專利名稱：含有白細胞介素il－12和單純皰疹病毒抗原的疫苗的制作方法
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)采用許多機制來攻擊病原體；然而，并不是所有這些機制在免疫接種后均必定被激活。接種疫苗誘導(dǎo)的保護性免疫力依賴于疫苗誘導(dǎo)恰當?shù)拿庖邞?yīng)答的能力來抵抗或消滅病原體。根據(jù)病原體，這可能需要細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和/或體液免疫應(yīng)答。
輔助性T細胞在免疫應(yīng)答中作用的最近范例是，它們可以根據(jù)它們產(chǎn)生的細胞因子分成細胞亞群，而且在這些細胞亞群中觀察到的獨特性細胞因子分泌決定了它們的功能。此T細胞模型包括兩個主要亞群產(chǎn)生IL-2和干擾素γ(IFN-γ)的TH-1細胞，它同時增強細胞和體液免疫應(yīng)答；產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-10的TH-2細胞，它增強體液免疫應(yīng)答。(Mosmann等，免疫學雜志。126:2348(1986))。通常理想的是增強抗原的免疫原性以在被接種的生物體內(nèi)獲得更強的免疫應(yīng)答，并增強宿主對抗原物質(zhì)的抵抗力。一類和被接種的抗原一起施用，能增強抗原的免疫原性的物質(zhì)稱為佐劑。例如，已證明某些淋巴因子有佐劑活性，能增強對抗原的免疫應(yīng)答(Nencioni，等，免疫學雜志。139:800-804(1987)；EP285441授予Howard等)。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及疫苗組合物，它包括單純皰疹病毒糖蛋白D，白細胞介素IL-12和礦物懸液的混合物。IL-12可吸附于礦物懸液或簡單的與其混合。在本發(fā)明的具體實施例中，IL-12吸附于例如明礬(例如，氫氧化鋁或磷酸鋁)的礦物懸液。在一具體實施例中，IL-12是人IL-12。本發(fā)明也涉及進一步含有生理學上可接受的載體的疫苗組合物。本發(fā)明還涉及包括單純皰疹病毒糖蛋白D、佐劑劑量的白細胞介素-12、礦物懸液的混合物，以及可任選的含有生理學上可接受的載體的免疫原性組合物。
本發(fā)明的組合物調(diào)節(jié)對抗原的保護性免疫應(yīng)答；即，該疫苗組合物能夠在量和質(zhì)上促進接種疫苗宿主的抗體應(yīng)答，在量上增加細胞介導(dǎo)的免疫力，提供對病原體的保護性免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的一個具體實施例中，抗原是單純皰疹病毒(HSV)抗原，例如單純皰疹病毒Ⅰ型和/或Ⅱ型的衣殼糖蛋白D(gD)。
本發(fā)明還涉及制備含有與礦物懸液混合的HSV gD和IL-12的疫苗組合物的方法。特別是，IL-12吸附于礦物懸液。本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)或增強被免疫者保護性免疫應(yīng)答的體液和/或細胞介導(dǎo)的免疫力，包括對脊椎動物宿主施用有效量的疫苗組合物，該組合物包含以生理學上可接受的溶液配制的HSVgD、IL-12和礦物懸液的混合物。特別是，IL-12吸附于礦物懸液。
發(fā)明詳述糖蛋白D(gD)是單純皰疹病毒(HSV)Ⅰ型和Ⅱ型的包膜糖蛋白。已證明HSV gD是動物模型中抵御初次或復(fù)發(fā)性HSV感染保護性免疫力的強誘導(dǎo)物。(Mishkin等，疫苗9:147-153(1991)；Landolfi等，疫苗11:407-414(1993))。
