專利名稱：Cyp2d6基因第九號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是基因技術(shù)領(lǐng)域的核酸及其引物和檢測方法，具體地講是一 種分離核酸、 一種等位基因特異性的核酸引物和CYP2D6基因第九號外顯子的單 核苷酸多態(tài)性的檢測方法。
背景技術(shù)：
細胞色素氧化酶P450 2D6(CYP2D6)也稱之為異喹胍羥化酶，是細胞色素 P450的一個成員。CYP2D是第一個被發(fā)現(xiàn)存在遺傳多態(tài)性的細胞色素氧化酶 P450，目前哺乳動物體內(nèi)至少發(fā)現(xiàn)了 21種CYP2D。而人類的CYP2D位于22ql3. 1， 由CYP2D6、 CYP2D7P和CYP2D8P共同構(gòu)成，其中CYP2D7P和CYP2D8P為假基因， 僅CYP2D6有功能蛋白表達。CYP2D6主要在肝臟中表達，CYP2D6共有497個氨 基酸組成。CYP2D6不僅氧化代謝某些內(nèi)源性的類固醇激素，而且還是20-25%常 用藥物的主要代謝酶。CYP2D6的底物包括e受體阻斷劑普萘洛爾(Propranolol) 等、抗心率失常藥奎尼丁(Quinidine)、普羅帕酮(Propafenone)等，降壓藥異 喹胍(Debrisoquine)等，鎮(zhèn)痛藥曲馬多(Tramadol)，抗精神病藥奮乃靜 (Perphenazine)、氟哌丁醇(Haloperidol)等，止咳平喘藥可待因(Codeine)、 右美沙芬(Dextromethorphan)等，降血糖藥苯乙雙胍(Phenformine)等，5_HT 拮抗劑托垸司瓊(Tr叩isetron)等，三環(huán)類抗抑郁藥，抗心絞痛藥等。CYP2D6的 活性受到遺傳因素及環(huán)境因素的影響，但遺傳因素是最主要的原因。多數(shù)CYP2D6 的單核苷酸突變可以影響基因的后續(xù)轉(zhuǎn)錄和表達，進而改變了酶的結(jié)構(gòu)和活性， 這是造成個體差異的主要原因。鑒于CYP2D6在藥物代謝中的作用及活性存在個 體差異，因此對解決CYP2D6基因多態(tài)性的檢測和相關(guān)問題是現(xiàn)有技術(shù)急需解決 的技術(shù)難題。
對現(xiàn)有文獻的檢索，未發(fā)現(xiàn)有本發(fā)明的CYP2D6基因第九號外顯子(G4046A) SNP (單核苷酸多態(tài)性)相關(guān)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種CYP2D6基因第九號外 顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，同時涉及一種分離核酸、 一種等位基因特 異性的核酸引物，可用于評估個體患CYP2D6基因的第九號外顯子相關(guān)疾病的易 感性，以及用于CYP2D6基因多態(tài)性與臨床用藥安全關(guān)系的研究。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，第一方面，提供了一種檢測人CYP2D6 基因第九號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法，它包括步驟
(a)采用Primer 5.0等相關(guān)軟件，以GenBank數(shù)據(jù)庫CYP2D6基因 (AY545216)第九號外顯子以及外顯子與內(nèi)含子接合部位序列為模板設計一對 等位基因特異性的核酸引物，利用引物對來擴增CYP2D6基因的第九號外顯子的 DNA序列，對擴增產(chǎn)物進行分離純化，得到相應分離核酸。
(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。采用一些分析技術(shù)可用于檢 測分離核酸的CYP2D6基因第九號外顯子的SEQ ID NO: 1所示序列的第1322位 核苷酸是否存在單核苷酸多態(tài)性，即G—A多態(tài)性。
這些分析技術(shù)包括(但并不限于)DNA測序法、雜交測序法；酶促錯配切 割法、異源雙鏈分析法、點雜交法、寡核苷酸陣列法、微測序法、T叫man技術(shù)、 分子信標法，變性高效液相色譜法。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離核酸，它具有SEQIDNO: l所示的 序列，且第1322位為A。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種等位基因特異性的核酸引物，其長度為 15-50bp，且特異性地雜交并擴增出含人CYP2D6基因第九號外顯子的SEQ ID NO: 1所示序列的第1322位的單核苷酸多態(tài)性的擴增產(chǎn)物。
本發(fā)明所述的"分離純化"是指在基因組DNA水平上，利用引物對來擴增 每個多態(tài)性位點的基因序列和利用純化試劑盒對擴增產(chǎn)物進行提純。
用于本發(fā)明的測試樣品沒有特別限制，對于檢測SNP而言，可以是從血液、 組織等樣品中抽提出的DNA或mRNA。對于CYP2D6基因的第九號外顯子活性而言， 可以任何含有CYP2D6基因的第九號外顯子的樣品，如血液等。
