專利名稱：檢測或確定hcv核心抗原的方法及其中應用的用于檢測或確定的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測或確定丙型肝炎病毒(HCV)的方法以及檢測或確定HCV的試劑。
用于檢測感染的病因性病毒的方法是抗體試驗、抗原試驗和遺傳試驗。
免疫測定是抗體試驗和抗原試驗的基本方法，廣泛應用于病毒感染的診斷，輸血用血液之病毒篩選試驗，監(jiān)測病毒感染的治療等。遺傳試驗可以利用基因擴增法進行，例如聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR)和基于核酸序列的擴增(NASBA)、具有改進的標記效能的分支DNA(bDNA)方法等，這些方法能夠進行高靈敏度地測定。
遺傳試驗不僅用于確定診斷，而且用于檢測水平在上述抗體試驗和抗原試驗檢測水平限之下的病毒，以及評價藥物治療中的病毒消除。近來，期望將基因擴增法應用于輸血用血液的篩選試驗，以檢測抗體試驗或抗原試驗不能檢測到的早期病毒感染。
然而，遺傳試驗還存在多種問題；例如，程序復雜，需要特殊裝置，需要技術(shù)人員，花費高昂，缺乏足夠的重現(xiàn)性和測量精確性，不適合處理大量樣品，由于樣品中的抑制因素易于顯示假陰性結(jié)果，與樣品中的蛋白質(zhì)相比核酸自身不穩(wěn)定，而且基因的擴增效能不一致。據(jù)報道，如果來源于病毒的核酸是RNA，則核酸仍然不太穩(wěn)定，得出根據(jù)試驗方法和試驗樣品的保存條件而變化很大的結(jié)果。
抗病毒抗體的試驗，即檢測體內(nèi)免疫機制產(chǎn)生的抗病毒抗體，是觀察病毒感染效果的方法。針對抗原的抗體的產(chǎn)生在不同個體中各不相同；即，存在表現(xiàn)高抗體效價的個體和根本不能產(chǎn)生抗體的個體。而且，難以預測患者的實際狀況和患者體內(nèi)的病毒量，因為抗體量不一定對應于病毒量。還存在不能做出準確判斷的問題，因為病毒感染的早期不產(chǎn)生抗體，這就不可能檢測早期感染，還觀察到抗體的非特異性反應。
抗原試驗是檢測來源于病毒的抗原的方法，商業(yè)提供了多種用于來源于病毒的抗原的測定系統(tǒng)。對于抗原試驗，主要應用利用識別病毒來源抗原的抗體的免疫測定，但與基因擴增法相比它的靈敏度不夠好。于是，還存在小量病毒不能被準確檢測到的問題。而且，病毒和抗病毒抗體在體內(nèi)共同存在，這些共存的抗體和免疫測定中應用的抗體競爭性地與抗原反應，有時這使得難于高靈敏度地測定抗原。已經(jīng)研究出一些檢測HBV和其它肝炎病毒、HIV等的抗原測定系統(tǒng)，但它們比DNA擴增法例如PCR靈敏度低，不足以用作診斷或治療的標志。
近來，研究出一種用于HCV核心蛋白質(zhì)(HCV的內(nèi)部抗原)的測定系統(tǒng)(日本公開而未審的專利申請，公開號29427/96)。與測定基因的方法相比，該方法簡便，能夠穩(wěn)定測定，該方法中應用的試劑盒用于HCV的確診和HCV治療效能的預測和判斷。然而，與PCR法相比，該方法靈敏度不夠好，因此單獨該HCV核心蛋白測定法不足以用作診斷或治療的標志。實際上，該方法的檢測限為8pg/ml(PCR滴度為104-5病毒粒/ml)，它高于PCR法的局限10倍以上。因此，在判斷治療效果時，HCV核心蛋白含量為8pg/ml或更低的樣品被判斷為陰性，這意味著該方法不能檢測小量病毒。
通常知道抗原-抗體反應中應用高濃度的鹽會抑制反應，并使抗原從抗原-抗體反應產(chǎn)物中解離出來。
例如，超靈敏酶免疫測定[Eiji Ishikawa，Gakkai Shuppan Center(1993)]的第9章中有下列描述“因為蛋白質(zhì)與固相的非特異性吸附依條件而改變，因此期望通過調(diào)整條件減少血清的相互作用，從而降低非特異性吸附的程度。在胰島素夾心免疫測定中，通過降低與抗-胰島素IgG-固定化聚苯乙烯小珠一同培養(yǎng)的血清濃度和減少培養(yǎng)時間而降低了血清干擾(表IX-14)(Ruan等，1986)。還可以通過增加無機鹽的濃度降低蛋白質(zhì)與固相非特異性吸附的程度，而降低血清干擾(表IX-15，圖IX-18-IX-21)(Hashida，等1983)。有效濃度根據(jù)無機鹽的種類而改變；然而，如果濃度太高，免疫反應自身被抑制。例如，對于氯化鈉，最高濃度可以是0.3-0.4mol/l?！北景l(fā)明的目的在于提供一種檢測或確定HCV抗原的方法，它能夠簡便和高靈敏度地檢測或確定HCV抗原，適用于需處理大量樣品的血液交易和健康檢查中篩選，本發(fā)明的目的還在于提供所述方法中應用的檢測或確定HCV抗原的試劑。
本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，與應用其它物質(zhì)而不是堿性磷酸酶標記抗HCV核心蛋白抗體的情況不同，使堿性磷酸酶標記的抗HCV核心蛋白抗體和HCV核心蛋白在含有高濃度鹽的水溶液中進行抗原-抗體反應，能夠高靈敏度地檢測HCV核心抗原，而不抑制免疫反應。本發(fā)明基于這些發(fā)現(xiàn)完成。
本發(fā)明涉及下列(1)-(29)方面(1)檢測或確定樣品中HCV核心抗原的免疫測定，包括使堿性磷酸酶標記的抗-HCV核心蛋白抗體和樣品中的HCV核心抗原在含有高濃度鹽的水溶液中進行抗原-抗體反應，形成抗原-抗體復合物，然后測定形成的抗原-抗體復合物的堿性磷酸酶活性。
