專(zhuān)利名稱：：HIV-1p24抗原吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于臨床血液檢測(cè)分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于臨床和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HIV-1p24抗原的方法。該方法靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、搡作簡(jiǎn)便，在新生兒HIV-1感染的診斷、HIV-1感染者病情發(fā)展的監(jiān)測(cè)、耐藥性監(jiān)測(cè)、抗病毒治療效果的評(píng)價(jià)等方面有重要應(yīng)用。技術(shù)背景HIV-1(Humanimmunodeficiencyvirus)病毒感染人體之后,在宿主細(xì)胞和病毒中會(huì)產(chǎn)生一些HIV感染的標(biāo)志性物質(zhì)(NielT.Constantine，HollyZink.HIVtestingtechnologiesaftertwodecadesofevolution.IndianJMedRes121.2005:519-524),通過(guò)這些標(biāo)志物我們可以進(jìn)行病毒檢驗(yàn)、監(jiān)測(cè)病毒在體內(nèi)的復(fù)制情況、了解感染后病情的發(fā)展、并實(shí)時(shí)掌握人體的免疫系統(tǒng)狀況。病毒感染后，這些標(biāo)志物隨著病毒侵染過(guò)程，p24抗原作為標(biāo)志物之一，在病毒診斷方面受到了人們的廣泛關(guān)注。通常來(lái)講HIV-1的核酸(RNA)檢測(cè)是靈敏性和特異性的方法，但是在實(shí)際應(yīng)用方面，核酸檢驗(yàn)具有很多不便于推廣的因素。核酸檢測(cè)同其它檢驗(yàn)方法相比，所需的實(shí)驗(yàn)費(fèi)用比較昂貴，所需的實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)條件也比較苛刻。另外，核酸檢驗(yàn)的操作復(fù)雜，為了增加檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，就要求實(shí)驗(yàn)操作人員有比較高的專(zhuān)業(yè)操作水平。同時(shí)，核酸實(shí)驗(yàn)整體耗時(shí)較長(zhǎng)。而從全球艾滋病毒感染者的分布情況來(lái)看(■IDS,WHO.AIDSepidemicupdate2006.)，大部分的感染者都分布在經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)的地區(qū)，如非洲等，這就為HIV-l的RNA4企測(cè)在不發(fā)達(dá)地區(qū)的推廣造成了不便。為了解決這一方面的問(wèn)題人們?cè)谄渌鼨z驗(yàn)方法上估支了4艮多嘗試，如全淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞檢測(cè)、血清白蛋白檢測(cè)、p24抗原檢測(cè)、抗p24抗體檢測(cè)等，試圖以此來(lái)替代核酸檢測(cè)方法進(jìn)行艾滋病的相關(guān)檢測(cè)，其中HIV-1p24抗原檢測(cè)方法的研究最為廣泛。在新生兒HIV-l診斷、HIV-l感染者病情發(fā)展的監(jiān)測(cè)、抗病毒治療效果的檢驗(yàn)等方面都具有4艮好的效果，并同核酸;險(xiǎn)測(cè)方法具有4艮好的相關(guān)性，有望替代核酸才企測(cè)在廣大不發(fā)達(dá)地區(qū)廣泛推廣。常用的HIV-1p24抗原;險(xiǎn)測(cè)方法為酶聯(lián)免疫分析法(Enzymelinkedimmuno-sorbentassay,ELISA),并多采用雙抗夾心法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的靈敏度在3.5-10pg/ml，檢測(cè)寬度在2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。為了提高檢測(cè)靈敏度，使HIV-1p24抗原檢測(cè)方法能在檢測(cè)靈敏性和特異性方面不斷接近核酸檢測(cè)的水平，在過(guò)去的二十幾年時(shí)間里人們?cè)谄胀‥LISA基礎(chǔ)上做了各種改進(jìn)，其中最為成功的方法有ELASTELISA方法和IPCR(Immunepolymerasechainreaction)-ELISA方法等。Ledergerberetal在文獻(xiàn)中報(bào)道，應(yīng)用ELASTELISA方法(Perkin-ElmerLifeSciences,Boston,MA)進(jìn)行HIV-1型p24抗原的檢測(cè)，其才全測(cè)限可以達(dá)到0.5pg/ml。JanetM.Barletta應(yīng)用免疫PCR方法同ELISA方法(Zeptomertrix，Buffalo,NY)結(jié)合，檢測(cè)低限可以達(dá)到1000個(gè)p24抗原分子。