本發(fā)明的實質(zhì)性特點和顯著進步表現(xiàn)在是一項原創(chuàng)性的發(fā)明。本發(fā)明的 內(nèi)容涉及一種分離出的或純化的CYP2D6基因的第九號外顯子多態(tài)性位點的基因 序列，所說的"分離出的或純化的"是指在基因組DNA水平上，利用引物對來 擴增多態(tài)性位點的基因序列和利用純化試劑盒對擴增產(chǎn)物進行提純。通過對所 取樣品CYP2D6基因測序結(jié)果，在上海中發(fā)現(xiàn)了 1個樣品含有CYP2D6基因的第 九號外顯子SNP (即第1322位G—A多態(tài)性)，頻率為0. 003。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該 SNP導致第441位氨基酸由Arg(R)—His(H)。由于這是不同性質(zhì)氨基酸的置換， 因此，會導致CYP2D6基因的第九號外顯子所編碼的蛋白活性發(fā)生改變，從而引 起酶活性發(fā)生改變，進一步影響CYP2D6酶代謝的藥物。
本發(fā)明為研究我國人群中CYP2D6基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關(guān)系奠定 了基礎，為藥物設計和臨床用藥個體化提供了基因?qū)W理論根據(jù)，同時也為基于 藥物基因組學理念的新藥研發(fā)提供指導依據(jù)，具有重大的理論意義和潛在的實 用價值。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一歩闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠 商所建議的條件。 步驟l
一種核酸的分離和測序
引物設計
采用Primer 5.0軟件，以GenBank數(shù)據(jù)庫CYP2D6基因(AY545216)第九 號外顯子以及外顯子與內(nèi)含子接合部位序列為模板設計一對等位基因特異性的 核酸引物，由Invitrogen公司合成。
引物信息
擴增CYP2D6基因的第九號外顯子SNP位點的DNA序列引物信息
正向引物 5 ，陽CAGAGTCC AGCTGTGTGCC A -3 ，
反向引物 5，-TGGGGTCACCAGGAAAGCAAA-3，
PCR擴增條件(體系各項試劑除DNA外均由Bio-Asia公司提供)
反應體系總體積為15W，其中
ddH20 8. 8rt 滅菌雙蒸水
10 X Buffer 1.聚合反應緩沖液包含KC1 Tris-HC1溶液 DMSO 0.
2mM dNTP 1. 2mM dNTP溶液
10pM正反向引物各0.9W
5U Taq 0. DNA合成多聚酶
10ng DNA 0. 10ng人體DNA擴增摸板
PCR反應條件
94°C 3mins; 94°C 30 seconds; 64。C 30 seconds, _0. 5°C/CYCLE; 72 °C lmin; 14 times to 2 ; 30X (94°C 30 seconds; 57°C 30 seconds; 72 °C lmin;) 72 。C lOmins。
測序反應均作正反向，條件如下
擴增產(chǎn)物酶純化法PCR產(chǎn)物加入純化酶系內(nèi)含SAP (Shrimp alkaline phosphatase,堿性磷酸酶)0. 15u和Exo-nuclease I(核酸外切酶I) 0. 75u/ul, 37°C 30mins, 85。C 20mins， 4°C保存?zhèn)溆谩?br> 測序采用ABI Prism BigDye terminator (BDT) cycle sequencing reaction kit (PE Applied Biosystems)，測序總體積為5t4，其中純化后的PCR產(chǎn)物化l， BDT 0. 5W，正向或反向引物0. 5W。反應條件是94°C 2 mins, 35 X (94°C 30 seconds, 55°C 40 seconds, 60 °C 1.5 mins), 4°C保存?zhèn)溆谩?br> 上樣前純化5W測序產(chǎn)物中加入無水乙醇和3.0 mol / L醋酸鈉混 合液(V:V:25:1)，室溫、避光、靜置15min, 4000 rpm/min 45mins， 700rpm/min 5 seconds棄上清；2X (75%Alcohol 25^1,4000 rpm/min 10 mins， 700rpm/min 5 seconds棄上清)；室溫、避光、靜置、風干20mins;上樣于3100測序
儀進行測序。 步驟2
SNP的獲得
對CYP2D6基因進行直接測序。將測定的各樣本序列與GenBank數(shù)據(jù)庫 CYP2D6基因序列(AY545216)進行比較，從而得出序列的差異。在上海中發(fā)現(xiàn) 了 1個樣品含有CYP2D6基因第九號外顯子SNP (即第1322位G—A多態(tài)性)，而 其它樣品的基因型均為GG，只有這1個樣品的基因型為GA,基因頻率為0. 003。 經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該SNP導致第441位氨基酸由Arg(R)—His(H)。由于這是不同性 質(zhì)氨基酸的置換，因此，會導致CYP2D6基因第九號外顯子所編碼的蛋白活性發(fā) 生改變。
