專利名稱：一種基于orf2抗原功能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及畜牧獸醫(yī)科學技術(shù)，特別是一種基于0RF2 (基于開方閱讀框2)抗原功 能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法。
背景技術(shù)：
II型豬圓環(huán)病(PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原，該 病主要引起斷奶仔豬發(fā)育不良、漸進性消瘦、皮膚蒼白或黃疸，呼吸困難，腹瀉等多種癥狀， 臨床上由于繼發(fā)細菌和病毒感染使該病的臨床癥狀復(fù)雜且多樣。因此，豬感染PCV-2后，可 于5 12周齡時發(fā)生PMWS，發(fā)病率為5% 30%，死亡率可達10% 30%。世界多個國家 和地區(qū)都有對該病的報道，該病毒在我國畜群中也廣泛存在。該病已經(jīng)被世界公認為是豬 的重要傳染病且會對全球的豬肉制品進出口業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。迄今還沒有控制和消滅PMWS的有效措施，也缺乏有效的疫苗來預(yù)防PMWS，因此在 加緊開展基礎(chǔ)研究工作的同時，盡快建立快速有效的診斷檢測方法是防控該病流行最必須 的措施。目前診斷豬圓環(huán)病最常用的方法是免疫過氧化物酶單層實驗(IPMA)和間接免疫 熒光實驗(IFA)。但這些方法的實驗操作費時費力，而且在準備感染細胞過程中有散毒的危 險，特別是這些診斷方法為保證做出正確判斷需要有經(jīng)驗的研究人員。與這些方法相比，酶 聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)除省時省力自動化程度高，適合進行大批量樣品檢測外，它還能 最大限度的減少IPMA和IFA造成的人為誤差。

發(fā)明內(nèi)容
及時、準確的診斷對疫病的防治是至關(guān)重要的，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是 提供一種以大腸桿菌表達的PCV2 0RF2特異抗原片段作為抗原，建立能夠從豬群中檢測陽 性感染豬的快速、敏感的且能將PCVl和PCV2兩種血清型病毒感染區(qū)分開的一種基于0RF2 抗原功能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法。本發(fā)明的技術(shù)問題通過下述技術(shù)手段解決一種基于0RF2抗原功能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法，包括如下步驟(1)設(shè)計特異引物，擴增獲得0RF2上的氨基酸區(qū)段113_147aa的基因片段；(2)將目的基因片段克隆進pGEX-4T-l中，獲得重組質(zhì)粒pGEX-GST-0RF2_E ；(3)在大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中誘導表達GST-0RF2-E融合蛋白，并純化；(4)以純化蛋白作為抗原包被ELISA 96孔板；(5)加入待檢血清；(6)加入HRP標記的二抗，即HRP標記抗豬IgG ；(7)加入鹽酸鄰苯二胺(OPD)底物溶液進行顯色；(8)測定490nm的光密度(OD49tl)并判讀結(jié)果。所述特異引物的核苷酸序列為0RF2-EF :5’ -GC |GGA TCC| CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC T_3’ ；
0RF2-ER 5' ~GC [CTC GAGj TTAA GCG GGA GGA GTA GTT TAAC A-3’如方框所示，引物中分別引入BamHI和Xho I酶切位點。所述目的基因片段的序列為CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC TCC AGT GCT GTT ATT CTA GAT GAT AAC TTTGTA ACA AAG GCC ACA GCC CTC ACC TAT GAC CCC TAT GTA AAC TAC TCC TCC CGCTAA0所述誘導表達的條件為在含100μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm 培養(yǎng)攜帶重組質(zhì)粒PGEX-GST-0RF2-E的大腸桿菌BL21 (DE3)，直至菌液的0D_值介于 0. 6-0. 8，加入IPTG至終濃度0. ImM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，離心收集細菌沉淀。所述純化GST-0RF2-E的方法為谷胱甘肽親和層析柱層析法，具體步驟為用 IXPBS懸浮細菌沉淀并超聲處理IOmin (power3，on 30sec ；off 30sec)，離心取上清，與經(jīng) IXPBS平衡的Glutathione Sepharosw 4B在室溫振蕩混合30min，將混合物轉(zhuǎn)移至層析柱 中，用1XPBS清洗柱子，用谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫融合蛋白。所述抗原的濃度為0. 