(2)按照(1)的免疫測定，其中鹽是鹵化堿金屬鹽。
(3)按照(1)的免疫測定，其中鹽是氯化鈉。
(4)按照(1)-(3)之一的免疫測定，其中鹽濃度為0.5M至飽和。
(5)按照(1)-(4)之一的免疫測定，其中抗-HCV核心蛋白的抗體是識別HCV核心蛋白N-末端11-50位氨基酸序列中至少5個連續(xù)氨基酸殘基序列的抗體。
(6)按照(1)-(4)之一的免疫測定，其中抗-HCV核心蛋白抗體選自KTM-145、KTM-153、KTM-157、KTM-163和KTM-167。
(7)按照(1)-(6)之一的免疫測定，其中樣品在進行抗原-抗體反應之前，用促溶物質(zhì)和/或堿性試劑處理。
(8)按照(7)的免疫測定，其中促溶物質(zhì)是胍鹽。
(9)按照(7)或(8)的免疫測定，其中堿性試劑是氫氧化堿金屬。
(10)按照(7)-(9)之一的免疫測定，其中促溶物質(zhì)的濃度為1M至飽和。
(11)按照(7)-(10)之一的免疫測定，其中堿性物質(zhì)的處理在45-55℃下進行。
(12)檢測或確定HCV核心抗原的試劑，包括一種堿性磷酸酶標記的抗-HCV核心蛋白抗體，一種濃度為0.5M至飽和的鹽，和一種測定堿性磷酸酶活性的試劑。
(13)按照(12)的試劑，其中鹽是鹵化堿金屬鹽。
(14)按照(12)或(13)的試劑，其中鹽是氯化鈉。
(15)按照(12)-(14)之一的試劑，其中抗-HCV核心蛋白抗體是識別HCV核心蛋白N-末端11-50位氨基酸序列中至少5個連續(xù)氨基酸殘基序列的抗體。
(16)按照(12)-(14)之一的試劑，其中抗-HCV核心蛋白抗體選自KTM-145、KTM-153、KTM-157、KTM-163和KTM-167。
(17)檢測或確定HCV核心抗原的試劑盒，包括(12)-(16)之一的試劑和包含促溶物質(zhì)和/或堿性試劑的樣品處理試劑。
(18)按照(17)的試劑盒，其中促溶物質(zhì)是胍鹽。
(19)按照(17)或(18)的試劑盒，其中堿性試劑是氫氧化堿金屬鹽。
(20)按照(17)-(19)之一的試劑盒，其中促溶物質(zhì)的濃度為1M至飽和。
(21)識別HCV核心蛋白N-末端11-50位氨基酸序列中至少5個連續(xù)氨基酸殘基序列的單克隆抗體。
(22)識別HCV核心蛋白N-末端41-50位氨基酸序列的單克隆抗體。
(23)按照(22)的單克隆抗體，其由雜交瘤KTM-145(FERMBP-6838)制備。
(24)識別HCV核心蛋白N-末端11-30位氨基酸序列的單克隆抗體。
(25)按照(24)的單克隆抗體，其由雜交瘤KTM-153(FERMBP-6839)制備。
(26)識別HCV核心蛋白N-末端31-50位氨基酸序列的單克隆抗體。
(27)按照(26)的單克隆抗體，其由雜交瘤KTM-157(FERMBP-6840)制備。
(28)識別HCV核心蛋白N-末端21-40位氨基酸序列的單克隆抗體。
(29)按照(28)的單克隆抗體，其由雜交瘤KTM-163(FERMBP-6841)或雜交瘤KTM-167(FERM BP-6842)制備。
任何來源的堿性磷酸酶都可以用于制備本發(fā)明的堿性磷酸酶標記的抗-HCV核心蛋白抗體。例如，可以使用來源于微生物(例如大腸桿菌)和動物(例如牛)的堿性磷酸酶。
用于制備本發(fā)明的堿性磷酸酶標記的抗-HCV核心蛋白抗體的抗-HCV核心蛋白抗體是指，可與日本公開未審的專利申請No.145194/95和肝病學(Hepatology)16，886(1992)中描述的HCV核心蛋白反應的抗體?？梢杂萌毡竟_未審專利申請145194/95和29427/96以及肝病學，16，886(1992)中所述的重組DNA技術(shù)制備HCV核心蛋白?？梢园凑罩苽鋯慰寺】贵w的已知方法，例如，單克隆抗體試驗手冊(Sakujitoyama編，Kodansha)中描述的方法，利用上述重組HCV核心蛋白作為免疫原制備抗體。
將上述免疫原對動物例如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、豚鼠、山羊、綿羊或家禽，優(yōu)選小鼠或大鼠施用，用于免疫接種以制備單克隆抗體。
可以按照已知方法[例如Saido和Toyoshima，Shin Seikagaku JikkenKoza(關(guān)于生化試驗的新文獻)1，389(1990)Tokyo Kagaku Dojin]進行免疫接種。例如，將免疫原用完全或不完全弗氏佐劑乳化，將得到的乳液給動物腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)施用。以7-30天，優(yōu)選12-16天的有規(guī)律的間隔給藥兩次或多次，優(yōu)選2-4次，完成免疫接種。
可以從免疫動物的脾、淋巴結(jié)、外周血等處得到生成抗體的細胞。還可以通過所謂的“體外免疫”，即通過直接免疫從未免疫動物的脾、淋巴結(jié)、外周血等中收集到的負責抗體產(chǎn)生的細胞，得到產(chǎn)生抗體的細胞[Arai和Ohta，試驗藥物，6，43(1988)]。
