專利名稱：：脂蛋白毛細(xì)管涂層及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一類脂蛋白毛細(xì)管涂層及其制備方法，其目的在于研制出一種大分子涂層，并保留一定生物活性和生物相容性，使之既可用于毛細(xì)管表面吸附的抑制和電滲調(diào)控，又可以用于生化分析和臨床檢測等具體應(yīng)用。脂蛋白包括極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和乳糜微粒。本發(fā)明的另一目的在于提供上述脂蛋白涂層的制備方法，該方法操作簡單，易于保持脂蛋白的活性和穩(wěn)定性。本發(fā)明所涉及的脂蛋白毛細(xì)管涂層的制備可以通過兩種方法實(shí)現(xiàn)，即物理吸附法(或稱自組裝法)和化學(xué)鍵合法。物理吸附法(自組裝法)制備脂蛋白毛細(xì)管涂層的原理在一定濃度的緩沖溶液(0.l-100mM，pH4-9)和溫度(4_37°C)條件下，使脂蛋白(濃度0.Ol-lOmg/mL)與石英或玻璃毛細(xì)管內(nèi)壁的硅羥基發(fā)生疏水、靜電吸引等非共價(jià)相互作用，從而自組裝到內(nèi)壁表面形成結(jié)合層；然后用緩沖液洗去未結(jié)合的脂蛋白，制得脂蛋白毛細(xì)管涂層?；瘜W(xué)鍵合法制備脂蛋白毛細(xì)管涂層的原理先依據(jù)溶膠-凝膠技術(shù)，用Y-氨丙基三乙氧基硅烷或Y-氨丙基三甲氧基硅烷等硅烷化試劑對毛細(xì)管進(jìn)行改性，引入氨基活性基團(tuán)，制得氨基修飾的毛細(xì)管；然后以過量的戊二醛或N，N-琥珀酰氨基碳酸酯(DSC)或辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)或l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺體系(EDC/NHS)為偶聯(lián)劑，在一定緩沖溶液pH值(pH4-9)、溫度(4_37°C)以及脂蛋白濃度(0.l-10mg/mL)的條件下，共價(jià)連接毛細(xì)管上的氨基與脂蛋白上的氨基酸殘基，將脂蛋白固定到毛細(xì)管內(nèi)壁；最后用緩沖液洗去未結(jié)合的脂蛋白，制得脂蛋白毛細(xì)管涂層。本發(fā)明所涉及的脂蛋白毛細(xì)管涂層及制備方法具有以下幾個(gè)特點(diǎn)具有良好的生物相容性，適用于生物大分子的分離和分析；保留脂蛋白的活性，可模擬生物膜進(jìn)行其與生物大分子、小分子之間的相互作用研究，可用于臨床診斷和藥理研究；可根據(jù)脂蛋白的等電點(diǎn)(pI5-6)，通過選擇電泳緩沖液來對電滲進(jìn)行調(diào)控；具有磷脂和載脂蛋白等活性組份，可為藥物載體的設(shè)計(jì)和外源性物質(zhì)體內(nèi)運(yùn)輸過程的機(jī)制提供研究工具。圖1為化學(xué)鍵合法制備脂蛋白涂層的合成路線示意圖。圖2為緩沖液pH與低密度脂蛋白涂層產(chǎn)生電滲的關(guān)系圖。圖3為脂蛋白毛細(xì)管涂層用于蛋白質(zhì)的分離色譜圖。具體實(shí)施例方式脂蛋白毛細(xì)管涂層及其制備方法，用以下實(shí)施方案舉例說明。在制備脂蛋白涂層之前，首先要進(jìn)行毛細(xì)管的預(yù)處理。毛細(xì)管先用色譜純甲醇沖洗l小時(shí)，然后用lmol/L氫氧化鈉沖洗l-2小時(shí)，去離子水清洗毛細(xì)管15分鐘，再用lmo1/L鹽酸沖洗1-2小時(shí)，最后用去離子水沖洗15分鐘，高純氮?dú)獯蹈蓚溆谩ｎA(yù)處理完成后，進(jìn)行脂蛋白涂層的制備。實(shí)施例1物理吸附法制備低密度脂蛋白毛細(xì)管涂層稱取5.0mg的低密度脂蛋白凍干粉，充分溶解于5.0mL的25mmoL磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)中，配制成1.0mg/mL的涂層溶液。