締組織病的特點是有較為特異的自身抗體，是一組病因復雜的疾病，其 基礎(chǔ)疾病的不同，治療時機的差異對預后有重要影響。CTD相關(guān)PAH在臨床表現(xiàn)隱匿，CTD患 者篩查PAH的主要方法是超聲心動圖，由于缺乏敏感的實驗室診斷指標和病情監(jiān)測指標，很多患者在發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，錯過了最佳治療時機。一些研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞形態(tài)和行 為異常是CTD相關(guān)PAH的重要始動環(huán)節(jié)，而AECA是可以與血管內(nèi)皮細胞上多種蛋白質(zhì)成分 相結(jié)合的自身抗體，具有潛在的致病作用。抗內(nèi)皮細胞抗體(AECA)是70年代初在腎活檢 標本中發(fā)現(xiàn)的自身抗體，為血管受損和血管炎的標記，可以與內(nèi)皮細胞上多種成分相結(jié)合， 具有潛在的致病性；與一些自身免疫病的臨床表現(xiàn)、病情活動、預后有很大的相關(guān)性。AECA 是一組抗體的總稱，其抗原是位于內(nèi)皮細胞膜或細胞漿的多種成分，在很多CTD中都有較 高的檢出率，目前常用的檢測方法為細胞-ELISA法和免疫印跡法。在SLE中的檢出率可 達40 50%，且與肺動脈高壓、雷諾現(xiàn)象、漿膜炎等聯(lián)系密切；在SSc的檢出率可達40 54%;在炎性肌病的早期也可檢測到。一些研究用免疫印跡法檢測，發(fā)現(xiàn)不同結(jié)締組織病的 陽性條帶不同，如125KD可能對韋格納肉芽腫(WG)比較特異，而200KD對SLE患者更加特 異，在SSc中則以90KD的抗原最常見。另外，同一種疾病中某個特定的條帶可能與特定的 癥狀有關(guān)，如SLE中狼瘡腎炎、低補體血癥與抗60KD條帶抗體有關(guān)，血小板減少癥與抗55KD 有關(guān)，胸膜炎與抗18KD有關(guān)。近年來一些研究發(fā)現(xiàn)，AECA與CTD相關(guān)的PAH有相關(guān)性，用細胞酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)研究SSc、MCTD及SLE患者，發(fā)現(xiàn)合并PAH患者的AECA滴度明顯高于無PAH組，但 由于AECA識別的抗原是分子量范圍廣泛的一組蛋白質(zhì)，細胞-ELISA方法無法識別特定的 蛋白質(zhì)組份，在探討其致病機制方面存在很大困難。2005年Tamby等應用免疫印跡法對肺 動脈高壓的患者的AECA做了分子量定位，發(fā)現(xiàn)SSc患者靶抗原為75KD的AECA陽性率較 高，而IPAH組沒有出現(xiàn)，但SSc患者中是否伴有PAH之間沒有顯著差異。基于目前的研究 背景，研究者采用細胞ELISA和免疫印跡法檢測CTD相關(guān)PAH患者血清中AECA的陽性率， 研究AECA與PAH的關(guān)系，為探討AECA的致病機制及臨床應用提供依據(jù)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在健康人群、腫瘤患者、以及不同自身免疫疾病患者的外周血中，CTD 患者的抗moesin抗體的滴度顯著增高，并與合并肺臟受累顯著相關(guān)，提示抗moesin抗體是 參與CTD相關(guān)肺臟損傷的重要免疫致病因子。因此抗moesin抗體可以作為CTD相關(guān)肺臟 受累早期診斷及預后的特異性指標。目前，國際上尚無膜突蛋白及其抗體參與CTD相關(guān)肺 臟受累發(fā)病機制的研究。結(jié)合CTD相關(guān)肺臟受累具有自身免疫性炎癥和血管病變的特點， 必然存在共同的自身免疫機制導致肺微血管內(nèi)皮細胞損傷的過程。因此，需要一種快速有 效檢測抗膜突蛋白抗體的方法，用于對CTD相關(guān)肺臟受累進行早期預測，病情評估和預后 判斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種用于檢測抗膜突蛋白抗體的試劑
品.O本發(fā)明第一方面提供了一種用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測板，所述的檢測板包 括固相載體和包被于所述固相載體的膜突蛋白抗原蛋白，所述膜突蛋白抗原蛋白為全長 人膜突蛋白。所述抗膜突蛋白抗體為IgG型抗體。優(yōu)選的，所述固相載體為酶標反應板。本發(fā)明第二方面，提供了所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測板的制備方法，包括如下步驟a)包被用包被緩沖液稀釋膜突蛋白抗原蛋白，然后將該抗原蛋白溶液加入到固 相載體上進行包被，包被完畢后洗滌并干燥；b)封閉加入封閉液后進行封閉，封閉完畢后洗滌并干燥；c)制板以室溫20°C 25°C真空干燥2小時，干燥過程中的壓強不超 過-0. 094Mpa ；然后進行真空密封，2 °C 8°C儲存。優(yōu)選的，所述步驟a)中的包被緩沖液為PBS溶液。優(yōu)選的，所述步驟a)中的抗原蛋白溶液的濃度為2 5μ g/ml。優(yōu)選的，所述步驟a)中的包被在2°C 8°C的溫度下進行12 16小時。優(yōu)選的，所述步驟b)中封閉液為IOmM PBS溶液，pH7. 0 pH7. 4，其中含有質(zhì)量百 分比為5 10%的山羊血清以及質(zhì)量百分比為10%的蔗糖。優(yōu)選的，所述步驟b)中的封閉在37°C的溫度下進行2h。本發(fā)明第三方面提供了一種用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測試劑盒，所述的檢測 試劑盒含有上述檢測板，或者分別包裝的固相載體和膜突蛋白抗原蛋白，所述膜突蛋白抗 原蛋白為全長人膜突蛋白。所述試劑盒中還包括標記抗體，該標記抗體上標記有能產(chǎn)生檢測信號的物質(zhì)，且 能夠與抗膜突蛋白抗體相結(jié)合。優(yōu)選的，所述能產(chǎn)生檢測信號的物質(zhì)選自過氧化物酶、半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。更優(yōu)選的，所述標記抗體為辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗人IgG抗體。在該用于檢測抗膜突蛋白抗體的試劑盒中，所述固相載體、膜突蛋白抗原蛋白和 標記抗體分別獨立包裝，且膜突蛋白抗原蛋白和標記抗體均為混懸液。所述膜突蛋白抗原蛋白和標記抗體混懸液的溶劑可以是常規(guī)的適合抗原抗體反 應的溶劑體系，如=HEPES緩沖液體系，Tris緩沖液體系等。