一種鉛離子可視化檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種鉛離子檢測方法及檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]鉛離子對人體危害嚴(yán)重，是環(huán)境監(jiān)測的重要指標(biāo)。其主要毒性效應(yīng)是導(dǎo)致貧血、神經(jīng)機能失調(diào)和腎損傷、生殖系統(tǒng)損傷等。美國環(huán)境保護署規(guī)定飲用水中鉛離子的最大允許量不得超過72 nM。目前，環(huán)境中痕量鉛離子的常規(guī)檢測方法主要有原子吸收法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法、電化學(xué)方法等。但是這些方法操作繁瑣，需要麻煩的前處理、專門的分析技術(shù)人員以及昂貴的儀器，不利于現(xiàn)場快速分析檢測。近年來，利用對鉛離子敏感的核酸酶(8-17DNAzyme)作為識別元件來檢測鉛離子的方法備受關(guān)注(D.Mazumdar, J.Liu, G.Lu, J.Zhou and Y.Lu, Chem.Commun., 2010, 46, 1416-1418)。但是潛在的缺點需要合成含有RNA的DNA來檢測，穩(wěn)定性差，成本較高。因此，迫切需要選擇一種新型的鉛離子識別元件，無需涉及RNA的合成。
[0003]據(jù)報道，有一種DNA核酸能與鉛離子特異識別(T.Li, S.Dong and E.Wang, J.Am.Chem.Soc., 2010, 132，13156-13157)，該DNA序列與鉛離子具有很強的親和力，可折疊成G四聚體。如果將該核酸DNA作為鉛離子識別元件，開發(fā)一種操作簡單、成本低廉、可快速檢測在環(huán)境中鉛離子的可視化檢測方法以及檢測試劑盒具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于建立一種可視化鉛離子檢測方法及檢測試劑盒。
[0005]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種鉛離子可視化檢測試劑盒，包括核酸序列、緩沖體系和試紙條檢測平臺，其核酸序列由核酸序列A、B、C、D組成；其中
序列A:具有a區(qū)域和b區(qū)域，a和b區(qū)域共同構(gòu)成鉛離子特異性識別元件，與鉛離子識別后可形成G四聚體結(jié)構(gòu)；
序列B:具有a*區(qū)域、c區(qū)域和b*區(qū)域，其中B的a*區(qū)域和b*區(qū)域分別與A的a區(qū)域和b區(qū)域互補，B的c區(qū)域位于a*區(qū)域和b*區(qū)域的中間，凸起，不與A互補；B的一端修飾有特異性親和小分子物質(zhì)；
序列C:具有a區(qū)域和c*區(qū)域，其中C的a和c*區(qū)域分別與B的a*和c區(qū)域互補；C的一端用疏基修飾；
序列D:具有a*區(qū)域和c區(qū)域；D的a*和c區(qū)域分別與C的a區(qū)域和c*區(qū)域互補。
[0006]優(yōu)選的，核酸序列B的c區(qū)域含有1-5個堿基。
[0007]優(yōu)選的，核酸序列B中所述的特異性親和小分子物質(zhì)包括生物素、地高辛、Cy3。
[0008]優(yōu)選的，試紙條檢測平臺的檢測區(qū)固定的是能與小分子物質(zhì)結(jié)合的配體或抗體；質(zhì)控區(qū)固定的是核酸序列D。
[0009]優(yōu)選的，緩沖體系不與鉛離子反應(yīng)生成沉淀。
[0010]一種鉛離子可視化檢測試劑盒，包括核酸序列、緩沖體系和試紙條檢測平臺，其核酸序列由核酸序列A、B、C、D組成；其中
核酸序列 A:5’-GGGTGGGT (a)GGGTGGGT (b)-3’ (SEQ ID NO:1);
核酸序列 B:5’-b1tin-AAAAAA-ACCCACCC (b*) TAT (c) ACCCACCC (a*)-3’ (SEQ IDNO:2)；
核酸序列 C:5’ -SH-AAAAAA-GGGTGGGT (a) ΑΤΑ (c*) -3’ (SEQ ID NO:3)；
核酸序列 D:5’-b1tin-AAAAAA-TAT (c) ACCCACCC (a*)-3’ (SEQ ID NO:4)。
[0011]優(yōu)選的，核酸序列c固定在金納米顆粒上，并噴射在試紙條檢測平臺的金標(biāo)墊上。
[0012]優(yōu)選的，試紙條檢測平臺的檢測區(qū)固定的是鏈霉親和素；質(zhì)控區(qū)固定的是鏈霉親和素-生物素-核酸D。
[0013]優(yōu)選的，緩沖體系是10 mM Tris-Ac緩沖液，pH=8.0。
