專利名稱：測(cè)定NT-proBNP的方法
測(cè)定NT-proBNP的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定哺乳動(dòng)物中的NT-proBNP或其片段的方法。
心房鈉尿肽(ANP)、腦鈉尿肽(BNP)和C型鈉尿肽(CNP)屬于這樣的激素家族，所述激素可以由心房、心室和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌。
所有鈉尿肽在C-末端處都具有相同的由二硫鍵連接的17氨基酸的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這個(gè)部分負(fù)責(zé)它們的生物學(xué)活性。目前，已表征了3種受體，即ANP-A受體(特異于ANP和BNP ) 、 ANP-B受體(特異于CNP和ANP)和清除受體(clearance receptor) 。 BNP首次分離自豬腦，并且后來也在豬心臟中發(fā)現(xiàn)。在文獻(xiàn)中已描述了，鈉尿肽保護(hù)生物體免于液體過量和高血壓。已在綜述出版物中廣泛描述了鈉尿肽的生物學(xué)、生物化學(xué)和病理生理學(xué)作用?，F(xiàn)在，鈉尿肽作為用于在人中心臟病的診斷和治療控制的血清標(biāo)志物的價(jià)值已得到了充分證明。
在人中，主要由心室分泌的BNP的成熟形式從高分子前階段(即proBNP (1-108))形成。在生理學(xué)上有活性的C-末端肽，即proBNP(77-108 )(也稱為BNP-32)，由32個(gè)氨基酸組成，在血漿中循環(huán)的N-末端形式由76個(gè)氨基酸組成(NT-proBNP (1-76))。此外，還已描述了 pre-proBNP的片段8-29和31-57，其中特別地，用于測(cè)量NT-proBNP 1-76的片段8-29的測(cè)定提供了類似的臨床數(shù)據(jù)。
心臟病不僅在人中起重要作用，動(dòng)物，尤其是寵物例如犬和貓，或者有用動(dòng)物例如馬，也受這些疾病的折磨?；加行呐K病的馬一般不是非常健康的，它們快速出汗，它們的脈搏增加，它們呼吸短促或發(fā)熱。所有馬中大約0. 3%具有先天性心臟缺陷，它們的動(dòng)脈可以運(yùn)輸比健康狀態(tài)下更少的氧。然而，在大多數(shù)情況下，心臟問題在生命過程中發(fā)展，心律失常頻繁發(fā)生，但在靜止?fàn)顟B(tài)下大多數(shù)是正常的。病理性心律失常是可以由缺氧或感染引起的心肌損傷的征兆。心肌的炎癥被稱為心肌炎。如果心肌纖維的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，那么心臟將不再能夠適當(dāng)?shù)乇醚?，人們稱之為心肌病。心內(nèi)膜的炎癥由通過血液，例如經(jīng)由發(fā)炎的蹄或關(guān)節(jié)到達(dá)心臟的細(xì)菌引發(fā)。在心包膜積液的情況下，水通過血管壁進(jìn)入心包膜。通常，對(duì)心臟問題不進(jìn)行治療將導(dǎo)致心功能不全。在輕度情況下，循環(huán)將會(huì)具有平衡效應(yīng)，在重度情況下，預(yù)期會(huì)出現(xiàn)心力衰竭。在患有心臟右半部分的瓣膜缺損的馬中，保留在
器官中的血液將導(dǎo)致肝硬化。心臟病由獸醫(yī)借助于聽診、超聲學(xué)或ECG來進(jìn)行診斷。最初，馬不應(yīng)當(dāng)經(jīng)歷任何應(yīng)激，并且理想地，它應(yīng)當(dāng),皮圏留在開放的馬廄或外部的運(yùn)馬用帶頂拖車中，從而使得給心臟供應(yīng)大量的氧。心臟病的治愈或治療分別可能花費(fèi)非常長的時(shí)間，治療在任何情況下將花費(fèi)4-6周。某些馬可以永久治愈，其他馬在藥療法停止時(shí)將會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)。然而，即使在治愈的情況下，也不再能夠從所迷馬要求得到最大性能。由于心臟能夠最初通過更努力地工作來抵消功能障礙，所以此類疾病在大多數(shù)情況下將仍是無法檢測(cè)的，后果是心臟狀態(tài)將由于增加的心臟運(yùn)轉(zhuǎn)而惡化。當(dāng)動(dòng)物的心臟不再能夠補(bǔ)償虛弱時(shí)，在大多數(shù)情況下將能夠識(shí)別出由于心臟病而引起的癥狀，例如疲勞、循環(huán)功能不全、疲倦。在此種情況下，心臟病已進(jìn)展得如此之遠(yuǎn)，從而幾乎不可能完全治愈。因此，盡可能早地在馬中診斷出心臟病將具有極大的重要性，并且可以避免不可挽回的損傷，或甚至防止
在運(yùn)動(dòng)中所使用的馬不得不無法取消地被禁止參與涉及賽跑和錦標(biāo)賽的運(yùn)動(dòng)。
心臟瓣膜和心肌的慢性改變通常是無法治愈的，心臟病的再進(jìn)一步的進(jìn)展可以通過使用藥物來減慢。也出于該原因，發(fā)展中的心臟病的早期診斷是重要的。常規(guī)地，主要是將物理方法用于這個(gè)目的，例如心音的聽診、心電圖的記錄、X射線和超聲波檢查。這些檢查方法主要具有下述缺點(diǎn)它們只有在已可看見或可聽見的心臟損傷能夠被
直接檢測(cè)之后才能進(jìn)行。此外，物理檢查方法需要合適和普遍昂貴的
裝置以用于作出合適的診斷。
總體上，馬的心臟病高度類似于在人中的類似疾病。在許多心臟病，例如心功能不全、擴(kuò)張型心肌病、肥厚型心肌病、左心室肥大和功能障礙中，釋放出BNP。這種激素引起經(jīng)由腎的液體的分泌，并因此調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)。因?yàn)檫@種肽在心臟中產(chǎn)生，并且在心臟受到過度緊應(yīng)激和充血時(shí)越來越多地產(chǎn)生，所以血液中BNP水平的檢測(cè)是用于評(píng)估心功能不全的合適方法。
也如同其他鈉尿肽一樣，BNP在調(diào)節(jié)水平衡和血壓方面起重要作用。如果使心臟壁伸展，那么它釋放更多的BNP,這導(dǎo)致經(jīng)由腎的鈉和液體的分泌，并且導(dǎo)致血管的擴(kuò)張，總而言之，這能夠降低血壓并且充填心臟。BNP由心肌細(xì)胞作為proBNP來合成，proBNP最終被切割成N-末端的proBNP和BNP。 BNP的這兩個(gè)部分凈皮分泌到血液中，并且可以在其中被檢測(cè)到。
一般地，動(dòng)物中的心臟病在下列相關(guān)的出版物中進(jìn)行了討論Bright JM和Cali JV， J Am Vet Med Assoc 2000, 216:1110-4;Guglielmini C， Vet Res Commun 2003， 27 Suppl 1:555; Bos謂d A等人，J Small AnimPract 2003， 44:104-8; Takemura N等人，J VetMed Sci 2003， 65:1265-7; Mac-Donald KA等人，J Vet Intern Med2003， 17:172-7; Greco DS等人，Can Vet J 2003， 44: 293-7; MonnetE等人，J Am Vet Med Assoc 1997， 211: 569-72; Hamlin RL等人，JVet Intern Med 1996， 10: 85-7; Gaschen L等人，J Vet Intern Med
1999, 13:346-56。
借助于其可以在個(gè)體血清中分別檢測(cè)出人proBNP或其片段的多
種方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。EP 0 648 228 Bl、 WO 03/87819和FR 2
