專利名稱：：一種新的復(fù)方頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉的檢測方法一種新的復(fù)方頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉的檢測方法
背景技術(shù)：
：頭孢噻肟鈉(cefotaximesodium,CTX)是1977年德國赫司特公司研制開發(fā)的第一個三代頭孢菌素，用于治療多種革蘭氏陽性菌和陰性菌所致的感染性疾病，具有抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，組織分布少，低毒等特點(diǎn)。該產(chǎn)品上市近30年，在全世界多個國家與地區(qū)使用，受到廣泛好評，至今仍是臨床一線用藥。由于大量和廣泛的臨床應(yīng)用，甚至近年來濫用的出現(xiàn)，臨床上產(chǎn)生了耐頭孢噻肟的耐藥菌。這類耐藥菌大多數(shù)是通過產(chǎn)e-內(nèi)酰胺酶降解頭孢噻肟起作用的，這樣降低了頭孢噻肟鈉的抗菌活性。針對這種情況開發(fā)的P-內(nèi)酰胺酶抑制劑與抗生素合用后可有效抑制細(xì)菌的耐藥性，恢復(fù)抗生素的活性，因此，采用"抗生素+P-內(nèi)酰胺酶抑制劑"的復(fù)方組合能有效地抑制了產(chǎn)酶菌的耐藥問題。由這種思路開發(fā)的復(fù)方制劑如"阿莫西林克拉維酸"、"頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉"、"哌拉西林鈉舒巴坦鈉"等在臨床上獲得了很大的成功。以頭孢噻肟鈉為主藥的復(fù)方抗生素"頭孢噻肟鈉"加上"舒巴坦鈉"的組合包裝在臨床上也有使用，并且獲得很好的效果(朱培成，1999;李復(fù)雄等，2004)。這樣的組合使用在臨床上已被證明是安全、有效的。但從制劑的角度來看，因?yàn)轭^孢噻肟鈉含有一定水分，而舒巴坦鈉遇水降解，不穩(wěn)定，如果簡單的將兩者混合到一起，則無法解決產(chǎn)品的穩(wěn)定性問題，須在制劑工藝上解決產(chǎn)品的穩(wěn)定性問題。同時由于之前沒有復(fù)方制劑，均是單一成分做檢測，兩者混合后的復(fù)方檢驗(yàn)需要建立新的檢測方法，這樣的檢測方法能夠檢測出復(fù)方中單一成分的含量和有關(guān)雜質(zhì)，同時，這一檢測方法對單一成分的測定還不能受到另一成分的影響，而且能夠達(dá)到專屬靈敏、簡便操作等要求，并能夠在制劑工廠以及各地檢測機(jī)構(gòu)或醫(yī)院對產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行檢査，針對這樣的要求我們建立了一個新的檢測復(fù)方頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉的方法。
發(fā)明內(nèi)容我們采用在工廠、藥品檢驗(yàn)所、醫(yī)院等常見的高效液相色譜法(HPLC)通過優(yōu)化流動相、流速、檢測波長等指標(biāo)，建立了一種新的檢測方法，這種方法可以檢測復(fù)方頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉中兩種單一成分的含量和有關(guān)物質(zhì)，而不會出現(xiàn)兩種成分相互影響與干擾，該方法簡便易行、操作步驟少，方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、線性范圍大、重復(fù)性好等，可用于復(fù)方制劑和原料的常規(guī)檢測。專利實(shí)例-實(shí)施例一、復(fù)方原料與制劑的初步檢測實(shí)驗(yàn)采用"注射用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉"，比例為2:1，規(guī)格為1.5g，因其他配比和規(guī)格在制劑上簡單的裝量變化，其原料來源、制備工藝均無顯著差異。故用該配比、規(guī)格樣品進(jìn)行研究。試驗(yàn)樣品為白色、類白色或微黃白色粉末，進(jìn)行以下各種試驗(yàn)。1、鑒別試驗(yàn)兩種組分舒巴坦和頭孢噻肟均以鈉鹽形式存在，灼燒時應(yīng)呈現(xiàn)鈉鹽的火焰反應(yīng)。取鉑絲，用鹽酸濕潤后，蘸取本品，在無色的火焰中燃燒，火焰即顯鮮黃色。兩種組分舒巴坦鈉和頭孢噻肟鈉極性不同，可通過HPLC法進(jìn)行分離，并用對照品進(jìn)行對照鑒別。取本品和舒巴坦和頭孢噻肟的標(biāo)準(zhǔn)品，分別用流動相制成每lml含0.5mg頭孢噻肟鈉和0.25mg舒巴坦鈉的溶液，按照本專利以下描述的含量測定項(xiàng)下高效液相色譜法試驗(yàn)，結(jié)果供試品峰與對照品峰一致。