IL-12由各種各樣的抗原遞呈細胞產(chǎn)生，主要是由巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生。它是誘導(dǎo)原初T細胞成為TH-1細胞的關(guān)鍵要素。IL-12的產(chǎn)生或?qū)ζ浞磻?yīng)的能力在保護性TH-1類應(yīng)答的發(fā)展中證明是關(guān)鍵性的，例如，在寄生蟲感染中，最值得注意的利士曼病中就是如此(Scott，等，美國專利號No.5,571,515)。IL-12的作用由NK細胞和輔助性T細胞產(chǎn)生的IFN-γ所介導(dǎo)。IFN-γ則是誘導(dǎo)抗T依賴性蛋白抗原的IgG2a抗體(Finkelman和Holmes，免疫學年度綜述。8:303-33(1990))和抗T非依賴性抗原的IgG3應(yīng)答(Snapper等，實驗醫(yī)學雜志，175:1367-1371(1992))。白細胞介素-12(IL-12)，原稱為自然殺傷細胞刺激因子，是一種異二聚體細胞因子(Kobayashi等，J.Exp.Med.170:827(1989))。IL-12蛋白在重組宿主細胞中的表達和分離在國際專利申請WO90/05147(1990年5月17日公開)中有所描述。
本文所描述的研究是關(guān)于IL-12在單純皰疹病毒(HSV)疫苗中作為佐劑的應(yīng)用。因此，本發(fā)明涉及含有HSV gD、IL-12和礦物懸液的混合物的疫苗組合物。在本發(fā)明的具體實施例中，IL-12吸附于例如明礬的礦物懸液(例如，氫氧化鋁或磷酸鋁)。這些疫苗組合物調(diào)節(jié)對HSV的保護性免疫應(yīng)答；即，該疫苗組合物能誘導(dǎo)被接種宿主產(chǎn)生細胞介導(dǎo)的免疫力，以提供對病原性抗原的保護性免疫應(yīng)答。
IL-12可從數(shù)種適當?shù)膩碓传@得。它可通過重組DNA工藝學生產(chǎn)；例如，將編碼人IL-12的基因在宿主系統(tǒng)中克隆并表達，使能大量生產(chǎn)純化的人IL-12。在本發(fā)明中同樣有用的是IL-12的生物學活性亞基或片段。另外，某些T淋巴細胞系產(chǎn)生高水平的IL-12，從而提供了易于得到的來源。重組人IL-12和小鼠IL-12的商品來源包括Genetics Institute,Inc.(Cambridge,MA)。
本發(fā)明的抗原，例如，HSV抗原，可用于在脊椎動物如哺乳動物宿主中誘導(dǎo)對該抗原的免疫應(yīng)答。例如，該抗原可以是HSV gD蛋白質(zhì)抗原或其保留了有刺激免疫應(yīng)答能力的部分。
本發(fā)明的方法包括對哺乳動物，特別是人或其它靈長類，施用免疫有效劑量的疫苗組合物，該疫苗組合物含有抗原，例如HSV gD抗原，和輔佐劑量的IL-12以及礦物懸液的混合物。特別是，IL-12吸附于礦物懸液。在本文中所用的，IL-12的“輔佐劑量”是指從1納克到大約20毫克的劑量，更具體的說，從100納克到大約5毫克。本文中所用的，疫苗組合物的“免疫有效”劑量是指適合誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的劑量。IL-12和抗原的具體劑量由待治療的哺乳動物的年齡、體重和醫(yī)學狀況所決定，同時還由施藥方法所決定。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員很容易確定合適的劑量。該疫苗組合物可任選的配制在藥物學或生理學上可接受的載體，例如生理鹽水、磷酸緩沖鹽或多元醇，(例如甘油或丙烯醇)中施藥。也可加入少量去污劑以增強疫苗穩(wěn)定性。
該疫苗組合物可任選的含有另外的佐劑，例如植物油或其乳劑，表面活性物質(zhì)，例如十六烷基胺，十八烷氨基酸酯，十八烷基胺，溶血卵磷脂，二甲基-二(十八烷基溴化銨)，N,N-雙十八烷基-N’-N’雙(2-羥乙基-丙烷二胺)，羥甲基十六烷基甘油，以及復(fù)合多元醇；聚胺，例如吡喃，硫酸葡聚糖，多聚IC，聚羧乙烯；肽，例如胞壁酰二肽，二甲基甘氨酸，促吞噬肽，免疫刺激復(fù)合物，油乳劑；脂多糖，例如MPL(3-O-去乙酰基一磷酸脂A；RIBI ImmunoChem Research,Inc.,Hamilton,Montana)和礦物凝膠。也可將本發(fā)明的抗原摻入脂質(zhì)體，共螯合物(cochleates)，可生物降解多聚物例如聚丙交酯，聚乙交酯和聚丙交酯-共-乙交酯，或ISCOMS(免疫刺激復(fù)合物)中，以及還可使用添加的活性成分。本發(fā)明的抗原也可和細菌毒素及其減毒衍生物聯(lián)用。本發(fā)明的抗原也可和其它的淋巴因子，包括，但不限于，白細胞介素-2,IFN-γ和GM-CSF聯(lián)用。