其中，膜突蛋白抗原蛋白混懸液 的溶劑優(yōu)選=Tris緩沖液、PBS+1% BSA, PBS+1% BSA+50%甘油；標記抗體混懸液的溶劑優(yōu) 選為商品化抗體稀釋液，如Guardian Peroxidase Conjugate Stabilizer/Diluent。上 述各種溶劑中還可添加起封閉和蛋白保護作用的物質(zhì)如BSA以及防止微粒聚集的穩(wěn)定試 劑如Tween20，出于對試劑防腐以及長期儲存的考慮還可在溶劑中添加防腐劑，防腐劑可選 疊氮鈉、硫柳汞，優(yōu)選為疊氮鈉。優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括與能產(chǎn)生檢測信號的物質(zhì)相對應的顯色液。更優(yōu)選的，所述顯色液包括顯色劑A和顯色劑B，其中，顯色劑A的組成為檸 檬酸· Η209· 33g/L、Na2HPO4. 12H20 36. 8g/L和過氧化脲0. 2g/L ；顯色劑B的組成為檸檬 酸.H2O 2. lg/L、TMB 0. 2g/L、EDTA-Na2O. 3g/L、無水乙醇 46. 5ml/L 和丙酮 3. 5ml/L，顯色劑 A和顯色劑B的溶劑均為水。用于檢測抗膜突蛋白抗體時，上述試劑盒中還可包括陽性對照、陰性對照，以及參 考樣品，上述參考樣品為含有確定濃度抗膜突蛋白抗體的溶液。上述陽性對照、陰性對照， 以及參考樣品分別獨立包裝。含有確定濃度抗膜突蛋白抗體的溶液中抗膜突蛋白抗體的濃 度為抗膜突蛋白抗體臨床參考臨界值(cutoff·值)對應的濃度。優(yōu)選的，所述試劑盒中還可包括包被緩沖液、樣品緩沖液、封閉液、洗滌緩沖液和終止液中的一種或多種。優(yōu)選的，所述包被緩沖液為PBS緩沖液。優(yōu)選的，所述樣品緩沖液為磷酸鹽緩沖液_吐溫溶液(PBST)，以pH7. 0 7. 4為 宜，其中含有質(zhì)量百分比為0. 5 2%的牛血清白蛋白(BSA)。優(yōu)選的，所述封閉液為IOmM的PBS溶液，以pH7. 3 7. 4為宜，其中含有質(zhì)量百分 比為8 10%的山羊血清以及質(zhì)量百分比為10%的蔗糖。優(yōu)選的，所述洗滌緩沖液為磷酸鹽緩沖液-吐溫溶液(PBST)。優(yōu)選的，所述終止液為濃度為2M的H2SO4溶液。本發(fā)明第四方面提供了所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測試劑盒的使用方法， 包括如下步驟①、抗原抗體反應將膜突蛋白抗原蛋白包被在固相載體上，然后在固相載體的微 孔內(nèi)分別加入待測樣品；②、酶聯(lián)反應將標記抗體溶液加入各孔，振蕩、孵育；然后洗滌；在每個微孔中加 入對應于能產(chǎn)生檢測信號的物質(zhì)的底物和顯色劑，避光孵育，在每個微孔加入終止液，終止 反應；③、測定光吸收值(OD)。優(yōu)選的，所述步驟①中的待測樣品選自血液、血清和血漿，更優(yōu)選的，所述待測樣 品在使用前需要用樣品稀釋液按1 100的比例稀釋。優(yōu)選的，所述步驟①中，每個微孔中待測樣品的加樣量為100μ 1。優(yōu)選的，所述步驟②中的標記抗體的稀釋度為1 15000 40000，更優(yōu)選為 1 20000。優(yōu)選的，所述步驟②中，每個微孔中標記抗體的加樣量為100μ 1。優(yōu)選的，所述步驟②中的所述孵育在20°C 25°C的溫度下進行0. 5h ；所述步驟③ 中的所述孵育在20°C 25°C的溫度下進行15 30min。優(yōu)選的，所述步驟④中的所述測定光吸收值時，主波長為450nm，參考波長為 620 650nm。優(yōu)選的，所述步驟④中還包括根據(jù)含有確定濃度抗膜突蛋白抗體的參考樣品計算 待測樣品中抗膜突蛋白抗體的濃度，并判斷是否達到臨床參考臨界值(cutoff值)。本發(fā)明第五方面提供了一種檢測抗膜突蛋白抗體的方法，包括如下步驟(a)將待測樣品加樣于包被有膜突蛋白抗原蛋白的固相載體，從而使待測樣品中 的抗膜突蛋白抗體與固相載體上的膜突蛋白抗原蛋白結(jié)合，形成“抗膜突蛋白抗體-膜突 蛋白抗原蛋白”二元復合物；所述膜突蛋白抗原蛋白為全長人膜突蛋白；(b)將標記抗體加樣于步驟a)中獲得的二元復合物，形成“標記抗體_抗膜突蛋 白抗體-膜突蛋白抗原蛋白”三元復合物；所述標記抗體為標記有檢測信號產(chǎn)生工具，且能 夠與抗膜突蛋白抗體相結(jié)合的抗體；(c)通過使用與檢測信號相匹配的檢測工具對三元復合物產(chǎn)生的信號進行檢測， 從而確定待測樣品中抗膜突蛋白抗體的含量及是否達到臨床參考臨界值(cutoff值)。本發(fā)明提供了一種由用于締組織病相關(guān)肺臟受累早期診斷的血清學特異性抗原 膜突蛋白抗原蛋白制成的試劑盒，該蛋白可以特異性的識別締組織病相關(guān)肺臟受累患者外周血中的特異性抗體——抗膜突蛋白抗體，該抗體可通過一些較為簡便的免疫學檢測方法 (如酶聯(lián)免疫吸附法)檢測出來。同現(xiàn)有的細胞ELISA法和免疫印跡法檢測相關(guān)抗體比較 具有很高的敏感性和特異性，并且該法適合臨床各級實驗室常規(guī)開展，實現(xiàn)高通量檢測，檢 測結(jié)果重復性好且易于標準化。能夠達到通過血清學方法診斷結(jié)締組織病相關(guān)肺臟受累的 疾病的目的，為結(jié)締組織病相關(guān)肺臟受累的疾病的臨床診斷提供客觀依據(jù)。本發(fā)明的用于 檢測抗膜突蛋白抗體的檢測試劑盒可以應用于對CTD相關(guān)肺臟受累進行早期預測和病情 評估的方法，主要通過采集受試者的生物樣本，并檢測該生物樣本中抗膜突蛋白抗體的量， 從而進行評估。本發(fā)明利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)和基因重組技術(shù)制備膜突蛋白抗原蛋白，提供 一種用于檢測抗膜突蛋白抗體的ELISA檢測試劑盒，該試劑盒對于CTD相關(guān)肺臟受累的檢 出率可達51. 7%。


圖1不同患者AECA免疫印跡結(jié)果。圖2AECA-EA-78胰蛋白酶酶解后的質(zhì)譜總離子流圖。圖3膜突蛋白(Moesin)的氨基酸組成及質(zhì)譜分析可匹配的氨基酸序列(加粗且 下劃線標記為可匹配的氨基酸序列)圖4HPMEC膜成分為底物驗證(ECL顯色)。圖5膜突蛋白在HPMEC的分布(X 1000倍)。圖 6pET32a(+)圖譜。圖 7pET28a(+)圖譜。圖8重組質(zhì)粒pET32a-moesin的酶切鑒定電泳圖。圖9純化的pET32a-moesin的電泳結(jié)果。圖10pET28a-mOSein純化圖；其中左圖為一次上樣后的電泳圖譜；右圖為二次上 樣后的電泳圖譜。圖11不同CTD疾病抗moesin抗體OD均值比較示意圖。圖12不同肺臟受累CTD患者膜突蛋白抗體滴度示意圖。圖13免疫組化技術(shù)檢測抗moesin抗體結(jié)果。