但/人實(shí)際應(yīng)用中來(lái)分析以上兩種方法第一種方法所應(yīng)用的》丈大體系主要是生物素-鏈親和素放大系統(tǒng)，這種體系常會(huì)在血清樣品檢驗(yàn)中出現(xiàn)非特異性的反應(yīng)，同時(shí)引入放大系統(tǒng)后操作步驟增加，反應(yīng)時(shí)間也會(huì)延長(zhǎng)，為了減少非特異性反應(yīng)洗滌次數(shù)也要增加；第二種體系中引入的免疫PCR反應(yīng)，在反應(yīng)時(shí)間和操作步驟上增加難度之外，在核酸標(biāo)記反應(yīng)上也為實(shí)驗(yàn)體系的操作上增加了不便?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析方法其原理與酶聯(lián)免疫方法相似，是把化學(xué)發(fā)光物質(zhì)與免疫學(xué)反應(yīng)結(jié)合起來(lái)，用光反應(yīng)表現(xiàn)被測(cè)的免疫成分濃度。即把高靈敏的光反應(yīng)與特異性的免疫學(xué)反應(yīng)相結(jié)合，用發(fā)光強(qiáng)度來(lái)對(duì)抗原、抗體等物質(zhì)進(jìn)行定量分析的方法。其中化學(xué)發(fā)光是伴隨化學(xué)反應(yīng)過(guò)程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)吸收了反應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)產(chǎn)物從分子狀態(tài)激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)。當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)時(shí)產(chǎn)生輻射，多余的能量以光子的形式釋放出來(lái)，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光(吳建民.臨床化學(xué)自動(dòng)化免疫分析.科學(xué)出版社，2000)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析方法自身具有靈敏度很高的靈敏性(C.Dodeigne,LThunus,R.Lejeime.ChemiluminescenceasDiagnosticTool.Talanta2000,51:415-439)，由于不需要外來(lái)光源，避免了瑞利散射和拉曼散射等噪音，因而本底低且具有比熒光法更高的信噪比，其靈敏度比酶聯(lián)免疫分析或放射性免疫分析方法高1至2個(gè)數(shù)量級(jí);另外化學(xué)發(fā)光試劑本身也有檢測(cè)線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn)A.C.Calokerinos,N.T.Deftereos，W.R.G.Baeyens.ChemiluminescenceinDrugAssay.JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis.1995，13:1063-1071.),可達(dá)6-7個(gè)lt量級(jí)。吖啶酯類(lèi)化合物作為一種常用的化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光免疫分析體系的研究中得到了廣泛的關(guān)注。它具有靈敏度高、容易標(biāo)記到蛋白、多肽和小分子上的優(yōu)點(diǎn)。而且由于吖啶酯或吖咬磺酰胺類(lèi)化合物在有11202的稀堿溶液中即能發(fā)生化學(xué)發(fā)光，無(wú)需催化過(guò)程，也不需要增強(qiáng)劑，從而降低了背景發(fā)光，提高了信噪比，干擾作用少，因此是化學(xué)發(fā)光免疫分析的理想的發(fā)光底物。例如，美國(guó)CibaCorning公司研制的ACS-180免疫分析試劑盒體系就是采用二曱基吖啶酯直接標(biāo)記的，靈敏度可達(dá)10—15g/l。用來(lái)進(jìn)行固相免疫學(xué)反應(yīng)的吖啶酯類(lèi)化合物可以選擇4-(2-琥珀酰亞氨基羧基)苯基-10-曱基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸鹽(AcridiniumC2NHSEster)等，目前已臨床用于曱狀腺功能、生殖生理、腫瘤標(biāo)志物、藥物監(jiān)測(cè)及心血管等多個(gè)項(xiàng)目得到應(yīng)用。但還未見(jiàn)有吖咬酯化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)方法用于HIV-lp24抗原4企測(cè)的才艮道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、簡(jiǎn)單、快捷，便于自動(dòng)化的HIV-1p24抗原吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)方法。本發(fā)明采用雙抗夾心的方法，以激發(fā)劑激發(fā)標(biāo)記于抗HIV-1p24抗體上的吖咬酯發(fā)光，進(jìn)行HIV-1p24抗原的定性和定量分析，具體步驟如下(1)用抗HIV-1p24抗體對(duì)固相載體進(jìn)行包被；(2)處理HIV-1樣品，即解離HIV-1樣品，分離HIV-1p24抗原；(3)將步驟(2)中處理后的HIV-1樣品和吖啶酯類(lèi)化合物標(biāo)記的抗HIV-1p24配對(duì)抗體加入步驟(1)中的反應(yīng)體系進(jìn)行免疫反應(yīng)；(4)將激發(fā)劑1和激發(fā)劑2加入步驟(3)中的反應(yīng)體系，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；(5)檢測(cè)步驟(4)中化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光子數(shù)，進(jìn)行定性或/和定量分析。