專利名稱：：甲型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學領域，具體地，本發(fā)明提供了一種曱型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫測定試劑盒及其制備方法。
背景技術：
：曱型肝炎是由曱型肝炎病毒(HAV)通過糞-口途徑傳播引起的一種以肝臟損害為主的傳染性疾病。是一種RM病毒，屬微小核糖核酸病毒科，為腸道病毒72型，呈球形直徑約27nm,由32個殼微粒組成對稱20面體核衣殼，內(nèi)含線型單股RNA。HAV具有4個主要多肽，為構成病毒殼蛋白的主要抗原多肽，誘生中和抗體。HAV存在于患者的血液、糞便及肝胞漿中。感染后血清中抗-HAVlgM抗體很快出現(xiàn)，在2周左右達高峰。然后逐漸下降，在8周之內(nèi)消失，是HAV急性感染和近期感染的血清學證據(jù)；具有比HAVIgG抗體更高的診斷價值，對曱型肝炎的早期診斷和預防有著重要意義。曱型肝炎病毒(HAV)IgM抗體實驗室檢測方法主要為免疫分析，常用檢測方法為放射免疫分析(RIA)和酶免疫分析(EIA)。目前使用最廣的為酶免疫分析(EIA)。近年來標記免疫分析技術的研究和應用發(fā)展迅速，已廣泛應用于生物醫(yī)學基礎理論研究及臨床疾病診斷各領域。易于推廣的主要有放射免疫分析、酶免疫分析、時間分辨熒光免疫分析和化學發(fā)光免疫分析等四種。這些超微量檢測技術的基本理論大體相同，但是所用示蹤劑及所發(fā)出的信號各不相同。根據(jù)大量的試驗結果及臨床應用資料，從實用性、穩(wěn)定性、準確性及發(fā)展前景來看，依次為化學發(fā)光免疫分析、時間分辨熒光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析?；瘜W發(fā)光免疫分析技術，既具有放射免疫分析、時間分辨熒光免疫分析等方法的高度靈敏性，線性范圍寬的優(yōu)點，又克服了放射免疫分析的放射性污染、半衰期短及時間分辨熒光免疫分析穩(wěn)定性差、儀器昂貴等缺點，能廣泛應用于生物醫(yī)學研究和臨床醫(yī)學檢驗，更便于在大、中、小醫(yī)院推廣應用。目前，化學發(fā)光免疫分析技術正在體外診斷免疫分析試劑方面廣泛運用，但采用直接包被抗原結合化學發(fā)光免疫分析技術在曱型肝炎病毒IgM抗體免疫分析產(chǎn)品的應用方面仍未見使用。本發(fā)明的試劑盒采用微孔板化學發(fā)光免疫分析技術，既可應用于開放式的半自動化學發(fā)光測量儀，也可用于全自動的測量系統(tǒng)，可實現(xiàn)大批量快檢測，使用成本低，更易推廣應用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明同時4艮好地解決了上述問題，將化學發(fā)光技術與曱型肝炎病毒IgM抗體的免疫分析學有效地結合，提供了一種能夠簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定地檢測曱型肝炎病毒IgM抗體的試劑盒，該試劑盒適于在產(chǎn)業(yè)上有效地推廣和應用。本發(fā)明的目的是提供一種化學發(fā)光酶免疫分析測定曱型肝炎病毒IgM抗體的試劑盒及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括1)曱型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性對照品；2)包被的固相載體；3)甲型肝炎病毒抗原液；4)酶標記的曱型肝炎病毒抗體(單抗或多抗)；5)上述酶所作用的化學發(fā)光底物；以及6)濃縮洗滌液。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒；所述標記酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶；所述化學發(fā)光底物為1，2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾，其中所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l,2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。進一步，本發(fā)明提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟1)以曱型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性血清制備對照品；2)以抗人-(j鏈抗體(單抗或多抗)包被固相載體；3)以曱型肝炎病毒抗原制備抗原液；4)以酶標記曱型肝炎病毒抗體(單抗或多抗)；5)制備化學發(fā)光底物液；6)制備濃縮洗滌液7)分裝上述曱型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性對照品、曱型肝炎病毒抗原液、酶標記的甲型肝炎病毒抗體、該酶所作用的化學發(fā)光底物和濃縮洗滌液；以及8)組裝為成品。根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選，所述包被固相載體的步驟2)包括以下步驟1)包被用0.1MpH值為9.0的磷酸氫二鉀緩沖液配制成所需濃度的抗人-ia鏈抗體(單抗或多抗)包被液，并將包被液負載于固相載體上；2)封閉用含2WBSA，0.01%明膠，pH值為6.8-7.3,濃度為0.01M的磷酸鹽緩沖液作為封閉液封閉上迷的固相載體。在上述方法中，優(yōu)選，所述抗體包被的固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒；所述結合物為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶；所述化學發(fā)光底物為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾，其中所述l，2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。