專利名稱：Sm22抗原多肽、自身抗體在制備檢測腫瘤試劑盒中的應(yīng)用及含有該多肽的檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種SM22抗原多肽，更具體地說是一種腫瘤標(biāo)記物SM22抗原多肽，自身抗體在制備檢測腫瘤試劑盒中的應(yīng)用及含有該多肽的檢測試劑盒，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前人類對腫瘤的診斷主要還是依靠影像學(xué)和病理學(xué)技術(shù)手段，患者大多在有明顯占位病變和臨床癥狀后才得以診斷，多數(shù)患者已經(jīng)到中晚期，很難得到有效的治療。而且，現(xiàn)在臨床上缺少對腫瘤發(fā)展過程有效的監(jiān)測指標(biāo)，從而導(dǎo)致早期診斷困難。因此，建立和發(fā)展適合臨床試用的可以監(jiān)測腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子標(biāo)志物，用該腫瘤標(biāo)記物制備診斷試劑盒或治療藥物，對于腫瘤的診斷和治療具有積極的作用。 腫瘤是一種涉及到多基因、多蛋白的復(fù)雜性疾病。過去三十年中，人們通過對一些單基因的克隆和鑒定獲得了一批與腫瘤相關(guān)的基因或蛋白，同時對這些基因或蛋白的生物學(xué)功能和在腫瘤細(xì)胞中的變化進行了測定。由于這些工作多數(shù)是在各種腫瘤細(xì)胞系中進行的，因而到目前為止，這些研究結(jié)果在用于指導(dǎo)腫瘤臨床的診斷和治療方面有很大的局限性。其中一個重要的問題是不能較全面的獲得準(zhǔn)確的基因、蛋白和機體代謝改變的規(guī)律。
隨著分子細(xì)胞生物學(xué)研究和生物信息學(xué)的發(fā)展，一些新的技術(shù)手段不斷涌現(xiàn)，越來越多組的概念的提出，腫瘤研究也進入了一個新的紀(jì)元。人們開始系統(tǒng)腫瘤生物學(xué)的研究，希望實現(xiàn)基因、蛋白和生物代謝研究的統(tǒng)一，獲得的大量實驗研究數(shù)據(jù)將有助于人類認(rèn)識腫瘤生物學(xué)本質(zhì)，并轉(zhuǎn)化為腫瘤防治的有效技術(shù)手段。 近年來，蛋白質(zhì)組分析技術(shù)的高速發(fā)展極大地推動了腫瘤標(biāo)記物的研究。由于蛋白質(zhì)組學(xué)可以高通量、高效的分析在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)生了變化的蛋白，包括量的上下調(diào)和修飾形態(tài)的改變，已經(jīng)成為篩選腫瘤標(biāo)志物的有效手段。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種特異性腫瘤標(biāo)志物SM22抗原多肽及其衍生物。
本發(fā)明的第二目的在于提供一種特異性腫瘤標(biāo)志物SM22抗原多肽制備的抗體。
本發(fā)明的再一個目的是提供該在SM22抗原多肽在制備檢測腫瘤試劑盒中的應(yīng)用。 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的發(fā)明思路為利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出了胃癌相關(guān)蛋白SM22，并且對其進行了克隆表達，制備了抗體，進一步研究可應(yīng)用于臨床診斷和研發(fā)藥物的靶標(biāo)。 本發(fā)明的技術(shù)方案為 —種SM22抗原多肽，其具有序列表中SEQ ID No. 1所示氨基酸序列。發(fā)明人根據(jù)胃癌組織中上調(diào)的SM22基因序列，克隆表達了 SM22蛋白全長，經(jīng)鎳柱純化后，獲得了純度較高的SM22抗原蛋白。采用高純度的抗原免疫兔子，獲得了高效價的多抗，經(jīng)ELISA和
3Western Blotting檢測，證實其特異性和靈敏性。 上述的一種SM22抗原多肽的衍生序列，其是由SEQ ID No. 1所示氨基酸序列經(jīng)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列，其氨基酸序列如SEQID No. 2所示。
—種能與上述SM22抗原多肽特異性結(jié)合的抗體。
