專利名稱：一種檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到基因組學(xué)和分子生物學(xué)中有機(jī)生物分子特別是核酸分子的質(zhì) 譜分析，具體是提供一種聯(lián)合限制性酶切法、核酸外切法和質(zhì)譜法以檢測(cè)單核 苷酸多態(tài)性的方法，更具體地說，提供一種在基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)中對(duì)基因組單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)的方法。技術(shù)背景人類的遺傳信息儲(chǔ)存在基因組中，2002年國際合作項(xiàng)目人類基因組計(jì)劃的 最終完成，繪制出了人類基因組結(jié)構(gòu)的精細(xì)圖，為相關(guān)研究提供了參考序列。 人類基因組序列共由30億個(gè)位點(diǎn)組成，研究表明，任意兩個(gè)人之間的基因組差 異在0.1%左右，即大約300萬個(gè)位點(diǎn)的差異。這些差異極有可能是造成兩個(gè)人 之間個(gè)體差異的遺傳因素。發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)，可廣泛地應(yīng)用于遺傳標(biāo)記的研究、 評(píng)估個(gè)體遺傳關(guān)系、評(píng)估物種進(jìn)化等研究領(lǐng)域。在人類基因組中，約90%的差異是以單個(gè)核苷酸的形式體現(xiàn)出來的，這樣 的差異位點(diǎn)被稱作單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)。 SNP 具有兩個(gè)顯著的特點(diǎn) 一是數(shù)目眾多，據(jù)估計(jì)人類基因組中的SNP數(shù)目約在1100 萬左右，目前國際數(shù)據(jù)庫dbSNP中已收錄來源于人類基因組的SNP達(dá)1083萬， 其中經(jīng)過確認(rèn)的為644萬(截至2007年8月22日)，如此大量的SNP方便了研 究這選擇合適的位點(diǎn)進(jìn)行研究，也使得絕大多數(shù)基因組區(qū)域在SNP效力的覆蓋 范圍內(nèi)；另外一個(gè)特點(diǎn)是SNP位點(diǎn)大多數(shù)為雙態(tài)，即在一個(gè)位點(diǎn)上僅有兩種表 現(xiàn)形式(基因型)，這樣很容易就能設(shè)計(jì)出高通量自動(dòng)化的檢測(cè)方法。正因?yàn)檫@ 兩個(gè)特點(diǎn)，使得SNP位點(diǎn)越來越受到研究者的青睞，被譽(yù)為是繼限制性片段長 度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)和短串聯(lián)重復(fù)序 列(shorttandemrepeat, STR)之后的第三代分子標(biāo)記物。人類基因組計(jì)劃完成 前后，基因組學(xué)研究的重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)向SNP領(lǐng)域，因此，SNP在遺傳標(biāo)記學(xué)、生 物群體遺傳學(xué)、生物分類學(xué)、遺傳育種學(xué)、物種或人類進(jìn)化學(xué)、法科學(xué)、藥物 基因組學(xué)等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用。例如，SNP的豐富性和雙等位基因特性使作物或家畜遺傳作圖更加精細(xì)， 使得育種工作者能夠更精確的進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇(MAS)和標(biāo)記輔助導(dǎo)入(MAI)， 降低或消除了目的基因之外的遺傳背景對(duì)這些技術(shù)帶來的不良影響，同時(shí)也給 品種資源和品種純度鑒定帶來嶄新局面。姜運(yùn)良等人通過對(duì)3種"雙肌臀"豬 品種的肌肉生長抑制基因3個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行分析，獲得肉質(zhì)提高的新品種。Mo皿a等人利用SNP標(biāo)記技術(shù)成功地將水稻半矮桿基因sd-l圖位克隆，Shen 等人構(gòu)建了水稻全基因組SNP數(shù)據(jù)庫，并成功地篩選多個(gè)水稻功能基因。例如，不同個(gè)體中存在的SNP差異，成為了法科學(xué)中身份鑒別的有力工具。 Gabirel等人對(duì)105個(gè)樣本的線粒體HVI/HVII區(qū)域的SNP進(jìn)行分析，并用途分 析了實(shí)際案例中毛發(fā)和骨骼等檢材，證明了該方法用于法醫(yī)檢案是可行的。