專利名稱：測定糜蛋白酶或胰蛋白酶或彈性蛋白酶或胃蛋白酶活力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定蛋白酶活力的方法，具體地說是一種測定糜蛋白酶或胰蛋白酶或彈性蛋 白酶或胃蛋白酶活力的催化共振散射光譜法。
背景技術(shù)：
糜蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶主要提取于動物胰臟，胃蛋白酶存在于胃液中。這4 種酶的制劑片劑、膠囊、注射用凍干粉、顆粒沖劑等在臨床醫(yī)學領(lǐng)域廣泛應用。糜蛋白酶是一種肽鏈內(nèi)切酶，專一水解羧端芳香族氨基酸(酪氨酸、色氨酸、亮氨酸)或側(cè) 鍵大體積疏水性殘基甲硫氨酸等5它可以分解炎癥部位纖維蛋白的凝結(jié)物，促進血凝塊、膿性 分泌物及壞死組織的溶化分解,從而凈化創(chuàng)面，使肉芽組織新生,促進傷口愈合等，在治療鼻黏 膜糜爛、痤瘡、潰瘍性直腸炎、胃石、甲狀腺瘤、重癥肺炎、結(jié)核性膿胸等疾病中有一定作 用。據(jù)報道,該酶在眼科、皮膚科中的臨床應用已被肯定。胰蛋白酶作用與糜蛋白酶類似，主要有消化食物、消炎等作用，對消化道疾病、肝炎、 膽囊炎等有較好的治療效果。此外，直接注射胰蛋白酶還可作為毒蛇咬傷的急救手段。糜蛋 白酶-胰蛋白酶聯(lián)用處理燒傷皮膚有良好的效果。彈性蛋白酶可以水解不溶性彈性硬蛋白，臨床上主要用于防治II型和IV型高血脂癥、動 脈粥樣硬化、脂肪肝等。其濃度還可以作為臨床診斷的指標，如過敏鼻炎、遺傳的過敏性支 氣管炎、皮炎患者血漿中的彈性蛋白酶含量明顯高于正常人。胃蛋白酶目前主要作為助消化類藥物應用。目前，這4種動物蛋白酶活'力的測定方法主要有紫外分光光度法、渾濁度法、比色法、 熒光法、酶聯(lián)法、免疫法、氣壓法、電分析法等。紫外分光光度法所需儀器簡單,操作簡單， 但靈敏度低，重現(xiàn)性差。用對苯甲磺酰基精氨酸甲酯做底物，水解釋放出對苯甲磺酰基精氨酸與NaOH反應使得pH值降低，用苯酚紅做指示劑，采用比色法測定胰蛋白酶的線性范圍 為0.00535 1.605 U/mL。該法操作簡單，但由于在實驗條件下酶自身帶正電而消耗部分 NaOH，所以精確度不高，結(jié)果往往不夠準確。用熒光素標記牛血清白蛋白做底物可檢測到 0.35嗎ml—1的胰蛋白酶。用辣根過氧化物酶標記紅桂木凝集素,通過夾心酶聯(lián)法能檢測到胃蛋 白酶的范圍為0.05ng/mL 3.5yg/mL。此法成本高且步驟煩瑣，不易操作。免疫法的靈敏度 較高，有報導用免疫法能檢測到0.9 ng/mL的彈性蛋白酶，但其成本也高，所需試劑要求較 高，且需要一定的操作技術(shù)。因此，建立簡便、靈敏、試劑易得的酶活力的分析方法具有重要的意義。通過檢索，未見糜蛋a酶等酶活力的催化共振散射光譜法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是要為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，而公開一種操作簡便、快速、且靈敏度高、 成本低的測定糜蛋白酶或胰蛋白酶或彈性蛋白酶或胃蛋白酶活力的催化共振散射光譜法。 本發(fā)明利用共振散射光譜技術(shù)的靈敏性和酶催化的專一性將酶催化反應與共振散射光譜結(jié)合，以酪蛋白為底物，分別加入各酶催化，用三氯乙酸(TCA)終止酶催化反應并與剩余底 物相互作用形成締合微粒使得共振散射強度急劇加強，由于通過實驗證實糜蛋白酶、胰蛋白 酶、彈性蛋白酶及胃蛋白酶體系均在470nm處有最強共振散射峰，且共振散射強度在一定范 圍內(nèi)各酶濃度均呈線性關(guān)系，據(jù)此建立了一個靈敏度高、選擇性好的測定糜蛋白酶、胰蛋白 酶、彈性蛋白酶及胃蛋白酶活力的共振散射光譜法。