5 μ g/mL。所述HRP標記抗豬IgG的稀釋度為1 3000;所述實驗血清的稀釋度為1 100，用含0. 1% Tween20和5% (w/v)脫脂奶粉的 PBS作為封閉液，用含0. 1% Tween20和(w/v)脫脂奶粉的PBS作為稀釋液。所述判斷標準為，OD490大于或等于0. 22為陽性，OD490小于0. 22為陰性。PCV2的0RF2作為其主要結(jié)構(gòu)蛋白，常被用于建立不同診斷方法和疫苗的抗原蛋 白。本發(fā)明以PCV20RF2上的特定氨基酸區(qū)段(113-147aa)為目標，將其與GST融合表達得 到GST-0RF2-E融合蛋白，利用親和層析柱將融合蛋白純化后作為抗原包被ELISA 96孔板， 建立間接ELISA方法，本方法中選擇的特定氨基酸區(qū)段是PCV2 0RF2上抗原性較高的區(qū)段， 將其作為ELISA包被抗原，提高了傳統(tǒng)PCV2ELISA方法的靈敏度和特異性，與常規(guī)應(yīng)用的免 疫熒光檢測方法相比，該法的特異性和敏感性分別為87. 7%和93. 57%。由于0RF2在PCVl 和PCV2間無抗原交叉，能夠用于鑒別診斷PCVl和PCV2的感染，高免疫原性氨基酸區(qū)段的 應(yīng)用，進一步提高了這一特異性。用該方法檢測了 46份血清，包括實驗感染PCVl和PCV2 的動物血清和健康動物血清。結(jié)果99%的的PCV2感染動物血清為陽性，97%的PCVl感染 動物血清為陰性，100%的健康動物血清為陰性。說明本發(fā)明可以鑒別PCVl和PCV2感染的 動物。
具體實施例方式實施例1.弓丨物的設(shè)計和目的基因的PCR擴增資料 艮道(MaheD, Blanchard P, Truong C, Arnauld C, Le Cann P, CarioletR, Madec F, Albina E, Jestin Α. 2000. Differential recognition of 0RF2protein from type land type 2porcine circoviruses and identificationof immunorelevant epitopes. J Gen Virol. 81 (Pt 7) :1815_1824.)，在PCV2編碼的蛋白上有五個主要免疫反 應(yīng)區(qū)，其中一個在ORFl蛋白編碼區(qū)上，其他四個在0RF2上。由于只有在0RF2上的抗原功 能區(qū)(113-147)是最有效的，并可能成為主要抗原用于研制檢測畜群PCV2感染的ELISA試 劑盒。在本發(fā)明中選擇0RF2上的該氨基酸區(qū)段(113-147)作為目的抗原進行克隆表達，其基因片段全長102bp。以PCV2 0RF2全基因為模板，設(shè)計兩條特異引物，通過PCR擴增 技術(shù)獲得位于0RF2蛋白序列上113-147aa特異抗原區(qū)段的基因片段。PCR反應(yīng)體系為 10XPCR buffer 5 μ 1, pfu DNA Pol ymerase 0· 25 μ 1 (5U/μ 1)，dNTPl μ 1 (10mmol/L)，模 板0. 5μ 1，上下游引物個0. 5μ αομπιο /υ，雙蒸水補足50μ 1。擴增條件為94°C預(yù)變 性 2min，然后 94°C 20s, 60°C 20s, 72°C 30s, 30 個循環(huán)，最后 72°C延伸 8min。引物序列如下，如方框所示，在引物中分別引入BamH I和Xho I酶切位點0RF2-EF :5’ ~GC |GGA TCC CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC T-3’ ；0RF2-ER :5，-GC CTC GAG TTA GCG GGA GGA GTA GTT TAC A-3，目的基因序列為CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC TCC AGT GCT GTT ATT CTAGAT GAT AAC TTT GTA ACA AAG GCC ACA GCC CTC ACC TAT GAC CCC TAT GTA AACTAC TCC TCC CGC TAA02.重組載體的構(gòu)建和目的基因的誘導表達及純化凝膠回收純化所擴增的基因片段，用BamH I和Xho I雙酶切所純化的基因片段和 PGEX-4T-1載體，再次凝膠純化經(jīng)雙酶切的基因片段和載體，然后用T4DNA快速連接酶連接，連接體系為10X Ii gase buffer Ιμ ，酶切純化的目的基 因片段5μ 1，載體pGEX-4T-lll·! 1，T4 DNA快速連接酶1 μ 1，雙蒸水補足10 μ 1，室溫連接 15min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，鋪LB平板于37°C培養(yǎng)過夜，挑取單克 隆菌落進行PCR鑒定，并測序確證，陽性重組質(zhì)粒命名為PGEX/0RF2-E。將重組質(zhì)粒pGEX/ 0RF2-E轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株中誘導表達。所述誘導表達的條件為在含IOOyg/ mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)攜帶重組質(zhì)粒pGEX/0RF2_E的大腸桿菌 BL21 (DE3)，直至菌液的OD600值介于0. 