將該涂層溶液在10psi壓力下通過經(jīng)預(yù)處理的毛細(xì)管15分鐘，然后用硅橡膠封住毛細(xì)管兩端，毛細(xì)管內(nèi)灌注有上述低密度脂蛋白涂層溶液，于室溫下靜置2-4小時(shí)。再次灌裝涂層溶液，封住毛細(xì)管兩端，于室溫下靜置2小時(shí)以上。完成上述操作后，用25mmoL磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)沖洗毛細(xì)管30分鐘，去除未與管壁結(jié)合的低密度脂蛋白，毛細(xì)管兩端用硅橡膠密封，并置于冰箱內(nèi)4t:保存。高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、乳糜微粒以及混合脂蛋白涂層合成方案與上述操作相同，僅需將低密度脂蛋白涂層溶液替換成相應(yīng)的脂蛋白溶液。實(shí)施例2氨丙基修飾的毛細(xì)管的制備移取0.lmL的Y-氨丙基三甲氧基硅烷，溶于1.0mL的水(稀醋酸調(diào)pH5)-甲醇(2:8，體積比)的混合溶液中，充分混勻后迅速充入預(yù)處理的毛細(xì)管中，將毛細(xì)管兩端用硅橡膠密封，室溫下反應(yīng)2-4小時(shí)。反應(yīng)完成后，依次用甲醇、水沖洗毛細(xì)管各30分鐘，然后毛細(xì)管在高純氮?dú)獗Ｗo(hù)下，置于105-12(TC的烘箱內(nèi)陳化干燥2小時(shí)以上。通過上述處理步驟，得到氨丙基修飾的毛細(xì)管。實(shí)施例3以戊二醛為偶聯(lián)劑的化學(xué)鍵合法制備低密度脂蛋白毛細(xì)管涂層移取0.5mL50%的戊二醛水溶液，加入到4.5mL的25mmoL磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)中，充分混勻后，在5psi的壓力下充入由實(shí)施例2制備的氨丙基修飾毛細(xì)管，1小時(shí)后用硅橡膠密封毛細(xì)管兩端，靜置于室溫反應(yīng)2-6小時(shí)。然后用25mmoL磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)將反應(yīng)未盡的戊二醛溶液沖出，得到戊二醛修飾的毛細(xì)管。按照實(shí)施例1所述方法配制1.Omg/mL的低密度脂蛋白涂層溶液，將該溶液充入上述經(jīng)戊二醛處理過的毛細(xì)管中，30分鐘后封住兩端，于室溫下繼續(xù)反應(yīng)2-4小時(shí)。在此反應(yīng)過程中，脂蛋白與戊二醛的醛基發(fā)生共價(jià)作用，生成希夫堿式化合物。用磷酸鹽緩沖溶液將反應(yīng)未盡的脂蛋白涂層溶液沖出，再用濃度為0.5mg/mL的氰基硼氫化鈉溶液(在25mmoL磷酸鹽緩沖液中，pH6.4)沖洗20分鐘。用硅橡膠密封毛細(xì)管兩端，于室溫下繼續(xù)反應(yīng)4-8小時(shí)，將不穩(wěn)定的希夫堿結(jié)構(gòu)還原成較穩(wěn)定的亞胺結(jié)構(gòu)(見附圖1)。最后用25mmoL磷酸鹽緩沖溶液(PH=7.4)將反應(yīng)液沖出，得到低密度脂蛋白的毛細(xì)管涂層。如不立即使用，須置于冰箱4t:保存。高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、乳糜微粒以及混合脂蛋白涂層合成方案與上述操作相同，僅需將低密度脂蛋白涂層溶液替換成相應(yīng)的脂蛋白溶液。實(shí)施例4以N，N-琥珀酰氨基碳酸酯(DSC)為偶聯(lián)劑制備高密度脂蛋白毛細(xì)管涂層稱取5.0mg的DSC溶于5mL乙腈中，充分混勻。將上述溶液充入由實(shí)施例2制備的氨丙基修飾毛細(xì)管中，20分鐘后用硅橡膠密封毛細(xì)管兩端，并置于45t:水浴中反應(yīng)2-4小時(shí)。