一種測定糜蛋白酶或胰蛋白酶或彈性蛋白酶或胃蛋白酶活力的催化共振散射光譜法包括 如下步驟一、 用己知酶活力單位的各酶制備測試體系，并測定各酶體系的散射光強度I;1. 在各具塞刻度試管中，依次加入0.09 0.10 mg/mL酪蛋白置于50'C水浴鍋中預熱10 min，取出分別加入適量上述各蛋白酶，用對應的緩沖液(其中胰蛋白酶或糜蛋白酶或彈性蛋 白酶分別用pH 8.0、 7.5、 8.0的0.2 mol/LNa2HP04- KH2P04緩沖液，胃蛋白酶用0.1 mol/LpH 1.65甘氨酸-NaCI-HCl緩沖液)稀釋至一定體積，搖勻并立即開始計時放回水浴鍋中反應， 其中糜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶溫育60 65 min，彈性蛋白酶溫育30 35 min;2. 反應時間到后，取出分別依次加入0.5 0.6mol/LTCA，用二次蒸餾水定容至5.0mL， 搖勻，放置10 30min;3. 用熒光分光光度計同步掃描激發(fā)和發(fā)射波長(A em—入ex=0 nm)得到體系的RSS光譜。 在360 nm或400 nm或420 nm或470 nm或520 nm處測定體系的散射光強度I;二、 用步驟一的方法制備上述各酶的試劑空白體系，并測定各酶的試劑空白Io;三、 計算各酶的A卜I一Io;四、 以加入的酶的濃度C為橫坐標，AI為縱坐標，繪制各酶工作曲線；五、 用步驟一的方法制備檢測體系，其中加入的是未知濃度的待測樣品，測定各樣品的△I;六、 根據(jù)工作曲線，即可求得某檢測樣品中待測酶在一定線性范圍內(nèi)的濃度。 步驟一所述的具塞刻度試管依次加入的酪蛋白最佳濃度為O.IO mg/mL，用對應的緩沖溶液稀釋至5.0mL，最佳溫育時間糜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶為60min，彈性蛋白酶為30 min;所述的TCA的最佳濃度為0.5 mol/L;定容體積為5.0 mL，搖勻，最佳放置時間為10 min; 所述的同步共振散射最佳測定波長為470 nm。本方法的原理是酪蛋白、蛋白酶的水溶性好，與水之間的界面不明晰，故其共振散射 強度Irs很弱。當溶液中的pH值小于酪蛋白的等電點(pl=4.6),酪蛋白肽鏈上的氨基酸殘基 C-末端質(zhì)子化而使該蛋白質(zhì)帶正龜荷。三氯乙酸(TCA)中羧基帶負電荷，通過靜電引力形 成疏水性的酪蛋白一TCAn締合物。酪蛋白一TCAn締合物之間存在較強的疏水作用力、范德 華力和氫鍵，可進一步聚集形成平均粒徑較大的(酪蛋白-TCAnV締合微粒，粒徑增大且有明 晰的固液界面，故體系的lRs顯著增強(圖l),其平均粒徑為1740nm (圖2， a)。在一定條件下，痕量蛋白酶強烈催化水解酪蛋白生成小分子多肽和氨基酸。加入TCA后，TCA既可 中止酶催化反應，又作為酪蛋白的共振散射光測量試劑。隨著蛋白酶量的增加，剩余酪蛋白 減少，體系的Ins線性降低，微粒的粒徑也有所降低(圖2， b、 c、 d)。酶的含量即可由酶活 力濃度——共振散射校正值曲線算出?；诖耍⒘艘环N測定動物蛋白酶活力的RSS新方法。本發(fā)明的優(yōu)點是-(1) 設備簡單、操作方便，只需要熒光分光光度計即可完成；(2) 所用試劑酪蛋白，緩沖溶液容易獲得，成本低廉，無毒環(huán)保；(3) 本發(fā)明方法將酶催化反應與共振散射光譜結(jié)合起來，分析靈敏度高，選擇性好，由 表1可見，糜蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶及胃蛋白酶活力檢出限分別為0.00115 U/mL、 0.000839 U/mL、 0.000156 U/ml^、 0.000557 U/mL,由表2可見,一些常見的氨基酸、維生素 和部分離子對反應的測定干擾不大。(4) 操作簡便，普通實驗室分析人員在實驗室即可實現(xiàn)。