SM22抗原多肽在制備檢測腫瘤試劑盒中的應(yīng)用。 —種檢測腫瘤的試劑盒，其含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的SM22抗原多肽特異性結(jié)合的抗體，所述抗體濃度為100ng/ml。
本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果 (1)本發(fā)明SM22抗原多肽具有極強的特異性，為潛在的腫瘤標(biāo)志物。 (2)本發(fā)明克隆了其全長并且制備了對應(yīng)的抗體，兼具免疫反應(yīng)的高特異性和高
敏感性；其可以制備檢測腫瘤尤其是胃癌的試劑盒，檢測效率高，使用方便，該試劑盒具有
較高的應(yīng)用價值。 (3)在腫瘤生物學(xué)研究中，本發(fā)明表達的抗原可應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)的相互作用等，產(chǎn)生的抗體可應(yīng)用于Western blotting,免疫熒光和免疫組化等。 (4)此外，SM22蛋白的表達和抗體的制備為進行腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究，揭示腫瘤發(fā)展規(guī)律，以及研究適合臨床診斷及治療的試劑材料提供了重要素材。本發(fā)明還可以作為新藥研發(fā)的靶標(biāo)，為抗腫瘤藥物研發(fā)提供新的研究素材。 下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明做進一步說明，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更清楚的得知本發(fā)明的技術(shù)方案，并非對本發(fā)明的限制。
圖1為胃癌組織(T)與癌旁正常組織(N)蛋白質(zhì)譜。所用膠條為pH3-10NL，每塊膠上樣蛋白量為200 iig。 圖2為SM22在8對胃癌組織中的差異表達T和N分別代表胃癌組織和癌旁正常組織。圖中橢圓標(biāo)示區(qū)域為差異點。 圖3為SM22在8對胃癌組織中的Western結(jié)果。Actin (肌動蛋白)和tubulin (微管蛋白)作為上樣蛋白的內(nèi)標(biāo)。 圖4為SM22在胃癌組織中的免疫組織化學(xué)結(jié)果。A為胃癌組織陽性著色；B為癌旁組織陰性著色。
具體實施例方式材料及試劑來源 本試驗所用胃癌組織標(biāo)本來源于北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院組織標(biāo)本庫。手術(shù)前停
止供血30分鐘，切除的新鮮胃癌組織與其對應(yīng)的癌旁組織經(jīng)生理鹽水洗滌后，放入液氮保
存。標(biāo)本均經(jīng)病理證實，并有患者知情同意書。 本具體實施方式
所用試劑均為市售產(chǎn)品。
具體實驗步驟 實施例1SM22抗原多肽的制備 1、蛋白質(zhì)的提取
4
液氮凍存的胃癌組織經(jīng)金屬研缽研磨后，采用10% TCA丙酮混勻，超聲2分鐘，之后靜置45分鐘，采用4度、35000g、離心15分，棄上清。沉淀經(jīng)丙酮清洗三次，最后一次棄上清后真空干燥，用lysis buffer(8M urea， 4% CHAPS， 0. 5% Ampholyte (3-10) ， 20mM TrispH8. 5，用時加入2mM EDTA， lmM PMSF，60mMDTT，Protease Inhibitor Cocktail)復(fù)溶，超聲5分鐘，采用15度、40000g、離心30分，取上清作為實驗所用蛋白。
2、蛋白質(zhì)的分離 提取的蛋白質(zhì)經(jīng)過Bradford法定量后，采用雙向電泳進行了分離。 一相采用的是18cm 3-10NL膠條，聚焦設(shè)置為無電壓泡漲4小時，50伏8小時，之后依次500伏、1000伏和8000伏各一個小時，最后保持8000伏直至總伏小時數(shù)達50， 000伏小時。聚焦好的一相膠條經(jīng)分別含有DTT和IAM平衡液平衡15分鐘后，轉(zhuǎn)移至二相12% SDS-PAGE進行分離。電泳結(jié)束后采用銀染顯色，如圖1所示。