待反應(yīng)完成后，依次用乙腈、去離子水和25mmoL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)沖洗毛細(xì)管10分鐘。按照實(shí)施例1所述方法配制1.Omg/mL的高密度脂蛋白涂層溶液，將該溶液充入上述經(jīng)DSC處理過的毛細(xì)管中，于室溫下反應(yīng)2-4小時(shí)。待反應(yīng)完成后，用25mmoL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)沖洗毛細(xì)管30分鐘，得到高密度脂蛋白的毛細(xì)管涂層(見附圖1)。如不立即使用，須置于冰箱4t:保存。低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、乳糜微粒以及混合脂蛋白涂層合成方案與上述操作相同，僅需將高密度脂蛋白涂層溶液替換成相應(yīng)的脂蛋白溶液。實(shí)施例5以辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)為偶聯(lián)劑制備高密度脂蛋白毛細(xì)管涂層以DSS為偶聯(lián)劑制備極低密度脂蛋白毛細(xì)管涂層的操作與實(shí)施例4相同，僅須將N，N-琥珀酰氨基碳酸酯更換為DSS(見附圖1)。低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、乳糜微粒以及混合脂蛋白涂層合成方案與上述操作相同，僅需將高密度脂蛋白涂層溶液替換成相應(yīng)的脂蛋白溶液。實(shí)施例6以EDC/NHS為偶聯(lián)劑的化學(xué)鍵合法制備極低密度脂蛋白毛細(xì)管涂層稱取5.Omg的極低密度脂蛋白，溶于5mL的25mmoL磷酸鹽緩沖液(pH6.0)中；向該溶液中依次加入2.OmgEDC和3.0mgNHS，室溫下漩渦震蕩5分鐘，靜置25分鐘。將上述溶液充入由實(shí)施例2制備的氨丙基修飾毛細(xì)管中，15分鐘后用硅橡膠密封毛細(xì)管兩端，4°C-25t:反應(yīng)4小時(shí)以上。待反應(yīng)完成后，用25mmoL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)沖洗毛細(xì)管30分鐘，得到極低密度脂蛋白的毛細(xì)管涂層(見附圖1)。高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、乳糜微粒以及混合脂蛋白涂層合成方案與上述操作相同，僅需將極低密度脂蛋白涂層溶液替換成相應(yīng)的脂蛋白溶液。實(shí)施例7脂蛋白毛細(xì)管涂層對于電滲的控制由實(shí)施例1制備的物理吸附(自組裝)型脂蛋白毛細(xì)管涂層與實(shí)施例3-5制備的化學(xué)鍵合型脂蛋白毛細(xì)管涂層有相近的電滲控制行為。通過上述實(shí)施方案制備的脂蛋白毛細(xì)管涂層，可根據(jù)使用電泳緩沖液的不同實(shí)現(xiàn)對電滲的控制。電滲淌度的計(jì)算公式為電滲(cm7Vs)=毛細(xì)管總長(cm)X有效長度(cm)/[電壓(V)X遷移時(shí)間(s)]以物理吸附型和化學(xué)鍵合型低密度脂蛋白涂層為例，選定實(shí)驗(yàn)條件為涂層毛細(xì)管內(nèi)徑50iim，總長50cm，有效長度40cm，施加電壓15kV，以N，N'-二甲基甲酰胺(DMF)為電滲標(biāo)記物，進(jìn)樣壓力0.5psi，進(jìn)樣時(shí)間5秒。在此條件下，如果將電泳緩沖液(25mmoL磷酸鹽緩沖液)PH值從4逐漸改變到pH8時(shí)，電滲淌度將會(huì)發(fā)生方向和絕對值大小的改變(見附圖2)。并且，線性擬合曲線與X軸(pH值)的交點(diǎn)在5.3-5.5之間，與低密度脂蛋白的等電點(diǎn)(Pl約為5.5)接近。實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了脂蛋白毛細(xì)管涂層對電滲的可控性。