843 396在此處可以作為例子而提及。
在US 2004/0018577中，一^開了包括至少三種抗體的免疫測(cè)定法，所述抗體都能夠結(jié)合分析物的不同表位。此處，待檢測(cè)的分析物特別涉及關(guān)于心臟病的標(biāo)志物的檢測(cè)，其中 一般還可以檢測(cè)BNP和proBNP。
Biondo A. W.等人(Vet, Pathol. 2003， 40 (5): 501-506 )描述了借助于多克隆抗體來檢測(cè)貓中的ANP和BNP的方法，所述多克隆抗體分別針對(duì)包含氨基酸1-28的ANP的肽，和針對(duì)包含proBNP的氨基酸43-56的肽。在EP 1 016 867 Al中，描述了用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物中的preproBnP的免疫測(cè)定法。此處，使用針對(duì)包含人BNP的氨基酸27-102、 73-102和27-64的肽的抗體。
Jortani S.A.等人(Clin. Chem. 2003， 50 (2): 265-278 )描述了 BNP及其前原形式和原形式作為關(guān)于心臟病的可能標(biāo)志物的用途。這篇文章未提及任何適合于檢測(cè)馬中的心臟病的BNP的優(yōu)選肽區(qū)域。
在W0 2000/35951中，公開了幾種針對(duì)其可以產(chǎn)生抗體的肽，所述抗體適合于診斷心臟病的方法。此處，/〉開了包含人Nt-pro-BNP蛋白的氨基酸1-13、 37-49和65-76的三種肽，其也可以用于產(chǎn)生針對(duì)這些肽的抗體。
在WO 2006/027374 A中，^>開了用于犬和貓的特異性BNP測(cè)試。已顯示，借助于其中所公開的抗體，還可以在某些其他動(dòng)物中檢測(cè)BNP，然而迄今為止無法提供馬BNP的特異性檢測(cè)。
在Mifune H等人(Anat. Embryol. (Berl) 192 (1995): 117-21 )中，描述了檢測(cè)馬心臟的心房中的免疫反應(yīng)性ANP和BNP肽的方法。
在EP 1 557 431 Al中，公開了定量人BNP的方法，其中使用針對(duì)包含人BNP的氨基酸殘基5-13、 1-10、 15-25和17-32的表位的抗體。
Richter R.等人(Acta Anat (Basel) ， 162 (1998): 185-93 )描述了在馬心臟中ANP的定位。
此外，分別用于檢測(cè)人proBNP及其片段的幾種測(cè)試試劑盒正在進(jìn)行銷售(例如，來自Roche和Biomedica )。然而，不存在有借助于其可以在馬樣品中特異性地測(cè)定proBNP的已知方法。因此并且由于成本密集且復(fù)雜的馬的體格檢查，本發(fā)明的目標(biāo)是提供分別用于在來自馬的樣品中測(cè)定proBNP及其片段的合適工具。特別地，以此將使得能夠及時(shí)診斷早期的心臟病。
因此，本發(fā)明涉及測(cè)定馬NT-proBNP或其片段的方法，所述方法
包括下述步驟
-提供馬樣品，-使該樣品與至少一種特異性地結(jié)合馬NT-proBNP的抗體接觸，
和
-測(cè)定該樣品中存在的馬NT-proBNP或其片段的存在情況和/或濃度。
采用本發(fā)明，提供了馬NT-proBNP的測(cè)定，因?yàn)楣_了針對(duì)這個(gè)物種的特異性抗體。以這種方式，可以達(dá)到有效且早期地診斷馬中的心臟病，該診新是高度相關(guān)的。
優(yōu)選地，在馬NT-proBNP或其片段的測(cè)定中，所述至少一種抗體結(jié)合來自SEQ ID No. 1的(當(dāng)然，馬特異性的)NT-proBNP表位，特別是選自具有下列序列的表位的表位PLGGLGPASEQS(SEQ IDNo. 3)、PASEQSGIQELL ( SEQ ID No. 4 ) 、 LLDRLGDSVLEP ( SEQ ID No. 5)、SVLEPQAE匿L ( SEQ ID No. 6 ) 、 PQAERMTLEPLQ ( SEQ ID No. 7 )、EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 ) 、 LQQDRGPAEASE ( SEQ ID No. 9 )、DRGPAEASETRG (SEQ ID No. 10) 、 PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11)、RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12) 、 LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13)、PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14)或LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15)。
優(yōu)選地，在馬NT-proBNP或其片段的測(cè)定中，另外還使用對(duì)于馬NT-proBNP非特異性的至少一種NT-proBNP抗體。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，另外還使用對(duì)于馬pre-proBNP特異性的至少一種抗體，特別是特異性地結(jié)合來自SEQ IDNo. l的至少一種表位的抗體，所述表位選自具有序列SPK薩RNSGCFG(SEQ ID No. 16)或DRIGSFSGLGCN (SEQ ID No. 17)的表位。
應(yīng)當(dāng)指出，馬NT-proBNP序列和proBNP序列分別作為關(guān)于整個(gè)馬科的例子而提及，由此，本文公開的序列也包括偏離本文7>開的序列的在這個(gè)科其他屬動(dòng)物的proBNP序列中的各個(gè)氨基酸，只要這些偏離氨基酸不以使得特異性結(jié)合不再可能的方式與本文公開的抗體的表位相關(guān)。本文公開的關(guān)于其他物種的氨基酸序列已在公共數(shù)據(jù)庫中公開。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的樣品包括液體樣品，例如血液、尿，還有組織樣品，例如心臟肌肉系統(tǒng)或腦的組織切片。需要時(shí)，可
10以適當(dāng)?shù)刂苽錁悠?，例如以便有助于樣品隨后與本發(fā)明抗體的接觸或
者使得樣品隨后與本發(fā)明抗體的接觸成為可能。因此，包含proBNP、NT-proBNP或其片段的級(jí)分分別可以由血液樣品提供，或者組織樣品可以例如進(jìn)行勻漿并且同樣地與非蛋白質(zhì)級(jí)分相分開。
至少一種抗體與樣品中的馬NT-proBNP的表位的結(jié)合表示，所述抗體能夠結(jié)合在特定蛋白質(zhì)的指定序列區(qū)域中的表位，除了該指定區(qū)域之外，這種抗體不能特異性地結(jié)合該蛋白質(zhì)的表位。
根據(jù)本發(fā)明，能夠結(jié)合馬特異性表位的抗體可以用于測(cè)定NT-proBNP和proBNP或其片段。然而，可能有利的是，使用數(shù)種(例如，2、 3、 4或5種)能夠結(jié)合NT-proBNP的不同表位的抗體。
可以通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法來測(cè)定樣品中存在的馬NT-proBNP或其片段的存在情況和/或的濃度。例如，在此處應(yīng)當(dāng)分別提及在液體樣品中施行酶免疫測(cè)定法(例如ELISA)或者在組織樣品中施行免疫組織化學(xué)方法。