具體實施例方式實施例ICTD相關(guān)PAH的AECA主要靶抗原moesin的確定第一步CTD相關(guān)PAH患者的AECA檢測通過細胞-ELISA法和免疫印跡法檢測CTD相關(guān)PAH患者中抗內(nèi)皮細胞抗體的陽 性率，分析AECA與CTD相關(guān)PAH特異性及疾病臨床活動指標的關(guān)系。1.研究對象與方法1. 1研究對象研究對象為2006年1月至2007年5月在北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科門診、病房診 治的結(jié)締組織病相關(guān)肺動脈高壓患者，實驗組選取68例CTD相關(guān)PAH(CTD-PAH)患者(只 合并肺動脈高壓而無肺間質(zhì)、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等內(nèi)臟受累的患者)，對照組為12例特發(fā)性肺 動脈高壓(IPAH)患者、61例CTD無PAH的患者，其中CTD單純合并腎小球病變(CTD-GN)患者21例、單純合并間質(zhì)性肺炎患者(CTD-ILD) 20例、無內(nèi)臟受累患者20例、慢性阻塞性肺 疾病相關(guān)肺動脈高壓(COPD-PAH)患者20例及健康對照20名。不同CTD患者均為符合相 應的臨床診斷或分類標準的確診患者，入選患者的抗磷脂抗體均為陰性。收集患者臨床、實 驗室資料，采集血清-20°C保存?zhèn)溆?。每位患者用免疫熒光法檢測抗核抗體，用免疫雙擴散 法和免疫印跡法檢測抗可提取性核抗原(ENA)抗體，包括抗Ul核糖體核蛋白(RNP)抗體和 抗Ro(SSA)抗體。同時，還包括MCTD (mixed connective tissuedisease，混合性結(jié)締組織 病)和 UCTD (undifferentiated connective tissue disease，未分化結(jié)締組織病)患者兩 組?；颊咔闆r具體如表1及表2所示。表1 :68例CTD-PAH患者基本情況 表2 不同組別病例基本情況 1.2.實驗方法1. 2. 1利用EA. hy926細胞株(EA. hy926細胞株是1983年Edgell CJ將人臍靜脈 內(nèi)皮細胞(HUVEC)與人肺癌細胞株A549融合而來。)通過細胞-ELISA法檢測抗內(nèi)皮細胞 抗體。1. 2. 2利用EA. hy926細胞株，通過免疫印跡法檢測抗內(nèi)皮細胞抗體(AECA)提取 內(nèi)皮細胞膜及漿蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜后檢測AECA陽性條帶。1.3實驗結(jié)果1. 3. 1細胞-ELISA方法檢測AECA結(jié)果本項實驗結(jié)果顯示CTD患者AECA陽性率明顯高于非CTD患者，但CTD患者各組 之間無顯著性差異；CTD相關(guān)PAH患者AECA的陽性率明顯高于IPAH患者和COPD合并PAH的患者，差異有顯著性(如表3所示)。表3 不同組別患者Cyto-ELISA檢測AECA結(jié)果 與CTD-PAH 比較，**P < 0. 01。1. 3. 2免疫印跡法檢測AECA的結(jié)果免疫印跡法檢測初篩結(jié)果顯示，大部分CTD-PAH的患者有共同的AECA條帶，即 78KD條帶(參見圖1)。如圖所示，大部分CTD-PAH的患者有共同的AECA條帶，即78KD條 帶。進一步將實驗組和對照組比對發(fā)現(xiàn)，AECA-78KD條帶的陽性率在CTD合并PAH患者明 顯高于特發(fā)性肺動脈高壓患者、結(jié)締組織病無內(nèi)臟受累患者、COPD合并PAH患者和正常對 照組(P < 0. 05或P < 0. 01)，AECA-78KD條帶的陽性率分別為結(jié)締組織病合并肺動脈高 壓患者為79. 4% (54/68)，結(jié)締組織病合并腎小球病變的患者71. 4% (15/21)，特發(fā)性肺動 脈高壓患者8. 3% (1/12)、結(jié)締組織病無內(nèi)臟受累患者50. 0% (10/20)(如表4所示)。表4 實驗組及對照組中AECA-78KD的陽性率 注與CTD-PAH 比較，*P < 0. 05 **P < 0. 01 ；與CTD-GN 比較，#P < 0. 05##P < 0. 011. 3. 3AECA與疾病臨床特征及病情活動性的關(guān)系1)有無雷諾現(xiàn)象有雷諾現(xiàn)象的患者的血清AECA-78KD檢出率明顯高于無雷諾現(xiàn)象的患者，差異有顯著性(P < 0. 01)?？筓lRNP抗體和抗SSA抗體是否陽性與AECA-78KD 的檢出率無明顯關(guān)系。2)AECA-78KD與CTD患者炎性指標的關(guān)系A(chǔ)ECA_78KD的陽性情況與血沉、CRP、血 白細胞之間均無顯著相關(guān)性。因此實驗結(jié)果及臨床資料分析顯示，CTD患者的各組炎性指 標水平與78KD-AECA無明顯相關(guān)性。3)AECA-78KD與CTD病程及PAH病程之間的關(guān)系結(jié)果顯示CTD病程大于5年的 患者AECA-78KD陽性率明顯大于CTD病程小于5年的患者，差異有顯著性。而與PAH病程 無明顯相關(guān)性(如表5所示)。表5 =CTD患者AECA-78KD與臨床指標及病程的關(guān)系 1. 4 結(jié)論1.4. 1以EA.hy926細胞為底物，細胞ELISA法和免疫印跡法檢測AECA陽性情況顯 示CTD不同靶器官受累的患者AECA-78KD條帶的陽性率不同，合并PAH和腎小球病變的患 者明顯高于無內(nèi)臟受累的患者；1. 4. 2CTD有雷諾現(xiàn)象的患者AECA-78KD的陽性率明顯高于沒有雷諾現(xiàn)象的患者， CTD病程大于五年的患者AECA-78KD的陽性率明顯高于病程小于五年的患者。與患者的炎 性指標及抗U1RNP、SSA抗體之間無明顯相關(guān)性。
第二步證實抗內(nèi)皮細胞抗體_78Kd的靶抗原為moesin蛋白應用SDS-PAGE、雙向電泳、免疫印跡、質(zhì)譜分析技術(shù)，分離和鑒定CTD相關(guān)PAH患者 高頻率出現(xiàn)的AECA-78KD靶抗原。2.1材料與方法2. 1.1所用細胞人肺微血管內(nèi)皮細胞(原代HPMEC)購自Sciencell公司，入室后經(jīng)過 VffF(yonffillebrand factor)、八因子和CD31 (P-CMA)抗體檢測，均為陽性體現(xiàn)內(nèi)皮源性。人 肺微血管內(nèi)皮細胞111￥、冊￥、!1(^、支原體、細菌、酵母菌和真菌檢測均為陰性。2. 1.2實驗方法提取細胞膜蛋白，并進行樣品濃縮，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)與免疫 印跡。根據(jù)免疫印跡的陽性條帶以及Marker和參照條帶，定位凝膠上的目標蛋白條帶，取 出后進行上質(zhì)譜儀前樣本處理后，做質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索(送交天津生物芯片技術(shù)有限 責任公司)。