對用于與產(chǎn)生抗體的細胞融合的骨髓瘤細胞沒有特別限制，但優(yōu)選使用來源于與產(chǎn)生抗體的細胞來源動物相同種動物的細胞系。還優(yōu)選使用具有特定藥物標記的骨髓瘤細胞以便有效地選擇已適當融合的細胞。例如，優(yōu)選使用8-氮雜鳥嘌呤抗性骨髓瘤細胞，因為它們不能在含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基(下文稱為HAT培養(yǎng)基)中生長，但這些骨髓瘤細胞和正常細胞融合得到的融合細胞能夠在HAT培養(yǎng)基中生長，因此可以從未融合的骨髓瘤細胞中區(qū)分出來。具體實施例是P3x63-Ag.8.653[免疫學雜志，123，1548(1979)]，P3 x 63-Ag.8.Ul[微生物免疫學當前課題(Curr.Topics.Microbiol.Immunol.)，81，1(1978)](下文簡稱為P3U1)和Sp/O-Ag14[自然，276，269(1978)]。
可以通過Khler和Milstein[自然，256，495(1975)]研究出來的方法和它的各種改進方法進行細胞融合。在通常應用的方法中，產(chǎn)生抗體的細胞和骨髓瘤細胞以10-3∶1的比例混合，然后用30-50％的聚乙二醇(平均分子量1500-6000)作為融合試劑處理。還可以通過電穿孔進行融合[Ohkouchi等，試驗藥物，6，50(1988)]。
已經(jīng)歷細胞融合處理的細胞懸浮于選擇培養(yǎng)基(例如，HAT培養(yǎng)基)，在適于選擇所需細胞的培養(yǎng)容器例如96-孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，以選擇性地使融合細胞生長。通過例如酶免疫測定或放射免疫測定等方法檢測融合細胞的培養(yǎng)基上清液中是否存在所需抗體，從上述生長的融合細胞中篩選產(chǎn)生抗HCV核心蛋白抗體的細胞。通過限制性稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法等從篩選的細胞得到單細胞克隆，建立生產(chǎn)HCV核心蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞系。
得到的雜交瘤在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，或者移植到動物腹膜內(nèi)，使其在腹水中生長?？梢詮氖占呐囵B(yǎng)物或腹水得到單克隆抗體。如果需要，可以純化后使用培養(yǎng)物或腹水中的抗體?？梢酝ㄟ^各種方法，例如利用硫酸銨進行的鹽析分級分離、離子交換色譜、凝膠過濾柱色譜、利用蛋白A或蛋白G進行的親和柱色譜、以及利用抗原-固定化凝膠進行的親和柱色譜，以及它們的組合進行純化。本發(fā)明中可用的抗體包括抗體片段，例如通過使上面獲得的抗體接受酶例如胃蛋白酶和/或還原處理得到的Fab、Fab’和F(ab)2。
優(yōu)選的抗體是識別HCV核心蛋白N-末端11-50位氨基酸序列至少5個連續(xù)氨基酸殘基序列的抗體。
產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤的具體例子是雜交瘤KTM-145、雜交瘤KTM-153、雜交瘤KTM-157、雜交瘤KTM-163和雜交瘤KTM-167。
雜交瘤KTM-145、雜交瘤KTM-153、雜交瘤KTM-157、雜交瘤KTM-163和雜交瘤KTM-167于1999年8月12日保藏于國家生物科學和人類技術(shù)研究所，工業(yè)科學和技術(shù)處，國際貿(mào)易和工業(yè)部，1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本，登記號分別為FERM BP-6838、FERM BP-6839、FERM BP-6840、FERM BP-6841和FERM BP-6842。雜交瘤KTM-145、雜交瘤KTM-153、雜交瘤KTM-157、雜交瘤KTM-163和雜交瘤KTM-167產(chǎn)生的單克隆抗體在下文分別稱為KTM-145、KTM-153、KTM-157、KTM-163和KTM-167。
按照例如戊二醛法、高碘酸法、馬來酰亞胺法、吡啶二硫化物法和應用已知交聯(lián)劑的方法(參見，例如，Eiji Ishikawa，酶免疫測定，IgakuShoin)，將抗-HCV核心蛋白抗體與堿性磷酸酶經(jīng)共價鍵結(jié)合得到本發(fā)明的堿性磷酸酶標記的抗-HCV核心蛋白抗體。
在一個實施方案中，用亞胺硫烷等巰基化的抗體與用SMCC(4-[N-馬來酰亞胺甲基]-環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯)馬來酰亞胺基化的堿性磷酸酶混合。
如本文使用的“含有高濃度鹽的水溶液”指含有0.5M或更多無機鹽的水溶液。穩(wěn)定的無機鹽包括鹵化堿金屬鹽、例如，氯化鈉、氯化鉀和氯化鋰。無機鹽的濃度優(yōu)選0.5M至飽和，更優(yōu)選1-3M。如果需要，含有高濃度鹽的水溶液可以包括緩沖液、除氯化鈉之外的鹽、表面活性劑、血清、防腐劑、免疫反應中的非特異性吸附抑制劑等。
上述溶液中可以使用任何緩沖液。合適的緩沖液是Tris緩沖液。表面活性劑的例子是Triton X-100、Triton X-705和Tween 20。防腐劑的例子是疊氮鈉。血清的例子是正常小鼠血清。除氯化鈉之外其它鹽的例子是氯化鋅和氯化鎂。免疫反應中非特異性吸附抑制劑的例子是蛋白質(zhì)，例如牛血清白蛋白和酪蛋白，和商業(yè)產(chǎn)品Block Ace(DainipponPharmaceutical Co.，Ltd.)。