根據(jù)本發(fā)明的"抗體"還包括能夠識(shí)別根據(jù)本發(fā)明的表位的抗體的片段。因此，抗體可以例如僅由具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的F(ab)部分組成。這些抗體片段可以進(jìn)一步是雙特異性抗體或異微型抗體(heterominibody)的一部分(參見例如，EP 1 100 830 Bl)。
根據(jù)本發(fā)明的"NT-proBNP或其片段"包括所有這樣的NT-proBNP片段，所述片段在體內(nèi)形成或在體外產(chǎn)生(例如，通過將樣品與蛋白酶或化學(xué)物質(zhì)例如CNBr相混合)，并且具有根據(jù)本發(fā)明的表位。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，可以使用數(shù)種能夠特異性地結(jié)合馬proBNP上的數(shù)種不同表位的抗體。為此，根據(jù)本發(fā)明可以使用至少一種能夠結(jié)合至少一種表位的抗體。此外，此處應(yīng)當(dāng)提及，本文所示的氨基酸區(qū)域不必要僅具有一種表位，而是依賴于其大小還可以包含數(shù)種表位。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法包括使用能夠特異性地結(jié)合至少一種表位的數(shù)種抗體的組合。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述至少一種抗體是多克隆的和/或單克隆的。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明，完整抗體的功能性變化形式、其片段或衍生物也由本領(lǐng)域技術(shù)人員歸于術(shù)語"抗體"之下，或者被理解為等價(jià)于所述抗體的藥劑。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的抗體可以是多克隆的，也可以是
單克隆的。為了產(chǎn)生這些抗體，使用包含本文公開的馬proBNP的氨基酸區(qū)域的肽片段。這些肽片段可以合成產(chǎn)生(Merri-f ield R. P. , 1963，J Am. Chem. Soc 85， 2000， 149)，重組產(chǎn)生，或者通過重組或天然來源的proBNP的化學(xué)或酶促降解來產(chǎn)生。依賴于其大小，從中回收的肽將被結(jié)合至免疫原性栽體(例如KLH)，或者直接用于產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體(例i。， K6hler G.和Milstein C， 1975， Nature256: 495; Galfre等人，1977， Nature 266:550 )。根據(jù)本發(fā)明，也可以重組產(chǎn)生抗體。產(chǎn)生重組抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員充分已知的(參見,例如,Sambrook等人，Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 2001)。
根據(jù)進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案，至少一種另外的抗體與所述至少一種抗體或所述至少一種表位結(jié)合，由此，例如根據(jù)本發(fā)明的測(cè)試可以作為夾心式觀'J定法(sandwich assay)來進(jìn)行。
另外的抗體與所述至少一種抗體的結(jié)合使得能夠分別定性和定量地測(cè)定后者，并且間接地測(cè)定結(jié)合至所述至少一種抗體的表位。如果所述至少一種另外的抗體與所述至少一種4^位結(jié)合，那么經(jīng)由酶免疫測(cè)定法可以定性和定量地測(cè)定所述至少一種抗體與所述至少一種表位的結(jié)合，如果例如所述至少一種抗體固定在固相上。
優(yōu)選地，所述至少 一種抗體和/或所述至少一種另外的抗體是經(jīng)標(biāo)記的。
在這種情況下，所述至少一種抗體和/或所述至少一種另外的抗體通過下列物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記酶，例如過氧化物酶，特別是辣根過氧化物酶，生物素，熒光染料，特別是熒光素(FITC， DFTF) , R-藻紅蛋白(PE ),多甲藻-葉綠素-蛋白(PerCP )和串接綴合物(tandemconjugate),例如PE-Cy5或PE-德克薩斯紅，膠體金或放射性核素。通過標(biāo)記這兩種抗體之一，分別地，可以通過次級(jí)反應(yīng)來測(cè)定或者還可以直接測(cè)定與所述至少一種表位相結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的抗體的存在
情況和濃度。而所述抗體本身可以通過A蛋白綴合物(例如，A蛋白-金綴合物)來檢測(cè)。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，將所述至少一種抗體或所述至少一種另外的抗體結(jié)合至固相。
通過所述至少一種抗體或所述至少一種另外的抗體的所述結(jié)合，可以產(chǎn)生例如抗體芯片、包被的微量滴定板或側(cè)流裝置(lateral flowdevices),它們可以在多種方法中4吏用。
優(yōu)選地，馬proBNP或其片段的測(cè)定通過選自下列的方法來進(jìn)行放射免疫測(cè)定法、免疫結(jié)合測(cè)定法、Western印跡、免疫組織化學(xué)、酶免疫測(cè)定法、側(cè)流裝置(LFD，測(cè)試條(test strips))及其組合。
上述方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員充分已知的。這些方法的綜述可以例如在"Bioanalytik" ( Lottspeich和Zorbas， Spektrum Verlag 1998 )中找到。側(cè)流裝置(LFD，測(cè)試條)已公開在例如冊(cè)02/059567中。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明還涉及特異性地結(jié)合馬NT-proBNP的抗體或抗體混合物。根據(jù)本發(fā)明，"特異性地結(jié)合"意指馬形式的該蛋白質(zhì)被這些抗體特異性地識(shí)別，并且這些抗體不結(jié)合其他物種的proBNP。在這種情況下，如果抗體在可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地決定的某些條件下顯示出這種特異性，則是足夠的，即使在較不嚴(yán)格的條件下(在抗原/抗體結(jié)合測(cè)定法中)，這種特異性不存在。特別地，根據(jù)本發(fā)明，"特異的"意指根據(jù)本發(fā)明的抗體或抗體混合物(例如，多克隆抗體制備物或者識(shí)別不同表位的單克隆抗體的混合物)分別在結(jié)合測(cè)定法中能夠?qū)ⅠRNT-proBNP與人、鼠類、大鼠、豬、?？苿?dòng)物、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物或綿羊proBNP區(qū)分開(即，分別地，牽涉不同的結(jié)合，或者專一地結(jié)合馬preBNP)。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的抗體或抗體混合物特異性地結(jié)合來自SEQID No. 1的至少一種表位，所述表位選自具有下列序列的表位PLGGLGPASEQS (SEQ ID No. 3) 、 PASEQSGIQEIX (SEQ ID No. 4)、LLDRLGDSVLEP ( SEQ ID No. 5 ) 、 SVLEPQAE匿L ( SEQ ID No. 6 )、PQAE薩LEPLQ ( SEQ ID No. 7 )， LQQDRGPAEASE (SEQ ID No. 9)、 PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11) LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13) LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15)
EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 )、 DRGPAEASETRG ( SBQ ID No. 10)， RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12)、 PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14)、 SP薩RNSGCFG (SEQ ID No. 16)
或DRIGSFSGLGCN (SEQ ID No. 17)。與本文提及的馬特異性表位的 特異性結(jié)合通過根據(jù)本發(fā)明的抗體來達(dá)到，優(yōu)選以較大的多肽，主要 以馬pre-proBNP、 proBNP、 NT-proBNP或BNP。在這種情況下，根據(jù) 本發(fā)明的抗體不牽涉與其他物種的相應(yīng)同源多肽的任何顯著結(jié)合，至 少在足夠嚴(yán)格的條件下不顯著結(jié)合(即，諸如通常在BNP的臨床免疫 診斷方法中使用的那些條件)。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選地通過表位特 異性親和層析或作為表位特異性單克隆抗體來產(chǎn)生(在每種情況下， 通過使用表位作圖)。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及具有根據(jù)SEQ ID. No. 1的氨基 酸序列的多肽或其特異性片段，特別是SEQ ID. No. l的氨基酸8-113、 8-81和82-113。氨基酸1-7不再存在于pre-proBNP中(信號(hào)序列)； 成熟的馬BNP激素從氨基酸82 (S)處開始。SEQ ID No. l的"特異 性"片段是這樣的片段，所述片段與已知pre-pro-BNP序列相差至少 一個(gè)氨基酸殘基，并且包含至少7個(gè)，優(yōu)選至少8個(gè)，特別是至少10 個(gè)氨基酸。特別優(yōu)選的本發(fā)明片段優(yōu)選地包含選自下列的一個(gè)或多個(gè) 表位PLGGLGPASEQS (SEQ ID No. 3) 、 PASEQSGIQELL (SEQ ID No. 4 ) 、 LLDRLGDSVLEP ( SEQ ID No. 5 ) 、 SVLEPQAE麗L ( SEQ ID No. 6 )、 PQAERMTLEPLQ ( SEQ ID No. 7 ) 、 EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 )、
LQQDRGPAEASE (SEQ ID No. 9)、
PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11)
LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13)
LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15)
DRGPAEASETRG (SEQ ID No. 10)、 RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12)、 PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14)、
,SPKMMRNSGCFG (SEQ ID No. 16)
或DRIGSFSGLGCN (SEQ ID No. 17)。
因此，本發(fā)明還涉及具有選自下列序列的氨基酸序列的多肽PLGGLGPASEQS ( SEQ ID No. 3 )，
LLDRLGDSVLEP ( SEQ ID No. 5 )，
PQAERMTLEPLQ ( SEQ ID No. 7 )、
LQQDRGPAEASE ( SEQ ID No. 9 )、
PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11)
LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13)
LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15)
PASEQSGIQELL ( SEQ ID No. 4 )、
SVLEPQAERMTL ( SEQ ID No. 6)、
EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 )、
DRGPAEASETRG (SEQ ID No. 10)、
RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12)、
PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14)、 SPKMMRNSGCFG (SEQ ID No. 16)
或DRIGSFSGLGCN (SEQ ID No. 17)。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的多肽分別是化學(xué)合成的，或 從樣品中分離的，或重組產(chǎn)生的。
為了合適地從分離自樣品或重組產(chǎn)生的肽中產(chǎn)生所述表位，可以 通過本身已知的酶促或化學(xué)方法來進(jìn)行進(jìn)一步加工所述肽。根據(jù)本發(fā) 明的多肽也可以作為與另外的分子的綴合物來提供，優(yōu)選地在所述肽 的N-或C-末端處與另外的分子的綴合物，特別是與并非天然地和本發(fā) 明多肽相連接的另外多肽的綴合物。
本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及根據(jù)本發(fā)明的抗體或抗體混合物在根 據(jù)本發(fā)明的方法中用于測(cè)定馬NT-proBNP或其片段的用途。 本發(fā)明的肽可以以經(jīng)標(biāo)記的形式用于竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)定法。 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的肽用于產(chǎn)生抗體或抗體混合物。 此外，根據(jù)本發(fā)明的肽在根據(jù)本發(fā)明的方法中用作陽性對(duì)照或用 作用于濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及用于測(cè)定馬NT-proBNP或其片段的試 劑盒，其包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的抗體或者至少一種根據(jù)本發(fā)明的 抗體混合物；用于定性和/或定量地檢測(cè)所述至少一種抗體或所述至少 一種抗體混合物與馬NT-proBNP或其片段的結(jié)合的工具；和任選地， 作為陽性對(duì)照或作為用于濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)的根據(jù)本發(fā)明的肽(即，馬 proBNP或其片段)。