(試驗(yàn)方法見實(shí)施例二、三)2、檢測試驗(yàn)試驗(yàn)樣品酸度檢査取試驗(yàn)樣品加注射用水制成每ml含150mg的溶液，用酸度計測定，結(jié)果試驗(yàn)樣品的pH在4.5—5.5之間，為合格產(chǎn)品。試驗(yàn)樣品溶液澄清度檢查取試驗(yàn)樣品5瓶，分別加水制成每lml中約含本品O.lg的溶液，與1號濁度標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比較，檢查澄清度。結(jié)果試驗(yàn)樣品為澄明液體，未超過l號濁度標(biāo)準(zhǔn)液，澄清度符合相關(guān)規(guī)定，為合格樣品。試驗(yàn)樣品溶液顏色檢査取試驗(yàn)樣品5瓶，加水溶解，置于25ml的納氏比色管中，加水稀釋至10ml，與黃色色調(diào)標(biāo)準(zhǔn)比色液比較。結(jié)果試驗(yàn)樣品為澄明液體，顏色不深于5號黃色標(biāo)準(zhǔn)比色液，符合相關(guān)規(guī)定，為合格樣品。試驗(yàn)樣品澄明度檢査取試驗(yàn)樣品本品五瓶，每瓶用注射針注入4ml注射用水使溶解后，照澄明度檢査細(xì)則和判斷標(biāo)準(zhǔn)操作，檢査澄明度。結(jié)果試驗(yàn)樣品溶液為澄明液體，毛、點(diǎn)總數(shù)未超過5個，其中色點(diǎn)數(shù)未超過3個，符合澄明度檢査細(xì)則和判斷標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，為合格樣品。試驗(yàn)樣品水分檢查取試驗(yàn)樣品lg，按水分檢測法測定，結(jié)果試驗(yàn)樣品水分含量均在2%左右符合標(biāo)準(zhǔn)，為合格樣品。由于該制劑是由無菌原料直接分裝的，所以，原料與制劑的成分、含量上完全一樣，沒有差別。采用本專利的檢測方法對原料進(jìn)行的檢測，得到與制劑相同的結(jié)果。實(shí)施例二、復(fù)方原料與制劑的分析和質(zhì)量控制方法為控制產(chǎn)品的質(zhì)量，必須對產(chǎn)品中的有可能出現(xiàn)的雜質(zhì)進(jìn)行分析研究。之前由于沒有將兩個物質(zhì)混合在一起使用的經(jīng)驗(yàn)，所以現(xiàn)有的資料也只有對單一頭孢噻肟鈉(或舒巴坦鈉)中有關(guān)雜質(zhì)的檢驗(yàn)方法。這樣的檢驗(yàn)方法雖然是對單一物質(zhì)檢驗(yàn)有效，但是否能夠檢驗(yàn)混合物中的有關(guān)雜質(zhì)還不清楚，因?yàn)橹苽涑苫旌现苿┮院髢煞N主要成分是否會相互影響對方的檢測，兩種雜質(zhì)是否也會影響對方的檢測有很多不確定因素，需要進(jìn)行大量的試驗(yàn)來驗(yàn)證。所以，我們根據(jù)頭孢噻肟鈉、舒巴坦鈉單一物質(zhì)檢測方法，建立了相應(yīng)的對復(fù)方物質(zhì)中雜質(zhì)的檢測方法。1、有關(guān)雜質(zhì)物質(zhì)檢測由于HPLC方法已經(jīng)能夠很好地用于單一的兩種成分檢測，因此我們采用HPLC方法建立復(fù)方的雜質(zhì)檢測方法。試驗(yàn)首先進(jìn)行破壞性試驗(yàn)，按照藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)指南分別進(jìn)行了1)堿破壞分別取頭孢噻肟鈉、舒巴坦鈉約25mg，以及樣品用O.lmol/L的Na0H溶液20ml溶解，室溫放置6小時。2)、然后采用酸破壞分別取頭孢噻肟鈉約25mg、舒巴坦鈉約12mg，以及樣品用0.1mol/L的鹽酸溶液20ml溶解，室溫放置6小時。3)、再采用氧化降解:分別取頭孢噻肟鈉約50mg、舒巴坦鈉約25mg，以及樣品用30%H20220ml溶解，置室溫6小時。取經(jīng)過上述三種破壞性試驗(yàn)的溶液精密量取5ml，置25ml量瓶中，用流動相(配方見后)稀釋至刻度，在下述色譜條件下測試，檢測舒巴坦鈉、頭孢噻肟鈉是否有明顯降解，以降解產(chǎn)物峰與主峰分離>2.0，頭孢噻肟鈉降解產(chǎn)物與舒巴坦鈉主峰分離度>1.5為合格標(biāo)準(zhǔn)的判斷指標(biāo)。我們首先采用如下的色譜條件進(jìn)行篩選最佳的檢測方法色譜條件(l):試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測器；色譜柱UltimateXB-NH2正相分析柱；規(guī)格5um，4.6*50mm;流動相正己垸-氯仿溶液(2:1);檢測波長220nm—260nm;流速0.13ml/min;進(jìn)樣量1030ul。