6-0. 8，加入IPTG至終濃度0. ImM,繼續(xù)培養(yǎng)3小時， 離心收集細菌沉淀。GST-0RF2-E融合蛋白應(yīng)用谷胱甘肽親和層析柱進行純化。具體步驟為用IXPBS懸浮細菌沉淀并超聲處理IOmin(超聲10s，間歇10s)，離心取上清， 與經(jīng)IXPBS平衡的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione Sepharosw 4B)在室溫振蕩混合 30min，將混合物轉(zhuǎn)移至層析柱中，用IXPBS清洗柱子，用谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫融合蛋 白。SDS-PAGE和Western-blotting結(jié)果顯示，融合蛋白的大小約29KDa。在超聲并離心之 后的菌液上清和沉淀中都有融合蛋白存在，在上清液中融合蛋白GST-0RF2-E的量要比在 沉淀中的多，這說明表達的融合蛋白GST-0RF2-E大部分是可溶的，這有利于蛋白純化并最 大可能的保證了蛋白的自然活性。用GST單抗做的Western-blotting也進一步證實融合 蛋白GST-0RF2-E在細菌中正確表達。為了證實融合蛋白GST-0RF2-E的抗原性，用抗PCV2 豬血清作為一抗進行western-blotting。結(jié)果顯示陽性血清有顯著的特異條帶而陰性血清 無條帶出現(xiàn)。同樣，純化后的蛋白在western-blotting中，可以用抗GST的單抗和豬血清 檢測到。3. ELISA 操作步驟(1)包被用包被液(0. 05M碳酸鈉緩沖液，pH9. 6)稀釋GST_0RF2_E融合蛋白至工 作濃度，加入96孔酶標板(Nunc Maxisorp)，每孔100 μ 1，4°C包被過夜。PBST清洗兩遍，拍干。(2)封閉每孔加入100 μ 1封閉液(含0. 1 % Tween20和5% (w/v)脫脂奶粉的 PBS)，37°C封閉lh。PBST洗兩遍，拍干。(3)與一抗(待檢血清)結(jié)合將待檢血清、陽性血清和陰性豬血清分別用稀釋液 (含0. Tween20和(w/v)脫脂奶粉的PBS)稀釋后加于已封閉的孔板中，每孔加入 100μ 1，于37°C孵育lh，PBST清洗三遍，拍干。(4)與二抗(HRP-IgG)結(jié)合用含1 %脫脂牛奶的PBST將HRP標記的二抗(Dako) 稀釋至工作濃度，每孔100 μ 1加于96孔酶標板中，于37°C孵育lh。PBST洗三遍，拍干。(5)顯色每孔加入50 μ 1鹽酸鄰苯二胺快速顯色液(FASTo-phenylenediamine dihydrochloride, 0PD, Sigma)，于 37°C孵育 15min。(6)終止每孔加入50 μ 1終止液(2Μ H2S04)，檢測490nm光密度(0D490)?？乖墓ぷ鳚舛扔闷灞P滴定法進行確定。具體方法為取96孔酶標板2塊，將純 化的重組抗原用0. 05M碳酸鈉緩沖液(pH9. 6)做1 10、1 20、1 140至1 1280的 稀釋，從左向右依次加入第1-8列，每個稀釋度8個重復(fù)，每孔100 μ 1，4°C包被過夜。PBST 洗兩遍，拍干。每孔加入100μ 1含5%脫脂奶奶的PBST，37°C封閉lh。PBST洗兩遍，拍干。 將標準陽性血清、標準陰性血清用含(w/v)脫脂奶粉的PBS做1 10、1 20,1 140 至1 1280的稀釋，從上至下分別加入到A-H的微孔中，每個稀釋度8個重復(fù)，每孔100μ1， 于37°C孵育lh，PBST清洗三遍，拍干。每孔加入50 μ 1鹽酸鄰苯二胺快速顯色液(FAST o-phenylenediaminedihydrochloride，OPD，Sigma)，于 37°C孵育 15min，最后每孔加入 50 μ 1 終止液(2Μ H2S04)，檢測490nm光密度(0D490)。最終確定的抗原最佳濃度為0. 5 μ g/ml, 實驗血清的稀釋度確定為1 100。以這一抗原濃度用同樣的棋盤滴定法確定HRP標記抗 豬IgG的稀釋度為1 3000。為了確定GST標簽是否影響GST-0RF2-E ELISA的結(jié)果，本 發(fā)明分別用純化的GST和GST-0RF2-E包被96孔板，并對已知的10份陽性和10份陰性血 清檢測其OD49tlt5統(tǒng)計學分析(兩樣品配對T檢驗)顯示以GST-0RF2-E為抗原檢測的陽性 血清的平均OD49tl值顯著大于用GST作為抗原的檢測結(jié)果(P < 0. 01)，而以GST-0RF2-E為 抗原檢測的陽性血清和陰性血清的平均OD49tl值之間也有顯著差異(0. 01 < P < 0. 05)。同 時，用GST作為抗原檢測的陽性血清和陰性血清的平均OD49tl沒有顯著差異(P > 0. 05).4.間接免疫熒光(IFA)在感染前一天，將100 μ 1濃度為5X104cells/ml的PK-15細胞以加入96孔板， 24小時后，將MOI為0. 1的PCV2接種于96孔板的第1、3、5和第7排，第2、4、6和8排分 別設(shè)為陰性對照。細胞在感染后4-6小時期間用溶于Hank，s液的300mM D-glucosamine 37°C處理20-30min，隨后繼續(xù)于37°C 5% C02培養(yǎng)箱中孵育72h.細胞用4% PFA(多聚甲 醛)室溫固定 30min 并用 PBST (PBSpH 7. 