李 莉、李成濤等人對(duì)人HLA-DR基因的SNP進(jìn)行檢驗(yàn)，在應(yīng)用于親子關(guān)系鑒定的 25個(gè)案例中，成功率達(dá)到96%。為了搶占市場(chǎng)，各大生物學(xué)公司都推出了自己的SNP檢測(cè)方法。其中質(zhì)譜 儀被認(rèn)為是很有發(fā)展前途的儀器，尤其是基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-TOFMS)。基于MALDI-TOF MS，開發(fā)了一些SNP檢測(cè)方法，如美 國Sequenom公司的hME和iPLEX方法，德國Bruker公司的GOOD assay方法， 韓國GeneMatrix公司的RFMP方法。這些方法的原理是設(shè)計(jì)一條與待檢測(cè)SNP 位點(diǎn)上游的基因組序列匹配的寡核苷酸探針，根據(jù)SNP位點(diǎn)的基因型差異，探 針將在待檢測(cè)SNP位點(diǎn)處連接上不同的脫氧核苷酸。其中，組成DNA片段的 四種脫氧核苷酸的分子量分別是dAMP 313.21Da， dCMP 289.19Da， dGMP 329.21Da， dTMP304.20Da。不同脫氧核苷酸之間是存在分子量差異的，其中差 異最小的是dAMP與dTMP之間的9.01Da，差異最大的是dCMP與dGMP之間 的40.02Da，通過質(zhì)譜儀能檢測(cè)到這種差異，從而將分子量不同的探針區(qū)分開來。 質(zhì)譜儀的檢測(cè)效果與探針的分子量相關(guān)，探針片段越短，分子量越小，區(qū)分效 果越明顯例如，在圖1中，A圖標(biāo)示的兩個(gè)峰，對(duì)應(yīng)的兩個(gè)寡核苷酸片段為 5'-ACGT-3，和5，-ACGA-3，，分子量分別為1174.699和1183.770Da，相差9.071Da， B圖標(biāo)示的兩個(gè)峰，對(duì)應(yīng)的兩個(gè)寡核苷酸片段為5'-ACGTACGT-3'和 5，-ACGTACGA-3，，分子量分別為2410.628和2419.821Da，相差9.193Da， C圖 標(biāo)示的兩個(gè)峰，對(duì)應(yīng)的兩個(gè)寡核苷酸片段為5'-ACGTACGTACGT-3'和 5，-ACGTACGTACGA-3，，分子量分別為3645,917和3654.736Da，相差8.819Da， 同樣相差9Da左右，但如圖所示，A圖中兩個(gè)峰之間的差異最明顯，B圖次之， C圖中兩個(gè)峰之間的差異相對(duì)不明顯，也就是說，分子量越小，質(zhì)譜儀的區(qū)分效 果越明顯，即分辨率越高。為了提高質(zhì)譜儀的分辨率，對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)傾 向于檢測(cè)分子量較小的寡核苷酸片段，如RFMP方法通過對(duì)含SNP位點(diǎn)的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切，產(chǎn)生2000~4000Da左右的寡核苷酸片段進(jìn)行檢測(cè)，而 GOOD assay方法通過磷酸二酯酶(Phosphodiesterase, PDE)將含SNP位點(diǎn)的 寡核苷酸片段切割成1000~2000Da左右的小片段進(jìn)行檢測(cè)。然而，國外公司利用質(zhì)譜儀對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的方法，在實(shí)際應(yīng)用中存在不少缺陷(1) S叫uenom公司的hME、 iPLEX兩種方法采用的是兩步PCR，即第一次PCR放大待檢測(cè)SNP位點(diǎn)的拷貝數(shù)，第二次PCR對(duì)待檢測(cè)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢 測(cè)，在兩次PCR之間，還要使用蝦堿性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase, SAP)除去第一次PCR反應(yīng)體系中剩余的dNTP，這樣就造成總檢測(cè)時(shí)間的延長， 以及單個(gè)檢測(cè)成本的增加；此外，這兩種方法沒有對(duì)含SNP位點(diǎn)的寡核苷酸片 段進(jìn)行切割，檢測(cè)范圍在4000 9000Da之間，因而分辨率不高；(2) GOOD assay方法也采用了兩步PCR，而且，為了提高分辨率，采用磷 酸二酯酶切割含SNP位點(diǎn)的寡核苷酸片段，提高了成本，延長了時(shí)間，不利于 快速檢測(cè)；(3) RFMP方法只有一步PCR，但是同GOOD assay方法(1000~2000Da) 相比，產(chǎn)生待檢測(cè)片段過長(2000 4000Da)，相應(yīng)的，分辨率不如GOOD assay 方法。