具體的上述試劑盒可以包括曱型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性對照品、直接包被抗人-in鏈抗體的微孔板、曱型肝炎病毒抗原液、酶標記物與化學發(fā)光底物液、濃縮洗滌液等。其中，所述曱型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性對照品為經(jīng)HBsAg、抗-HIV、抗-TP以及抗-HCV抗體測定為陰性的多份混合血清，60。C滅活1小時，(抗-HAVIgM抗體陽性效價〉1:1000)適度稀釋制配。直接包被抗人-p鏈抗體的微孔板為48或96孔的微孔板條，酶標記物的為偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP),化學發(fā)光底物液為魯米諾，濃縮洗滌液為PBST。本發(fā)明"甲型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒"可以非常專一地檢測出早期感染曱型肝炎病毒后人體中的曱型肝炎病毒IgM抗體，可以根據(jù)曱型肝炎病毒IgM抗體變化情況判斷治療效果及其早期病情的變化。它具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點。并且本發(fā)明的檢測系統(tǒng)為開放式操作，簡便快速，不需要昂貴的全自動化學發(fā)光測量儀，特別適合廣大的中小醫(yī)院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價值的檢測手段。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，載體上包被的抗人-ju鏈抗體先捕獲被測樣品中特異性抗體(IgM抗體)，再結合加入的曱型肝炎病毒特異性抗原，最后和酶標記的特異性抗體結合形成抗原抗體復合物，因此本發(fā)明采用的"捕獲法"反應模式，既有效地利用了化學發(fā)光技術原理，又確保了檢測的靈敏度。另外，本發(fā)明的試劑盒便于規(guī)模生產(chǎn)，便于實際中應用推廣。本發(fā)明的試劑盒應用的是酶催化發(fā)光底物，通過檢測發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號代替酶免疫分析中的顯色底物，因而具有與酶免疫分析同等的特異性，而靈敏度高，比ELISA試劑檢測血清樣本灰區(qū)值少，避免了檢測樣本判斷出現(xiàn)假陰、陽性結果出現(xiàn)的幾率?？蔀闀跣透窝撞《綢gM抗體的診斷提供更為特異、快速、可靠的依據(jù)。具體實施例方式實施例1制備本發(fā)明的曱型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒在本發(fā)明的研究過程中，本發(fā)明的發(fā)明人首先對所用的原材料進行了篩選實驗和質(zhì)量鑒定，包括抗體標記物與包被抗體的活性、載體(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和變異大小、HRP的活性、化學發(fā)光底物的發(fā)光強度及發(fā)光持續(xù)時間等。然后對包被方法進行了研究，用不同的包被緩沖液和保護液進行實驗，選擇出最適合的包被緩沖液和保護液，通過抗體不同包被濃度實驗找到最佳的濃度條件。對于HRP的標記可以有不同的方法，通過反復探索和對比實驗最終找到了簡便、產(chǎn)率高、成本低、質(zhì)量可靠的標記方法，并對不同的酶稀釋液進行了長期的考察實驗，配制出了能夠使抗體標記物長期保持活性穩(wěn)定的稀釋液。一、酶標抗體制備曱型肝炎病毒抗原的抗體用戊二醛法與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，用PBS充分透析，加等體積甘油，-20。C以下保存。二、曱型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性對照的制備混合6份以上經(jīng)ELISA試劑盒檢測曱型肝炎病毒IgM抗體陽性血清或陰性血清，經(jīng)HBsAg、抗-HIV、抗-TP以及抗-HCV抗體陰性血清，60。C滅活1小時，過濾除菌、適度稀釋、分裝，低溫凍存。三、酶標抗體濃度選定酶標單抗稀釋液的配置硼砂'1.4304g硼酸5.2564g小牛血清200ml甘油20mlProclin3001ml雙蒸水1000ml將酶標記抗體用酶稀釋液稀釋不同的的工作濃度，利用方陣滴定法選擇出酶標抗體適合的工作濃度為1:5500。四、固相包被板的制備(1)包被K2HP04.3H2022.823g雙蒸水1000ml溶解混勻后，調(diào)整PH至9.0,加入適量抗人-M鏈抗體混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔100jaL,4'C過夜。(2)封閉NaH2P042H200.6944gNa2HP0412H202.1851gNaCL8.5gBSA20g明膠0.lgProclin300lml雙蒸水定容至1000ml將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，加雙蒸水定容，溶解混勻，測定pH值為6.8~7.3。每孔分別加入封閉液150)iiL，吸附24。C小時。厄掉封閉液，在吸水紙上拍干。室溫除濕干燥24小時。立即進行真空封袋。封袋后放置15分鐘檢查無漏氣，如果有漏氣需重新封袋。貼簽后置2~8'C保存。五、化學發(fā)光底物A液魯米諾10mM1.7716g4-羥基聯(lián)苯0.3mM0.051g4-不典苯硼酸0.05raM0.012g硼酸11.4g硼J少4.9g雙蒸水定溶lOOOmLpH8.0-10.0六、化學發(fā)光底物B液過氧化脲3.5mM0.329gTween200.1%lmlNa2HP04.12H2051.58gNaH2P042H208.74g雙蒸水定溶lOOOmLpH7.0—7.6使用時A液與B液等比例混合。