2. 2試驗結(jié)果1)樣品將單向SDS-PAGE分離的78KD的AECA-EC條帶，標記為AECA-EA-78。2) AECA-EA-78 抗原的鑒定圖2為AECA-EA-78抗原由LC-ESI-IT-MS/MS分析質(zhì)量肽譜的總離子流圖。MS確 定了酶解所得到的每一肽段的分子量，選擇相對強度較強的肽段進行二級質(zhì)譜分析。對MS 檢測到的肽段，我們通過MS/MS測定了氨基酸序列。MS確定了酶解所得到的每一肽段的分 子量，如圖所示縱坐標為相對強度，橫坐標為質(zhì)荷比。Sequest檢索結(jié)果在檢索結(jié)果中選擇分子量、Xcorr、Delta Cn、Sp、Rsp及Icons 等參數(shù)比較符合的進行分析。選擇其中Moesin [Homo sapiens] [gi 16878176]來進行分 析，Moesin[Homo sapiens] [gi 16878176]鑒定分數(shù)為 139 分。Moesin [Homo sapiens] [gi 16878176]的理論分子量是68KD，等電點為6. 08，是ERM蛋白家族的成分，由577個氨基酸 組成。質(zhì)譜分析搜索到的肽段數(shù)為65個，可匹配的肽段為23個，序列覆蓋率為33%，氨基 酸序列參見SEQ ID NO :1ο2. 3 結(jié)論CTD相關(guān)PAH患者相對特異的AECA-78KD的相應抗原為moesin蛋白。第三步moesin在人肺微血管內(nèi)皮細胞膜表達的驗證本部分內(nèi)容主要為通過抗moesin單抗應用Western Blot驗證陽性條帶和陰性條 帶位置，以及抗moesin單抗作用于人肺微血管內(nèi)皮細胞驗證moesin表達。3.1材料和方法3. 1. 1標本來源培養(yǎng)的人肺微血管內(nèi)皮細胞(HPMEC)，本部分實驗選取第5代至 第7代的細胞。3. 1.2 方法Dffestern Blot驗證陽性條帶和陰性條帶位置方法同前，膜突蛋白單抗 1 5000稀釋，ECL顯色。2)免疫熒光形態(tài)學觀察moesin蛋白在HPMEC的分布。3. 2 結(jié)果
3. 2. Iffestern Blot法驗證陽性條帶和陰性條帶位置結(jié)果詳見圖4，圖4為HPMEC 膜成分為底物驗證(ECL顯色)，其中從左到右起，泳道1為Marker、泳道2_3為陽性血清、 泳道4為單抗、泳道5為陰性血請。HPMEC膜成分為底物驗證(ECL顯色)。3. 2. 2免疫熒光形態(tài)學觀察膜突蛋白在HPMEC的分布免疫熒光圖見圖5，由圖5 中可以看出熒光顯示為moesin，主要分布在細胞膜上。實施例1的實驗結(jié)果證明抗內(nèi)皮細胞抗體_78Kd的靶抗原為moesin蛋白，同時 moesin在人肺微血管內(nèi)皮細胞膜表達，可以確定CTD相關(guān)PAH的AECA主要靶抗原為moesin 蛋白。實施例2m0eSin蛋白基因克隆、原核表達與純化第一步膜突蛋白的基因重組1. 1重組蛋白moesin克隆模板的獲得從胃癌組織中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。1. 2根據(jù)genebank提供的moesin蛋白全長cDNA序列如下，1. 2. 1 核苷酸序列(序列參見 > gi I 53729335 199_1932Homo sapiens moesin(MSN)，mRNA1734bp)。1.2. 2蛋白序列參見SEQ ID N0:1及圖3。圖3中，膜突蛋白(Moesin)的氨基酸 組成及質(zhì)譜分析可匹配的氨基酸序列(加粗且下劃線標記為可匹配的氨基酸序列)。1. 2. 3moesin蛋白擴增引物序列設(shè)計如下Moesin-top (EcoR I)對應序列為 SEQ ID NO 25， -CCGGAATTCATGCCCAAAACGATCAGT-3，Moesin-bottom(Hind III)對應序列為 SEQ ID NO 35’ -CCCAAGCTTTTACATAGACTCAAATTCGTC-3’1. 3采用大腸桿菌表達系統(tǒng)，將擴增所得全長序列克隆入載體，選用pET32a(+)和 pET28a(+)兩種，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)，進行誘導培養(yǎng)。pET32a(+)克 隆位點詳見圖6中所示，圖6中，M為DL2000 marker、泳道1為pET32a-moesin質(zhì)粒、泳道 2為pET32a-moesin質(zhì)粒EcoR I/Hind III雙酶切。pET28a(+)克隆位點詳見圖7中所示。1. 4對克隆產(chǎn)物進行酶切鑒定，產(chǎn)物大小符合預期，參見圖8，圖8為重組質(zhì) 粒pET32a-moesin的酶切鑒定電泳圖，其中從左到右，M為DL2000 marker、泳道1為 pET32a-moesin 質(zhì)粒、泳道 2 為 pET32a-moesin 質(zhì)粒 EcoR I/Hind III 雙酶切。進一步對重 組質(zhì)粒進行測序，pET32a-m0esin的測序由上海英俊公司完成，測序結(jié)果通過序列比對可知 成功獲得了 moesin全長，序列完全正確，符合預期。然后將測序正確的pET32a-m0esin進 行EcoR I和Hind III雙酶切，同時pET28a進行同樣酶切，構(gòu)建pET28a-moesin重組質(zhì)粒。第二步重組moesin蛋白表達2. Imoesin的克隆表達將測序正確的pET32a-moesin和pET28a-moesin進行劃板，挑取單克隆在含有相 應抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，次日按1 100進行接種，200rpm培養(yǎng)至菌體濃度OD6tltl = 0. 3 0. 4，加入終濃度為ImM的誘導劑IPTG，培養(yǎng)4小時后收菌。2. 2moesin 的純化取適量菌體進行超聲，上清離心后，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示moesin在兩種表達載體 中均獲得了可溶性表達。