因此，基于MALDI-TOFMS，目前需要開發(fā)一種分辨率高、準(zhǔn)確、成本低、 快速的方法來檢測(cè)基因組中SNP位點(diǎn)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是在針對(duì)以往基于MALDI-TOF MS檢測(cè)基因組SNP位點(diǎn)的方法存 在的前期處理速度慢或撿測(cè)分辨率不夠高等問題提出的相應(yīng)的解決方案。本發(fā)明原理在于利用酶切位點(diǎn)位于識(shí)別位點(diǎn)下游的一類特殊限制性內(nèi)切 酶的獨(dú)特性質(zhì)，通過將識(shí)別位點(diǎn)引入用于擴(kuò)增SNP位點(diǎn)的正向引物中的5'端， 并聯(lián)合與互補(bǔ)鏈中的SNP位點(diǎn)5'端上游序列的反向引物，擴(kuò)增得到包含識(shí)別位 點(diǎn)+酶切位點(diǎn)+SNP+部分保護(hù)堿基的產(chǎn)物。然后對(duì)產(chǎn)物分別進(jìn)行特殊限制性內(nèi)切 酶得到獲得具有粘性末端的雙鏈核酸片段，其中粘性末端中包含SNP位點(diǎn)。隨 后，通過雙鏈核酸外切酶切下粘性末端，獲得包含SNP位點(diǎn)的短片段，從而實(shí) 現(xiàn)只經(jīng)過一次PCR即獲得適于用質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)檢測(cè)SNP位點(diǎn)的探 針短片段。因此，本發(fā)明方案包括確定SNP位置、設(shè)計(jì)正向引物、設(shè)計(jì)反向引物、PCR 擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶消化、雙鏈核酸外切酶消化、質(zhì)譜檢測(cè)等步驟。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的步驟如下(1) 確定SNP位置針對(duì)待檢核酸序列可能存在的SNP，確定SNP在待檢序 列中的位置；(2) 設(shè)計(jì)正向引物根據(jù)SNP的位置，設(shè)計(jì)正向引物，其中正向引物3'端位于 SNP位點(diǎn)5'端l-10bp處，正向引物5'端含有特殊限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位 點(diǎn)，而在待檢核酸序列中，所述的特殊限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)位于識(shí)別 位點(diǎn)的3'端l-10bp，并位于SNP位點(diǎn)5，端l-5bp;(3) 設(shè)計(jì)反向引物根據(jù)SNP的位置，設(shè)計(jì)與另一條核酸鏈(或互補(bǔ)鏈)上的 SNP位點(diǎn)的5'端序列互補(bǔ)的反向引物；(4) PCR擴(kuò)增通過PCR擴(kuò)增，獲得包含特殊限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)+酶切 位點(diǎn)+SNP位點(diǎn)+SNP位點(diǎn)的部分下游序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。其中具體的PCR 反應(yīng)體系，即含SNP位點(diǎn)的DNA模板、本發(fā)明的特殊引物、dNTPs、耐 熱保真聚合酶、緩沖液、Mg2+、無菌的去離子水等各種試劑的體積，都與 常規(guī)PCR反應(yīng)一致，而反應(yīng)溫度條件和反應(yīng)時(shí)間根據(jù)引物Tm值和反應(yīng)片 段大小而定；(5) 限制性內(nèi)切反應(yīng)PCR反應(yīng)完成后將反應(yīng)產(chǎn)物直接進(jìn)行徹底的限制性酶切 反應(yīng)，酶切反應(yīng)條件根據(jù)具體使用的限制性內(nèi)切酶而定。其中使用所述的 特殊限制性內(nèi)切酶進(jìn)行限制性內(nèi)切反應(yīng)，獲得具有粘性末端的雙鏈核酸片 段，其中粘性末端中包含SNP位點(diǎn)；(6) 雙鏈DNA外切反應(yīng)利用雙鏈DNA核酸外切酶，切下雙鏈核酸片段的粘 性末端，獲得兩條包含SNP位點(diǎn)并且互補(bǔ)的單鏈短片段；(7) 質(zhì)譜檢測(cè)將包含SNP的單鏈短片段進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，通過與野生型單鏈短 片段的分子量進(jìn)行比較，確定SNP的基因型。