疫苗可通過多種途徑施用給人或動物，包括但不限于，腸胃外、動脈內(nèi)、真皮內(nèi)、透皮(例如通過使用緩釋多聚物)，肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口腔或鼻內(nèi)施藥途徑。在這些疫苗中使用的抗原量，視抗原的特性而不同。為適合本發(fā)明疫苗，需要對采用傳統(tǒng)載體抗原所確定的劑量范圍進行判定和操作，這正好在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的能力內(nèi)。本發(fā)明的疫苗計劃用于治療未成年和成年溫血動物，特別是人。通常，抗原和IL-12/鋁聯(lián)合物將同時施用。
IL-12的佐劑作用具有許多重要意義。IL-12的佐劑活性能增加免疫接種生物體針對抗原產(chǎn)生的保護性抗體的濃度。因此，有效的(亦即，保護性的)接種可用比通常所需更少量的抗原而達到?？乖枇康臏p少可以使得制備困難且昂貴的抗原被更廣泛的使用。另外，IL-12用作佐劑能增強免疫原性微弱或免疫原性貧乏的抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。當抗原在有效免疫通常所要求的濃度是有毒的情況下，它可提供更安全的免疫接種。通過減少抗原量，毒性反應(yīng)的危險也降低了。
通常，疫苗接種方案要求在幾星期或幾個月的時間內(nèi)施用抗原，以激發(fā)“保護性”免疫應(yīng)答。保護性免疫應(yīng)答是足以保護被免疫生物體抵抗疫苗針對的一種或多種特定病原體所致疾病的免疫應(yīng)答。IL-12，當和抗原，(例如HSV抗原)并和礦物懸液(例如，鋁)混合或吸附于其上時一起施用時，能加速保護性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。這能減少接種方案起效的時間過程。在某些例子中，單劑即能產(chǎn)生保護性應(yīng)答。本發(fā)明的疫苗組合物在治療上也有用，可減少已感染HSV個體的癥狀發(fā)作次數(shù)和嚴重程度。
作為本文所述工作的結(jié)果，聯(lián)合施用HSV亞基疫苗和吸附于鋁懸液的IL-12已顯示出能誘導(dǎo)壓倒性的TH-1相關(guān)應(yīng)答；這是gD亞基疫苗免疫誘導(dǎo)的一種新模式。如本文進一步所述，在用可溶性和磷酸鋁吸附gD免疫的臨床前(動物)模型中測定了能發(fā)揮作用的IL-12劑量范圍。本文所述的結(jié)果也揭示了用細胞因子/糖蛋白聯(lián)合或不聯(lián)合鋁免疫，可誘導(dǎo)TH-1相關(guān)抗體。疫苗和IL-12/鋁聯(lián)合施用對亞基疫苗的免疫應(yīng)答有佐劑作用，如用ELISA和病毒中和反應(yīng)測定表明，抗-gD抗體水平提高那樣。
糖蛋白D(gD)是單純皰疹病毒Ⅰ和Ⅱ型的一種包膜糖蛋白，已證明其為病毒感染性所需并且是體液以及細胞免疫應(yīng)答的主要目標，可用作抵御人初次和復(fù)發(fā)性皰疹感染的主要候選疫苗。施用基于鋁或其它目前可接受的人用免疫吸附劑配制的gD亞基疫苗在幾項臨床前研究中已顯示能誘導(dǎo)TH-2輔助性T淋巴細胞激活占優(yōu)勢的免疫應(yīng)答。然而，看來復(fù)發(fā)性皰疹疾病的終止和適當保護性免疫功能的建立需要誘導(dǎo)強TH-1應(yīng)答。
本文所述工作的結(jié)果表明IL-12和可溶性的、吸附于AlPO4的gD聯(lián)合施用可導(dǎo)致體液和細胞免疫應(yīng)答量的增加，以及體液應(yīng)答質(zhì)的變化。這可由IL-12存在時，疫苗誘導(dǎo)了不同的IgG亞類分泌所證明。事實上，對具有有效固定補體能力的IgG2a抗體的優(yōu)先誘導(dǎo)，是TH-1應(yīng)答的一個特點。施用IL-12對免疫應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)作用和IL-4(TH-2相關(guān))相比，在IFN-γ(TH-1相關(guān))分泌的比率和數(shù)量上發(fā)生的變化是明顯的。