根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒可以包含至少一種另外的抗體。 該另外的抗體具有對(duì)于所述至少一種抗體的親和性或者還有對(duì)于所述至少一種表位的親和性。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述至少一種抗體和/或所述至少一種 另外的抗體是經(jīng)標(biāo)記的。
優(yōu)選地，所述標(biāo)記包括酶，例如過氧化物酶，特別是辣根過氧 化物酶，生物素，熒光染料，特別是熒光素(FITC, DFTF) , R-藻紅 蛋白(PE)，多甲藻-葉綠素-蛋白(PerCP)和串接綴合物，例如PE-Cy5 或PE-德克薩斯紅，膠體金或放射性核素。
本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及本發(fā)明的試劑盒在測(cè)定馬proBNP的 方法中的用途。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法， 其中將編碼這些多肽的核酸引入合適的宿主生物中，以本身已知的方 式由所述宿主表達(dá)所述多肽，并且回收所表達(dá)出的多肽。這些方法是 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括合適的宿主、表達(dá)系統(tǒng)和就這樣回 收所述多肽的方法。
另一方面，本發(fā)明的多肽也可以是化學(xué)合成的，優(yōu)選經(jīng)由固相方 法(Merryfield)。同樣地，關(guān)于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可用許多本身 已知的方法。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗體用于在馬中診斷心臟病的用途。在這 種情況下，抗體可以在已知用于人的裝置(set-up)中使用。本發(fā)明
的多肽也可以例如用作標(biāo)準(zhǔn)、比較用樣品，或者用于滴定仍未反應(yīng)的抗體。
將通過下列實(shí)施例和附圖更詳細(xì)地說明本發(fā)明，然而并不局限于此。
圖1顯示了各個(gè)物種的已知BNP序列(SEQ ID No. 32-39 )相比
于根據(jù)本發(fā)明的序列而言的比對(duì)；
圖2顯示了馬pre-proBNP變體(SEQ ID No. 40-45 )的i殳計(jì)；
圖3顯示了各個(gè)物種的pre-proBNP的比較結(jié)構(gòu)分析；
圖4顯示了馬pre-proBNP ( eq-pre-proBNP )的最可能變體的結(jié)
構(gòu)分析；圖5顯示了 eq-pre-proBNP的分離；
圖6顯示了在1. 2%瓊脂糖凝膠上的總RNA的分析M) GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas) , 150 ng; 1)總RNA，心臟的右半部 分，lug; 2)總RNA，心臟的左半部分，lyg;
圖7顯示了在1. 2。/。瓊脂糖凝膠上的ds cDNA的分析M) GeneRuler 腿Ladder Mix( Fermentas ) ， 150 ng; 1)來自馬心臟組織的ds cDNA, 120 ng;
圖8顯示了來自馬的pre-pro-BNP的cDNA的部分序列；
圖9顯示了由各種鈉尿肽的序列而獲得的系統(tǒng)樹；所比較的鈉尿
肽的各自氨基酸序列得自相關(guān)的序列數(shù)據(jù)庫；
圖IO顯示了對(duì)于各個(gè)物種的NT-proBNP而言，NT-proBNP-抗血清
的特異性。
實(shí)施例
實(shí)施例1:
人馬； re-; roJy^y^^/^設(shè) yv
盡管已經(jīng)闡明了類似于人pre-proBNP的某些物種(犬、貓、牛) 的那些分子的氨基酸序列，但迄今為止無人能夠分離出馬的 pre-proBNP并且對(duì)其進(jìn)行表征。這可能是由于不同動(dòng)物物種的 pre-proBNP分子的低的序列同源性(圖1)。因此，已開發(fā)了可以相 應(yīng)于馬的pre-proBNP的氨基酸鏈段的序列。先前公開的其他物種的 pre-proBNP分子的序列并未使得這些序列顯而易見，因?yàn)椋缫呀?jīng)提 及的，這些序列僅存在微小的相關(guān)性。已通過新方法選擇出了具有假 設(shè)的序列變體的最有希望的那些(圖2)，在所述新方法中借助于蛋 白質(zhì)組學(xué)輸入來對(duì)所述序列實(shí)施分子分析。
在這樣做時(shí)，在某些區(qū)域中具有經(jīng)建立的序列的一些變體令人驚 訝地顯示出所謂的識(shí)別因子(recognition factor)的顯著相關(guān)性，
這暗示了這些結(jié)構(gòu)的高度的分別在結(jié)構(gòu)和功能上的保守性，并因此暗示了關(guān)于所述序列變體的正確性而言的高度可能性。圖3給出了所施 行的分子分析的概況。圖4顯示了對(duì)于最可能的序列變體的類似的結(jié) 構(gòu)分析。
因?yàn)樽R(shí)別因子圖中的峰相應(yīng)于具有高度的抗原性和表位可用性的 區(qū)域，所以推斷，針對(duì)區(qū)域1-20和45-55的抗體應(yīng)當(dāng)適合于制備馬 eq-pre-proBNP。產(chǎn)生此類抗體，并且用它們來分離下文描述的分子。
么^Cj&清辦務(wù)馬AV尸；
借助于免疫親和層析來純化馬pre-proBNP，并且在竟?fàn)幮訣LISA 中進(jìn)行檢測(cè)。
將馬血清在2000 rpm下離心10分鐘，并且在添加1 ml/1
Proclin300后j^存于-20。C。
給鏈霉抗生物素蛋白-Sepharose (AMERSHAM)加載純化的生物素
化的S2190抗體AA 45-55。(柱參數(shù)100 m g抗體/ml鏈霉抗生物素
蛋白-Sepharose)。洗脫參數(shù)結(jié)合緩沖液，0.05M硼酸鹽，pH 8. 0;
洗脫緩沖液，0.1 M甘氨酸緩沖液，pH 2.0， 0.5 ml/分鐘。 義借勿于f爭(zhēng)遂^趁^ ^-; re-;7roAV尸； 通過使用針對(duì)序列1-20的抗體在ELISA中檢測(cè)回收的
eq-pre-proBNP。將相應(yīng)序列的經(jīng)過氧化物酶標(biāo)記的肽用作示蹤分子。
圖5顯示了免疫反應(yīng)性與親和層析的洗脫特性曲線圖的相關(guān)性。
由于該可良好測(cè)量的免疫反應(yīng)性，因而假定eq-pre-proBNP事實(shí)
上已得到分離，并且基于測(cè)定出的部分序列，進(jìn)行eq-pre-proBNP的
分子生物學(xué)擴(kuò)增(4)。
《^C^《馬心處逸織W^ ) W哞^"增w;7re-/;roAV/V 趟始#辨
在RNALater中，具有來自馬的心臟組織的兩個(gè)小管，分別將它們 命名為"右"和"左，，。 ,g WW的為、庠
根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，用來自Quiagen的RNeasy Fibrous Tissue Midi Kit來分離總RNA。將來自心臟的左半部分和右半部分的各200 mg組織分別用于分離。
在1. 2%瓊脂糖凝膠上分析總RNA的品質(zhì)(圖6 )。 c細(xì)合底.