CYP2D6基因CDS及其多態(tài)性位點的CDS序列如SEQ NO. 1所示
(a) 序列特征 *長度1494堿基對
*類型核酸 *鏈型雙鏈
(b) 反義:否 (C)最初來源人
(d) SEQ ID NO. l核酸序列描述如下-
1atggggctagaagcactggtgcccctggccgtgatagtggccatcttcctgctcctggtg
61g3CCtg3tgCaccggcgccaacgctgggctgcacgctacccaccaggccccctgccactg
121cccgggctgggcaacctgctgC3tgtgg3Ccaccatactgcttcgaccag
181ttgcggcgccgcttcggggacgtgttcagcctgcagctggcctggacgccggtggtcgtg
241ctc犯tgggctggcggccgtgcgcg兆gcgctggtgacccacggcg鄉(xiāng)3caccgccgac
301cgcccgcctgtgcccatcacccagatcctgggtttcgggccgcgttcccasggggtgttc
361ctggcgcgctatgggcccgcgtggcgcgagcagaggcgcttctccgtgtccaccttgcgc
421aacttgggcctgggcaag3￡LgtcgctggagC3gtgggtgElccgagg鄉(xiāng)ccgcctgcctt
481tgtgccgccttcgccaaccactccggacgcccctttcgccccaacggtctcttggacaaa
541gccgtgagcaacgtgatcgcctccctcacctgcgggcgccgcttcgagtacgacgaccct
601cgcttcctcaggctgctggacctagctcaggagggactgagggctttctg
661cgcgaggtgctg38tgCtgtccccgtcctcctgcatatccc鄉(xiāng)gctggctggcaaggtc
721ctacgcttccaaaaggctttcctgacccagctggatgagctgctaactgagcacaggatg
781eicctgggacccagcccagcccccccgagacCtg3Ctg鄉(xiāng)ccttcctggc3g卿tggtLg
841aaggccaagggg犯ccctgagagcagcttc肌tgatgagaacctgcgcatsgtggtggct
901gacctgttctCtgCCggg8tggtgaccacctcgaccacgctggcctggggcctcctgctc
961atgatcctacatccggatgtgcagcgccgtgtccaacaggcgtgataggg
1021caggtgcggcgacc6Lgetgatgggtgaccaggctceicatgctgccgtgeitt
1081catgaggtgcagcgctttggggacatcgtccccctgggtgtgacccstatgacatcccgt
1141g3C3tCg犯gtacagggcttccgcatccct卿gg犯cgacactcatcaccaacctgtca
1201tcggtgctgacgtctgggsgaagcccttccgcttccaccccgaacacttc
1261ctggatgccc兆ggccactttgtgaagccggaggccttcctgcctttctcagcaggccgc
1321cgtgcatgcctcggggagcccctggcccgcatggagctcttcctcttcttcacctccctg
1381ctgcagcacttcagcttctcggtgcccactggacagccccggcccagccaccatggtgtc
1441tttgctttcctggtgagcccatccccctatg鄉(xiāng)tttgtgctgtgccccgctag
CYP2D6基因CDS及其多態(tài)性位點的氨基酸序列如SEQN0.2所示:
SEQ ID N0.2氨基酸序列描述如下: (a)序列特征
*長度497氨基酸
*類型蛋白質(zhì) (b)反義:否 (C)最初來源人
(d) SEQ ID N0.2核酸序列描述如下
1 mglealvpla vivaiflllv dlmhrrqrwa aryppgplpl pglgnllhvd fqntpycfdq 61 Irrrfgdvfs lqlawtpvvv lnglaavrea lvthgedtad rppvpitqil gfgprsqgvf 121 laxygpawre qrrfsvstlr nlglgkksle qwvteeaacl caaf肌hsgr pfrpnglldk
181 avsnviaslt cgrrfeyddp rflrlldlaq eglkeesgfl revlnavpvl lhipalagkv 241 lrfqkafltq ldelltehrm twdpaqpprd lteaflaeme kakg叩essf ndenlrivva 301 dlfsagmvtt sttlawglll milhpdvqiT vqqeiddvig qvrrpemgdq ah即yttavi 361 hevqrfgdiv plgvthmtsr dievqgfrip kgttlitnls svlkdeavwe kpfrfhpehf 421 ld叫g(shù)hfvkp eaflpfsagr raclgeplar melflfftsl lqhfsfsvpt gqprpshhgv 481 faflvspspy elcavpr 本發(fā)明實施例中采用的樣品包括上海(IOO例，男女各50例，年齡為18-53 歲)、汕頭(100例，男女各50例，年齡為18-53歲)、和西安(100例，男女 各50例，年齡為18-53歲)，沈陽(100例，男女各50例，年齡為18-53歲)， 均為正常人。全體參與者均在正式的知情同意書上同意簽字。