2. 2. lpET32a-moesin 的純化3g菌體用30ml的20mM的PB緩沖液(pH = 8. 0)冰裕攪拌混勻，然后進行超聲 破碎，4度，12000rpm，40min，離心取上清，用0.45μπι的濾膜過濾。用平衡液(20mMPB， 0. 15MNaCl，20mM的咪唑)平衡鎳柱，然后樣品進行上樣，lml/min。上樣完畢后用平衡液沖 柱后用洗脫液 l(50mM 咪唑，20mMPB，0. 15MNaCl)和洗脫 2 (IOOmM 咪唑，，20mMPB，0. 15MNaCl) 洗脫，收集相應洗脫峰，見圖9。圖9中，從左到右，M為protein marker (94. 0,66. 2,45,35, 24，20，14. 4kDa)、泳道1為moesin超聲后的上清、泳道2為洗脫液1洗脫產(chǎn)物、泳道3為洗 脫液2洗脫產(chǎn)物。2. 2. 2pET28a-mosein 純化4g菌體用40ml的20mM的Tris-HCL緩沖液(pH = 8. 0)冰裕攪拌混勻，后進行超 聲破碎。4度12000rpm，40min離心取上清，用0. 45 μ m的濾膜過濾。用平衡液(20mMTris_HCL，0. 15M NaCl，20mM 咪唑，pH = 8. 0)平衡鎳柱，然后進 行上樣，上樣速度為lml/min。上樣完畢后用平衡液沖柱后用洗脫液1 (20mM Tris-HCL, 0. 15MNaCl,50mM 咪唑，pH = 8. 0)和洗脫液 2 (20mM Tris-HCL, 0. 15M NaCl，IOOmM 咪唑，pH =8.0)進行洗脫，收集相應洗脫峰。電泳結(jié)果見圖10(左)。圖10(左)中，從左到右，M 為蛋白 marker (94. 0,66. 2，45，35，24，20，14. 4kDa)，泳道 1 為 28a_moesin 誘導后全菌、泳 道2為28a-m0esin誘導后全菌上樣穿液、泳道3為洗脫液1產(chǎn)物、泳道4為洗脫液1洗脫 產(chǎn)物、泳道5為洗脫液2洗脫產(chǎn)物、泳道6為28a-m0esin誘導后全菌超聲離心沉淀。將洗脫所得的樣品，用20mM的Tris-HCL緩沖液(pH = 8. 0)稀釋至咪唑濃度為 5mM 二次上柱，平衡后，再用洗脫液 l(20mM Tris-HCL, 0. 15M NaCl，50mM 咪唑，pH = 8. 0)和 洗脫液2(20mM Tris-HCL, 0. 15M NaCl，IOOmM咪唑，pH = 8. 0)洗脫，收集洗脫峰。電泳結(jié)果 見圖10(右)。圖10(右)中，從左到右，M為蛋白marker、泳道1為樣品、泳道2為穿液、 泳道3為洗脫液1、泳道4為洗脫液2。實施例2的結(jié)果證實通過原核表達純化技術(shù)獲得高純度moesin全長蛋白。實施例3抗moesin抗體檢測試劑盒的制備第一步最優(yōu)反應條件的摸索實驗1. 1兩種重組蛋白的抗原性評價和選擇依據(jù)對兩種重組蛋白抗原通過間接法酶聯(lián)免疫法進行抗原性評估，具體方法為將 抗原稀釋成1μ g/ml、2y g/ml、4l·! g/ml、5l·! g/ml、10l·! g/ml后包被酶標板，臨床收集的抗 moesin體檢測結(jié)果為強陽、弱陽及陰性的血清樣本各1份。在上述抗原包被的濃度范圍內(nèi)， 抗原1#選擇能明顯區(qū)分三份不同血清樣本，且差異顯著者，因此將抗原1#作為檢測用抗原 蛋白，認為其具有較強的抗原性(靈敏度)和較低的背景值(特異性)。見表6。表6 不同抗原的抗原性鑒定結(jié)果 1.2標記抗體稀釋液的選擇選用商品化Pierce過氧化物酶稀釋液，其商品名為“Guardian Peroxidase ConjugateStabilizer/Diluent”作為標記抗體稀釋液，該稀釋液能滿足試劑盒的性能要求 (見試劑盒穩(wěn)定性實驗)。1.3封閉液的確定用含0. 5%、1%、2%、3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液為封閉液，結(jié)果表明含 1 % 3% BSA封閉液較其它濃度有較好的封閉效果，但正常人檢測OD均值在0. 2左右(參 見圖11)，換用另一種封閉系統(tǒng)后得到很好的效果，在基本不降低陽性值的前提下，較好地 壓低了本底。最終選擇了 IOmM pH7.3 7.4 PBS+8 10%山羊血清+10%蔗糖作為封閉液。1.4血清稀釋度的選擇根據(jù)陰陽性樣本檢測值的差異大小及控制本底的角度，最終選擇了 1 100。實驗 數(shù)據(jù)見表7。表7 血清稀釋度的選擇實驗結(jié)果
血清稀釋緩沖液為PBST pH7. 3 pH7. 4+1% BSA，儲存溫度2°C 8°C。1. 5酶標羊抗人IgG稀釋度的選擇在確定了抗原蛋白最適包被濃度(4μ g/ml)基礎(chǔ)上，運用棋盤試驗法，選擇抗原 的最佳包被濃度和酶標羊抗人IgG的稀釋度，選取依據(jù)為陰陽性樣本檢測值差別拉大即信 噪比高，陽性血清的OD45tl值大于1. 60，陰性血清的OD45tl小于0. 15，但又不造成包被抗原和 酶標羊抗人IgG的浪費。最終選擇的酶標羊抗人IgG稀釋度為1 20000。實驗數(shù)據(jù)見表 8。表8 包被抗原濃度和酶標羊抗人IgG稀釋度的選擇試驗結(jié)果 注1)各種稀釋度和包被濃度對應的數(shù)據(jù)是OD45tl-OD63tl。2)⑴抗moesin抗體陽性血清，㈠抗moesin抗體陰性血清。1. 6參考臨界值(cutoff值)的確定檢測400份正常人血清，根據(jù)400份血清的檢測OD值計算檢測平均值^和標準差 SD。以I+2SD作為cutoff值，此cutoff值代表95%的可信度。結(jié)果見表9。表9 正常人群的檢測結(jié)果(0D值)的均值和標準差
第二步完成本實施例的方式2.1.制備96孔包被板1)包被以PBS溶液作為包被緩沖液稀釋抗原蛋白至4μ g/ml，每孔加液量 100 μ 1，包被溫度為2°C 8°C，包被時間12 16小時，抗原包被后倒去包被液，以PBS洗 滌板孔1次后甩去板中液體并扣干。2)封閉加封閉液10mM pH7. 3 pH7. 4PBS (溶液配方見后)+8 10%山羊血清 +10%蔗糖，200 μ 1/孔，置于37°C孵育箱中封閉2小時，倒去封閉液，以PBS洗滌板孔1次后甩去板中液體并扣干。3)制板以室溫20°C 25°C真空干燥2小時，壓強_0. 09MPa,以不超過_0. 094Mpa 為宜。將酶標板裝入密封袋，真空密封，2°C 8°C儲存。2. 2所需溶液的配制方法，優(yōu)選方案1)樣品稀釋緩沖液PBST pH7. 3 pH7. 4+1% BSA。儲存溫度2°C 8°C。2)酶標記抗體工作液酶標記抗體辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗人IgG抗體。酶標記抗體稀釋液采用Pierce的商品化抗體稀釋液，"Guardian PeroxidaseConjugate Stabilizer/Diluent”。兩者配制比例1 20000，儲存溫度2°C 8V。3)洗滌緩沖液0. 01mol/L pH 7. 4磷酸鹽緩沖液-吐溫溶液(PBST)，試劑盒提供 洗滌液為10倍濃縮液，配方中各成分及含量為=Na2HPO4. 12H20(11. 5g)、NaH2PO4. 2H20(2g) 和NaCl (87g)，用去離子水800ml充分溶解后，調(diào)pH值至7. 4，加5ml Tween-20,定容至 1000ml，2 8°C貯存。4)顯色系統(tǒng)采用Η202/ΤΜΒ顯色系統(tǒng)，試劑盒內(nèi)含顯色劑A和顯色劑B，使用時每 孔加入A、B液各50 μ 1。