色譜條件(2):試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測器，色譜柱采用Hypersil0DS2250X4.6mm，流動相采用0.00125mol/L四丁基氫氧化銨(磷酸調(diào)節(jié)pH至5.0-5.4):乙月青=75-90:25-10，流速0.13.Oml/min，檢測波長采用210-230nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10-30ul。色譜條件(3):試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測器，色譜柱采用Hypersil0DS2250X4.6ram，流動相采用0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液-甲醇(7089:30~11)，流速0.廣3.Oml/min，檢測波長采用210-230nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10-30ul。色譜條件(4):試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測器，色譜柱采用Hypersil0DS2250X4.6mm，流動相采用0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈(6590:4510)，流速0.13.Oml/min，檢測波長采用210-230nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10-30P1。采用上述方法檢測發(fā)現(xiàn)，色譜條件(1)、(3)、(4)雖然也可以用于檢測但兩者的分離度都小于1.0，兩組分都分不開，而色譜條件(2)的分離度較好，但還需優(yōu)化。經(jīng)過三種破壞性試驗(yàn)的樣品在色譜條件(2)試驗(yàn)條件下舒巴坦鈉、頭孢噻肟鈉均無明顯降解，頭孢噻肟鈉雜質(zhì)峰與舒巴坦鈉主峰分離度M.5。哪是不是方法學(xué)不夠靈敏沒檢測出雜質(zhì)？還是本身就沒有出現(xiàn)雜質(zhì)？對此，我們首先采用LC-MS對樣品進(jìn)行了檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過上述三種破壞試驗(yàn)的樣品，在LC-MC檢測條件下也沒有發(fā)現(xiàn)有雜質(zhì)出現(xiàn)，說明本檢驗(yàn)方法是可靠。更進(jìn)一步，我們采用極端手段將上述的破壞條件增強(qiáng)2-10倍，用LC-MS首先檢測以保證出現(xiàn)雜質(zhì)，觀察本試驗(yàn)條件是否可以檢測出來。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用更強(qiáng)烈的破壞條件后，頭孢噻肟鈉和舒巴坦鈉均在不同程度上出現(xiàn)了降解，這樣的降解在3倍強(qiáng)化的酸破壞的條件下剛剛出現(xiàn)，雜質(zhì)量很低，用LC-MS可以檢測到雜質(zhì)的出現(xiàn)，更強(qiáng)烈破壞條件可以產(chǎn)生更多的雜質(zhì)。我們采用上述建立的檢測方法，對于3倍強(qiáng)化的酸破壞的條件下剛剛出現(xiàn)雜質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果該方法可以發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)的出現(xiàn)。我們以"3倍強(qiáng)化的酸破壞的條件下剛剛出現(xiàn)雜質(zhì)的溶液"作為檢測對象，對我們建立的HPLC檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化，最后確定了以下方法作為最佳鑒定方法色譜條件試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測器，色譜柱采用Hypersil0DS2250X4.6mm，流動相采用0.00125mol/L四丁基氫氧化銨(磷酸調(diào)節(jié)pH至5.0):乙腈=82.5:17.5，流速1.Oml/min，檢測波長采用230nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10ul。