另外，特別重要的是，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合施用IL-12和可溶性亞基疫苗免疫的小鼠中誘導(dǎo)了抗原-特異性溶細胞活性。該應(yīng)答模式提示IL-12的加入導(dǎo)致對gD亞基疫苗免疫應(yīng)答特征上的基礎(chǔ)性改變，因為在前人研究中g(shù)D亞基疫苗很少(如果有的話，)顯示過能誘導(dǎo)溶細胞活性。
用該新配方疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答譜和天然病毒感染誘導(dǎo)的緊密相關(guān)，并和無疾病而血清反應(yīng)陽性人體中觀察到的免疫力模式相關(guān)。聯(lián)系在一起，這些結(jié)果提示IL-12介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)在抗單純皰疹病毒疾病的免疫治療性和/或預(yù)防性干涉中為建立有效的免疫應(yīng)答提供了明顯有益的作用。
給出以下的實施例目的是闡明本發(fā)明，但不能解釋成限制本發(fā)明的范圍。本文所引用的所有參考文獻的內(nèi)容在此納入以備參考。
實施例材料和方法單純皰疹病毒糖蛋白D的表達和純化以及疫苗制備單純皰疹病毒糖蛋白D(gD疫苗)的制備如Landolfi等(Vaccine11(4):407-414(1993))先前所述。
實驗設(shè)計雌性Balb/C小鼠被隨機編入表1描述的組中(N=10/組)。在第0和21日，給動物股部肌肉內(nèi)接種單獨的或和不同劑量IL-12混合的上述gD疫苗。在免疫前和免疫后每隔7日小鼠分別取血。第28天和第35天殺死每組中的5只小鼠，收集免疫脾細胞和陰道洗滌液。用酶聯(lián)免疫試驗(EIA)分析血清和陰道洗滌液中對gD抗原應(yīng)答的IgA和IgG亞類抗體數(shù)量。功能性抗體活性用血清中和HSV感染的能力來評估。細胞介導(dǎo)活性用溶細胞T淋巴細胞試驗、淋巴細胞增殖分析和細胞因子分泌模式來評估。
EIA分析各血清的HSV gD特異性抗體應(yīng)答用York等(Vaccine 13:1706-1712(1995))所述的EIA定量測定。
簡單來說，用純化的gD以20納克/孔包被96孔培養(yǎng)板1小時。用0.01M PBS和0.1％Tween-20溶液將板洗滌3次，然后用PBS和1％BSA溶液封閉。室溫下將板培養(yǎng)1小時，然后用0.01M PBS和0.1％Tween-20洗滌3次。將以0.05MTris-緩沖鹽水配制的2倍系列稀釋度的血清加入雙份孔中，培養(yǎng)1小時。用0.01M PBS和0.1％Tween-20洗滌各孔，然后加入第二抗體。第二抗體由辣根過氧化物酶(HSP)標記的山羊抗小鼠IgG(1∶2000稀釋于TBS和0.1％Tween-20)，和生物素化的山羊抗小鼠IgG1和IgG2a(400納克/毫升以TBS和0.1％Tween-20配制)組成。50納克/毫升濃度的親和素-HRP被加入IgG1和IgG2a檢測孔中。1小時培養(yǎng)后，洗滌各孔，然后加入ABTS(2,2’-連氮-(3-乙基苯并噻唑啉)-6磺酸二銨鹽)底物。產(chǎn)生的顏色在405納米處定量測定OD值，滴度用終點外推法確定。
血清中和各血清用前述(Mishkin等，Vaccine 9:147-153(1991))的微量中和試驗評估HSV中和滴度。
簡單的說，將Vero細胞在96孔平底培養(yǎng)板中培養(yǎng)至鋪滿。測試血清在56℃加熱滅活30分鐘，然后以培養(yǎng)液作2倍系列稀釋，體積為0.1毫升。加入等體積的HSV1或HSV2(含大約100噬斑形成單位(PFU)的病毒)。加入10％(v/v)豚鼠補體進行補體依賴性試驗。將病毒/血清/(補體)混合物在37℃(5％CO2)溫和振蕩培養(yǎng)1小時，然后直接加到Vero細胞單層上。每次試驗均包括病毒(即，無血清的培養(yǎng)液)，培養(yǎng)液(即，未感染細胞)，和補體(即，無血清或補體的培養(yǎng)液)對照。37℃培養(yǎng)后，細胞用1％的甲基纖維素覆蓋。37℃(5％CO2)培養(yǎng)平板，直至病毒對照孔中大約可數(shù)到50個噬斑(亦即，48-72小時)。計數(shù)噬斑，滴度定義為產(chǎn)生50％以上噬斑減少的最大血清稀釋度的倒數(shù)。