顯色劑A 檸檬酸· H2O (9. 33g)、Na2HPO4. 12Η20(36· gg)和過氧化脲(0. 2g)。充分 溶解后，用去離子水定容至1000ml，2 8°C貯存。顯色劑B 檸檬酸· H2O(2. lg)、TMB(0. 2g) ,EDTA-Na2(0. 3g)、無水乙醇(46. 5ml)和 丙酮(3. 5ml)。充分溶解后，用去離子水定容至1000ml，2 8°C貯存。5)終止液:2M =H2SO4 (98% ) 110ml，加純化 H2O 至 IL0第三步抗moesin抗體檢測操作程序3.1準備工作1)將試劑平衡至室溫，約需30分鐘，各試劑在使用前應充分混勻。2)配制應用洗滌液將試劑盒中的濃縮洗滌液(IOX)用純化水按1 10倍稀 釋。如果一次不需使用整塊板進行測試，則根據(jù)測試樣本孔數(shù)，取相應量濃縮的洗滌液，按 1 10倍的比例稀釋。稀釋后的應用洗滌液可在2 8°C環(huán)境下保存一周。3)稀釋待檢血清將待檢血清用樣品稀釋液按1 100的比例稀釋。檢測待檢血 清建議做復孔。稀釋后的血清樣本應在8小時內(nèi)使用。3. 2實驗步驟1)將所需moesin抗原包被的微孔板條放置在酶標板架上，不需要的板條應立即 放回包裝袋中，并將其密封好，盡量減少與水蒸汽的接觸，切勿將袋內(nèi)干燥劑丟棄。2)檢測時，將陽性對照、陰性對照和稀釋好的待檢血清一起孵育。3)加樣品每孔100μ 1，用封板膜把板條口封好，室溫(20°C 25°C )孵育半小時 (加完最后一個樣本后開始計時)。陽性對照、陰性對照為實驗可靠性的內(nèi)部對照，每次實 驗都必須做。如室溫低于20°C，需在20°C 25°C的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。4)洗板手洗時，把反應孔內(nèi)的溶液倒出，每孔加入應用洗滌液300μ 1，在微量震 蕩器上震蕩1分鐘，震蕩后再靜置半分鐘，然后把反應孔內(nèi)的溶液倒出，把板條倒扣扣干， 反應孔內(nèi)應無肉眼可見的液體殘留量和氣泡，如此重復3次。機洗時每孔加應用洗滌液350 μ 1，洗滌液在孔中保留1分鐘，重復3次，最后把板條倒扣扣干。5)加酶標抗體工作液每孔100 μ 1，室溫(20°C 25°C )孵育半小時。6)洗板同步驟4，共洗5次。7)顯色每孔加入顯色A、B液各50 μ 1，在室溫(20°C 25°C)避光反應15分鐘。8)終止反應每孔加入50 μ 1終止液，輕輕震蕩混勻，終止反應。9)測定光吸收值(OD)主波長為450nm，參考波長為620nm 650nm之間，優(yōu)選 630nm。測定各孔OD值。3. 3結(jié)果詳見實施例4。實施例4臨床患者群體中驗證對于大樣本量的CTD患者(主要包括RA，SLE, SSC, SV, RA和MCTD等)以及腫瘤 患者(主要為乳腺癌)進行外周血抗moesin抗體篩查，比較不同疾病的群體間抗moesin 抗體的差異。1研究對象與方法1.1研究對象研究對象為2007年4月至2009年5月在北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科門診和病房 診治的結(jié)締組織病患者，試驗組選取159例血管炎患者(主要為白塞氏病，MPA, TAA)，SLE 81例，MCTD 37例，SSc 83例，對照組為30例健康對照和20例疾病對照(主要包括C0PD， DPLD，肺癌，IPAH以及糖尿病，冠心病等常見疾病)(如表10所示)。所有CTD診斷皆符合 美國風濕病學會(ACR)或相應的國際分類診斷標準[1]。收集患者臨床信息、實驗室檢查資 料，采集血清或血漿，-20°C保存?zhèn)溆?。每位患者用免疫熒光法檢測抗核抗體，用免疫雙擴散 法和免疫印跡法檢測抗可提取性核抗原(ENA)抗體，包括抗Ul核糖體核蛋白(RNP)抗體和 抗R0 (SSA)抗體。同時每位患者均進行肺功能檢測(通氣功能+彌散功能)。表10 不同組別患者基本情況 1.2 方法1. 2. 1通過對于患者外周血(血清/血漿)應用ELISA方法檢測抗moesin抗體， 具體步驟詳見實施例3。根據(jù)實施例3中第一步中確定的OD值的cut-off數(shù)值為0. 159進 行結(jié)果陰性或陽性判斷。1. 2. 2通過免疫組化技術(shù)檢測抗moesin抗體1. 2. 2. 1細胞爬片的處理用玻璃刀將標準蓋玻片劃成1/4大小，清洗、消毒，包被 L-多聚賴氨酸(2ug/cm2)，置于24孔板中，待檢細胞按常規(guī)消化、計數(shù)，按實驗計劃種到細胞培養(yǎng)板上，使細胞鋪后板后達到50 80 %，用0. 01mol/L pH7. 2PBS洗兩次，3. 7 %多聚甲 醛固定30min以上，-20°C保存。1. 2. 2. 2免疫熒光法檢測抗moesin抗體1)去固定液，用洗滌液洗2次，每次3-5分鐘，吸盡液體。2)用封閉液(1%牛血清白蛋白BSA)封閉60分鐘，在搖床上輕輕搖動。3)去封閉液，加稀釋的抗moesin抗體血清(1 50 1 100)，每玻片20ul，于 37°C濕盒內(nèi)作用60分鐘，或濕盒內(nèi)4°C作用過夜(覆蓋封口膜，避免干燥)。4)用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。5)去除洗滌液，每玻片加入兔抗鼠熒光二抗稀釋液(1 50)20ul，濕盒內(nèi)室溫作 用60分鐘。6)用洗滌液洗滌2次，每次3-5分鐘。7)滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，盡量避免氣泡。 使細胞接觸封片液，切勿弄反。8)熒光顯微鏡觀察、拍照。1.2.2.3 骨架蛋白 F-actin 染色1)鬼筆毒素母液的準備購買的熒光鬼筆毒素300imits溶于1. 5ml的甲醇溶解。2)固定洗好的細胞爬片，置于0. 1% X-IOOTriton PBS中萃取3到5分鐘，用PBS 洗兩次。3)將鬼筆毒素母液按1 40稀釋，加到爬片上，濕盒內(nèi)室溫60min。4)滴加抗熒光衰減劑封片，或繼續(xù)行下述操作。1.2. 2. 4細胞核染色1)將 100 μ g/ml 1 μ 1 Hoechst 33342 原液用 PBS 稀釋成 lug/ml，加到爬片上， 37 °C恒溫孵育30分鐘。2)滴加抗熒光衰減劑封片。1. 2. 2. 5激光共聚焦顯微鏡拍照，(紅色熒光激發(fā)波長545nm，綠色熒光激發(fā)波長 488nm，藍色熒光激發(fā)波長356nm)。觀察細胞形態(tài)。1. 3實驗結(jié)果表11 不同組別患者檢測抗moesin抗體結(jié)果 **SSc，MCTD,和SLE組陽性率與疾病對照組和健康對照組之間卡方檢驗結(jié)果P < 0. 001。