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的特殊限制性內(nèi)切酶包括但不限于^"ni、5&I、 56vl、萬/"AI、 5mI、 5swAI、 S;ymBI、 5;y附F I、 5s; MI、 5spQ I、份gZ I、五wl、 FoA:I、 //gal、 Sapl、 S/aNI。以i/gfll為例，該限制性內(nèi)切酶的酶切 位點(diǎn)在識(shí)別序列3'端之后的5bp核苷酸處。識(shí)別序列在正向引物中的具體位置， 視實(shí)際操作中所使用的限制性內(nèi)切酶而定，并使酶切后SNP位點(diǎn)位于內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)之后。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的雙鏈DNA核酸外切酶包括X噬菌體核酸 外切酶aexo)。通過酶切反應(yīng)，消除上一步酶切反應(yīng)產(chǎn)物的雙鏈DNA部分， 保留單鏈的粘性末端，酶切反應(yīng)條件根據(jù)具體使用的雙鏈DNA外切酶而定。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，在進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)之前，還包括對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行 純化處理，以減少對(duì)最終檢測(cè)結(jié)果的干擾，提高分辨率。未經(jīng)純化的產(chǎn)物進(jìn)行 質(zhì)譜檢測(cè)，將出現(xiàn)含有鈉離子(Na+)、鉀離子(K+)等各種陽離子的質(zhì)譜峰， 這些陽離子質(zhì)譜峰與不含陽離子的主質(zhì)譜峰相差數(shù)十個(gè)Da (鈉離子23Da，鉀 離子39Da)，很容易造成誤判。而純化后的產(chǎn)物，陽離子峰的比例將大大降低， 甚至檢測(cè)不到，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。以樹脂純化法為例，在酶切產(chǎn)物中加 入適量樹脂，然后用微量移液器吹打均勻，來回顛倒eppendorf管使充分混勻， 上下顛倒15分鐘。1600rpm離心3分鐘，然后取上清液進(jìn)行下一步操作。7在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的質(zhì)譜檢測(cè)包括將基質(zhì)與純化后的酶切 產(chǎn)物點(diǎn)到質(zhì)譜儀所用的檢測(cè)靶上，供下一步的質(zhì)譜檢測(cè)，基質(zhì)的具體配方和與 用量視樣品濃度、樣品用量、環(huán)境條件、機(jī)器狀態(tài)而定。例如，所述的質(zhì)譜檢測(cè)是利用高分辨率的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS) 檢測(cè)酶切片段的分子量，由于單個(gè)SNP的分子量變化在9個(gè)或9個(gè)Da以上， 而高分辨率的質(zhì)譜儀能很好的區(qū)分單個(gè)堿基的差異，因此通過與野生型短片段 分子量的比較，可確定所檢測(cè)SNP在特定個(gè)體中的基因型。離心后的上清液可 用于質(zhì)譜儀檢測(cè)。先在樣品靶上點(diǎn)0.5ul基質(zhì)，基質(zhì)組成為檸檬酸銨(Ammonium citrate) 1.6g/L， 3 —羥基卩比啶羧酸(3-hydroxypicolinic acid， 3畫HPA) 6g/L，以 1:1的乙腈-水混合溶解，待基質(zhì)在自然狀態(tài)下結(jié)晶后，在結(jié)晶后的基質(zhì)上點(diǎn)lul 樣品(即離心上清液)，自然狀態(tài)下結(jié)晶。然后進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，獲 得酶切產(chǎn)物的質(zhì)譜圖，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)測(cè)得酶切產(chǎn)物分子量根據(jù)實(shí)驗(yàn)推測(cè)的產(chǎn)物分 子量相比對(duì)確定相應(yīng)的SNP類型，實(shí)現(xiàn)SNP檢測(cè)。