其中，步驟(1)中的抗HIV-1p24抗體可以對(duì)各種各樣的固相載體進(jìn)行包被，如聚苯乙烯乳膠、聚苯乙烯塑料制品、聚氯乙烯塑料制品、脂質(zhì)體、免疫磁性微珠等。步驟(2)中所述的HIV-1樣品為任意來(lái)源的HIV-1p卩4抗原。任意來(lái)源是指，HIV-1艾滋病毒感染者的血液、以HIV-l病毒侵染細(xì)胞后得到的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物、以原核生物或真核生物為表達(dá)載體根據(jù)基因工程而得到的p24重組抗原。其中，血液需要通過(guò)物理方法離心得到血清。細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物需要物理方法、化學(xué)方法和生物方法使其裂解，離心取其上清。重組抗原需要通過(guò)物理方法、化學(xué)方法和生物方法使其純化。血液來(lái)源和細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源的p24抗原，以游離的p24抗原分子和p24抗原及其抗體的復(fù)合物的一種或任意組合的形式存在，需要預(yù)先進(jìn)行加熱解離或酸性解離以使抗原從抗原抗體復(fù)合物中解離出來(lái)。步驟(2)中所述的HIV-1樣品包含任意類(lèi)型的HIV-1型病毒。任意類(lèi)型是指M亞群和O亞群的一種或任意組合。所述的M亞群中包括A、B(B')、C、D、E、F、G、H、I和J等10個(gè)亞型。步驟(4)中所述的激發(fā)劑1為過(guò)氧化氫和硝酸的混合液，其中過(guò)氧化氫的濃度為0.05-0.1M,硝酸的濃度為0.1-0.5M;所述的激發(fā)劑2為曲拉通100和氯氧化鈉的混合液，其中曲拉通100的濃度為0.1-0.5M,氫氧化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2-5%;過(guò)氧化氫和氫氧化鈉主要為吖啶酯類(lèi)化合物提供堿性的發(fā)光環(huán)境；優(yōu)選加入激發(fā)劑1,0.5-1秒鐘后再加入激發(fā)劑2。本發(fā)明方法中采用吖啶酯類(lèi)化合物標(biāo)記配對(duì)抗體。主要通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將一種分子共價(jià)連接到另一種分子上，參與偶聯(lián)反應(yīng)的兩種物質(zhì)分別稱為標(biāo)記物和被標(biāo)記物?；瘜W(xué)標(biāo)記的目的是使被標(biāo)記物保持自身的性質(zhì)(如免疫學(xué)性質(zhì))且又具有標(biāo)記物的某些性質(zhì)(如發(fā)光性質(zhì))。吖啶酯類(lèi)化合物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使吖啶酯通過(guò)共價(jià)鍵與被標(biāo)記的蛋白、多肽或核酸的氣基結(jié)合。本發(fā)明所涉及的硝酸和曲拉通100為吖啶酯類(lèi)化合物發(fā)光的激發(fā)劑、增強(qiáng)劑，使吖啶酯類(lèi)化合物在激發(fā)劑的作用下瞬時(shí)即可發(fā)光，同以往酶聯(lián)免疫分析反應(yīng)相比大大縮短了#:作的時(shí)間。本發(fā)明所涉及的吖啶酯類(lèi)化合物的激發(fā)劑以即時(shí)加樣即時(shí)檢測(cè)的方法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)光即可檢測(cè)光子數(shù)，不需要加入終止試劑、信號(hào)放大體系等額外反應(yīng)，也減少了操作步驟。普通的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的自動(dòng)化程度已經(jīng)很高，目前國(guó)內(nèi)外的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀已經(jīng)很多，如CibaCorning公司的ACS:180、PerkinElmer公司的MulUlabelCounterVICTOR1420等。本發(fā)明方法采用的即時(shí)加入激發(fā)劑的方法對(duì)于自動(dòng)化操作、減少人為操作誤差、提高檢測(cè)靈敏度都很有幫助。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有以下有益效果1)靈敏度較高，可達(dá)到O.5pg/ml，達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。2)檢測(cè)范圍較寬，可達(dá)到5-6個(gè)數(shù)量級(jí)，對(duì)較高濃度的樣品無(wú)需稀釋即可檢測(cè)。3)操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)時(shí)間短，吖啶酯類(lèi)化合物在激發(fā)劑作用下兩秒內(nèi)即可發(fā)光。