這一特點(diǎn)可以為不同的分析及分離目的提供靈活簡便的操作參數(shù)，從而提高分離效率和分析速度。實(shí)施例8脂蛋白毛細(xì)管涂層用于蛋白質(zhì)的生化分離和分析6采用化學(xué)鍵合法制備的低密度脂蛋白涂層，對細(xì)胞色素c(Cytc)、溶菌酶(Lys)、核糖核酸酶A(RNaseA)和a_糜蛋白酶原A(a-ChyA)4種堿性蛋白進(jìn)行了分離。電泳條件毛細(xì)管內(nèi)徑50iim，總長50cm，有效長度40cm，施加電壓+15kV，以25mmoL磷酸鹽溶液(pH7.4)為電泳緩沖液，混合樣品中各蛋白質(zhì)濃度0.2mg/mL，進(jìn)樣壓力0.5psi，進(jìn)樣時(shí)間5秒。結(jié)果表明，在上述電泳條件下，以上4種堿性蛋白質(zhì)達(dá)到完全電泳分離，分離度大于1.5(見附圖3)。蛋白質(zhì)的分離效率為8700-124000塊理論塔板/米，回收率在82%-96%之間，日間和日內(nèi)精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%-5.7%(見表1)，滿足上述堿性蛋白質(zhì)生化分離以及定性定量分析的要求。脂蛋白涂層與分析物之間除存在疏水和靜電相互作用外，還可能存在一定的親和作用。脂蛋白涂層具有良好的結(jié)構(gòu)特征及生物相容性，可以抑制蛋白質(zhì)等生物大分子在毛細(xì)管壁上的不可逆吸附，適用于蛋白質(zhì)的生化分離和分析。表1低密度脂蛋白毛細(xì)管涂層電泳分離蛋白質(zhì)的性能蛋白質(zhì)柱效回收率(%)精密度(RSD%，n=5)(塊塔板/m)曰間曰內(nèi)Lys3900086.8±4.2%2.434.31Cytc12400096.1±3.3%1.263.35RNaseA1410089.0±5.5%2.864.76ff-ChyA870082.4±6.挑3.475.64實(shí)施例9低密度脂蛋白毛細(xì)管涂層用于自由基氧化損傷機(jī)理的研究采用低密度脂蛋白涂層毛細(xì)管，研究二價(jià)銅離子(Cu2+)誘導(dǎo)低密度脂蛋白的自由基氧化損傷。電泳條件毛細(xì)管內(nèi)徑50iim，總長50cm，有效長度40cm，施加電壓+15kV，以25mmoL磷酸鹽溶液(pH7.4)為電泳緩沖液，以0.2%DMF為電滲標(biāo)記物，混合樣品中各蛋白質(zhì)濃度O.2mg/mL，進(jìn)樣壓力0.5psi，進(jìn)樣時(shí)間5秒。0^04溶液的配制稱取8.0mg(50iimol)的無水硫酸銅，溶于10mL的25mmoL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中，配制成5iimol的CuS04溶液。低密度脂蛋白涂層的氧化修飾將上述CuS04溶液分別沖入3支尺寸相同的低密度脂蛋白涂層毛細(xì)管內(nèi)，密封兩端，置于37t:水浴分別孵育2、6和12小時(shí)。反應(yīng)完成后，用電泳緩沖液將管內(nèi)溶液沖出，并繼續(xù)沖洗20-30分鐘，最后接入毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行電滲測定和蛋白質(zhì)分離。按照實(shí)施例7所述方法測定電滲，按照實(shí)施例8所述方法進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。脂蛋白的折合氧化率用電滲流的相對變化表示，即[(Cu2+氧化后的電滲_未氧化電滲)/未氧化電滲]X100X。結(jié)果表明，二價(jià)銅離子(Cu2+)可以誘導(dǎo)低密度脂蛋白的自由基氧化損傷，而且隨著處理時(shí)間的增長折合氧化率也隨之增加，脂蛋白涂層的穩(wěn)定性下降，對蛋白質(zhì)分離的效率也顯著降低(見表2)。脂蛋白的氧化修飾是引發(fā)動(dòng)脈粥狀硬化的主要誘因之一，自由基的存在會(huì)促進(jìn)脂蛋白的氧化損傷。