才艮據(jù)生產(chǎn)商的說明書，用來自BD Biosciences的Library Construction Kit來進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。作為模板，使用1/i g 的總RNA。使用5' PCR引物和CDS III/3' PCR引物，通過PCR擴(kuò)增 (15個(gè)循環(huán))來制備雙鏈cDNA (ds cDNA)。
在1. 2%瓊脂糖凝膠上分析ds cDNA的品質(zhì)(圖7 )。
m ,增；
通過所給出的參考序列，得到幾種PCR引物。對(duì)于proBNP基因的 3'末端的擴(kuò)增，使用基因特異性正向引物和3' cDNA合成引物。對(duì)于 5'末端的擴(kuò)增，使用基因特異性反向引物和覆蓋SMARTIV寡核苷酸的 3'區(qū)域的引物。
經(jīng)由制備型瓊脂糖凝膠來分開特異性PCR產(chǎn)物，并且從凝膠中切 出所述片段。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，用來自Macherey-Nagel的 NucleoSpin Extract II Kit來分離所述DNA。
所述PCR片段各自用基因特異性引物進(jìn)行測(cè)序。用程序SeqMan (腿Star Lasergene Sof tware )對(duì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行^修整，并且將所獲 得的序列與來自Genbank數(shù)據(jù)庫的核苷酸和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較。
將顯示出極佳的與proBNP序列的同源性的PCR片段克隆到質(zhì)粒 pAllilO中。分離出幾個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA，并測(cè)序。用程序SeqMan來 對(duì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行修整，去除載體序列，并且裝配所獲得的序列。鑒定 出不同長度的轉(zhuǎn)錄物。這是由于轉(zhuǎn)錄物各自在不同位置處被多腺苷酸 化。所得到的共有序列相應(yīng)于最短的轉(zhuǎn)錄物，并且顯示在圖6中。
為了擴(kuò)增proBNP特異性PCR片段，使用27聚體 (5'-CTCCTGCTCCTCCTSTTCTTGCACCTG-3' ( SEQ ID No. 18))。字母 S表示核苷酸C或G。在所述克隆中發(fā)現(xiàn)了這兩種變體。因此，所獲得 的序列的前27個(gè)核苷酸(9個(gè)氨基酸)不能被認(rèn)為是確定的，因?yàn)樗?br>
19們不由引物預(yù)先決定。因此，來自馬的pre-proBNP的推導(dǎo)出的氨基酸 序列可以如下所示
SPLGGRSYPL GGLGPASEQS GIQELLDRLG DSVLEPQAER MTLEPLQQDR GPAEASETRG AAPTGVLGPR TKVLQALRGL RSPKMMRNSG CFGRRLDRIG SFSGLGCNVL RRY (Seq.ID.No.1)
馬proBNP序列如下所示(活性BNP激素加有下劃線)；因此， NT-proBNP序列由SEQ ID No. 2的未加下劃線的部分組成
YPLGGLGPAS EQSGIQELIiD RLGDSVLEPQ AERMTLEPLQ QDRGPAEASE TRGAAPTGVL GPRTKVLQAL RGLRSPKMMR NSGCFGRR!LD RIGSFSG!LGC NVLRRY (Seq.ID.No.2)
為了擴(kuò)增該前肽的完整的5'末端，合成了 22種序列特異性反向 引物，并且在各種條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。獲得特異性PCR片段并測(cè)序， 然而無法測(cè)定出該前肽的5'序列?？赡埽荒軘U(kuò)增5'末端，因?yàn)榭?RNA顯示出降解的征兆?？赡?，proBNP的5'末端已被降解。
借助于ClustalW方法，在程序MegAlign (DNAStar Lasergene Software)中將根據(jù)SEQ ID No. 1的氨基酸序列與類型A、 B和C的 鈉尿肽的各種序列進(jìn)行比較。在系統(tǒng)樹中圖解說明了所檢測(cè)出的序列 的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系(參見圖9)。圖9顯示了，來自馬的proBNP位于B 型鈉尿肽的簇群中，并且展示出最高的與來自豬的肽序列的同源性。
乂本發(fā)'^^拔伴時(shí)橫弄^:
本發(fā)明抗體的特異性的主要特征在于，它們能夠經(jīng)由馬 pre-proBNP中的獨(dú)特表位而將馬分子與其他已知物種(人、小鼠、大 鼠、豬、牛、犬、貓和綿羊)的同系物區(qū)分開。
關(guān)于表位PLGGLGPASEQS ( SEQ ID No. 3)的特異性例如表示，本 發(fā)明的抗體結(jié)合這個(gè)表位，而不結(jié)合或以顯著(-例如在ELISA中可 區(qū)分)更低的親和力結(jié)合下列序列PLGSPGSASDLE (人)(SEQ ID No.19) ， PLGSPSQSPEQF (小鼠)(SEQ ID No. 20) , PLGSPSQSPEQS (大 鼠)(SEQ ID No. 21) , PLGGAGLASELP (豬)(SEQ ID No. 22)， PLGGPGPVSELP (牛)(SEQ ID No. 23) , PLGGRSPASEAS (犬)(SEQ ID No. 24 ) ， PLGGPGPASEAS (貓)(SEQ ID No. 25 )和PLGGPGSASELP (綿羊)(SEQ ID No. 26)。對(duì)于下列其他優(yōu)選的表位而言，類似地 保持這一含義PASEQSGIQELL (SEQ ID No. 4) ， LLDRLGDSVLEP (SEQ ID No. 5 ) ， SVLEPQAE麗L ( SEQ ID No. 6 ) ， PQAE麗LEPLQ ( SEQ ID No. 7 ) , EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 ) ， LQQDRGPAEASE ( SEQ ID No. 9) ， DRGPAEASETRG (SEQ ID No. 10) ， PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11) ， RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12) ， LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13) , PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14) ， LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15 ) , SPKMMRNSGCFG ( SEQ ID No. 16 )或DRIGSFSGLGCN ( SEQ ID No. 17)(各自與根據(jù)圖1的序列進(jìn)行比較)。與本文提及的馬特異性表 位的特異性結(jié)合通過本發(fā)明的抗體來達(dá)到，優(yōu)選地在與較大的多肽結(jié) 合的范圍內(nèi)，主要是與馬pre-proBNP、 proBNP、 NT-proBNP或BNP結(jié)合。
實(shí)施例2:
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>
驗(yàn)證所產(chǎn)生的針對(duì)馬NT-proBNP的綿羊抗血清的"物種特異性"。 才法..