七、20倍洗涂液Na2HP04.12H2058gNaH2P042H202gNaCl160gTween-20lmLProclin300lmL去離子水lOOOmL調(diào)整pH至7.2~7.4八、半成品及成品組成上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。抽出三份經(jīng)過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成曱型肝炎病毒IgM抗體測定試劑盒(化學發(fā)光法)。組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。本發(fā)明的發(fā)明人還對試劑盒的反應模式和反應條件進行了實驗研究，最終確定了捕獲法反應模式，并就不同的反應時間對實驗結果的影響進行了實驗，確定最適合的反應時間。通過對化學發(fā)光底物液發(fā)光持續(xù)時間的測定及不同發(fā)光時間對測定值的影響實驗表明在加入化學發(fā)光底物液后5-25分鐘之間進行測量為最佳，其結果也較為準確。實施例2~3制備本發(fā)明的曱型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒除以堿性磷酸酶標記甲型肝炎病毒抗體、以AMPPD作為化學發(fā)光底物、以塑料珠、塑料管作為載體、包被液的pH值為4.5、封閉液的pH值為7.5外，其余均以與實施例1相同的方法制備曱型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒。實施例4制備本發(fā)明的曱型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒除以磁性顆粒作為固相栽體，用戊二醛偶聯(lián)法制備磁顆?？谷?ja鏈抗體固相載體外，其余均以與實施例1相同的方法制備曱型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒。實施例5本發(fā)明的試劑盒的使用方法以上實施例1制備的曱型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒的具體操作如下1)自4'C冰箱中取出試劑盒，室溫平衡15分鐘。再將濃縮稀液按比例稀釋為使用濃度備用。2)先將待4企血清樣品用生理鹽水1:1000稀釋備用3)取出包被板條，插入板架上。4)除空白孔外，反應孔中分別加陰、陽對照品各兩孔，每孔50ul,各孔加待檢樣本50ul，然后每孔加抗原50jLiL，用微量震蕩器充分振蕩混勻，37。C溫育0.5小時。5)甩去反應液，每孔加滿稀釋后的洗滌液，洗板5次，在干凈的吸水紙上扣干，然后加酶標抗體標記物lOOpL,用微量震蕩器充分振蕩混勻，37。C溫育0.5小時。6)甩去反應液，每孔加滿稀釋后的洗滌液，洗板5次，最后在干凈的吸水紙上扣干。7)各孔加化學發(fā)光底物液A、B各50nL，用微量震蕩器充分振蕩混合均勻，室溫(20~25°C)避光反應5分鐘。8)必須于加化學發(fā)光底物液后的第5-25分鐘內(nèi)測量，在化學發(fā)光測量儀上依序測量各孔的發(fā)光強度(RLU),測量時間l秒/孔。9)CO值=2.1^，RLU值>C0值則樣本判定為陽性樣本；RLU值<CO值則樣本判定為陰性樣本。實施例6本發(fā)明的試劑盒的方法學鑒定按照本領域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對實施例1中制備的試劑盒進行檢定，見下表l:表l<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>說明本發(fā)明"曱型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學發(fā)光法免疫分析測定試劑盒"的靈敏度、特異性、精密性以及穩(wěn)定性完全符合檢定要求。實施例7本發(fā)明的曱型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學發(fā)光法免疫分析測定試劑盒的臨床應用與ELISA試劑盒比較兩家臨床醫(yī)院使用實施例1的曱型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學發(fā)光法免疫分析測定試劑盒和ELISA試劑盒(該試劑盒為獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局生產(chǎn)批件的檢測抗-HAVIgM的ELISA產(chǎn)品)檢測712份臨床血清樣本(健康人310份、健康兒童60例、HBsAg陽性患者120例、紅斑性狼癡患者40例、類風濕因子陽性65例、臍帶血清35例)和102例臨床確診為曱型肝炎患者患者血清樣本，以對比兩種試劑盒檢測的符合率。一、臨床血清標本的來源各醫(yī)院臨床收集的曱型肝炎病毒及非曱型肝炎病毒患者及正常人的樣本。二、使用曱型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學發(fā)光法免疫分析測定試劑盒與ELISA試劑盒比較1、方法兩家醫(yī)院分別使用本發(fā)明實施例1制備的"甲型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學發(fā)光法免疫分析測定試劑盒"(按其說明書操作)和ELISA試劑盒(按其說明書操作)檢測臨床樣本712份，以對比兩種試劑盒檢測的符合率。2、結果兩家醫(yī)院使用實施例1的"甲型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學發(fā)光法免疫分析測定試劑盒"和ELISA試劑盒對比檢測結果(見表2)表2.兩家醫(yī)院對比兩種方法比較_<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>兩家醫(yī)院使用"曱型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學發(fā)光法免疫分析測定試劑盒，，與ELISA試劑盒對比檢測結果表明本發(fā)明試劑盒的特異性100%，敏感性100%;臨床試驗中，對比試劑2例類風濕因子陽性樣本血清檢出HAVIgM抗體陽性及l(fā)例曱肝陽性樣本4企測HAVIgM抗體陰性，3份血清樣經(jīng)2-琉基乙醇處理后復測確認試驗，2例類風濕因子陽性樣本結果為陰性，l例曱肝陽性樣本復測結果為陽性。