利用脂蛋白毛細(xì)管涂層可進(jìn)行脂蛋白自由基氧化損傷以及動(dòng)脈粥狀硬化致病機(jī)理的研究。表2Cu2+導(dǎo)致的涂層性能變化與脂蛋白的自由基氧化之間的關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求一類脂蛋白毛細(xì)管涂層，其特征在于，毛細(xì)管內(nèi)壁固定有一層或多層脂蛋白；脂蛋白包括高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳糜微粒。2.—種脂蛋白毛細(xì)管涂層的制備方法，其特征在于，可以通過物理吸附(或稱自組裝法)和化學(xué)鍵合的方法將脂蛋白固定到毛細(xì)管內(nèi)壁，形成脂蛋白毛細(xì)管涂層。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白毛細(xì)管涂層，其特征在于，具有磷脂、載脂蛋白、膽固醇脂等組份，保留有脂蛋白的活性。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂蛋白毛細(xì)管涂層的方法，其特征在于，物理吸附法(或稱自組裝法)的原理為在緩沖溶液(0.l-100mM，pH4-9)和溫度(4_37°C)條件下，使脂蛋白(濃度0.01-10mg/ml)與石英或玻璃毛細(xì)管內(nèi)壁的硅羥基發(fā)生疏水、靜電吸引等非共價(jià)相互作用，從而自組裝到內(nèi)壁表面，制得脂蛋白毛細(xì)管涂層。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂蛋白毛細(xì)管涂層的方法，其特征在于，化學(xué)鍵合法的原理為先采用Y-氨丙基三乙氧基硅烷或Y-氨丙基三甲氧基硅烷等硅烷化試劑對毛細(xì)管進(jìn)行改性，引入氨基活性基團(tuán)；然后以過量的戊二醛或N，N-琥珀酰氨基碳酸酯(DSC)或辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)或l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺體系(EDC/NHS)為偶聯(lián)劑，在緩沖溶液pH值(pH4_9)、溫度(4-37°C)以及脂蛋白濃度(0.l-10mg/mL)的條件下，共價(jià)連接毛細(xì)管上的氨基與脂蛋白上的氨基酸殘基，從而將脂蛋白固定到毛細(xì)管內(nèi)壁。全文摘要本發(fā)明涉及一類脂蛋白毛細(xì)管涂層及其制備方法。該涂層可通過物理吸附法和化學(xué)鍵合法制備。物理吸附法是將濃度為0.01-10mg/mL脂蛋白溶液與毛細(xì)管內(nèi)壁發(fā)生非共價(jià)相互作用，自組裝到內(nèi)表面形成涂層?；瘜W(xué)鍵合法是先采用氨丙基硅氧烷對毛細(xì)管進(jìn)行改性，引入氨基；然后以戊二醛或N，N-琥珀酰氨基碳酸酯或辛二酸二琥珀酰亞胺酯或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺為偶聯(lián)劑，在緩沖液pH(4-9)和脂蛋白濃度(0.1-10mg/mL)條件下，共價(jià)連接毛細(xì)管壁的氨基與脂蛋白上的氨基酸殘基，得脂蛋白涂層。該涂層保留有生物活性，可用于抑制毛細(xì)管表面吸附和電滲調(diào)控，也可用于生化分離分析。文檔編號(hào)G01N27/447GK101750449SQ20081024010公開日2010年6月23日申請日期2008年12月18日優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日發(fā)明者宋玉玲,宋茂勇,尹俊發(fā),汪海林申請人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心