對所取樣品進行CYP2D6基因的PCR擴增與測序，根據(jù)對所取樣品CYP2D6 基因測序結(jié)果，在上海中發(fā)現(xiàn)了 1個樣品含有CYP2D6基因的第九號外顯子SNP (即第1322位G—A多態(tài)性)，頻率為0. 003經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該SNP導致第441位 氨基酸由Arg(R)—His(H)。由于這是不同性質(zhì)氨基酸的置換，因此，會導致 CYP2D6基因所編碼的蛋白活性發(fā)生改變。
CYP2D6基因的第九號外顯子的cDNA序列列于SEQ ID NO: 1，其中開放閱 讀框為第1-1494位，其所編碼的氨基酸序列列于SEQ ID NO: 2。 CYP2D6基因 的第九號外顯子的基因組序列可以從GenBank中獲得。
序列表
<110>上海交通大學
<120> CYP2D6基因第九號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法
<160>3
<210> 1
<211> 1494
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens) <220>
<221> misc_feature
<222>(1322)
<223> n =g或a
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1494)
<400> 1
1atggggctagaagcactggtgcccctggccgtgat3gtggccatcttcctgctcctggtg
61gacctgatgcaccggcgccaacgctgggctgcacgctacccaccaggccccctgccactg
121cccgggctgggcaacctgctgC3tgtgg3Cttccag犯cacaccatactgcttcgaccag
181ttgcggcgccgcttcggggacgtgttcagcctgc柳tggcctggacgccggtggtcgtg
241ctcaatgggctggcggccgtgcgcgaggcgCtggtgElCCCcaccgccgac
301cgcccgcctgtgcccatcacccagatcctgggtttcgggccgcgttcccaaggggtgttc
361ctggcgcgctatgggcccgcgtggcgcgagcagaggcgcttctccgtgtccaccttgcgc
421肌cttgggcctgggca卿agtcgctggagcagtgggtgaccgaiggaggccgcctgcctt
481tgtgccgccttcgccaaccactccggacgcccctttcgccccaacggtctcttggacaaa
541gccgtgagca3CgtgEltCgCctccctcacctgcgggcgccgcttcgagtacgacgaccct
601cgcttcctcaggctgctggacctagctcagagga卿gtcgggcUtctg
661cgcg鄉(xiāng)tgctgatgctgtccccgtcctcctgcatatcccagcgctggctggcaggtc
721ctacgcttccaa犯ggctttcctgacccagctggatgagctgct肌ctgagcac鄉(xiāng)atg
781acctgggscccagcccagcccccccgagacctgactgaggccttcctggc3g卿tggag
841卿gcc鄉(xiāng)gggaaccctgagagcagcttcaa^tg3tgagaacctgcgcatagtggtggct
901gacctgttctCtgCCggg3tggtgaccacctcgaccacgctggcctggggcctcctgctc
961atgatcctacatccggatgtgcagcgccgtgtccaacaggcgtgataggg
1021c兆gtgcggcgggtg3CC3ggctcacatgcCCt3C3CC3Ctgccgtgatt
1081C3tg3ggtgCagcgctttggggacatcgtccccctgggtgtgacccatatgacatcccgt
1141g3C2LtCg幼gt3C3gggCttccgcatccctcactcatcaccaacctgtcei
1201tcggtgctg3aggatg郷ccgtctgggagaagcccttccgcttccaccccgaacacttc
1261ctggatgcccagggccactttgtg犯gccggaggccttcctgcctttctcagcaggccgc
1321cgtgcatgcctcggggagcccctggcccgcatggeigctcttcctcttcttcacctccctg