測(cè)試馬抗血清與來自其他物種的NT-proBNP的反應(yīng)性。 平板的包被
將來自各個(gè)物種的重組NT-proBNP( 1 ja g/ml， 200 u g/孔，pH 9. 6, 0.02 M碳酸鹽緩沖液)于4。C在微量滴定板上包被過夜。洗滌平板， 并用封閉緩沖溶液(包含2%蛋白胨(w/v)和0. 1% (w/v)脫脂奶粉的 10 mM PBS pH 7. 4)封閉1小時(shí)。
吸出封閉溶液，并將平板在3(TC下干燥過夜。組5^-橫舉程y^
在0. 1 M PBS， pH 7. 3中以1: 10000稀釋針對(duì)馬NT-proBNP的抗 血清，并且將200 m 1這種溶液施加在已用重組NT-proBNP包被的平板 上。在環(huán)境溫度下溫育2小時(shí)后，洗滌平板，并且使200 y 1兔抗綿羊 -HRP綴合物摻混30分鐘。再次洗滌平板，并與200 y 1四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) —起溫育IO分鐘。用50iil 0. 1M硫酸來終止反應(yīng)，并且用 標(biāo)準(zhǔn)的微量培養(yǎng)板閱讀裝置于450 nm處測(cè)量光密度。
潛^z
用下文所示的序列(人proBNP， SEQ ID No. 27;小鼠proBNP， SEQ ID No. 28;大鼠proBNP， SEQ ID No. 29;貓proBNP， SEQ ID No. 30;馬proBNP， SEQ ID No. 31)來測(cè)試與下列物種的重組NT-proBNP 的反應(yīng)性。proBNP，2345678970727375 Z61778，920
人HPLGSPGSASDLETsGl_QEQ
小鼠YP匕GsPSQSPEQFKMQK匕LE
大鼠HPLGsPSQSPEQSTMQKLLE
貓HPl_GGPGPASEASA1QEl_
馬YPLGGLGPASEQsGIQEL
272223242526272829303338
人RNHLQGKLsELQVEQTsLEP
小鼠■L1REKSEEMA
大鼠L1REKSEEMAQRQLSKDQGP
貓匕DGl_RDTVSELQEAQMAl_GP
馬DRLGDSVLEPQAERMTLEP
4243454647484950 5254555657585960
人QEsPRPTGVwKsREVATEG
小鼠QRQLl_KDQGl_TKEHPKR
大鼠TKELl_VLRSQDSAFRIQE
貓LQQGHSPASWEAQEPPAR
馬LQQDRGPAEASTRGAAPTG
626364656667686970777273747576
人，RGHRKMVLYTlLRAPR
小鼠VLRSQGSTl_RVQQRPQ
大鼠RLR
貓VLAPHDNVLRA匕RRl_G
馬V匕GPRTKVl_QALRGLR
將抗血清與固定的NT-proBNP分子的相對(duì)親和力與關(guān)于馬 NT-proBNP而言的抗原的親和力相聯(lián)系(與馬NT-proBNP的親和力-100%)
人貓大鼠小鼠馬
相對(duì)親和力2%7%5%1%畫
潛論,
所形成的綿羊抗馬NT-proBNP抗血清是特異性的，其僅顯示出微小 的與人、貓、大鼠或小鼠NT-proBNP的交叉反應(yīng)性。
2權(quán)利要求
1.測(cè)定馬NT-proBNP或其片段的方法，所述方法包括下列步驟-提供馬樣品，-使該樣品與至少一種特異性地結(jié)合馬NT-proBNP的抗體接觸，和-測(cè)定該樣品中存在的馬NT-proBNP或其片段的存在情況和/或濃度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于，在馬NT-proBNP或其片 段的測(cè)定中，所述至少一種抗體特異性地結(jié)合來自SEQ ID No. 1的至 少 一種特異性NT-pr oBNP表位，特別是選自具有下列序列的表位的表位 PLGGLGPASEQS ( SEQ ID No. 3 ) 、 PASEQSGIQELL ( SEQ ID No. 4 )、 LL亂GDSVLEP ( SEQ ID No. 5 ) 、 SVLEPQAE麗L ( SEQ ID No. 6 )、 PQAE麗LEPLQ ( SEQ ID No. 7 ) 、 EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 )、 LQQDRGPAEASE (SEQ ID No. 9) 、 DRGPAEASETRG (SEQ ID No. 10)、 PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11 ) 、 RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12)、 LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13) 、 PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14)或 LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，在馬NT-proBNP或 其片段的測(cè)定中，另外還使用對(duì)于馬NT-proBNP非特異性的至少一種 NT-proBNP抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法,其特征在于，在馬 NT-proBNP或其片段的測(cè)定中，另外還使用對(duì)于馬pre-proBnP特異性 的至少一種抗體，特別是特異性地結(jié)合來自SEQ ID No. 1的至少一種 表位的抗體，所述表位選自具有序列SPKMMRNSGCFG (SEQ ID No.") 或DRIGSFSGLGCN (SEQ ID No. 17)的表位。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述至少一種抗體是多克隆的和/或單克隆的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述至少一種抗體和/或所述至少一種另外的抗體是經(jīng)標(biāo)記的。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于，用過氧化物酶特別是辣根過氧化物酶、生物素、熒光染料、膠體金或放射性核素來標(biāo)記所述至 少 一種抗體和/或所述至少 一種另外的抗體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，將所述至少 一種抗體或所述至少一種另外的抗體結(jié)合至固相。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1 - 8中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，馬NT-proBNP 或其片段的測(cè)定通過選自下列的方法來進(jìn)行放射免疫測(cè)定法、免疫結(jié) 合測(cè)定法、Western印跡、免疫組織化學(xué)、酶免疫測(cè)定法、側(cè)流裝置(LFD, 測(cè)試條)及其組合。