可以通過本發(fā)明的方法測定的試驗樣品包括全血、血清、血漿、尿和淋巴液。
待測定HCV抗原存在與否的樣品可以如上述使用，也可以利用病毒分離試劑濃縮后使用。分級分離試劑的例子是用于密度梯度的試劑，例如聚乙二醇(PEG)試劑和Percoll。PEG的分子量和濃度沒有特別限制，但分子量優(yōu)選1000-20000，濃度優(yōu)選在3-10％范圍內(nèi)。
優(yōu)選用具有蛋白質(zhì)變性活性、蛋白質(zhì)溶解活性、和蛋白質(zhì)分散活性的試劑處理樣品。試劑的例子是促溶物質(zhì)、堿性試劑、酸性試劑和表面活性劑。優(yōu)選促溶物質(zhì)和堿性試劑。
促溶物質(zhì)的例子是脲、鹽酸胍和硫氰酸胍。優(yōu)選脲和鹽酸胍。鹽酸胍的濃度優(yōu)選1-8M。
作為堿性試劑，可以應用任何水溶液中pH為10或更高的堿性試劑。適當?shù)膲A性試劑的例子是氫氧化堿金屬鹽。優(yōu)選氫氧化鈉溶液。
酸性試劑的例子是鹽酸、硫酸、乙酸、三氟乙酸和三氯乙酸。
適當?shù)谋砻婊钚詣┌ǚ请x子表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑和兩性表面活性劑。
優(yōu)選用促溶物質(zhì)和堿性試劑二者處理樣品。用堿性試劑處理優(yōu)選在45-55℃下進行。
優(yōu)選將用酸性試劑或堿性試劑處理的樣品中和后，進行抗原-抗體反應。樣品用酸性試劑處理的情況下，用堿性試劑進行中和；樣品用堿性試劑處理的情況下，用酸性試劑進行中和。在這兩種情況下，可還使用具有高緩沖容量的溶液。
對于本發(fā)明的免疫測定沒有特別限制，可以使用本領(lǐng)域廣泛使用的方法，例如夾心免疫測定。
具體地說，本發(fā)明的免疫測定可以通過夾心免疫測定，例如已知的1步法、延遲1步法和2步法，利用結(jié)合到固相支持物上的抗體和堿性磷酸酶標記的抗-HCV核心蛋白抗體進行。優(yōu)選的是2步法，其包括(1)將抗體結(jié)合的固相和含抗原的水溶液樣品一同保溫，然后用清洗溶液清洗固相，(2)向其中加入含有標記抗體的水溶液和高濃度鹽，然后進一步培養(yǎng)和清洗，以及(3)測定固相上形成的抗原-抗體復合物的堿性磷酸酶活性。
上述方法中可以使用常規(guī)免疫測定中使用的各種固相支持物。有用的固相支持物的例子是塑料試管、微板孔、玻璃珠、塑料珠、各種膜和磁性顆粒(參見，例如，Eiji Ishikawa，酶免疫測定，Igaku Shoin)。待結(jié)合固相支持物的抗體的例子是上述抗-HCV核心蛋白單克隆抗體，優(yōu)選使用識別不同于堿性磷酸酶標記之抗體識別表位的抗體?？贵w與固相支持物的結(jié)合可以通過已知方法進行，例如物理吸附和化學結(jié)合。
堿性磷酸酶的活性可以利用色原、熒光試劑、發(fā)光試劑等通過常規(guī)方法測定。(參見，例如，Bunji Maruo，酶手冊，Asakura Shoten)。可以使用本領(lǐng)域已知的任何色原，它們包括能夠靈敏檢測的酶循環(huán)反應試劑，具體是，利用催化輔酶NAD(AmpliQ，Dako)等氧化-還原循環(huán)的酶的酶循環(huán)反應試劑。熒光試劑是4-甲基傘形酮衍生物和2-羥基二苯基衍生物。
發(fā)光試劑的例子是具有二氧雜丁環(huán)(dioxetane)結(jié)構(gòu)的衍生物，具體說是AMPPD[3-(2’-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧雜丁環(huán)]，CDP-星[4-氯-3-(甲氧基螺{1，2-二氧雜丁環(huán)-3，2’-(5’-氯)三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷}-4-基)-苯基磷酸氫二鈉]和CSPD[3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧雜丁環(huán)-3，2’-(5’-氯)三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷}-4-基)苯基磷酸氫二鈉]。不具有二氧雜丁環(huán)結(jié)構(gòu)的發(fā)光原衍生物也可以使用，具體是APS化合物([10-甲基-9(10H)-亞吖啶基]苯氧甲基磷酸氫二鈉等。
檢測或確定本發(fā)明的HCV核心抗原的試劑包括堿性磷酸酶標記的抗-HCV核心蛋白抗體，濃度為0.5M至飽和的鹽，和測定堿性磷酸酶活性的試劑。試劑可以進一步包括抗-HCV核心蛋白抗體-固定化固相和標準HCV核心蛋白。本發(fā)明的試劑可以為包括含有上述成分試劑的試劑盒形式。
試劑盒可以進一步含有樣品濃縮試劑和樣品處理試劑。樣品濃縮試劑的例子是上述分級分離試劑。樣品處理試劑的例子是上述具有蛋白質(zhì)變性活性、蛋白質(zhì)溶解活性和蛋白質(zhì)分散活性的試劑。用于測定堿性磷酸酶活性的試劑包括含有上述色原、熒光物質(zhì)或發(fā)光物質(zhì)的試劑。抗-HCV核心蛋白抗體的例子是上述單克隆抗體。
本發(fā)明的某些實施方式以下面實施例方式舉例說明。本發(fā)明的這些實施例不構(gòu)成本發(fā)明范圍的限制。至于血清樣品，使用Uniglobe或BostonBiomedica，Inc.(BBI)商業(yè)提供的樣品。