4containing 0. 1 % Tween-20)清洗兩遍.細胞隨 后用0. Triton X-100于室溫處理lOmin。PBST清洗后加入1 50倍稀釋(包含5% FBS的PBST)的豬血清37°C孵育lh. PBST清洗三次后.加入用包含5% FBS的PBST倍稀釋 的FITC標記的兔抗豬免疫球蛋白(1 100，Dako)，37°C孵育lh，PBST清洗兩遍后直接于 熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。5.陰陽性臨界值的確定陰陽性臨界值由GST-0RF2-E ELISA的25個陰性血清的OD值平均值和25個陽性血清的OD值平均值決定。每一次實驗的陰陽性極限用Microsoft Excel軟件計算得到。確 定實驗的臨界值是為了實驗的敏感性(DSn)和實驗的特異性(DSp)最大化，假陰性和假陽 性的總數(shù)最小化。陰性血清的OD490值從0. 068到0. 209，其平均OD值為0. 12466。以此獲 得了合適的臨界OD值為0. 224313 (mean士3SD)并說明99%的陰性血清的OD值低于0. 22， 以此設(shè)定陽性的最低限為0. 22.6.實驗重復(fù)性的確定選擇10份陽性血清和10份陰性血清用于重復(fù)性實驗的確定。對于批內(nèi)重復(fù) 性(板內(nèi)重復(fù))每一血清樣品的三次重復(fù)加于同一多孔板中。對于批間重復(fù)性(不同實 驗板)，每一血清樣品的三次重復(fù)在不同次加于不同板。計算出每次實驗中三次重復(fù)的 平均OD值、標準差(SD)和變異系數(shù)(CV)。試驗結(jié)果顯示實驗是可重復(fù)的。10份陽性血 清樣品的批內(nèi)CV范圍為0. 12-14. 87 %，中間值為2. 34 %，陰性血清樣品的批內(nèi)CV范圍 為0.46-6. 45%，其中間值為2. 17% .陽性血清的批間CV從11. 26-37. 04%，中間值為 19. 03%，而陰性血清的CV從10. 16到38. 26%，中間值為31. 74%。7.實驗特異性和敏感性的確定實驗敏感性(DSn)特異性(DSp)用以下公式計算DSn = TP/(TP+FN) X 100 (TP 是真陽性、FN是假陰性)；DSp = TN/(TP+TN) X 100 (TN是真陰性、FP假陽性)。精確性是 (TP+TN) /被檢血清總數(shù)X 100。PCV2GST-0RF2-E ELISA的結(jié)果由288份血清樣品獲得。通過比較ELISA與IFA的 結(jié)果，說明ELISA的準確性和敏感性比IFA的高。在IFA的結(jié)果中陰性血清和陽性血清分 別為8和280 ；而ELISA的結(jié)果中陰性血清和陽性血清分別為25和263。特異性=100X(ELISA 陰性數(shù))/(IFA 總陰性數(shù))=100X7/8 = 87. 7%敏感性=100X(ELISA 陽性數(shù))/(IFA 總陽性數(shù))=100X262/280 = 93. 57% ·符合率為2. 43% +90. 97%= 93. 4% .8. ELISA 和 IFA 的相關(guān)性16份PCV2感染豬血清的ELISA結(jié)果(0D值)與用PCV2感染細胞檢測的IFA結(jié) 果進行比較。相應(yīng)的血清在IFA中從1 50到1 51，200進行系列稀釋。IFA中的血清 滴度和ELISA OD值之間的相關(guān)性由Spearman’ s相關(guān)系數(shù)表示。結(jié)果顯示，IFA滴度的對 數(shù)值與 GST-0RF2-E ELISA 的 OD 值之間存在線性關(guān)系(spearman’ s rank correlation = 0. 9665 ；P < 0. 0001) [IFA 滴度的回歸方程式=1. 21339*A490+3. 41189 (r2 = 0. 7897，P < 0. 001)]。這說明GST-0RF2-E ELISA的OD值可用于估計IFA滴度。9.用所建立的ELISA方法鑒別PCVl和PCV2感染的動物用該方法檢測了 46份血清，包括實驗感染PCVl和PCV2的動物血清和健康動物血 清。結(jié)果99%的的PCV2感染動物血清為陽性，97%的PCVl感染動物血清為陰性，100%的 健康動物血清為陰性。說明本發(fā)明可以鑒別PCVl和PCV2感染的動物。
權(quán)利要求
一種基于ORF2抗原功能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法，其特征在于包括如下步驟設(shè)計特異性引物，擴增獲得ORF2上的氨基酸區(qū)段113 147aa的基因片段；將目的基因片段克隆進pGEX 4T 1中，在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中誘導表達GST ORF2 E融合蛋白，并純化；以純化蛋白作為抗原包被96孔ELISA板；加入待檢血清；加入HRP標記的二抗，即HRP標記抗豬IgG；加入鹽酸鄰苯二胺(OPD)快速顯色液進行顯色；測定490nm的光密度(OD490)并判讀結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于0RF2抗原功能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法，其特征在 