圖1為本發(fā)明檢測方法原理圖；圖2為本發(fā)明糜蛋白酶-酪蛋白-TCA體系的締合微粒的粒徑分布圖； 其中a: pH7. 5， 0.1 mg/mL酪蛋白-O. 5 mol/L TCA; b: pH7. 5， a-O. 024 U/mL糜蛋白酶; c: pH7. 5， a-0. 045 U/mL糜蛋白酶;d: pH7. 5, a-O. 06 U/mL糜蛋白酶。 圖3為本發(fā)明糜蛋白酶-酪蛋白-TCA體系的共振散射光譜； 其中a: pH7. 5，0. 1 mg/mL酪蛋白-0. 5mol/LTCA; b: a-0. 024U/mL糜蛋白酶；c:a-O. 045 U/mL糜蛋白酶；d: a-0. 06 U/mL糜蛋白酶；e:pH7.5,0. 1 mg/mL酪蛋白，低靈敏度擋；縱 坐標=2。圖4為本發(fā)明實施例樣品測定結(jié)果與分光光度法測定結(jié)果的回歸分析圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的闡述 實施例試劑40U/mg胰蛋白酶(中國科學院新疆理化所)，其酶活力單位定義為在pH7.5，40 。C反應30分鐘條件下,每分鐘水解酪蛋白生成三氯醋酸不沉淀物(肽及氨基酸等)在275 mn 波長處與lumol/L酪氨酸相當?shù)拿噶浚瑸?個活力單位。1500'U/mg糜蛋白酶(上海阿敏 生物技術(shù)公司)，其酶活力單位定義為25。C時，糜蛋白酶水解N—乙酰一L一酪氨酸乙酯， 采用連續(xù)讀數(shù)法，吸收度每分鐘改變0.0075，即相當于l個糜蛋白酶單位。30U/mg胃蛋白 酶(北京麒麟宏偉科技有限公司)，其酶活力單位定義為在指定條件下，以血紅蛋白為底物， 37i:反應10分鐘，每分鐘能催化水解血紅蛋白生成1 Pmol酪氨酸的酶量，為一個蛋白酶 活力單位。40U/rag彈性蛋白酶(上海阿敏生物技術(shù)有限公司)，其酶活力單位定義為在指定條件下，每20分鐘水解剛果紅彈性蛋白1 mg所需酶量定義為l個彈性酶活力單位。注射 用糜蛋白酶(4000 U/瓶，上海第一生化藥業(yè)有限公司)，三氯乙酸，0.2 mol/L Na2HP04-NaH2P04緩沖液，0.1 mol/L甘氨酸-NaCl-HCl緩沖液。10mg/mL酪蛋白溶液取酪蛋白1.0g,加0.05rnol/LNa2HPO4溶液50mL，置沸水浴中加熱 30min，攪拌，取出冷至室溫，用0.05moI/L檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5土0.1，同時迅速攪拌， 以防止酪蛋白沉淀，用水定容至100mL (臨用新配)。酶液分別準確稱取10.0 mg各種蛋白酶，胰蛋白酶或糜蛋白酶或彈性蛋白酶分別用pH 8.0、 7.5 、 8.0 0.2 mol/L Na2HP04- KH2P04緩沖液溶解，胃蛋白酶用0.1 mol/L pH 1.65甘氨酸 -NaCl-HCl緩沖液溶解，然后定容至50mL制成0.2mg/mL儲備液，臨用時用對應緩沖液稀 釋至所需濃度。所用試劑為分析純，所用水均為二次蒸餾水。測定上述各酶活力的方法，步驟為一、 制備己知酶活力單位的各酶的測試體系1、 在各5mL具塞比色管中，分別依次加入0.50mL1.0mg/mL酪蛋白置5(TC水浴鍋(紹 興縣醫(yī)療器械廠)中預熱lOmin，取出分別加入適量各蛋白酶，用對應的緩沖液稀釋至1.0 mL， 搖勻并立即開始計時放回水浴鍋中反應，其中糜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶溫育60min, 彈性蛋白酶溫育30min;2、 取出后依次加入1.0 mL2.5 mol/LTCA，用二次蒸餾水定容至5.0mL，搖勻，放置10 min;3、 用RF-540型熒光分光光度計(日本島津公司)同步掃描激發(fā)和發(fā)射波長(A em- A ex=0 nm)得到體系的RSS光譜。