淋巴細胞增殖應(yīng)答HSV-特異性淋巴細胞增殖試驗的方法先前已有詳述(Ishizaka等，病毒免疫學4:187-193(1991))。收集小鼠脾細胞，合并于補充的RPMI(RoswellPark Memorial Institute培養(yǎng)基號1640，用于淋巴細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的常用組織培養(yǎng)基)中。然后將0.1毫升細胞以2×105活細胞/孔置于96孔平底板中。對采用的每一種體外刺激抗原均作5個重復(fù)孔。這些孔包括培養(yǎng)液、Vero細胞裂解液、HSV1(105熱滅活的噬斑形成單位/孔)、HSV2(105熱滅活噬斑形成單位/孔)、和純化的桿狀病毒表達的HSV2重組糖蛋白D(bgD2)(20納克/孔)。這些抗原各孔加入0.1毫升體積。
然后將培養(yǎng)板37℃(5％CO2)培養(yǎng)5天。收集前5到6小時，各孔加入25微升0.5μCi3H-胸苷的25ml RPMI液。將細胞用細胞收集器收集到玻璃纖維過濾網(wǎng)上，用β-平板計數(shù)器測定摻入的活性。
細胞毒T細胞活性如前所述(York等，1995)脾細胞用于特異性CTL活性的二次刺激。在本實驗中，免疫后14周收集脾細胞。制備脾細胞懸浮液，然后在室溫下用0.17％NH4Cl(5ml/脾臟)處理4分鐘，滲透法除去紅細胞。然后洗滌細胞，計數(shù)并用臺盼藍染色排除法測定存活率。
采用原初動物的脾細胞作為抗原遞呈細胞(APC)。這些細胞受到γ-輻射(2000R)然后用HSV1(NS株)和HSV2(186株)感染，感染復(fù)數(shù)(MOI)為5，37℃(5％CO2)渦旋感染1小時。洗滌細胞1次，以5×106細胞/毫升重懸浮，再培養(yǎng)4小時。然后暴露于短波UV輻射15分鐘滅活病毒。將5毫升培養(yǎng)液中的APC(1毫升含5×106細胞)加至2×107效應(yīng)細胞/孔。培養(yǎng)物再培養(yǎng)5天，然后用51Cr-釋放試驗測定溶細胞活性。
體外再次刺激后，從培養(yǎng)板上收集效應(yīng)細胞，用臺盼藍排除法評估存活率。然后用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細胞濃度，分成200微升的三等份，以得到所要的效靶(E∶T)比率。然后進行雙倍稀釋。
收集適宜數(shù)量的A20靶細胞用于試驗。這些細胞在初始1小時吸收階段用HSV1和HSV2以10MOI感染，洗滌并再培養(yǎng)3小時。用作對照的未感染A20細胞用相同方法作模擬感染。3小時培養(yǎng)后，沉淀5×106到1×107的A20靶細胞并重懸浮于加有200μCi51Cr的0.2毫升胎牛血清中，培養(yǎng)1小時(37℃，5％CO2)。用10ml RPMI洗滌細胞兩次，在1ml培養(yǎng)液中重懸浮，稀釋得到E∶T比率適宜的每份100微升的(混合細胞)。
培養(yǎng)效應(yīng)細胞和標記靶細胞(37℃,5％CO2)4小時，此時，從每孔小心收集100μl上清液，用γ計數(shù)器測定γ放射量。用2％Tween-20處理過的標記靶細胞的三重復(fù)孔確定總釋放。自發(fā)釋放用僅在培養(yǎng)液中培養(yǎng)4小時的標記靶細胞三重復(fù)孔計數(shù)。特異釋放百分數(shù)用以下公式計算 如先前報告(York等，1995)采用酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)來直接計數(shù)分泌IL-4和IFN-γ的細胞。在無菌條件下，Millipore HA硝酸纖維素96孔微量滴定板用以無菌PBS配制的5微克/毫升(抗IFN-γ)或2微克/毫升(抗IL-4)濃度的100μl體積抗細胞因子MoAb包被。室溫培養(yǎng)平板過夜，然后用無菌水洗滌4次，PBS和0.05％Tween-20洗滌3次。接著用0.2ml RPMI1640和1％BSA封閉各孔，在5％CO2中(37℃)培養(yǎng)10分鐘。此時，制備所需濃度的細胞懸液。