我們以上述檢驗(yàn)方法，對檢驗(yàn)樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果如下-樣品溶液制備取本品適量，精密稱定，用流動相溶解制成每lml中含頭孢噻肟鈉0.5mg和舒巴坦鈉0.25mg的溶液，作為供試品溶液。精密量取0.33ml至10ml量瓶，用流動相稀釋至刻度，作為對照溶液。取對照溶液10ixl注入液相色譜儀，調(diào)整儀器靈敏度，使頭孢噻肟峰高度約為記錄儀滿量程的10~25%;再精密量取上述兩種溶液各IOul分別進(jìn)樣，記錄供試液色譜圖至頭孢噻肟主成分峰保留時間的2倍。供試品溶液的色譜圖中如顯示雜質(zhì)峰，計算各雜質(zhì)峰面積的和，不得大于對照溶液主成分的峰面積。試驗(yàn)檢驗(yàn)了三批生產(chǎn)樣品有關(guān)物質(zhì)檢査結(jié)果均符合規(guī)定。結(jié)果見表1及圖廣3表1有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果批號有關(guān)物質(zhì)(％)結(jié)論wm02012.57符合規(guī)定wm02022.39符合規(guī)定wm02032.62符合規(guī)定2、頭孢噻肟鈉聚合物由于頭孢噻肟鈉還有聚合物產(chǎn)生，如果聚合物含量高會導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生，需要在產(chǎn)品中控制聚合物的含量，按照相關(guān)要求必須對聚合物進(jìn)行檢測。以往，只有在單方頭孢噻肟鈉中進(jìn)行聚合物的檢測，還沒有關(guān)于復(fù)方頭孢噻肟舒巴坦鈉混合后中進(jìn)行聚合物測定的研究報告，是否單方測定的條件可以準(zhǔn)確反應(yīng)復(fù)方中的情況，或者說，復(fù)方混合物是否會影響原來?xiàng)l件的檢測的準(zhǔn)確性，對此，我們也進(jìn)行了研究。我們首先進(jìn)行了頭孢噻肟聚合物色譜條件與測定方法試驗(yàn)。色譜條件采用儀器是Waters515泵加上Waters2487紫外檢測器，色譜柱為葡聚糖凝膠柱(G-10)，流動相A采用磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鈉21.85g，磷酸二氫鈉5.83g，加水1000ml溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0)，流動相B采用0.01%十二烷基硫酸鈉溶液，流速為1.5ml/min，檢測波長為254nm，柱溫采用室溫，進(jìn)樣量采用100ul。對照品溶液取頭孢噻肟鈉對照品約25mg，置250ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。首先進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，以流動相A為流動相，用lmg/ml藍(lán)色葡聚糖2000溶液進(jìn)樣100ix1，理論塔板數(shù)以藍(lán)色葡聚糖2000計算大于700;再以流動相B為流動相，取對照品溶液，反復(fù)進(jìn)樣100yl，頭孢噻肟鈉峰面積值的相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.71%，小于5%。結(jié)果見下表2及圖4~10。表2頭孢噻肟鈉精密度測定結(jié)果1234567A111247280110735224112294448110797664112528264110494696111579720均值RSD1113824710.71%根據(jù)上述結(jié)果表明，原來用于單方中聚合物檢測的方法是可以用于復(fù)方藥物中的頭孢噻肟鈉聚合物的測定的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這樣的情況，我們對于上述方法采用了LC-MS驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用上述方法測定的結(jié)果和LC-MS方法測定的結(jié)果能夠很好的對應(yīng)，說明復(fù)方藥物雖然是混合物，但是這樣的混合物并不影響原來測定聚合物方法的專屬性和靈敏度。依此，我們對試驗(yàn)樣品進(jìn)行了頭孢噻肟聚合物測定取試驗(yàn)樣品約0.2g，精密稱定，置lOml量瓶中，加流動相A溶解并稀釋至刻度，搖勻。立即取100ul注入色譜儀，以流動相A為流動相進(jìn)行測定，記錄色譜圖；另取對照品溶液100yl注入色譜儀，以流動相B為流動相，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算。