參考實施例1HCV核心蛋白的制備按照日本公開未審專利申請No.29437/96描述的方法制備和純化具有HCV核心蛋白N-末端125個氨基酸殘基的重組HCV核心蛋白。
利用BioRad蛋白質(zhì)測定試劑盒(BioRad)和BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce)計算純化的重組HCV核心蛋白質(zhì)的濃度。
參考實施例2抗-HCV核心蛋白抗體的制備用完全弗氏佐劑乳化從參考實施例1中得到的HCV核心蛋白(25-100μg)，得到的乳劑施于BALB/C小鼠或SD大鼠用于免疫。2-3周后，用不完全弗氏佐劑乳化HCV核心蛋白(25-100μg)，得到的乳劑施于動物進行加強免疫。確定抗體效價升高后，靜脈給藥25-100μg HCV核心蛋白。3-4天后，從動物中取出脾，制備脾細胞。然后，預先在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細胞(P3U1)與脾細胞以1∶2-1∶5的比率混合，然后用聚乙二醇進行細胞融合。融合的細胞懸浮于HAT培養(yǎng)基，將得到的懸浮液移入96孔培養(yǎng)板，然后在CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)。以下述方式篩選抗-HCV核心蛋白的抗體。
將HCV核心蛋白懸浮于8M鹽酸胍溶液或10M脲溶液，至濃度為2μg/ml，得到的懸浮液移入96孔ELISA平板(Nunc)，每孔50μl，4℃靜置過夜，使HCV核心蛋白吸附到平板上。用含有1％牛血清白蛋白(下文簡稱為BSA)的磷酸鹽緩沖鹽水(下文簡稱為PBS溶液)封閉后，將50μl融合細胞的培養(yǎng)上清液置于各孔，然后在室溫下反應1小時。清洗后，向各孔中加入過氧化物酶標記的抗-小鼠IgG抗體，然后室溫下反應1小時。清洗后，向孔中加入底物ABTS，觀察到顏色的孔被篩選出來，用來得到產(chǎn)生識別HCV核心蛋白的抗體的雜交瘤KTM-145、KTM-153、KTM-157、KTM-163和KTM-167。將雜交瘤分別移植到降植烷等處理的小鼠腹腔，得到在腹水中產(chǎn)生的單克隆抗體。按照常規(guī)方法，利用蛋白質(zhì)A柱(Sakuji Toyama編，單克隆抗體試驗手冊，Kodansha)純化獲得的單克隆抗體。得到的抗體被分別稱為KTM-145、KTM-153、KTM-157、KTM-163和KTM-167。
參考實施例3單克隆抗體的反應特異性利用HCV核心蛋白-或大腸桿菌裂解液吸附的96孔微滴平板，確定參考實施例2中得到的單克隆抗體的反應特異性。結(jié)果證明KTM-145、KTM-153、KTM-157、KTM-163和KTM-167與HCV核心蛋白特異性反應。還通過Western印跡確證它們表現(xiàn)相同的反應。另外，利用HCV核心蛋白的部分肽進行了表位分析，由此證實KTM-145識別HCV核心蛋白N-末端41-50位的序列，KTM-153識別11-30位的序列，KTM-157識別31-50位的序列，KTM-163和KTM-167識別21-40位的序列。
參考實施例4堿性磷酸酶標記的單克隆抗體的制備按照常規(guī)方法(Eiji Ishikawa，酶免疫測定，Igaku Shoin)，通過馬來酰亞胺化將參考實施例2中得到的各種單克隆抗體與堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim)結(jié)合。單克隆抗體(5mg)對50mM Tris緩沖液(pH 8)透析，然后用亞氨基硫烷巰基化。通過Sephadex G-25柱(Pharmacia)從亞氨基硫烷化的抗體中除去游離亞氨基硫烷。用馬來酰亞胺化試劑SMCC(Pierce)使堿性磷酸酶馬來酰亞胺化，通過G-25柱從中除去游離的SMCC。
將上述巰基化的單克隆抗體和馬來酰亞胺化的堿性磷酸酶混合，使其在4℃下反應過夜。反應完成后，用Sephacryl S-200柱(Pharmacia)純化形成的堿性磷酸酶標記的單克隆抗體。
用標記的抗體稀釋液[含有50mM Tris緩沖液(pH 7.6)，10mM氯化鎂，0.1mM氯化鋅和20％Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)的水溶液]將純化的堿性磷酸酶標記抗體稀釋到固定濃度，用于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。
參考實施例5固相的制備用含有0.1％疊氮鈉的PBS將參考實施例2中得到的各種單克隆抗體稀釋至終濃度為5μg/ml。將抗體稀釋液置于固相96孔微滴平板的孔中，每孔200μl，4℃靜置過夜。用PBS清洗后，向各孔中加入300μl含有0.1％BSA的PBS，然后使平板在4℃靜置過夜，以使封閉。
參考實施例6過氧化物酶標記的單克隆抗體的制備按照常規(guī)方法將參考實施例2中得到的各種單克隆抗體和過氧化物酶(Toyobo Co.，Ltd.)通過馬來酰亞胺化結(jié)合。單克隆抗體(5mg)對50mM Tris緩沖液(pH 8)透析，然后用亞氨基硫烷巰基化。通過SephadexG-25柱(Pharmacia)從亞氨基硫烷化的抗體中除去游離亞氨基硫烷。用馬來酰亞胺化試劑SMCC(Pierce)使過氧化物酶馬來酰亞胺化，通過G-25柱從中除去游離SMCC。