4)有利于反應(yīng)體系的自動(dòng)化操作。圖1、吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析HIV-1p24抗原的胡克效應(yīng)。圖2、吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析HIV-1p24抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。具體實(shí)施方式材料和試劑吖"定酉旨(AcridiniumC2NHSEster)購(gòu)自Assaydesigns公司；固相載體(白色96微孔板ImmunoMaxiSorp)購(gòu)自Nunc公司;包被緩沖液Na2C03-NaHC030.05MpH9.5洗滌緩沖液Na2HP04-NaH2P040.01MNaCl0.9%pH7.4封閉緩沖液Na2HP04-NaH2P040.05MNaCl0.9%BSA1%PH7.4分析緩沖液Na2HP04-NaH2P040.05MNaCl0.9%200.05%BSA0.5%pH7.0激發(fā)劑1:HN030.1MH2020.08M激發(fā)劑2:TritonX-1002%NaOH0.2MHIV-1樣品HIV-1p24重組抗原(病毒所提供)；HIV-lp24抗原國(guó)家參考品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品;險(xiǎn)定所)包括20支HIV-lp24抗原陰性參考品，編號(hào)為Nl-N20;10支HIV-1p24抗原陽(yáng)性參考品，編號(hào)為Pl-P10;IO支線性靈敏度參考品，編號(hào)為L(zhǎng)1-L10;HIV-lp24抗原檢測(cè)精密度參考品,編號(hào)為AgCV;陰性對(duì)照人血清(VironostikaHIV-1Antigen,bioMerieuxInc.,Durham,NC);陽(yáng)性對(duì)照重組p24抗原(VironostikaHIV-lAntigen,bioMerieuxInc.,Durham,NC)。實(shí)施例1)用包被緩沖液將包被用抗p24抗體稀釋至6pg/ml后，于白色96微孔板中，每孔加入100p1,4。C封閉16個(gè)小時(shí)；2)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入300pl洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次；3)每孔加入封閉緩沖液300p1,37。C恒溫震蕩1個(gè)小時(shí)；4)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入300jul洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次，晾千后4。C保存；5)分別將濃度為80、40、20、10、5pg/ml的五個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣品加入孔中，每個(gè)濃度2個(gè)復(fù)孔，每孔加入100)n1,將陰性對(duì)照樣品分別加入4個(gè)孔中，每孔加入100pl，將HIV-1p24抗原國(guó)家參考品40個(gè)樣品(N1-N20、PI-P10和L1-L10)各加入1孔，每孔加入lOOjil,將AgCV樣品分別加入4個(gè)孔中，每孔加入100|ul，3rc恒溫振蕩1個(gè)小時(shí)；6)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入30(^1洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次；7)用分析緩沖液對(duì)吖啶酯標(biāo)記的抗p24抗體進(jìn)行1:200倍稀釋后，每孔加入lG0iil;8)將HIV-1樣品和吖啶酯標(biāo)記的抗HIV-lp24抗體充分混合后，于37。C恒溫振蕩1個(gè)小時(shí)；9)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入30(^1洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次；10)將50|il激發(fā)劑1和50pl激發(fā)劑2,分別通過(guò)多功能分析儀即時(shí)力口入孔中，兩試劑加入時(shí)間相隔1秒；11)加入激發(fā)劑后立即檢測(cè)發(fā)光值，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表lHIV-1p24抗原國(guó)家參考品檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)20支HIV-1p24抗原陰性參考品不得出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)(20/20)。IO支HIV-Ip24抗原陽(yáng)性參考品不得出現(xiàn)陰性反應(yīng)(10/10)。