在470 nm處測定體系的散射光強度I47Gnm;二、 依據(jù)步驟一的方法制備各酶的試劑空白體系求得試劑空白I(j;三、 計算AI 470nm =丄470腦 -Io值；四、 以加入的酶的濃度c為橫坐標，AI為縱坐標，繪制工作曲線；五、 依據(jù)步驟一的方法，制備各酶的檢測體系測定各酶的AI;六、 根據(jù)工作曲線，求得各酶的活力，見表l;本發(fā)明實施例共存物質(zhì)對糜蛋白酶測定 體系的影響見表2。為了證明本發(fā)明方法的可靠性，我們還特地用注射用糜蛋白酶凍干粉為樣品檢驗試劑， 用本發(fā)明方法與分光光度法分別多次測定，并與廠家標出的活力單位的相對比；用I.OmLpH 7.5 0.2 mol/L Na2HP04- NaH2P04緩沖液溶解注射用糜蛋白酶凍干粉,再用此緩沖液稀釋2000 倍，按本發(fā)明方法，根據(jù)工作曲線，測定溶液中糜蛋白酶活力，同時參考文獻(Vandermeers A.， Vandermeers-Piret M. C., Rath J., Christophe J. Simple automated spectrophotometric method for assay of trypsin and chymotrypsin in duodenal juice [J]. Clin Chem.1972,18(12): 1514-1517.)用分 光光度法進行測定，測定結(jié)果以每瓶內(nèi)凍干粉總活力表示，結(jié)果見表3。兩種方法的回歸分 析結(jié)果(圖4)表明，兩種方法所測結(jié)果基本一致；且與出廠所標示活力也基本一致(4000U)。參照圖3，圖3中的e表明，沒有TCA存在時，因酪蛋白水溶性好，其界面不清晰，故 其共振散射信號均很微弱。圖3中的a表明酪蛋白-蛋白酶體系的共振散射信號亦很微弱。酪 蛋白可與TCA反應形成白色締合物微粒，體系存在明顯的固液界面，故其共振散射信號顯著 增強。圖3中的b、 c、 d表明糜蛋白酶-酪蛋白-TCA微粒體系的共振散射光譜輪廓與酪蛋白 陽TCA微粒體系的相似，均在360nm、 400 nm、 420 nm、 470 nm、 520 nm處產(chǎn)生5個共振散 射峰，最強峰均位于470nm處。故本方法的最佳共振散射測定波長為470 nm。以酶活力濃 度為橫坐標，對應的Al470皿為縱坐標繪制標準曲線。表l檢測體系回歸方程 U/mL線性范圍相關(guān)系數(shù)檢出限(3o/K) U/mL胰蛋白酶△ =702.98C士3. 820.00024-0. 04 U/mL (6-1000 ng/mL)0.99770.000839糜蛋白酶Al條f576. 53C+4. 580. 0012 0. 06 U/mL 0.8-40 ng/mL)0.99570.00115彈性蛋白酶△ I47。 =4908. 4C+5. 870. 0002 0. 006 U/mL (5-150 ng/mL0. 99740.000156胃蛋白酶△ :U =1059C+7. 670.0006-0. 024 U/mL (0. 02-0. 8 li g/mL)0.99820.000557表2共存物質(zhì)允許量 相對誤差共存物質(zhì)允許量相對誤差(ug/mL ) (%) (ug/mL ) (%)L-賴氨酸183. 5L-谷氨酸3-4.9DL-甲硫氨酸68.5煙酸301. 2天冬氨酸127.4L-胱氨酸44.4甘氨酸183.5L-酪氨酸605.9DL-色氨酸205.4L-精氨酸4-3. 2葉酸16,5維生素K387.2維生素C8一4. 7維生素Bfi 100 6.9維生素B, 20 5.3維生素B2 4 -2.8Mg2+， CI— 36 -4.3Na', I03— 23 7.5Ca2 CV 4.4 7.3Mg2+， SO/ 754 2.3o o oo o o 2A A萄糖素m M葡庶尿<formula>formula see original document page 8</formula>