2、CTD不同臟器受累的moesin抗體陽性率判斷選擇57例SSc患者為例，分析不同臟器受累患者的抗moesin抗體陽性率結(jié)果，應 用卡方檢驗分析，結(jié)果提示呼吸系統(tǒng)受累中抗moesin抗體的陽性率存在差異(如表12所 示)°表12不同臟器受累患者的抗moesin抗體陽性率結(jié)果 3、不同CTD相關(guān)肺臟受累的moesin抗體OD值的均值比較PAH組，ILD組，和PAH&ILD各組與健康對照組之間P值均< 0. 05 ；無肺臟受累組與 健康對照之間P = 0. 292 ；PAH組與無肺臟受累組比較，P = 0. 723 ；ILD組與無肺臟受累組比 較，ρ = 0.467 ；PAH&ILD組與無肺臟受累組比較，ρ = 0.001 (one-way AN0VA)，具體結(jié)果參見 圖12。圖12中，其中PAH組，ILD組，和PAH&ILD各組與健康對照組之間P值均< 0. 05 ；無 肺臟受累組與健康對照之間P = 0. 292 ；PAH組與無肺臟受累組比較，ρ = 0. 723 ；ILD組與無 肺臟受累組比較，P = 0. 467 ；PAH&ILD組與無肺臟受累組比較，ρ = 0. 001 (one-way AN0VA)4、抗moesin抗體定性判斷與PFTs各項指標的統(tǒng)計分析選擇MCTD和SSc患者為研究對象，通過肺功能檢查反向驗證抗moesin抗體的定 性判斷的臨床意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗moesin抗體陽性的患者于陰性患者相比較，其TLC，F(xiàn)VC和 FEVl均有顯著差異，提示抗moesin抗體陽性和陰性的患者之間在肺臟的表現(xiàn)上，陽性組患 者限制性通氣功能障礙更明顯(如表13所示)。表13 不同抗膜突蛋白抗體患者肺功能特點 *p<0. 05
5、同一患者治療前后抗體滴度比較表14同一患者治療前后抗體滴度比較 6、moesin定性判斷與PFTs各項指標的單因素方差分析表15 不同抗膜突蛋白抗體患者肺功能特點 *p<0. 05。7、其他抗體指標與肺臟受累之間的關(guān)系(卡方檢驗)表16其他抗體指標與肺臟受累之間的關(guān)系 臨床中常見的抗體往往在診斷某種CTD具有一定特異性。例如抗dsDNA抗體和Sm 抗體診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡，ANCA對于診斷系統(tǒng)性血管炎有一定提示意義，抗SSA和抗SSB陽 性有助于診斷干燥綜合征，但是目前沒有一項臨床中常用的抗體能夠提示CTD相關(guān)肺臟受 累，主要包括PAH和ILD。根據(jù)上表所示常見ENA中各個抗體陰性和陽性與肺臟受累與否之
22抗SSa抗體陰性47 (37.3%)79 (62.7%)0.237陽性34 (45.9%)40 (54.1%)抗SSb抗體陰性70 (38.5%)112 (61.5%)0.123陽性10 (58.5%)7 (41.2%)抗KNP抗體陰性51 (45.1%)62 (54.9%)0.144陽性29 (34.1%)56 (65.9%)抗Scl70抗體陰性78 (41.5%)110 (58.5%)0.367陽性3 (25.0%)9 (75.0%)間沒有顯著差異，因而提示臨床常用抗體不能夠提示肺臟受累。8、通過免疫組化技術(shù)檢測抗moesin抗體結(jié)果見圖13熒光染色顯示結(jié)果其中，正常培養(yǎng)的細胞(X 1000)，箭頭3所示為 綠色熒光是膜突蛋白，箭頭1所示為紅色熒光是細胞骨架F-actin，箭頭2所示為藍色熒光 是細胞核，可見膜突蛋白主要在細胞膜表達，呈散點狀或顆粒狀分布；正常狀態(tài)細胞周邊的 F-actin，線條完整連續(xù)，顯示出典型的鵝卵石樣內(nèi)皮細胞輪廓，稱為外周致密束。細胞漿內(nèi) 細胞骨架排列整齊，著色均勻。細胞核為圓形或橢圓形，核的周圍也有少量分布形成核骨
^K O1. 4 結(jié)論結(jié)締組織病相關(guān)肺臟受累患者群體中存在抗moesin抗體，該自身抗體的產(chǎn)生對 結(jié)締組織病相關(guān)肺臟受累具特異性，提示通過檢測患者外周血中的抗moesin抗體具有臨
床診斷價值。
序列表
<110>上海富莼科芯生物技術(shù)股份有限公司
<120> 一種用于檢測抗膜突蛋白抗體的試劑盒
<130)090654
<160>3
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>577
<212>PRT
<213>人工合成
<400>1
Met Pro LysThrIleSerValArgValThrThrMetAspAlaGluLeu
151015
Glu Phe AlaIleGlnProAsnThrThrGlyLysGlnLeuPheAspGln
202530
Val Val LysThrIleGlyLeuArgGluValTrpPhePheGlyLeuGln
354045
Tyr Gln AspThrLysGlyPheSerThrTrpLeuLysLeuAsnLysLys
505560
Val Thr AlaGlnAspValArgLysGluSerProLeuLeuPheLysPhe
65707580
Arg Ala LysPheTyrProGluAspValSerGluGluLeulieGlnAsp
859095
lie Thr GlnArgLeuPhePheLeuGlnValLysGluGlylieLeuAsn
100105110
Asp Asp lieTyrCysProProGluThrAlaValLeuLeuAlaSerTyr
Met Ala Arg GlnLysLysGluSerGluAlaValGluTrpGlnGlnLys
435440445
Ala Gln Met ValGlnGluAspLeuGluLysThrArgAlaGluLeuLys
450455460
Thr Ala Met SerThrProHisValAlaGluProAlaGluAsnGluGln
465470475480
Asp Glu Gln AspGluAsnGlyAlaGluAlaSerAlaAspLeuArgAla
485490495
Asp Ala Met AlaLysAspArgSerGluGluGluArgThrThrGluAla
500505510
Glu Lys Asn GluArgValGlnLysHisLeu LysAlaLeuThrSerGlu
515520525
Leu Ala Asn AlaArgAspGluSerLysLysThrAlaAsnAspMetlie
530535540
His Ala Glu AsnMetArgLeuGlyArgAspLysTyrLysThrLeuArg
545550555560
Gln lie Arg GlnGlyAsnThrLysGlnArglieAspGluPheGluSer
565570575
Met
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213> 物