本品含頭孢噻肟聚合物以頭孢噻肟計不得過1.0%為合格作為檢測指標(biāo)，結(jié)果三批樣品的頭孢噻肟聚合物含量均符合規(guī)定。結(jié)果見表3及圖1廣15。表3頭孢噻肟聚合物檢查結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例三、用于該復(fù)方制劑的新檢測方法的建立和制劑含量測定驗(yàn)證為控制產(chǎn)品的質(zhì)量，對復(fù)方制劑中兩個主要成分的含量控制是個重要指標(biāo)，對于單一頭孢噻肟鈉、舒巴坦鈉兩種含量檢測已經(jīng)有比較多的研究方法建立，中國藥典也有指定的方法。但是，在制備成混合物后，是否這樣的方法仍然能夠用于混合物中成分的檢測？或者說，混合物中兩個物質(zhì)是否會相互影響對方的檢測？這樣的問題尚無人進(jìn)行研究，其中還有很多不確定因素需要面對和解釋。對此，我們對于如何開展復(fù)方制劑中兩種成分的含量進(jìn)行檢測方法進(jìn)行了研究。由于HPLC方法已經(jīng)能夠很好地用于單一的兩種成分檢測，同時HPLC方法也是中國藥典推薦的方法，因此，我們采用HPLC方法建立復(fù)方的兩個成分含量的檢測方法。色譜條件選用儀器Waters515泵和Waters2487紫外檢測器，試驗(yàn)采用色譜柱為Hypersil0DS2250X4.6,，5um;流動相0.00125mol/L四丁基氫氧化銨溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH至5.0)-乙腈(82.5:17.5)，流速為1.Oml/min，檢測波長為230nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10yl。流動相的選擇和優(yōu)化本品為復(fù)方制劑，流動相的選擇主要考慮兩主峰的出峰時間，分離效果以及主峰與雜質(zhì)峰的分離情況，選用磷酸二氫鉀溶液-甲醇為流動相及磷酸二氫鉀溶液-乙腈為流動相測定時，兩組份的分離度太小，而且頭孢噻后鈉的保留時間過長，不適于測定。適當(dāng)調(diào)節(jié)流動相組成。為避免頭孢噻肟保留時間過長，采用離子對試劑四丁基氫氧化銨溶液濃度為0.00125mol/L。當(dāng)選擇0.00125M四丁基氫氧化銨溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH至5.0)-乙腈(7580:2520)和(8590:15~10)為流動相時，頭孢噻肟雜質(zhì)峰與舒巴坦主峰和頭孢噻肟主峰分離度不好(R〈1.5)，將流動相組成調(diào)節(jié)為四丁基氫氧化銨溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH至5.0)-乙腈(82.5:17.5)，頭孢噻肟雜質(zhì)峰與舒巴坦主峰和頭孢噻肟主峰分離度均大于1.5，能獲得較佳的分離效果。檢測波長的選擇和優(yōu)化分別將濃度為20Pg/ml的頭孢噻肟鈉，134.4pg/ml的舒巴坦鈉在200300rim范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果舒巴坦鈉和頭孢噻肟鈉在230nm處均有較大吸收，且頭孢噻肟鈉吸收度遠(yuǎn)高于舒巴坦，故選擇230ran作為測定波長。在上述研究的基礎(chǔ)上，我們采用選定的色譜條件首先進(jìn)行了系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，在上述色譜條件下，溶劑峰保留時間約3min，不千擾主成分測定。分別注入舒巴坦、頭孢噻肟對照品以及樣品供試溶液，記錄色譜圖。舒巴坦保留時間13.198min，理論塔板數(shù)為13722;頭孢噻肟保留時間23.685min，理論塔板數(shù)為10027。樣品溶液譜圖中，舒巴坦主峰(13.165min)與雜質(zhì)峰(11.532min,14.565min)分離度，頭孢噻躬主峰(23.665min)與雜質(zhì)峰(20.065min)分離度均大于2.0(見圖1618)。我們進(jìn)一步對檢測方法的線性范圍進(jìn)行了研究精密稱取舒巴坦鈉對照品(批號130483-200102，純度92.0%)42.40mg，頭孢噻肟鈉對照品(批號0430-200002，純度90.6%)80.OOrag，置于50ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度。精密吸取1.00,2.00，3.00，4.00,5.00ml溶液，置于10ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度。