本發(fā)明與傳統(tǒng)PCR檢測(cè)或常規(guī)質(zhì)譜分析檢測(cè)SNP相比，具有下列意想不到 的優(yōu)點(diǎn)(1) 常規(guī)PCR必須擴(kuò)大含SNPs位點(diǎn)的片段，即必須進(jìn)行兩次PCR，因此需 要很大的模板量。而本發(fā)明僅進(jìn)行一次PCR，可針對(duì)微量的SNP結(jié)果進(jìn) 行檢測(cè)，因此簡化了檢測(cè)過程；(2) 本發(fā)明所用引物和條件按常規(guī)方法進(jìn)行，具有較高地通用性；(3) 本發(fā)明的PCR過程無需高保真酶，在消化(酶切)過程中也無需蝦堿性 磷酸酶，降低的酶成本；(4) 本發(fā)明減去了單堿基延伸這一步驟，限制性內(nèi)切酶的用量也降低，從而 降低檢測(cè)成本約20 40%左右；(5) 本發(fā)明在保持原有的檢測(cè)準(zhǔn)確度的基礎(chǔ)上，能節(jié)約檢測(cè)時(shí)間30分鐘左右；(6) 本發(fā)明產(chǎn)生的用于質(zhì)譜儀檢測(cè)的DNA片段，在3 5個(gè)bp之間，分辨率 很高；(7) 對(duì)于一個(gè)SNP位點(diǎn)，本發(fā)明產(chǎn)生互補(bǔ)的兩條DNA片段，它們的分子量 不一樣，可以相互印證檢測(cè)的準(zhǔn)確性；(8) 對(duì)于多個(gè)位置比較靠近的SNP位點(diǎn)，傳統(tǒng)的方法檢測(cè)起來比較困難，本 發(fā)明產(chǎn)生的DNA片段上可以攜帶多個(gè)SNP位點(diǎn)，因此提高了檢測(cè)效率;(9) 對(duì)于多個(gè)位置相對(duì)分散的SNP位點(diǎn)，傳統(tǒng)的方法要進(jìn)行二次多重PCR， 由于某些引物之間存在干擾，因此有些位點(diǎn)不能同時(shí)參與PCR，而使用 本發(fā)明只需進(jìn)行一次多重PCR，引物之間的干擾相對(duì)較少，可以更方便 的選擇SNP位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)；


圖l分別是具有相同SNP(T/A)的不同長度的序列分子量與質(zhì)譜儀分辨率關(guān) 系的示意圖。其中，圖例A是5bp長度(5'-ACGT-3'和5，-ACGA-3')的分子量 質(zhì)譜檢測(cè)差異，圖例B是8bp長度(5'-ACGTACGT-3，和5'-ACGTACGA-3，)的 分子量質(zhì)譜檢測(cè)差異，圖例C是12bp長度(5'-ACGTACGTACGT-3'和 5'-ACGTACGTACGA-3')的分子量質(zhì)譜檢測(cè)差異。圖2是實(shí)施本發(fā)明的完整實(shí)驗(yàn)流程圖。圖3是限制性內(nèi)切酶/Zgal和雙鏈DNA核酸外切酶Xexo的雙酶切原理圖。 其中，字母GACGC為限制性內(nèi)切酶i/gal的識(shí)別序列，三角形為/Zgal對(duì)應(yīng)的 酶切位點(diǎn)，方括號(hào)內(nèi)小寫字母c/a、 g/t為SNP位點(diǎn)及其基因型。經(jīng)過雙酶切后， 獲得兩條包含SNP位點(diǎn)并且互補(bǔ)的單鏈短片段。圖4是根據(jù)本發(fā)明的方法，所得到的陰性對(duì)照A、待測(cè)樣品B、待測(cè)樣品C 的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
現(xiàn)在僅用參考下面非限制性的實(shí)施例的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明。但是應(yīng)當(dāng) 理解，下面的實(shí)施例僅僅是作為例證的，不應(yīng)以任何方式當(dāng)作對(duì)上述本發(fā)明總 體的限制。除非有其它說明，本發(fā)明的實(shí)施例使用本領(lǐng)域中的傳統(tǒng)分子生物學(xué)、 細(xì)胞生物學(xué)、PCR擴(kuò)增和突變技術(shù)等等。這些技術(shù)是技術(shù)人員熟知的，并在文 獻(xiàn)中有詳細(xì)解釋。參見，例如，Sambrook and Russell"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2001);Cloning: A Practical Approach, "Volumes I and II (D.N.Glover， ed.， 1985)";T.A Brown "Genome" BIOS Scientific Publishers Limited;PYKwok Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. (2001), 235-58.