分別用PBS和含有0.05％Tween-20的PBS洗滌3次除去封閉溶液。以預(yù)先確定的濃度和稀釋度(即，1×106/孔)將細胞-式三份以0.1ml體積接種入孔中。培養(yǎng)板在5％CO2(37℃)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時。每次用PBS，然后是PBS和0.05％Tween-20洗滌3次，除去細胞。生物素化的MoAb用PBS和0.05％Tween-20+1％FB配制成最終濃度為0.25μg/ml的抗IFN-γ或4μg/ml的抗IL-4，在孔中加入0.1ml抗體溶液。培養(yǎng)板4℃濕室中培養(yǎng)過夜。
用PBS和0.05％Tween-20洗滌培養(yǎng)板3次，然后加入用PBS和0.05％Tween-20+1％FBS 1∶400稀釋的過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗生物素抗體，每孔0.1ml，使斑點顯影。
要使斑點可見，用PBS洗滌培養(yǎng)板3次，然后加入0.2ml底物。將10毫克3-氨基-9-乙基咔唑溶于一玻璃試管中的1ml二甲基甲酰胺，然后加入30ml 0.1M醋酸鈉緩沖液制備該底物液。即將使用前，在底物溶液中加入15微升H2O2。室溫下顯影斑點5-15分鐘，然后加入自來水停止顯影。用解剖顯微鏡計數(shù)斑點。
結(jié)果EIA反應(yīng)抗gD IgG類和亞類的應(yīng)答總結(jié)于表1。滴度低于50的(第一個血清稀釋度)被賦值為25。在第7日，只有用活的HSV1誘導(dǎo)的小鼠顯示出顯著的總IgG滴度(表1a)。然而，接受可溶性gD和IL-12的動物血清中記錄到可測量水平的活性。在第28天時，接受可溶性亞基疫苗和所有劑量IL-12的小鼠和單用可溶性疫苗相比，可見應(yīng)答增強模式。在此，施用了可溶性gD和1.0微克IL-12的小鼠血清應(yīng)答最大。在接種AlPO4-吸附糖蛋白的小鼠中，增強的IgG EIA應(yīng)答僅在用AlPO4和gD加0.2微克IL-12免疫的動物中觀察到，免疫導(dǎo)致大約兩倍的增加。第35日，可見對可溶性gD(無AlPO4)的總IgG抗體應(yīng)答呈劑量依賴性的IL-12佐劑效果。聯(lián)合施用0.2、1.0和5.0微克的IL-12與gD分別導(dǎo)致應(yīng)答增加5-,24-和215-倍。相反的，當IL-12加到AlPO4吸附的gD時，最大的應(yīng)答發(fā)生在用0.2微克IL-12時。
除了HSV1-感染動物組，IgG1應(yīng)答(表1b)在任何處理組中第7日都未見到，而在HSV1處理組中見到低水平的活性。滴度低于50的(第一個血清稀釋度)被指定為25。在第28日，用AlPO4吸附，但沒有IL-12的糖蛋白免疫的小鼠血清可見最大的抗gD IgG1應(yīng)答。事實上，在AlPO4吸附的疫苗中加入IL-12導(dǎo)致該應(yīng)答明顯可見且呈劑量相關(guān)性降低。相反，IL-12和可溶性gD聯(lián)合施用和單用亞基疫苗比較，導(dǎo)致IgG1應(yīng)答增強。然而，無IL-12配方疫苗產(chǎn)生的活性水平和單用AlPO4吸附的亞基疫苗觀察到的同樣大。第35日，在所有組中IgG1滴度減弱。此時，接受可溶性gD和IL-12的小鼠的IgG1滴度，達到了那些用AlPO4吸附的亞基疫苗免疫后的小鼠所見的可比水平。
抗gD IgG2a應(yīng)答(表1c)第7日時在HSV1引發(fā)的動物中是明顯的。滴度低于50的(第一血清稀釋度)被指定為25。此時也注意到用可溶性gD和0.2或5.0微克IL-12引起一中等程度應(yīng)答。第28日，施用IL-12導(dǎo)致了IgG2a滴度顯著增加。這在接受可溶性gD的動物中特別明顯，比這些動物中觀察到的滴度增加1000倍以上。IL-12和AlPO4吸附的疫苗的聯(lián)合施用也導(dǎo)致gD特異性IgG2a抗體的顯著增加。在這種情況下，當用0.2微克IL-12時，IgG2a抗體應(yīng)答最大，提示鋁結(jié)合的IL-12顯著增強了生物活性。第35日，注意到總IgG應(yīng)答模式和IgG2a應(yīng)答模式緊密并行，表明IL-12和亞基gD疫苗聯(lián)合施用導(dǎo)致顯著佐劑效應(yīng)，以及誘導(dǎo)了高滴度的IgG2a抗體。