各精密吸取10ul進(jìn)樣測定，以峰面積對進(jìn)樣濃度進(jìn)行回歸。結(jié)果表明，舒巴坦鈉在0.078016mg/ml0.39008mg/ml濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系；頭孢噻肟鈉在0.14496mg/ml0.7248mg/ml濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表4，線性圖見圖19~23。表4舒巴坦鈉與頭孢噻肟鈉線性范圍舒巴坦頭孢噻肟C(mg/ml)AC(mg/ml)A10.0780168219800.144961502066620.15603214974210.289922733952230.23404822378350.434884075546040.31206430119930.579845435934850.3900837983010.724867912560回歸A=33341.8+9571387.2CA=1236427+91613972.13C方程(r=0.9995)(r:=0.9998)再進(jìn)一步，我們對這個檢測方法的精密度進(jìn)行了試驗(yàn)，采用舒巴坦鈉濃度為0.19504mg/ml，頭孢噻肟鈉濃度為0.3624mg/ml的對照品溶液，按照前述含量測定方法，進(jìn)樣10"1測定。重復(fù)測定六次，其峰面積值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，舒巴坦鈉為0.63%，頭孢噻肟鈉為0.64%。結(jié)果見表5，色譜圖見圖2429。表5精密度試驗(yàn)結(jié)果1234A舒巴坦AverRSD184499118551211844781183492918391810.63%18215941833671A334411443353219233111432330356703336593833531986Aver3336393RSD0.64%頭孢噻肟我們對這個方法的靈敏度也進(jìn)行了研究，取舒巴坦鈉濃度為1.952ug/ml，頭孢噻肟鈉濃度為3.624ug/ml的對照品溶液，照前述含量測定方法，進(jìn)樣5u1測定。以信號是噪音的3倍所對應(yīng)的樣品量進(jìn)行計算，結(jié)果舒巴坦鈉的檢測靈敏度為1.21ng，頭孢噻肟鈉的檢測靈敏度為0.32ng。我們還對這個檢測方法進(jìn)行了重復(fù)性試驗(yàn)，稱取同一批號的樣品6份，按照前述含量測定方法制備供試液，測定舒巴坦鈉和頭孢噻肟鈉的含量。測得舒巴坦鈉含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.75%，頭孢噻肟鈉含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.88%,結(jié)果見表6，色譜圖見圖3035。表6重復(fù)性試驗(yàn)測定結(jié)果123456均值RSD%舒巴坦(%)29.8229.9929.9529.4229.8630.0529.850.75頭孢噻肟(%)59.3760.5959.9060.6860.6359.9760.190.88我們還進(jìn)行了樣品檢測的回收率試驗(yàn)，精密稱取試驗(yàn)樣品60.08mg,于5(M量瓶，加流動相溶解并稀釋至刻度。精密吸取樣品溶液5ml，于10ral量瓶，分別加入對照品<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>坦鈉和頭孢噻肟鈉的含量。=a"対xf7。wsx麵A對x樣xW樣x標(biāo)不量說明W對對照品的稱樣量，W樣樣品的稱樣量，W裝樣品的平均裝量，A標(biāo)對照品的峰面積，A樣樣品的峰面積，對％:對照品的純度，標(biāo)示量樣品的標(biāo)示量三批樣品含量測定結(jié)果見表8，色譜圖見圖45~50。表8三批樣品含量測定結(jié)果批號舒巴坦％頭孢噻肟％卿0201wm0202wm020399.45100.88100.52100.4199.86100.04由于該制劑是由無菌原料直接分裝的，所以，原料與制劑的成分、含量上完全一樣，沒有差別。采用本專利的檢測方法對原料進(jìn)行的檢測，得到與制劑相同的結(jié)果。實(shí)施例五、新檢測方法對不同配比的復(fù)方制劑的檢測釆用上述實(shí)例建立的檢測方法，我們對不同配比的頭孢噻躬鈉舒巴坦鈉的復(fù)方制劑進(jìn)行了檢測，以觀察這樣的方法是否可以用于不同的配比的復(fù)方制劑的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于頭孢噻肟鈉/舒巴坦鈉20:1，10:1，8:1，6:1,5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:8，1:10,1:20等17個不同配比的樣品的檢測，本專利建立的新方法均能很好的對兩個組成成分進(jìn)行測定，該方法有很好的靈敏度和可靠性。