3 、膠圖分析和質(zhì)譜鑒定 銀染的膠圖經(jīng)掃描儀掃描后，采用ImageMaster 2D Platinum分析軟件進行了分
析，設(shè)定3倍以上的光密度差異為閾值，如圖2所示，發(fā)現(xiàn)有四個點在8對中的7對胃癌組織
有明顯上調(diào)。差異具有顯著意義。這四個點被切下，進行酶切消化，經(jīng)MALDI-TOF和LC-MS/
MS質(zhì)譜鑒定為SM22。 4、SM22全長蛋白的克隆 首先提取培養(yǎng)細(xì)胞的總mRNA，以之為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)SM22全長序列設(shè)計引物，引物兩端連入Bam Hl和Xho I酶切位點，
SM22F :5' CGCGGATCCGAATTCGATTGCCTTCTTTC 3'
SM22R :5' CCGCTCGAGTTCCGCTCTAACTGATGAT 3' 以cDNA第 一 鏈為模板進行PCR反應(yīng)(PCR參數(shù)95 。C 5min ;94 °C 30s50°C 30s72°C lmin，共40個循環(huán)；72。C后延伸10min) 。 MgCl2濃度為2mM。 PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，膠內(nèi)回收，Bam Hl和Xho I雙酶切后，與同樣雙酶切的pET30a連接，化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 a ，涂Kana平板篩選轉(zhuǎn)化陽性菌，挑單克隆過夜搖菌，提取質(zhì)粒進行測序，驗證序列無誤。 5、 SM22蛋白誘導(dǎo)表達及純化 從測序正確的陽性菌中提取pET30a-SM22質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂Kana平板篩選轉(zhuǎn)化陽性菌，挑單克隆過夜搖菌，次日擴大培養(yǎng)至0D讀數(shù)為0. 6-0. 8時，lmmol/LIPTG誘導(dǎo)表達。誘導(dǎo)以后的菌株經(jīng)超聲后離心，上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示表達的產(chǎn)物為可溶性蛋白。 大量搖菌后進行誘導(dǎo)表達，提取可溶的蛋白過鎳柱進行純化，100mM咪唑洗脫，SDS-PAGE電泳，切取條帶進行MALDI-T0F鑒定，證實表達產(chǎn)物為SM22。
實施例2SM22抗原多肽多克隆和單克隆抗體制備
1、多克隆抗體制備 純化產(chǎn)物經(jīng)PBS充分透析，并且濃縮至濃度為1. 0mg/ml 。將750 ii g的上述方法制備的全長蛋白和等體積的完全福氏佐劑混和均勻，充分乳化后于新西蘭白兔背部皮下多點注射。初次免疫前從兔腿靜脈取血分離血清，作為免疫前血清對照；兩周后進行首次加強免疫，將500 ii g的His融合蛋白和等體積的不完全福氏佐劑混和均勻，充分乳化后于新西蘭
5白兔背部皮下多點注射。之后，每隔2周加強免疫一次，并于第二次加強免疫后7天從兔腿靜脈取血，用ELISA法測定抗體效價。第四次加強免疫后第7天頸動脈放血，室溫放置4-5小時后，4t: 3000rpm離心5分鐘，收集上清，分裝后于-8(TC凍存待用。
2、單克隆抗體制備 應(yīng)用純化后的抗原皮下免疫三只4-6周的雌性Balb/c小鼠，免疫頻率為間隔10-14天免疫一次，共進行四次免疫。第四次免疫后選取抗體滴度最高的一只小鼠進行加強免疫。加強免疫后三天，殺死小鼠，分離其脾臟細(xì)胞，與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞在PEG1500介導(dǎo)下進行常規(guī)細(xì)胞融合，融合的比例為10 : 1-2。細(xì)胞融合后的細(xì)胞在含有25%新鮮小牛血清，2%甲基纖維素(Sigma)和2% HAT的半固體MDM(GIBCO)培養(yǎng)基中，于37°C 5% C02孵箱培養(yǎng)1周。 細(xì)胞融合后7天進行單克隆細(xì)胞篩選。肉眼可見平皿的培養(yǎng)基表面有白色斑點，顯微鏡下即為細(xì)胞克隆團。