10支線性靈敏度參考品對(duì)HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑，最低檢出量不得高于1.25U/ml(至少檢測(cè)出LI-L5),進(jìn)行p24定量測(cè)定時(shí)，LI-L5共5個(gè)樣品測(cè)定值統(tǒng)計(jì)分析后線性關(guān)系系數(shù)(R值)必須>0.95。精密度測(cè)定統(tǒng)計(jì)分析后CV《15%。結(jié)合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可知本發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果符合HIV-lp24抗原國(guó)家參考品標(biāo)準(zhǔn)的要求。相應(yīng)參數(shù)的確定1、分析靈每文度將HIV-lp24重組抗原用分析緩沖液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e得到0,0.05pg/ml,0.1pg/ml，0.2pg/ml，0.5pg/ml,1pg/ml,2pg/ml，5pg/ml,10pg/ml,20pg/ml,50pg/ml,100pg/ml，200pg/ml,500pg/ml等濃度梯度，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100pU。0標(biāo)準(zhǔn)和各樣品作10次批內(nèi)重復(fù)測(cè)定，求每組的均值(M)、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(cvy。)。反應(yīng)所應(yīng)用的吖。定酯標(biāo)記抗體為1:1000倍稀釋。激發(fā)劑1和2均為多功能分析儀即時(shí)加樣、即時(shí)檢測(cè)。將各濃度梯度所得(M-3SD)x值與陰性對(duì)照的(M+3SD)NC值進(jìn)行比較，選取(M-3SD)X>(M+3SD)NC時(shí)的最小濃度值為該體系的檢測(cè)限，經(jīng)比較本發(fā)明方法的檢測(cè)限為0.5pg/ml。2、檢測(cè)寬度2.1胡克效應(yīng)將HIV-lp24重組抗原用分析緩沖液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e得到0,lng/ml，5ng/ml,10ng/ml，20ng/ml,50ng/ml，100ng/ml,200ng/ml，500ng/ml，lOOOng/ml,2000ng/ml，5000ng/ml等濃度梯度,每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，每孔加入10(^1。0標(biāo)準(zhǔn)和各樣品4次批內(nèi)重復(fù)測(cè)定，求每組的均值。反應(yīng)所應(yīng)用的吖啶酯標(biāo)記抗體為1:100倍稀釋。激發(fā)劑1和2均為多功能分析儀即時(shí)加樣、即時(shí)檢測(cè)。100ng/ml的濃度梯度所對(duì)應(yīng)的發(fā)光值最高。當(dāng)被;險(xiǎn)測(cè)的HIV-lp24抗原濃度大于100ng/ml時(shí)，其發(fā)光值不^f旦沒(méi)有升高反而急劇下降，呈明顯的鉤狀，如圖1所示。2.2檢測(cè)寬度將HIV-lp24重組抗原用分析緩沖液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e得到0，10pg/ml，20pg/ml,50pg/ml,100pg/ml,200pg/ml，500pg/ml，lng/ml，2ng/ml，5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,lOOng/ml等14個(gè)濃度的樣品，每個(gè)濃度2個(gè)復(fù)孔，每孔加入10(^1。0標(biāo)準(zhǔn)和各樣品作4次批內(nèi)重復(fù)測(cè)定，求每組的變異系數(shù)。反應(yīng)所應(yīng)用的吖啶酯標(biāo)記抗體為1:1000倍稀釋。激發(fā)劑1和2均為多功能分析儀即時(shí)加樣、即時(shí)檢測(cè)。在所選的濃度范圍內(nèi)，各個(gè)梯度的變異系數(shù)均小于20%,故此將100ng/ml作為檢測(cè)范圍的上限。對(duì)于檢測(cè)范圍的下限，通常選取功能靈敏度，本發(fā)明方法的功能靈敏度為0.5pg/ml,由此得出本發(fā)明HIV-1p24吖。定酯化學(xué)發(fā)光免疫分析方法檢驗(yàn)的線性范圍是0.5pg/ml-100ng/ml,共6個(gè)數(shù)量級(jí)。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合將HIV-lp24重組抗原用分析緩沖液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e得到0，0.1pg/ml,0.2pg/ml，0.5pg/ml,1pg/ml,2pg/ml,5pg/ml，10pg/ml,20pg/ml，50pg/ml，100pg/ml,200pg/ml，500pg/ml，lng/ml,2ng/ml,5ng/ml,lOng/ml,20ng/ml，50ng/ml,lOOng/ml等20個(gè)濃度的樣品，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，每孔加入100nl，求每個(gè)濃度的光子數(shù)均值。反應(yīng)所應(yīng)用的吖啶酯標(biāo)記抗體為1:1000倍稀釋。