1381CtgC3gC3Cttcagcttctcggtgcccactggacagccccggcccagccaccatggtgtc
1441tttgctttcctggtgagcccatccccctatg3gCtttgtgctgtgccccgcteig
<210〉2 <211>497 <212> PRT
<213>人(Homo sapiens) <400〉 2
1mglealvplavivaiflllv dlmhrrqrwasr卿gplpl pglgnllhvdfqntpycfdq
61lrrrfgdvfslqlawtpvvv lngl犯vrealvthgedtad rppvpitqilgfgprsqgvf
121larygpawreqrrfsvstlr nlglgkksleq群teeaacl caafajihsgrpfrpnglldk
181avsnviasltcgrrfeyddp rflrlldl叫eglkeesgfl revlnavpvlIhipeilagkv
241lrfqkafltQldelltehrm twdpaqpprdlteaflaeme kakgnpessfndenlrivva
301dlfsagmvttsttlawglll milhpdvqrrvQqeiddvig Qvrrpemgdqahmpyttavi
361hevqrfgdivplgvthmtsr dievqgfripkgttlitnls svlkdeavwekpfrfhpehf
421ld叫g(shù)hfvkpeaflpfsagr raclgeplarmelflfftsl lqhfsfsvptgqprpshhgv
481faflvspspyelcavpr
權(quán)利要求
1、一種CYP2D6基因第九號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于包括如下步驟(a)采用Primer 5.0軟件，以GenBank數(shù)據(jù)庫CYP2D6基因第九號外顯子以及外顯子與內(nèi)含子接合部位序列為模板設計一對等位基因特異性的核酸引物，利用引物對來擴增CYP2D6基因的第九號外顯子的DNA序列，對擴增產(chǎn)物進行分離純化，得到相應分離核酸；(b)檢測分離核酸的CYP2D6基因第九號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第1322位核苷酸是否存在單核苷酸多態(tài)性，即G→A多態(tài)性。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的CYP2D6基因第九號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測 方法，其特征在于步驟(b)檢測多態(tài)性時采用的方法包括DNA測序法、雜交 測序法；酶促錯配切割法、異源雙鏈分析法、點雜交法、寡核苷酸陣列法、微 測序法、Taqman技術(shù)、分子信標法，變性高效液相色譜法。
3、 權(quán)利要求1的檢測方法的應用，其特征在于用于評估個體患CYP2D6基 因的第九號外顯子相關(guān)疾病的易感性，用于研究我國人群中CYP2D6基因多態(tài)性 與臨床用藥安全的關(guān)系，用于新藥的研究開發(fā)。
4、 一種分離核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO: 1所示的序列，且第 1322位為A。
5、 一種等位基因特異性的核酸引物，其特征在于，其長度為15-50bp，且 特異性地雜交并擴增出含人CYP2D6基因的第九號外顯子的SEQ ID NO: 1所示 序列的第1322位的單核苷酸多態(tài)性的擴增產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種CYP2D6基因第九號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，同時涉及一種分離核酸、一種等位基因特異性的核酸引物。方法包括確定在人CYP2D6基因第九號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第1322位的核苷酸；檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性；一種分離核酸，具有SEQ ID NO1所示的序列，且第1322位為A；一種等位基因特異性的核酸引物，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并擴增出含人CYP2D6基因的第九號外顯子的SEQ IDNO1所示序列的第1322位的單核苷酸多態(tài)性的擴增產(chǎn)物。本發(fā)明可用于研究我國人群中CYP2D6基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關(guān)系，為新藥研發(fā)提供指導依據(jù)。
文檔編號C07H21/00GK101109018SQ20071004172
公開日2008年1月23日 申請日期2007年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月7日
發(fā)明者唐吉敏, 陸 沈, 秦勝營, 林 賀 申請人:上海交通大學