無菌條件下將平皿中分散的、單個的細(xì)胞團吸起放入96孔板培養(yǎng)液中，在含有15%新鮮小牛血清的MDM培養(yǎng)基中進行繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿96孔板底部時進行ELISA檢測，雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液上清應(yīng)用抗原包被ELISA進行篩選，陽性孔細(xì)胞進行擴增培養(yǎng)和再檢測。 使用protein A進行Ig G的純化，獲得了抗SM22的多克隆和單克隆抗體。我們采用ELISA和Western blotting兩種方法來驗證抗體的特異性和靈敏度。ELISA實驗證明，該抗體的滴度為l : 12000，背景值很低。Western blotting結(jié)果顯示，該抗體能特異的和抗原反應(yīng)，交叉反應(yīng)很弱。 實施例3SM22特異性抗體制備檢測腫瘤試劑盒 (1)選擇合適的聚苯乙烯ELISA板，保證單孔的吸光值和96孔吸光值的平均值之間的差值在10%以內(nèi)； (2)用微量點樣儀在每孔中包被標(biāo)記了辣根過氧化物酶的抗SM22抗體(lOOng/ml); (3)用0. 5%的牛血清白蛋白進行封閉； (4)對板材和包被的抗體進行干燥處理和真空包裝。 實施例4SM22特異性抗體用于胃癌生物學(xué)行為的判斷 我們應(yīng)用制備的抗體檢驗了提取的胃癌組織蛋白及癌旁正常組織中SM22蛋白質(zhì)的表達。如圖3所示，在8對組織中，除第6對變化不明顯外，其余7對組織中，腫瘤組織的SM22表達量顯著高于癌旁組織。 為了進一步了解SM22在胃癌組織中的分布和定位情況，我們首先制備了胃癌和相應(yīng)癌旁組織的微陣列，然后用免疫組織化學(xué)的方法，對SM22在157例胃組織(其中胃癌組織110例，非癌胃組織47例)中的表達情況進行了研究。如圖4所示，圖4A為胃癌組織陽性著色；圖4B為癌旁組織陰性著色。相對于癌旁組織，SM22確實在胃癌組織中存在高表達，表現(xiàn)為強著色(陽性著色)，而對應(yīng)的癌旁組織則著色較弱(陰性著色)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，胃癌組織中SM22的陽性率為72. 7% (80/110)，而癌旁組織中的陽性率僅為48. 9%(23/47)，統(tǒng)計學(xué)分析顯示兩組的差異存在顯著性(p = 0. 006)。 從以上SM22特異性抗體用于胃癌生物學(xué)行為的判斷結(jié)果可以看出，SM22可以用來制備檢測腫瘤的試劑盒應(yīng)用，并且具有很好的特異性和靈敏度。
序列表〈110〉中國科學(xué)院北京基因組研究所〈120>SM22抗原多肽、自身抗體在制備檢測腫瘤試劑盒中的應(yīng)用及含有該多
檢測J試劑盒〈130〉〈160>2〈170>PatentIn version 3.5〈210>1〈211>213〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>1ArgGly SerGluPheAspCysLeuLeuSerProAspMetAlaAsnLys151015GlyPro SerTyrGlyMetSerArgGluValGinSerLyslieGluLys202530LysTyr AspGluGluLeuGluGluArgLeuValGluTrplielieVal354045GinCys GlyProAspValGlyArgProAspArgGlyArgLeuGlyPhe505560ArgVal TrpLeuGluAsnGlyVallieLeuSerLysLeuValAsnSer65707580LeuTyr ProAspGlySerLysProValLysValProGluAsnProPro859095SerMet ValPheLysGinMetGluGinValAlaGinPheLeuArgAla100105110AlaGlu AspTyrGlyVallieLysThrAspMetPheGinThrValAsp115120125LeuPhe GluGlyLysAspMetAlaAlaValGinArgThrLeuMetAla130135140LeuGly SerLeuAlaValThrLysAsnAspGlyHisTyrArgGlyAsp145150155160ProAsn TrpPheMetLysLysAlaGinGluHisLysArgGluPheThr165170175GluSer GinLeuGinGluGlyLysHisVallieGlyLeuGinMetGly180185190SerAsn ArgGlyAlaSerGinAlaGlyMetThrGlyTyrGlyArgPro195200205ArgGin lielieSer