表1aIL-12對HSV-2gD免疫的血漿IgG抗體應(yīng)答的增強 表1bIL-12對HSV-2gD免疫的血漿IgG1抗體應(yīng)答的增強
表1cIL-12對HSV-2gD免疫的血漿IgG2a抗體應(yīng)答的增強 分泌性抗體應(yīng)答用IL-12配制的gD免疫后，測定了陰道分泌物的抗體活性。在一些處理組中觀察到抗-gD IgA(表2a)。最大滴度發(fā)生在接種可溶性gD和1.0微克IL-12的小鼠分泌物中。該組在第28日也顯示出抗gD IgG的最高滴度(表2b)。在施用AlPO4吸附的gD和0.2微克IL-12的小鼠中見到相對強的IgG滴度。滴度低于5的(第一個血清稀釋度)被指定為3。第35日，任何一組的陰道沖洗液中都沒有顯著的gD特異性IgA。然而，用可溶性或AlPO4吸附的gD加上5.0微克IL-12免疫的動物陰道洗液顯示出顯著的抗原特異性IgG滴度。
表2a對配制有IL-12的gD的粘膜抗HSV-2 IgA應(yīng)答 表2b對配制有IL-12的gD的粘膜抗HSV-2 IgG應(yīng)答
血清HSV-2中和滴度補體增強的中和性抗體滴度(表3)在接受可溶性gD和IL-12的小鼠血清中呈劑量依賴性方式增加。這些滴度分別在該細胞因子水平為0.2,1.0和5.0微克時呈5-,15-,和50-倍增加。滴度低于10的(第一個血清稀釋度)被指定為5。就ELISA測定的抗gD應(yīng)答而言，由鋁吸附的gD誘導(dǎo)的最大病毒中和應(yīng)答是用0.2微克IL-12誘導(dǎo)的。
表3IL-12對gD免疫的血漿中和抗體應(yīng)答的增強 淋巴細胞增殖反應(yīng)對回憶抗原的體外母細胞形成反應(yīng)總結(jié)在表4中?；貞浛乖撬拗髟谙惹坝龅竭^的抗原；在本例中，免疫小鼠的回憶抗原是gD。使用關(guān)于HSV-1和HSV-2的該術(shù)語推測和病毒表達的gD有高度的交叉反應(yīng)性。未觀察到任何一組顯示出對Vero細胞對照抗原的高水平非特異性作用。對HSV-1抗原的異源應(yīng)答在用可溶性和AlPO4吸附的gD和1.0微克IL-12免疫的小鼠收獲的細胞中最大。體外用HSV2和gD2抗原刺激也記錄到相似模式的應(yīng)答。有趣的是，用HSV-1誘導(dǎo)的小鼠脾細胞在本實驗中顯示出對HSV-2gD的應(yīng)答性。
表4gD/IL-12淋巴細胞增殖反應(yīng) 細胞因子應(yīng)答評價了用1.0微克劑量IL-12(免疫)的所選小鼠組的細胞因子分泌情況，并總結(jié)于表5。和單用可溶性gD或用AlPO4吸附的gD免疫組比較，加入IL-12導(dǎo)致IFN-γ分泌比IL-4顯著增加。
表5細胞因子分泌情況 溶細胞活性用gD加上1.0微克IL-12，或?qū)φ找呙缑庖邉游锏腃TL應(yīng)答總結(jié)于表6。E∶T比率在25∶1到3∶1范圍時，HSV-1誘導(dǎo)的小鼠產(chǎn)生相對均一的溶細胞活性。用可溶性gD加1.0微克IL-12免疫的小鼠獲得的免疫細胞培養(yǎng)物中觀察到可比較水平的殺傷。在其它疫苗組或?qū)φ战M脾細胞中未見顯著的溶細胞活性。
表6CTL活性 等效例本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員使用常規(guī)實驗方法將會認識，或能夠確定，本文所述的本發(fā)明具體實施例的許多等效例。這些等效例應(yīng)包括在本申請的權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1．一種疫苗組合物，其特征在于它包括單純皰疹病毒抗原，輔佐劑量的白細胞介素IL-12和礦物懸液的混合物，以及可任選的包括生理學上可接受的載體。
2．如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于白細胞介素IL-12吸附于礦物懸液。
3．如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于白細胞介素IL-12是人白細胞介素IL-12。