于所述特異引物的核苷酸序列為0RF2-EF 5' -GC GGA TCC CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC T-3'； 0RF2-ER :5’ -GC CTC GAG TTA GCG GGA GGA GTA GTT TAC A-3’ 引物中分別引入BamHI和XhoI酶切位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于0RF2抗原功能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法，其特征在 于所述目的基因片段的序列為CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC TCC AGT GCT GTT ATT CTA GAT GAT AAC TTTGTA ACA AAG GCC ACA GCC CTC ACC TAT GAC CCC TAT GTA AAC TAC TCC TCC CGCTAA0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于0RF2抗原功能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法，其特征在 于所述誘導表達的條件為在含100yg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng) 攜帶重組質(zhì)粒PGEX-GST-0RF2-E的大腸桿菌BL21 (DE3)，直至菌液的OD6tltl值介于0. 6-0. 8， 加入IPTG至終濃度0. ImM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，離心收集細菌沉淀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于0RF2抗原功能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法，其特征在 于所述純化GST-0RF2-E的方法為谷胱甘肽親和層析法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于0RF2抗原功能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法，其特征 在于所述抗原的工作濃度為0. 5 μ g/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于0RF2抗原功能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法，其特征在 于所述HRP標記抗豬IgG的稀釋度為1 3000。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于0RF2抗原功能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法，其特征在 于所述實驗血清的稀釋度為1 100，用含0. 1% Tween20和(w/v)脫脂奶粉的PBS作 為稀釋液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于0RF2抗原功能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法，其特征在 于所述判斷標準為，0D490大于或等于0. 22為陽性，0D490小于0. 22為陰性。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于0RF2抗原功能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法，其特征 在于該方法可用于鑒別PCVl和PCV2感染的動物。
全文摘要
一種基于ORF2抗原功能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法，以PCV2 ORF2上的特定氨基酸區(qū)段(113-147aa)為目標，將其與GST融合表達得到GST-ORF2-E融合蛋白，利用親和層析柱將融合蛋白純化后作為抗原包被ELISA 96孔板，建立間接ELISA方法，本方法中選擇的特定氨基酸區(qū)段是PCV2 ORF2上抗原性較高的區(qū)段，將其作為ELISA包被抗原，提高了傳統(tǒng)PCV2 ELISA方法的靈敏度和特異性，與常規(guī)應(yīng)用的免疫熒光檢測方法相比，該法的特異性和敏感性分別為87.7％和93.57％。由于ORF2在PCV1和PCV2間無抗原交叉，能夠用于鑒別診斷PCV1和PCV2的感染。用該方法可以鑒別PCV1和PCV2感染的動物。
文檔編號G01N33/569GK101936993SQ20101024135
公開日2011年1月5日 申請日期2010年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月24日
發(fā)明者劉湘濤, 孫世琪, 尚佑軍, 尹雙輝, 才學鵬, 殷宏, 郭慧琛 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所