激發(fā)劑1和2均為多功能分析儀即時(shí)加樣，即時(shí)檢測(cè)。通過(guò)曲線擬合得到曲線，如圖2所示，得出擬合方程為四參數(shù)logistic曲線形式CPS/CPSmax為不同濃度p24抗原所對(duì)應(yīng)的吖啶酯發(fā)光值與此次檢測(cè)中最高發(fā)光值之間的比值；四個(gè)參數(shù)<3、6分別為0.9953、0.04764，c為2,934，d為1.209，W為0.9990，具有非常好得統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HIV-1p24吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的功能靈敏度為0.5pg/ml，比普通的ELISA方法低1-2個(gè)數(shù)量級(jí)；分析靈敏度為0.5pg/ml;線性范圍在0.5pg/ml-100ng/ml，比普通的ELISA方法高1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。權(quán)利要求1.一種HIV-1p24抗原吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)方法，具體步驟如下(1)用抗HIV-1p24抗體對(duì)固相載體進(jìn)行包被；(2)處理HIV-1樣品；(3)將步驟(2)中處理后的HIV-1樣品和吖啶酯類(lèi)化合物標(biāo)記的抗HIV-1p24配對(duì)抗體加入步驟(1)中的反應(yīng)體系進(jìn)行免疫反應(yīng)；(4)將激發(fā)劑1和激發(fā)劑2加入步驟(3)中的反應(yīng)體系，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；(5)檢測(cè)步驟(4)中化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光子數(shù)，進(jìn)行定性或/和定量分析。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(l)中所述的固相載體為聚苯乙烯乳膠、聚苯乙烯塑料制品、聚氯乙烯塑料制品、脂質(zhì)體或免疫磁性微珠。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的HIV-1樣品選自血清、血漿、HIV-1細(xì)胞培養(yǎng)物裂解上清或HIV-lp24重組抗原的一種或多種。4、根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的HIV-1樣品包含的HIV-1型病毒為M亞群和0亞群的一種或任意組合。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的M亞群中包括A、B、B'、C、D、E、F、G、H、I和J亞型。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的激發(fā)劑1為過(guò)氧化氫和硝酸的混合液，其中過(guò)氧化氫的濃度為0.05-0.1M，硝酸的濃度為0.1-0.5M。7、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的激發(fā)劑2為曲拉通100和氫氧化鈉的混合液，其中曲拉通100的濃度為0.1-0.5M，氬氧化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2-5%。8、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(4)中加入激發(fā)劑1，0.5-1秒鐘后再加入激發(fā)劑2。全文摘要HIV-1p24抗原吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)方法屬于臨床血液檢測(cè)分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
。現(xiàn)有HIV-1p24抗原檢測(cè)方法存在靈敏度不高且操作繁瑣等問(wèn)題。本發(fā)明以吖啶酯類(lèi)化合物標(biāo)記抗HIV-1p24抗體，通過(guò)雙抗夾心的方法進(jìn)行p24抗原抗體間的免疫結(jié)合；以激發(fā)劑過(guò)氧化氫、硝酸、曲拉通100和氫氧化鈉，激發(fā)吖啶酯類(lèi)化合物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；檢測(cè)光子數(shù)，進(jìn)行定性或/和定量分析。本發(fā)明具有與普通的ELISA檢測(cè)方法具有很好的相關(guān)性，在P≤0.01情況下，相關(guān)系數(shù)為0.951；靈敏度高、檢測(cè)限為0.5pg/ml，檢測(cè)范圍廣、5-6個(gè)數(shù)量級(jí)；反應(yīng)時(shí)間短，操作更為簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N21/76GK101281196SQ200810111678公開(kāi)日2008年10月8日申請(qǐng)日期2008年5月16日優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日發(fā)明者娟馮,毅曾,鐘儒剛,馬雪梅申請(qǐng)人:北京工業(yè)大學(xué)