權(quán)利要求
1、測定糜蛋白酶或胰蛋白酶或彈性蛋白酶或胃蛋白酶活力的催化共振散射光譜法，其特征是檢測方法包括如下步驟(1)制備已知酶活力單位的各酶的測試體系①具塞刻度試管中，依次加入0.09～0.10mg/mL酪蛋白置于50℃水浴鍋中預熱10min，取出加入適量上述各蛋白酶，用對應的緩沖液(其中胰蛋白酶或糜蛋白酶或彈性蛋白酶分別用pH 8.0、7.5、8.0的0.2mol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖液，胃蛋白酶用0.1mol/L pH 1.65甘氨酸-NaCl-HCl緩沖液)稀釋至一定體積，搖勻并立即開始計時放回水浴鍋中反應，其中糜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶溫育60～65min，彈性蛋白酶溫育30～35min；②反應時間到后，取出依次加入0.5～0.6mol/LTCA，用二次蒸餾水定容至5.0mL，搖勻，放置10～30min；③用熒光分光光度計同步掃描激發(fā)和發(fā)射波長(λem-λex＝0nm)得到體系的RSS光譜，在360nm或400nm或420nm或470nm或520nm處測定體系的散射光強度I；(2)用步驟一的方法制備上述各酶的試劑空白體系，并測定各酶的試劑空白IO；(3)計算各酶的ΔI＝I-IO；(4)以加入的酶的濃度c為橫坐標，ΔI為縱坐標，繪制各酶工作曲線；(5)用步驟一的方法制備檢測體系，其中加入的是未知濃度的待測樣品，測定各樣品的ΔI；(6)根據(jù)工作曲線，即可求得某檢測樣品中待測酶在一定線性范圍內(nèi)的濃度。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征是所述的加入的酪蛋白的最佳濃度為0.1mg/ml，用對應的緩沖溶液稀釋至5.0ml，溫育的最佳時間糜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶 為60min，彈性蛋白酶為30min。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的測定方法，其特征是所述的TCA的最佳濃度為0.5 mol/L， 定容體積為5ml，最佳放置時間為10min。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征是所述的同步共振散射，最佳測定波長 為470nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定糜蛋白酶或胰蛋白酶或彈性蛋白酶或胃蛋白酶活力的方法，本發(fā)明以酪蛋白為底物，分別加入各酶催化，用三氯乙酸終止酶催化反應并與剩余底物相互作用形成締合微粒使得共振散射強度急劇加強，據(jù)此建立了一個測定糜蛋白酶或胰蛋白酶或彈性蛋白酶或胃蛋白酶活力的方法，酶活力濃度——共振散射校正值曲線算出。本發(fā)明的優(yōu)點在于與現(xiàn)有的方法相比，本方法將酶催化反應與共振散射光譜結(jié)合起來，分析靈敏度高，選擇性好，檢測限低，操作簡便，并且所用試劑無毒安全。
文檔編號G01N21/65GK101226150SQ200810073469
公開日2008年7月23日 申請日期2008年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月4日
發(fā)明者廖獻就, 李紀順, 溫桂清, 蔣治良, 黃國霞 申請人:廣西師范大學