210〈210>2〈211>199〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>2MetAlaAsnArgGlyProAlaTyrGlyLeuSerArgGluValGinGin151015LyslieGluLysGinTyrAspAlaAspLeuGluGinlieLeulieGin202530 [o川]TrplieThr 35ThrGinCysArgLys 40AspValGlyArgPro 45GinProGlyArgGluAsnPheGinAsnTrpLeuLysAspGlyThrValLeuCysGlu505560LeulieAsnAlaLeuTyrProGluGlyGinAlaProValLysLyslie65707580GinAlaSerThrMetAlaPheLysGinMetGluGinlieSerGinPhe859095LeuGinAlaAlaGluArgTyrGlylieAsnThrThrAspliePheGin100105110ThrValAspLeuTrpGluGlyLysAsnMetAlaCysValGinArgThr115120125LeuMetAsnLeuGlyGlyLeuAlaValAlaArgAspAspGlyLeuPhe130135140SerGlyAspProAsnTrpPheProLysLysSerLysGluAsnProArg145150155160AsnPheSerAspAsnGinLeuGinGluGlyLysAsnVallieGlyLeu165170175GinMetGlyThrAsnArgGlyAlaSerGinAlaGlyMetThrGlyTyr180185190GlyMetProArgGinlieLeu195
8
權(quán)利要求
一種SM22抗原多肽，其特征在于，其具有序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SM22抗原多肽，其特征在于，其是由SEQ ID No. 1所示氨基酸序列經(jīng)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種SM22抗原多肽，其特征在于，SM22抗原多肽衍生序列的氨基酸序列為SEQ ID No. 2。
4. 一種能與權(quán)利要求1至3中任意一項所述的SM22抗原多肽特異性結(jié)合的抗體。
5. SM22抗原多肽在制備檢測腫瘤試劑盒中的應(yīng)用。
6. —種檢測腫瘤的試劑盒，其特征在于，其含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的權(quán)利要求4所述的SM22抗原多肽特異性結(jié)合的抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種檢測腫瘤的試劑盒，其特征在于所述抗體濃度為100ng/ml。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5、6或7所述的檢測腫瘤試劑盒，其特征在于，所述腫瘤為胃癌。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種腫瘤標(biāo)志物SM22抗原多肽，其具有序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列。本發(fā)明還公開了用其基因克隆表達該蛋白，制備該蛋白的特異性抗體，并且進行胃癌生物學(xué)行為判斷的方法。由本方法制備的SM22抗原多肽及其抗體可用于制備檢測腫瘤試劑盒的應(yīng)用以及藥物靶標(biāo)的研發(fā)。
文檔編號G01N33/574GK101735316SQ200810227090
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日
發(fā)明者劉斯奇, 呂有勇, 孫毛毛, 張軍, 彭福利, 徐寧志, 李向紅, 李娜, 梁玉梅, 王融, 邵建敏 申請人:中國科學(xué)院北京基因組研究所