[0014]一種鉛離子可視化檢測方法，利用上述所述任一項的試劑盒來進行鉛離子檢測。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
(1)鉛離子識別元件是普通的DNA序列，無需使用傳統(tǒng)的8-17 DNAzyme，無需涉及到合成RNA，也無需使用抗體。
[0016](2)檢測結(jié)果直接肉眼可見，無需檢測儀器即可獲得使用數(shù)據(jù)。
[0017](3)操作簡單，成本低廉，適于單位推廣使用。
[0018](4)本發(fā)明方法對鉛的檢測限為1 nM，低于美國環(huán)境保護署規(guī)定飲用水中鉛離子的最大允許量72 nM，檢測靈敏度高，選擇性好。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明所述的檢測方法的原理圖；
圖2為對不同濃度的Pb2+檢測的結(jié)果圖；
圖3為特異性實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0020]一種鉛離子可視化檢測試劑盒，包括核酸序列、緩沖體系和試紙條檢測平臺，其核酸序列由核酸序列A、B、C、D組成；其中
序列A:具有a區(qū)域和b區(qū)域，a和b區(qū)域共同構(gòu)成鉛離子特異性識別元件，與鉛離子識別后可形成G四聚體結(jié)構(gòu)；
序列B:具有a*區(qū)域、c區(qū)域和b*區(qū)域，其中B的a*區(qū)域和b*區(qū)域分別與A的a區(qū)域和b區(qū)域互補，B的c區(qū)域位于a*區(qū)域和b*區(qū)域的中間，凸起，不與A互補；B的一端修飾有特異性親和小分子物質(zhì)；
序列C:具有a區(qū)域和c*區(qū)域，其中C的a和c*區(qū)域分別與B的a*和c區(qū)域互補；C的一端用疏基修飾；
序列D:具有a*區(qū)域和c區(qū)域；D的a*和c區(qū)域分別與C的a區(qū)域和c*區(qū)域互補。
[0021]優(yōu)選的，核酸序列B的c區(qū)域含有1-5個堿基。
[0022]更優(yōu)選的，核酸序列B的c區(qū)域含有3個堿基。
[0023]優(yōu)選的，核酸序列B中所述的特異性親和小分子物質(zhì)包括生物素、地高辛、Cy30
[0024]優(yōu)選的，核酸序列B通過連接臂與特異性親和小分子連接，序列C通過連接臂與巰基連接。
[0025]優(yōu)選的，連接臂為多個A的堿基序列，其堿基數(shù)為3-12個。
[0026]更優(yōu)選的，連接臂為6個A的堿基序列。
[0027]優(yōu)選的，試紙條檢測平臺的檢測區(qū)固定的是能與小分子物質(zhì)結(jié)合的配體或抗體；質(zhì)控區(qū)固定的是核酸序列D。
[0028]優(yōu)選的，質(zhì)控區(qū)固定核酸序列D的方法為將核酸序列D噴射在試紙條的質(zhì)控區(qū)后在紫外線下交聯(lián)5分鐘；或者將核酸序列D的一端用生物素修飾，質(zhì)控區(qū)利用鏈霉親和素將生物素修飾的核酸D固定。
[0029]優(yōu)選的，緩沖體系不與鉛離子反應(yīng)生成沉淀。
[0030]一種鉛離子可視化檢測試劑盒，包括核酸序列、緩沖體系和試紙條檢測平臺，其核酸序列由核酸序列A、B、C、D組成；其中
核酸序列 A:5’-GGGTGGGT (a) GGGTGGGT (b)-3’ (SEQ ID NO:1);
核酸序列 B:5’-b1tin-AAAAAA-ACCCACCC (b*) TAT (c) ACCCACCC (a*)-3’ (SEQ IDNO:2)；
核酸序列 C:5’ -SH-AAAAAA-GGGTGGGT (a) ΑΤΑ (c*) -3’ (SEQ ID NO:3)；
核酸序列 D:5’-b1tin-AAAAAA-TAT (c) ACCCACCC (a*)-3’ (SEQ ID NO:4)。
[0031]優(yōu)選的，核酸序列C固定在金納米顆粒上，并噴射在試紙條檢測平臺的金標(biāo)墊上。
[0032]優(yōu)選的，試紙條檢測平臺的檢測區(qū)固定的是鏈霉親和素；質(zhì)控區(qū)固定的是鏈霉親和素-生物素-核酸D。
[0033]優(yōu)選的，質(zhì)控區(qū)固定核酸序列D的方法為將核酸序列D噴射在試紙條的質(zhì)控區(qū)后在紫外線下交聯(lián)5分鐘；或者將核酸序列D的一端用生物素修飾，質(zhì)控區(qū)利用鏈霉親和素將生物素修飾的核酸D固定。
[0034]優(yōu)選的，緩沖體系是10 mM Tris-Ac緩沖液，pH=8.0。
[0035]一種鉛離子可視化檢測方法，利用上述任一項的試劑盒來進行鉛離子檢測。
[0036]下面結(jié)合附圖(見圖1)，進一步說明本發(fā)明的檢測原理:
一種鉛離子可視化檢測方法，包括以下步驟:(圖1所示)
(1)核酸A與鉛離子(Pb2+)具有高親和力，能形成G四聚體。A先與B雜交，