4．如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于礦物懸液是明礬的水懸浮液。
5．如權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其特征在于明礬是氫氧化鋁或磷酸鋁。
6．如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于單純皰疹病毒抗原選自單純皰疹Ⅰ型糖蛋白D，單純皰疹Ⅱ型糖蛋白D，以及它們的組合。
7．如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于白細胞介素-12的輔佐劑量是約1納克到約20毫克。
8．一種誘導(dǎo)對單純皰疹病毒抗原免疫應(yīng)答的方法，其特征在于所述方法包括對脊椎動物宿主施用有效劑量的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含單純皰疹病毒抗原，輔佐劑量的白細胞介素IL-12和礦物懸液的混合物，以及可任選地包含生理學上可接受的載體。
9．如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于白細胞介素IL-12吸附于礦物懸液。
10．如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于白細胞介素IL-12是人白細胞介素IL-12。
11．如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于礦物懸液是明礬的水懸浮液。
12．如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于明礬是氫氧化鋁或磷酸鋁。
13．如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于單純皰疹病毒抗原選白單純皰疹Ⅰ型糖蛋白D，單純皰疹Ⅱ型糖蛋白D，以及它們的組合。
14．如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于白細胞介素-12的輔佐劑量是約1納克到約20毫克。
15．一種免疫原性組合物，其特征在于它包括單純皰疹病毒抗原，輔佐劑量的白細胞介素IL-12和礦物懸液的混合物，以及可任選的包括生理學上可接受的載體。
16．如權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，其特征在于白細胞介素IL-12吸附于礦物懸液。
17．如權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，其特征在于白細胞介素IL-12是人白細胞介素IL-12。
18．如權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，其特征在于礦物懸液是明礬的水懸浮液。
19．如權(quán)利要求18所述的免疫原性組合物，其特征在于明礬是氫氧化鋁或磷酸鋁。
20．如權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，其特征在于單純皰疹病毒抗原選自單純皰疹Ⅰ型糖蛋白D，單純皰疹Ⅱ型糖蛋白D，以及它們的組合。
21．如權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，其特征在于白細胞介素-12的輔佐劑量是約1納克到約20毫克。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有抗原,(例如單純皰疹病毒抗原)和白細胞介素IL－12混合物的疫苗組合物,該疫苗組合物可吸附于礦物懸液。這些疫苗組合物調(diào)節(jié)對抗原的保護性免疫應(yīng)答。
文檔編號C07K14/035GK1299287SQ99804331
公開日2001年6月13日 申請日期1999年2月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月12日
發(fā)明者E·M·米什金, J·H·埃爾德里奇 申請人:美國氰胺公司