本試劑盒與類風濕因子陽性血清、乙肝病毒表面抗原陽性血清無交叉反應。發(fā)明的曱型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒特異性、靈敏度，優(yōu)于對比試劑，可以應用于臨床曱型肝炎早期感染及急性曱肝指標的診斷檢測。權利要求1、一種甲型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)甲型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性對照品；2)包被的固相載體；3)甲型肝炎病毒抗原液；4)酶標記物；5)上述酶所作用的化學發(fā)光底物；以及6)濃縮洗滌液。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述固相載體為抗人-y鏈抗體(單抗或多抗)直接包被的微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。3、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶標記物為以堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶標記的曱型肝炎病毒抗體(單抗或多抗)。4、如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾。5、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物包括A液和B液，其中，所述化學發(fā)光底物A液，包括lOmM魯米諾、0.3mM4-輕基聯(lián)苯、0.05mM4-硤代苯基硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.0~10.0;所迷化學發(fā)光底物B液，包括3.5mM過氧化脲、0.1。/。Tween20、0.2MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0-7.6。6、一種制備權利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1)以曱型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性血清制備對照品；2)以抗人-u鏈抗體(單抗或多抗)直接包被固相栽體；3)以甲型肝炎病毒抗原制備抗原液；4)以酶標記甲型肝炎病毒抗體(單抗或多抗)；5)配制化學發(fā)光底物液；6)配制濃縮洗涂液；7)分裝上述曱型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性對照品、曱型肝炎病毒抗原液、酶標記的曱型肝炎病毒抗體、該酶所作用的化學發(fā)光底物和濃縮洗滌液；以及8)組裝為成品。7、如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述包被固相載體的步驟2)采用以下方法1)包被用0.1MpH值為9.0的磷酸氫二鉀緩沖液配制成所需濃度的抗人-n鏈抗體(單抗或多抗)包被液，并將包被液負栽于固相載體上；2)封閉用含2%BSA，0.01%明膠pH值為6.8~7.3,濃度為0.01M的磷酸鹽緩沖液作為封閉液封閉上述的固相載體。8、如權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述包被抗人-ia鏈抗體固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。9、如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶；所述化學發(fā)光底物為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾。10、如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)_1，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學領域，具體地，本發(fā)明提供了一種甲型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫測定試劑盒及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括1)甲型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性對照品；2)包被的固相載體；3)甲型肝炎病毒抗原液；4)酶標記物；5)化學發(fā)光底物；以及6)濃縮洗滌液。進一步，根據(jù)本發(fā)明制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)以甲型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性血清制備對照品；2)以抗人-μ鏈抗體(單抗或多抗)包被固相載體；3)以甲型肝炎病毒抗原制備抗原液；4)以酶標記甲型肝炎病毒抗體(單抗或多抗)；5)配制化學發(fā)光底物液；6)制備濃縮洗滌液；7)分裝上述甲型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性對照品、甲型肝炎病毒抗原液、酶標記物、化學發(fā)光底物及濃縮洗滌液；以及8)組裝為成品。本發(fā)明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點。文檔編號G01N33/576GK101533025SQ200810101998公開日2009年9月16日申請日期2008年3月14日優(yōu)先權日2008年3月14日發(fā)明者于尚永,應希堂,楊俊峰,胡國茂,鄭金來申請人:北京科美東雅生物技術有限公司