實(shí)施例l:設(shè)計(jì)擴(kuò)增乙肝病毒P基因669位SNP的引物乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是嚴(yán)重的世界性衛(wèi)生問題，每 年約有近百萬人死于乙肝病毒感染引起的各類疾病。但是對(duì)于已經(jīng)確診的乙肝 病人而言，不同個(gè)體中的乙肝病毒基因組存在多種SNP突變，導(dǎo)致相同疾病的 病人對(duì)同一藥物產(chǎn)生耐藥性。如果對(duì)乙肝病人體內(nèi)的SNP標(biāo)記進(jìn)行研究，揭示 了人群中不同個(gè)體對(duì)相同藥物的敏感性差異的根本原因，將有助于研究者篩選 更合適的藥物。其中，乙肝病毒基因組編碼的P基因(NCBI Gene ID: 944565)上第669位 核苷酸發(fā)生C—A突變，使編碼氨基酸由亮氨酸變?yōu)榈鞍彼?L180M)，從而產(chǎn)生對(duì)抗病毒藥物拉米夫定(lamivudine， LAM)的耐藥性。 對(duì)于該SNP位點(diǎn)的質(zhì)譜檢測(cè)，我們?cè)O(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)首先根據(jù)乙肝病毒基因組的序列(NCBI登錄號(hào)NC—003977)，設(shè)計(jì)PCR 引物，正向引物為GGGCCTCAGTgacgcCCGTTTC，其中的小寫字母為限制性 內(nèi)切酶/fg"I的識(shí)別序列，反向引物為CCACTGAACAAATGGCACTA。實(shí)施例2:擴(kuò)增包含乙肝病毒P基因的669位SNP片段PCR反應(yīng)片段大小為58個(gè)核苷酸，含5個(gè)核苷酸的Z/gal識(shí)別序列。PCR 反應(yīng)體系為10ul體系，其中乙肝病毒基因組DNA1.5ul (初始濃度10ng/ul)、 正向引物和反向引物各lul (初始濃度5pmol/ul)、 dNTPs 0.8ul (初始濃度各 2.5mM)、緩沖液lul(初始濃度lx，含Mg2+)、HSTaq酶0.05ul(初始濃度5U/ul)、 無菌的去離子水4.65ul; PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為95°C5min，然后95°C20s、 55 。C20s、 72°C20s循環(huán)30次，之后72。C7min。 PCR反應(yīng)后，乙肝病毒基因組DNA 中帶有SNP位點(diǎn)的那段核苷酸序列的拷貝數(shù)得到放大。反應(yīng)完成后的PCR產(chǎn)物 可在4。C冷藏保存數(shù)天，也可在-2(TC冷凍保存數(shù)月，也可立即直接用于后續(xù)的 酶切反應(yīng)。實(shí)施例3:對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特殊限制性內(nèi)切酶和雙鏈核酸外切酶消化PCR反應(yīng)后經(jīng)Z/gal酶解，反應(yīng)體系為20ul體系，其中PCR產(chǎn)物10ul、 酶緩沖液2ul (初始濃度10x)、 //gal酶lul (初始濃度2U/ul)、無菌的去離子水 7ul;酶切反應(yīng)參數(shù)為37。C40min， 65。C20min。經(jīng)過/Zgal酶的消化，PCR產(chǎn) 物將被切割成兩個(gè)部分，每個(gè)部分都帶有粘性末端，即雙鏈酶切產(chǎn)物的反義鏈 上帶有4個(gè)核苷酸的單鏈部分，而SNP位點(diǎn)正好位于單鏈區(qū)域內(nèi)。反應(yīng)完成后 的酶切產(chǎn)物可在4。C冷藏保存數(shù)天，也可在-20。C冷凍保存數(shù)月，也可立即直接 用于后續(xù)的酶切反應(yīng)。接下來用X噬菌體核酸外切酶(人exo)進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系為30ul體系， 其中內(nèi)切酶消化產(chǎn)物20ul、酶緩沖液3ul (初始濃度10x)、人exo酶3ul (初始濃 度2U/ul)、無菌的去離子水4ul;酶切反應(yīng)參數(shù)為37。C40min， 95°C20min，冰 水浴20min。經(jīng)過Xexo酶的消化，上一步酶切產(chǎn)物的雙鏈部分將被降解，這樣， 將得到兩個(gè)5核苷酸長的單鏈DNA，分別是5'-TCTC[c/a]-3'和5'-[g/t]GAGA-3'， 它們序列互補(bǔ)，并且攜有SNP位點(diǎn)(方括號(hào)內(nèi)的小寫字母所示)。反應(yīng)完成后的 酶切產(chǎn)物可在4'C冷藏保存數(shù)天，也可在-2(TC冷凍保存數(shù)月，也可立即直接用 于后續(xù)的純化反應(yīng)。