<400>2
ccggaattca tgcccaaaac gatcagt27
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>引物
<400>3
cccaagcttt tacatagact caaattcgtc30
權(quán)利要求
一種用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測板，所述的檢測板包括固相載體和包被于所述固相載體的膜突蛋白抗原蛋白，所述膜突蛋白抗原蛋白為全長人膜突蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測板，其特征在于，所述抗膜突蛋 白抗體為IgG型。
3.如權(quán)利要求1所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測板，其特征在于，所述固相載體 為酶標反應板。
4.權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測板的制備方法， 包括如下步驟a)包被用包被緩沖液稀釋膜突蛋白抗原蛋白，然后將該抗原蛋白溶液加入到固相載 體上進行包被，包被完畢后洗滌并干燥；b)封閉加入封閉液后進行封閉，封閉完畢后洗滌并干燥；c)制板以室溫20°C 25°C真空干燥2小時，干燥過程中的壓強不超過-0.094Mpa ；然 后進行真空密封，2°C 8°C儲存。
5.如權(quán)利要求4所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測板的制備方法，其特征在于，所 述步驟a)中的包被緩沖液為PBS溶液。
6.如權(quán)利要求4所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測板的制備方法，其特征在于，所 述步驟a)中所述抗原蛋白溶液的濃度為2 5yg/ml。
7.如權(quán)利要求4所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測板的制備方法，其特征在于，所 述步驟a)中的所述包被在2 8°C的溫度下進行17小時。
8.如權(quán)利要求4所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測板的制備方法，其特征在于，所 述步驟b)中的所述封閉液為IOmM PBS溶液，pH7. 0 pH7. 4，其中含有質(zhì)量百分比為5 10%的山羊血清以及質(zhì)量百分比為10%的蔗糖。
9.一種用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包含權(quán)利要求1中 所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測板，或者分別包裝的固相載體和膜突蛋白抗原蛋白， 所述膜突蛋白抗原蛋白為全長人膜突蛋白。
10.如權(quán)利要求9所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑 盒中還包括標記抗體，該標記抗體上標記有能產(chǎn)生檢測信號的物質(zhì)，且所述抗體能夠與抗 膜突蛋白抗體相結(jié)合。
11.如權(quán)利要求9所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測試劑盒，其特征在于，所述能產(chǎn) 生檢測信號的物質(zhì)選自過氧化物酶、半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。
12.如權(quán)利要求9所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑 盒中還包括與能產(chǎn)生檢測信號的物質(zhì)相對應的顯色液。
13.如權(quán)利要求9所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑 盒中還包括包被緩沖液、樣品緩沖液、封閉液、洗滌緩沖液和終止液中的一種或多種。
14.權(quán)利要求9-13中任一權(quán)利要求所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測試劑盒的使 用方法，包括如下步驟①、抗原抗體反應將膜突蛋白抗原蛋白包被在固相載體上，然后在固相載體的微孔內(nèi) 分別加入待測樣品；②、酶聯(lián)反應將標記抗體溶液加入各孔，振蕩、孵育；然后洗滌；在每孔加入與能產(chǎn)生檢測信號的物質(zhì)相對應的顯色劑，避光孵育；③、測定光吸收值。
15.如權(quán)利要求14所述用于檢測抗膜突蛋白抗體的檢測試劑盒的使用方法，其特征在 于，所述步驟①中的待測樣品選自血液、血清和血漿。
16.一種檢測抗膜突蛋白抗體的方法，包括如下步驟(a)將待測樣品加樣于包被有膜突蛋白抗原蛋白的固相載體，從而使待測樣品中的抗 膜突蛋白抗體與固相載體上的膜突蛋白抗原蛋白結(jié)合，形成“抗膜突蛋白抗體-膜突蛋白 抗原蛋白”二元復合物；所述膜突蛋白抗原蛋白為全長人膜突蛋白；(b)將標記抗體加樣于步驟a)中獲得的二元復合物，形成“標記抗體-抗膜突蛋白抗 體-膜突蛋白抗原蛋白”三元復合物；所述標記抗體為標記有檢測信號產(chǎn)生工具，且能夠與 抗膜突蛋白抗體相結(jié)合的抗體；(c)通過使用與檢測信號相匹配的檢測工具對三元復合物產(chǎn)生的信號進行檢測，從而 確定待測樣品中抗膜突蛋白抗體的含量及是否達到臨床參考臨界值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測抗膜突蛋白抗體的試劑盒，所述試劑盒中含有固相載體和膜突蛋白抗原蛋白，所述膜突蛋白抗原蛋白為全長人膜突蛋白。本發(fā)明的試劑盒可以應用于對CTD相關(guān)肺臟受累進行早期預測和病情評估的方法，主要通過采集受試者的生物樣本，并檢測該生物樣本中抗膜突蛋白抗體的量進行評估。本發(fā)明利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)和基因重組技術(shù)制備膜突蛋白，提供了一種用于檢測抗膜突蛋白抗體的ELISA檢測試劑盒，該試劑盒對于CTD相關(guān)肺臟受累的檢出率可達51.7％。
文檔編號G01N33/531GK101929999SQ200910053508
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者孫宏彬, 尹雷, 張玥, 曾小峰, 李春梅, 李夢濤, 楊超文, 王遷, 艾軍, 趙久良, 錢杰, 黃嵐 申請人:上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司