將上述巰基化的單克隆抗體和馬來酰亞胺化的過氧化物酶混合，使其在4℃下反應過夜。用Sephacryl S-200柱(Pharmacia)純化獲得的過氧化物酶標記的單克隆抗體。
用標記的抗體稀釋液[含有50mM Tris緩沖液(pH 7.6)，10mM氯化鎂，0.1mM氯化鋅和20％Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)的水溶液]將純化的標記抗體稀釋到固定濃度，用于ELISA。
實施例1重組HCV核心蛋白的確定參考實施例1中得到的重組HCV核心蛋白用含有0.1％BSA的PBS稀釋至濃度為0-100pg/ml。
將各重組HCV核心蛋白的稀釋液置于參考實施例5中制備的微平板的孔中，每孔200μl，然后在室溫下反應1小時。用清洗液(含有AMPAK靈敏度增強試劑，Dako)清洗后，向孔中加入?yún)⒖紝嵤├?得到的標記抗體。用含有50mM Tris緩沖液(pH 7.6)，10mM氯化鎂，0.1mM氯化鋅，20％Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)和0-3M氯化鈉的溶液稀釋標記抗體，得到的稀釋液移入孔中，每孔200μl。室溫下振蕩反應1小時后，用清洗液清洗孔，向各孔加入200μl顏色試劑[酶循環(huán)反應試劑(Dako)]，然后在室溫下振蕩反應20分鐘。向各孔加入100μl混入上述試劑的反應終止劑，測定490nm主波長和660nm輔波長處的吸光度。該試驗中，KTM-145應用于固相，KTM-163應用于堿性磷酸酶標記。
結(jié)果顯示在表1中。在表1中，各抗原濃度的數(shù)字表示吸光度(Abs)。
表1
標記抗體稀釋液中氯化鈉濃度的升高幾乎不影響無抗原(0pg/ml)試驗組的吸光度；然而，它使含有抗原(100pg/ml)試驗組的吸光度增加。在表中，S/N的比率表明，含有抗原(100pg/ml)的試驗組與無抗原(0pg/ml)的試驗組之間吸光度的比值。發(fā)現(xiàn)添加氯化鈉增加S/N比值，能夠高靈敏度地檢測抗原。也就是說，上述結(jié)果表明應用本發(fā)明的方法能夠準確地判斷盡管存在抗原但不能被判斷抗原為陽性的樣品，因為在缺乏氯化鈉的情況下，存在抗原的樣品的吸光度與無抗原樣品相比輕微增加。
實施例2重組HCV核心蛋白的確定參考實施例1中得到的重組HCV核心蛋白用含有0.1％BSA的PBS稀釋至濃度為0-20pg/ml。
將各重組HCV核心蛋白的稀釋液置于參考實施例5制備的微平板的孔中，每孔200μl，然后在室溫下反應1小時。用清洗液(含有AMPAK靈敏度增強試劑，Dako)清洗后，向孔中加入?yún)⒖紝嵤├?得到的標記抗體。用含有50mM Tris緩沖液(pH 7.6)，10mM氯化鎂，0.1mM氯化鋅，20％Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)和0-2M氯化鈉的溶液稀釋標記抗體，得到的稀釋液移入孔中，每孔200μl。室溫下振蕩反應1小時后，用清洗液清洗孔，向各孔加入200μl顏色試劑[酶循環(huán)反應試劑(Dako)]，然后在室溫下振蕩反應40分鐘。向各孔加入100μl混入上述試劑的反應終止劑，測定490nm主波長和660nm輔波長處的吸光度。該試驗中，KTM-145應用于固相，KTM-163應用于堿性磷酸酶標記。
結(jié)果顯示在表2中。在表2中，各抗原濃度的數(shù)字表示吸光度(Abs)。
表2
標記抗體稀釋液中氯化鈉濃度的升高幾乎不影響無抗原(0pg/ml)試驗組的吸光度；然而，它使含有抗原的試驗組的吸光度增加。該結(jié)果表明應用本發(fā)明的方法能夠準確地判斷盡管存在抗原但不能被判斷抗原為陽性的樣品，因為在缺乏氯化鈉的情況下，與無抗原樣品相比其吸光度輕微增加。
實施例3檢測限用含有0.1％BSA的PBS將參考實施例1中得到的重組HCV核心蛋白稀釋至濃度為0-10pg/ml。
將各重組HCV核心蛋白的稀釋液置于參考實施例5中制備的微平板的孔中，每孔200μl，然后在室溫下反應1小時。用清洗液(含有AMPAK靈敏度增強試劑，Dako)清洗后，向孔中加入?yún)⒖紝嵤├?得到的標記抗體。用含有50mM Tris緩沖液(pH 7.6)，10mM氯化鎂，0.1mM氯化鋅，20％Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)和0或1M氯化鈉的溶液稀釋標記抗體，得到的稀釋液移入孔中，每孔200μl。室溫下振蕩反應1小時后，用清洗液清洗孔，向各孔加入100μl顏色試劑[酶循環(huán)反應試劑(Dako)]，然后在室溫下振蕩反應30分鐘。向各孔加入100μl混入上述試劑的反應終止劑，測定490nm主波長和660nm輔波長處的吸光度。該試驗中，KTM-145應用于固相，KTM-163應用于堿性磷酸酶標記。
結(jié)果顯示在表3中。在表3中，各鹽濃度的數(shù)字表示吸光度(Abs)。
表3
標記抗體稀釋液中氯化鈉濃度的升高使極端低濃度抗原的檢測成為可能。如表3所示，當不加氯化鈉時，觀察到不含抗原的溶液和含有1pg/ml抗原的溶液之間10mAbs數(shù)量級的吸光度差異，而加有1M氯化鈉時，不含抗原的溶液和含0.125pg/ml抗原的溶液之間即具有10mABs數(shù)量級的吸光度差異。表明，加入氯化鈉增強了檢測靈敏度。
比較實施例1用含有0.1％BSA的PBS將參考實施例1中得到的重組HCV核心蛋白稀釋至濃度為0、10、100和1000pg/ml。