10. 抗體或抗體混合物，其特征在于，它特異性地結(jié)合馬 NT-proBNP。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的抗體或抗體混合物，其特征在于，它結(jié)合 來自SEQ ID No. 1的至少一種表位，所述表位選自具有下列序列的表 位PLGGLGPASEQS (SEQ ID No. 3) 、 PASEQSGIQELL (SEQ ID No. 4)、 LLDRLGDSVLEP ( SEQ ID No. 5 ) 、 SVLEPQAERMTL ( SEQ ID No. 6 )、 PQAE麗LEPLQ ( SEQ ID No. 7 ) 、 EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 )、 環(huán)DRGPAEASE (SEQ ID No. 9) 、 DRGPAEASETRG (SEQ ID No- 10)、 PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11) 、 RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12)、 LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13) 、 PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14)、 LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15) 、 SPK畫RNSGCFG (SEQ ID No. 16)或 DRIGSFSGLGCN (SEQ ID No. 17)。
12. 具有根據(jù)權(quán)利要求SEQ ID. No. 1的氨基酸序列的多肽或其特 異性片段，特別是具有SEQ ID. No. l的氨基酸8-113、 8 - 81和82 -113的片段。
13. 多肽，其包含有選自下列序列的氨基酸序列PLGGLGPASEQS (SEQ ID No. 3 ) 、 PASEQSGIQELL ( SEQ ID No. 4 ) 、 LLDRLGDSVLEP (SEQ ID No. 5 ) 、 SVLEPQAERMTL ( SEQ ID No. 6 ) 、 PQAE匿LEPLQ (SEQ ID No. 7 ) 、 EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 ) 、 LQQDRGPAEASE(SEQ ID No. 9) 、 DRGPAEASETRG ( SEQ ID No. 10) 、 PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11) 、 RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12) 、 LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13) 、 PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14) 、 LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15) 、 SPK隱NSGCFG (SEQ ID No. 16)或DRIGSFSGLGCN (SEQ ID No. 17)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13的多肽，其特征在于，它是化學(xué)合成的 多肽，從樣品中分離的多肽，或重組產(chǎn)生的多肽。
15. 根據(jù)權(quán)利要求IO或11中任一項(xiàng)的抗體或抗體混合物在根據(jù)權(quán) 利要求1 - 9中任一項(xiàng)的方法中用于測(cè)定馬NT-proBNP或其片段的用途。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的肽用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求10 或11中任一項(xiàng)的抗體或抗體混合物的用途。
17. 根據(jù)權(quán)利要求12 一 14中任一項(xiàng)的肽在根據(jù)權(quán)利要求1 - 9中任 一項(xiàng)的方法中作為陽性對(duì)照或作為用于濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)的用途。
18. 用于測(cè)定馬NT-proBNP或其片段的試劑盒，其包含至少一種根 據(jù)權(quán)利要求IO或11的抗體或者至少一種根據(jù)權(quán)利要求IO或11的抗體 混合物；用于定性和/或定量地檢測(cè)所述至少一種抗體或所述至少一種 抗體混合物與馬NT-proBNP或其片段的結(jié)合的工具；和任選地，作為陽 性對(duì)照或作為用于濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)的根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的 肽。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18的試劑盒，其特征在于，所述用于定性和/ 或定量地檢測(cè)所述至少一種抗體或所述至少一種抗體混合物與馬 proBNP或其片段的結(jié)合的工具包括至少一種另外的抗體。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19的試劑盒，其特征在于，所述至少一種 抗體和/或所述至少一種另外的抗體是經(jīng)標(biāo)記的。
21. 根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)的試劑盒，其特征在于，用過 氧化物酶特別是辣根過氧化物酶、生物素、熒光染料、膠體金或放射性 核素來標(biāo)記所述至少一種抗體和/或所述至少一種另外的抗體。
22. 根據(jù)權(quán)利要求18 - 21中任一項(xiàng)的試劑盒在根據(jù)權(quán)利要求1 - 9 中任一項(xiàng)的方法中的用途。
23. 產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的多肽的方法，其特征在 于，將編碼所述多肽的核酸引入合適的宿主生物中，以本身已知的方式 由所述宿主表達(dá)所述多肽，以及回收所表達(dá)出的多肽。
24. 產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的多肽的方法，其特征在 于，所述多肽是化學(xué)合成的。
25. 根據(jù)權(quán)利要求10或11的抗體用于在馬中診斷心臟病的用途。
26. 根據(jù)權(quán)利要求12 - 14中任一項(xiàng)的多肽用于在馬中診斷心臟病 的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及測(cè)定馬NT-proBNP或其片段的方法，所述方法包括下列步驟提供馬樣品，使該樣品與至少一種特異性地結(jié)合馬NT-proBNP的抗體接觸，和測(cè)定該樣品中存在的馬NT-proBNP或其片段的存在情況和/或濃度。
文檔編號(hào)G01N33/74GK101627310SQ200880007351
公開日2010年1月13日 申請(qǐng)日期2008年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月7日
發(fā)明者G·哈瓦, W·沃洛茲祖克 申請(qǐng)人:生物醫(yī)學(xué)醫(yī)藥產(chǎn)品有限責(zé)任兩合公司