實(shí)施例4:純化雙酶切產(chǎn)物在兩步酶切后的產(chǎn)物中加入3mg樹脂，用微量移液器吹打均勻，來回顛倒 eppendorf管使充分混勻，上下顛倒15分鐘。經(jīng)過本步反應(yīng)，樹脂將充分與反應(yīng) 體系中的陽離子結(jié)合，而使反應(yīng)體系脫鹽。反應(yīng)完成后的純化產(chǎn)物可在4"C冷藏 保存數(shù)天，也可在-2(TC冷凍保存數(shù)月，也可1600rpm離心3分鐘后取出上清液 直接用于后續(xù)的質(zhì)譜檢測(cè)。實(shí)施例5:基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)檢測(cè)SNP先在樣品靶上點(diǎn)0.5ul基質(zhì)，基質(zhì)組成為檸檬酸銨(Ammonium citrate) 1.6g/L， 3—羥基吡啶羧酸(3-hydroxypicolinic acid， 3-HPA) 6g/L，以1:1的乙 腈-水混合溶解，待基質(zhì)在自然狀態(tài)下結(jié)晶后，在結(jié)晶后的基質(zhì)上點(diǎn)lul離心上 清液，自然狀態(tài)下結(jié)晶。然后進(jìn)行MALDI-TOFMS分析，獲得酶切產(chǎn)物的質(zhì)譜 圖。判定標(biāo)準(zhǔn)如下如沒發(fā)生耐藥突變，酶切產(chǎn)物的質(zhì)譜結(jié)果應(yīng)為5'-TCTCC-3， 和5'-GGAGA-3'，分子量分別為1413.92和1552.00;若發(fā)生耐藥突變，酶切產(chǎn) 物的質(zhì)譜結(jié)果應(yīng)為5'-TCTCA-3'和5'-TGAGA-3'，分子量分別為1437.94和 1526.99;如果4個(gè)分子量都在質(zhì)譜圖中表示，則表明樣品中既有未發(fā)生耐藥突 變的野生株，也有發(fā)生耐藥突變SNP的乙肝病毒株的存在。檢測(cè)結(jié)果如下其中，樣品A為陰性對(duì)照樣本，樣品B和樣品C為待測(cè)樣本。(1) 對(duì)于陰性對(duì)照樣本A，由于其為沒有發(fā)生耐藥突變的病毒株，因此 酶切產(chǎn)物應(yīng)為5'-TCTCC-3，和5，-GGAGA-3，，而實(shí)際質(zhì)譜檢測(cè)的分 子量為1414.571和1552.194，與預(yù)期的分子量(1413.92和1552.00) 僅偏差0.7Da不到，這屬于可以接受的誤差范圍。因此，證實(shí)樣品A 為陰性對(duì)照樣本(參見圖4A)。(2) 對(duì)于樣品B，實(shí)際質(zhì)譜檢測(cè)分子量為1437.746和1526.732，這與預(yù) 期的陽性結(jié)果的分子量(1437.94和1526.99)僅偏差0.3Da不到(屬 于可以接受的誤差范圍)，因此證實(shí)樣品B具有SNP突變，其酶切 產(chǎn)物應(yīng)為5，-TCTCA-3，和5，-TGAGA-3，(參見圖4B);(3) 對(duì)于樣品C，實(shí)際質(zhì)譜檢測(cè)分子量為1414.001和1551.915、 1437.813 和1527.121Da，這與預(yù)期的陰性分子量(1413.92和1552.00)以及 陽性分子量(1437.94和1526.99)分別相差0.2Da不到(屬于可以 接受的誤差范圍)，因此證實(shí)樣品C為發(fā)生耐藥突變的病毒株與未發(fā) 生耐藥突變的病毒株(參見圖4C)。因此，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，揭示了樣本A、 B以及樣本C個(gè)體對(duì)相同藥物的敏 感性差異的根本原因，這有助于研究者篩選更合適的藥物。
權(quán)利要求
1、一種聯(lián)合限制性酶切法和質(zhì)譜法以檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，包括以下步驟(1)確定SNP位置針對(duì)待檢核酸序列可能存在的SNP，確定SNP在待檢序列中的位置；(2)設(shè)計(jì)正向引物根據(jù)SNP的位置，設(shè)計(jì)正向引物，其中正向引物3’端位于SNP位點(diǎn)5’端1-10bp處，正向引物5’端含有特殊限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，而在待檢核酸序列中，所述的特殊限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)位于識(shí)別位點(diǎn)的3’端1-10bp，并位于SNP位點(diǎn)5’端1-5bp；(3)設(shè)計(jì)反向引物根據(jù)SNP的位置，設(shè)計(jì)與另一條核酸鏈或互補(bǔ)鏈上的SNP位點(diǎn)的5’端序列互補(bǔ)的反向引物；(4)PCR擴(kuò)增通過PCR擴(kuò)增，獲得包含特殊限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)+酶切位點(diǎn)+SNP位點(diǎn)+SNP位點(diǎn)的部分下游序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；(5)限制性內(nèi)切反應(yīng)使用所述的特殊限制性內(nèi)切酶進(jìn)行限制性內(nèi)切反應(yīng)，獲得具有粘性末端的雙鏈核酸片段，其中粘性末端中包含SNP位點(diǎn)；(6)雙鏈DNA外切反應(yīng)利用雙鏈DNA核酸外切酶，切下雙鏈核酸片段的粘性末端，獲得兩條包含SNP位點(diǎn)并且互補(bǔ)的單鏈短片段；(7)質(zhì)譜檢測(cè)將包含SNP的單鏈短片段進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，通過與野生型單鏈短片段的分子量進(jìn)行比較，確定SNP的基因型。
2. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的特殊限制性內(nèi)切酶包括A^ II、 I、 56vl、 B/wAI、 ^al、 5smAI、 5swBI、 SswF I、 Bs; MI、丑^QI、份gZI、 ￡ar I、 MI、雄al、鄉(xiāng)I、脈NI。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的雙鏈DNA核酸外切酶包括X噬菌 體核酸外切酶(Xexo)。
4. 權(quán)利要求1-3所述的方法，其中在進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)之前，還包括對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn) 行純化處理，以減少對(duì)最終檢測(cè)結(jié)果的干擾，提高分辨率。
5. 權(quán)利要求4所述的方法，其中純化方法包括樹脂純化。
6. 權(quán)利要求1-5所述的方法，其中所述的質(zhì)譜檢測(cè)包括將基質(zhì)與純化后的酶 切產(chǎn)物點(diǎn)到質(zhì)譜儀所用的檢測(cè)靶上，供下一步的質(zhì)譜檢測(cè)，基質(zhì)的具體配方和 與用量視樣品濃度、樣品用量、環(huán)境條件、機(jī)器狀態(tài)而定。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的質(zhì)譜檢測(cè)是利用高分辨率的基質(zhì)輔 助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)檢測(cè)酶切片段的分子量，由 于單個(gè)SNP位點(diǎn)的分子量變化在9個(gè)或9個(gè)Da以上，而高分辨率的質(zhì)譜儀能 很好的區(qū)分單個(gè)堿基的差異，因此通過與野生型短片段分子量的比較，可確定 所檢測(cè)SNP位點(diǎn)在特定個(gè)體中的基因型。
全文摘要
本發(fā)明提供一種聯(lián)合內(nèi)切酶和外切酶以及質(zhì)譜法方法來檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的新方法。本發(fā)明要點(diǎn)在于參與PCR反應(yīng)的其中一條引物含限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，通過對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化，以及隨后的雙鏈DNA外切酶消化，產(chǎn)生兩個(gè)含多態(tài)位點(diǎn)的單鏈核苷酸片段，并通過純化、點(diǎn)靶等步驟，制備可直接用于基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)的樣本。與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明具有存在耗時(shí)短、成本低、分辨率高、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N27/64GK101246142SQ20081008948
公開日2008年8月20日 申請(qǐng)日期2008年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月3日
發(fā)明者于中連, 芳 呂, 呂萍萍, 趙洪斌, 馬慶偉 申請(qǐng)人:毅新興業(yè)(北京)科技有限公司