將各重組HCV核心蛋白的稀釋液置于參考實施例5制備的微平板的孔中，每孔200μl，然后在室溫下反應1小時。用清洗液(含有AMPAK靈敏度增強試劑，Dako)清洗后，向孔中加入?yún)⒖紝嵤├?得到的過氧化物酶標記的抗體。用含有50mM Tris緩沖液(pH 7.2)，0.1％BSA和0-4M氯化鈉的溶液稀釋標記抗體，得到的稀釋液移入孔中，每孔200μl。室溫下振蕩反應1小時后，用清洗液清洗孔，向各孔加入200μl顏色試劑TMB(四甲基聯(lián)苯胺，Intergen Co.)，然后在室溫下振蕩反應30分鐘。向各孔加入100μl 1N硫酸，終止顏色反應，測定450nm主波長和660nm輔波長處的吸光度。該試驗中，KTM-145應用于固相，KTM-163應用于堿性磷酸酶標記。
結(jié)果顯示在表4中。在表4中，各抗原濃度的數(shù)字表示吸光度(Abs)。
表4
當使用過氧化物酶標記的抗體時，加入氯化鈉降低了無抗原反應系統(tǒng)的反應特異性。在含有抗原的反應系統(tǒng)中，氯化鈉濃度的升高沒有改善反應特異性。
實施例4人血清樣品的測定按照日本公開未審的專利申請No.29427/96描述的方法處理人血清。即將50μl 20％PEG4000加入200μl血清樣品，將得到的混合物在冰上靜置1小時。4℃下4000xg離心5分鐘，沉淀懸浮于50μl的50mM Tris緩沖液(pH 8.0)，向其中加入50μl的0.5M氫氧化鈉溶液，在37℃下處理30分鐘。然后，用50μl含有0.3％Triton X-100的0.5M磷酸氫鈉溶液中和混合液。用300μl 0.1％BSA-PBS溶液將得到的混合液稀釋三倍，制備測定液。對于人血清樣品，使用抗HCV抗體陽性樣品(Uni-2和0401)和正常樣品作為對照，按照實施例1測定吸光度(Abs)同樣的方法測定。結(jié)果如表5所示表5
如表5所示，當使用正常血清樣品時，升高標記抗體稀釋液中氯化鈉的濃度僅略微增加吸光度。另一方面，當使用抗-HCV抗體-陽性血清樣品，升高標記抗體稀釋液中氯化鈉的濃度，能夠增加吸光度。結(jié)果表明通過應用本方法能夠正確判斷含低水平抗原樣品的抗原-陽性。還可以從S/N比值清楚地看到，當氯化鈉濃度為0.5-3M，尤其為1-3M時，靈敏度顯著增加。
實施例5用鹽酸胍和堿處理樣品將50μl的20％PEG4000加入200μl血清樣品，將得到的混合液在冰上靜置1小時。4℃下4000xg離心5分鐘，沉淀懸浮于50μl含有0-8M鹽酸胍的50mM Tris緩沖液(pH 8.0)用來變性，向所得懸浮液中加入50μl 0.5M氫氧化鈉溶液，在37℃下處理30分鐘。然后，用0.5M磷酸氫鈉溶液中和得到的混合液。然后用0.1％BSA-PBS溶液將得到的混合液稀釋三倍，制備測定液。按照如實施例4的同樣方法進行測定，除了氯化鈉的濃度為1M。對于人樣品，使用正常人血清樣品和3個抗-HCV抗體-陽性樣品(U-19，U-21和U-29)。結(jié)果如表6所示。在表6中，各樣品的數(shù)字表示吸光度(Abs)。
表6
如表6所示，取決于鹽酸胍的濃度，吸光度增加。
實施例6
用脲和鹽酸胍重復實施例5的同樣程序。脲的濃度為10M，鹽酸胍的濃度為8M。作為樣品，使用正常人血清樣品和4個抗-HCV抗體-陽性血清樣品(104、106、187和197)。結(jié)果如表7所示。在表7中，各試劑的數(shù)字表示吸光度(Abs)。
表7
如表7所示，當用脲處理樣品時，正常人血清與樣品104和197的吸光度之間沒有顯著差異，這兩個樣品不能判斷為陽性。然而用鹽酸胍處理能夠判斷這兩個樣品為陽性。
實施例7關(guān)于堿處理之溫度的試驗重復實施例6的同樣程序，除了改變堿處理的溫度。作為血清樣品，使用樣品6、9和138。在37℃、50℃、70℃和100℃進行堿處理。結(jié)果如表8所示。在表8中，各樣品的數(shù)字表示吸光度(Abs)。
表8
如表8所示，血清堿處理的優(yōu)選溫度為50℃左右。
實施例8各檢測方法的比較以下列方式進行本發(fā)明的測定法。將50μl的20％PEG4000加入200μl各血清樣品，將得到的混合物在冰上靜置1小時。4℃下4000xg離心5分鐘，沉淀懸浮于50μl含有8M用于變性的鹽酸胍的50mM Tris緩沖液(pH 8.0)。向得到的懸浮液中加入50μl 0.5M氫氧化鈉溶液，在50℃下處理30分鐘，用含有0.3％Triton X-100的0.5M磷酸氫鈉溶液中和得到的混合液。然后用0.1％BSA-PBS溶液將得到的混合液稀釋三倍，制備測定液。按照實施例4的同樣方法進行測定，除了標記抗體稀釋液中使用2M氯化鈉。
另外，用下列市售試劑進行相同樣品的測定，以比較本方法的靈敏度，市售試劑為Immunocheck F-HCV Ag core，它是一種測定HCV核心蛋白的測定試劑盒(Kokusai Siyaku，下文僅稱為HCV核心蛋白質(zhì)測定試劑盒)，第三代抗-HCV抗體，它是一種抗-HCV抗體的測定試劑盒(Ortho，下文僅稱為抗-HCV抗體測定試劑盒)，以及Amplicore HCVmonitor，它是一種通過PCR對HCV的RNA的測定試劑盒(Roche，下文僅稱之為RNA測定試劑盒)。
結(jié)果如表9所示。在表9中，“-”表示“未檢測到”，“+”表示“可檢測到”。
表9
如表9所示，通過本發(fā)明方法進行的測試對HCV核心蛋白測定試劑盒(International Reagents Corp.)不能判斷是否為陽性的樣品給出陽性結(jié)果。除了正常人血清樣品，血清樣品為抗-HCV抗體-陽性，通過RNA測定試劑盒(Roche)測試的樣品被判斷為HCV-陽性。
測定血清樣品的HCV核心蛋白測定試劑盒(International ReagentsCorp.)的靈敏度級別為104病毒粒/ml，而本發(fā)明方法的數(shù)量級為103病毒粒/ml，它等同于RNA測定試劑盒(Roche)的靈敏度。
實施例9抗體組合重復實施例6的相同程序，除了用于固相和堿性磷酸酶-標記的抗體種類被改變，來自未感染HCV的人血清和來自感染HCV的人血清用作樣品，稀釋標記抗體的氯化鈉水溶液的濃度為0或1M。測定各試驗的吸光度，計算S/N比值。結(jié)果如表10所示。在表10中，各氯化鈉濃度的數(shù)值表示S/N比值。
表10
如表10所示，在固相抗體和標記抗體的所有組合中，通過將氯化鈉加入溶液稀釋標記抗體，增加了S/N比值。表明可以在存在氯化鈉的條件下較高靈敏度地檢測HCV感染。
實施例10
用正常血清溶液連續(xù)稀釋各樣品溶液(U-14和U-19)，制備樣品。將50μl的20％PEG4000加入200μl各連續(xù)稀釋的樣品，將得到的混合液在冰上靜置1小時。4℃下4000xg離心5分鐘，沉淀懸浮于50μl含有8M用于變性的鹽酸胍的50mM Tris緩沖液(pH 8.0)。向得到的懸浮液中加入50μl 0.5M氫氧化鈉溶液，在50℃下處理30分鐘，用含有0.3％Triton X-100的0.5M磷酸氫鈉溶液中和得到的混合液。然后用0.1％BSA-PBS溶液將得到的混合液稀釋三倍，制備測定液。按照實施例4描述的方法測定各稀釋樣品。標記抗體稀釋液中氯化鈉的濃度為2M。
用參考實施例1中得到的已知濃度的HCV核心蛋白作為標準物質(zhì)制備標準曲線，從各樣品的吸光度(Abs)計算HCV核心蛋白的量。
應用樣品U-14和樣品U-19進行的測試結(jié)果分別顯示于表11和表12。
表11
表12
如表11和表12所示，本發(fā)明的測定方法能夠檢測級別為0.1pg/ml的HCV核心蛋白。
實施例11在血清轉(zhuǎn)化板樣品中HCV核心抗原的檢測按照實施例8中描述的方法測定商業(yè)提供的血清轉(zhuǎn)化板PHV 908(BBI)的HCV核心抗原。HCV核心抗原的量表示為將正常人樣品的吸光度定為1時，S/N的比值形式。
還用抗-HCV抗體測定試劑盒(Ortho)測定了上述板。抗體效價表示為閾值參數(shù)(S/CO)的形式，抗體效價為1.0或更高的樣品判斷為陽性。
結(jié)果顯示于表13。
表13
如表13所示，本發(fā)明的方法能夠在抗-HCV抗體測試得到陽性結(jié)果之前檢測核心抗原；也就是說，本發(fā)明能夠檢測早期狀態(tài)的HCV感染。
實施例12HCV核心蛋白測定試劑盒制備了包括下列試劑的試劑盒。
抗體-包被的平板(按照參考實施例5描述的相同方法，應用參考實施例2中得到的KTM-145制備)樣品稀釋液(包括含有0.1％BSA和1％正常小鼠血清的PBS之水溶液)酶標記抗體(按照參考實施例4中描述的同樣方法，利用參考實施例2中得到的KTM-163制備)標準抗原0pg/ml10pg/ml(如下制備，將參考實施例1中得到的HCV核心蛋白溶解于包括含有0.067％BSA、0.89M鹽酸胍、5.56mM Tris緩沖液(pH 8)、0.056M氫氧化鈉、0.056M磷酸二氫鈉和0.005％Triton X-100的PBS溶液中，使?jié)舛葹?或10pg/ml)。
標記抗體稀釋液(含有50mM Tris緩沖液(pH 7.6)、10mM氯化鎂、0.2mM氯化鋅、20％Block Ace、2M氯化鈉、0.1％疊氮鈉、0.1TritonX-705和1％正常小鼠血清)顏色試劑[在酶循環(huán)反應試劑(AmpliQ，Dako)中含有顏色試劑]反應終止劑[在酶循環(huán)反應試劑(AmpliQ，Dako)中含有反應終止劑]沉淀劑(20％PEG 4000)分散劑[8M鹽酸胍和50mM Tris緩沖液(pH 8)]堿性試劑(0.5M氫氧化鈉溶液)中和劑(0.5M磷酸氫二鈉和0.3％Triton X-100)
權(quán)利要求
1.一種識別HCV核心蛋白N-末端21-40位氨基酸序列的單克隆抗體。
2.按照權(quán)利要求1的單克隆抗體，其由雜交瘤KTM-163(FERMBP-6841)或雜交瘤KTM-167(FERM BP-6842)制備。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測樣品中HCV核心抗原的免疫測定，包括使堿性磷酸酶標記的抗－HCV核心蛋白抗體和樣品中的HCV核心抗原在含有高濃度鹽的水溶液中進行抗原－抗體反應，形成抗原－抗體復合物，然后測定形成的抗原－抗體復合物的堿性磷酸酶活性。還提供了一種檢測HCV核心抗原的試劑，其包括堿性磷酸酶標記的抗－HCV核心蛋白抗體，濃度為0.5M至飽和的鹽，以及測定堿性磷酸酶活性的試劑。
文檔編號G01N33/576GK1932517SQ20061009995
公開日2007年3月21日 申請日期2000年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月19日
發(fā)明者守田和樹, 西田綾子, 福井正憲, 近藤大, 小原道法 申請人:協(xié)和梅迪克斯株式會社