實(shí)施例六、采用該種檢驗(yàn)方法評判為合格制劑的進(jìn)行動物試驗(yàn)的結(jié)果根據(jù)GMP規(guī)范進(jìn)行三批樣品制備，按照本專利實(shí)例一、二、三的方法對三批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，采用上述標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格的制劑樣品進(jìn)行動物試驗(yàn)，檢査通過上述新檢測方法檢驗(yàn)合格的樣品是否能夠符合動物試驗(yàn)的要求。試驗(yàn)樣品首先進(jìn)行無菌檢査。在無菌室內(nèi)進(jìn)行無菌操作，取三批試驗(yàn)樣品各6支，分別加入100ml0.9y。無菌氯化鈉溶液使溶解，搖勻，打開濾器蓋，在火焰旁打開樣品供試液的塞子使瓶口通過火焰，立即倒入濾器中，并閉濾器蓋，打開排液架的閥門，啟動真空泵進(jìn)行減壓抽濾，待干后，用滅菌生理鹽水照上述操作沖洗濾膜3次，每次100ml。打開抽氣瓶排氣管，將過濾器取下，用滅菌鑷子將濾膜取出放入滅菌雙碟中。用滅菌剪刀將濾膜平均分成3份，分別置于各含50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中，其中一份做陽性對照。按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間逐日觀察并記錄是否有菌生長。結(jié)果無細(xì)菌生長，無菌試驗(yàn)符合規(guī)定，為合格產(chǎn)口叫o試驗(yàn)樣品進(jìn)行異常毒性檢査取三批試驗(yàn)樣品，加氯化鈉注射液制成每lml中含0.15g的溶液，取15只小鼠分成三組，每組5只尾靜脈注射同一批號的溶液0.5ral，觀察48小時的內(nèi)無異常反應(yīng)也無死亡，結(jié)果為合格產(chǎn)品。試驗(yàn)樣品進(jìn)行熱原檢查取三批試驗(yàn)樣品，加滅菌注射用水制成每lml中含0.15g的溶液，取9只家兔分成3組，每組3只，測定其正常體溫后15分鐘內(nèi)，劑量按家免體重每lkg注射lml，自耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量并溫?zé)嶂?8"C的供試品溶液，然后每隔30分鐘測量其體溫1次，共測6次，以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔體溫的升高溫度。各兔體溫升高均低于0.6°C，而且每組家兔體溫升高總和低于1.4。C，因此三批樣品可判斷為熱源檢查符合規(guī)定，三批樣品為合格產(chǎn)品。結(jié)果見表9表9:熱原檢査結(jié)果批號家兔體重注射前家兔平均注射后家兔體溫<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2.圖1是wm0201批有關(guān)物質(zhì)檢査圖譜圖3是to0203批有關(guān)物質(zhì)檢查圖譜圖5是頭孢噻肟聚合物精密度2圖圖7是頭孢噻肟聚合物精密度4圖圖9是頭孢噻肟聚合物精密度6圖圖11是頭孢噻肟聚合物測定對照1圖圖13是wm0201批樣品聚合物測定圖圖15是wm0203批樣品聚合物測定圖圖17是頭孢噻肟鈉對照品圖譜圖19是線性試驗(yàn)圖譜圖21是線性試驗(yàn)圖譜3圖2是wm0202批有關(guān)物質(zhì)檢査圖譜圖4是頭孢噻肟聚合物精密度1圖圖6是頭孢噻肟聚合物精密度3圖圖8是頭孢噻肟聚合物精密度5圖圖10是頭孢噻肟聚合物精密度7圖圖12是頭孢噻肟聚合物測定對照2圖圖14是wm0202批樣品聚合物測定圖圖16是舒巴坦對照品圖譜圖18是樣品圖譜圖20是線性試驗(yàn)圖譜2圖22是線性試驗(yàn)圖譜4圖23是線性試驗(yàn)圖譜5圖25精密度試驗(yàn)圖譜2圖27精密度試驗(yàn)圖譜4圖29精密度試驗(yàn)圖譜6圖31重復(fù)性試驗(yàn)圖譜2圖33重復(fù)性試驗(yàn)圖譜4圖35重復(fù)性試驗(yàn)圖譜6圖37回收率試驗(yàn)圖譜2圖39回收率試驗(yàn)圖譜4圖41回收率試驗(yàn)圖譜6圖43回收率試驗(yàn)圖譜8圖45是wm0201批含量測定圖譜1圖47是wm0202批含量測定圖譜1圖49是wm0203批含量測定圖譜1圖24是精密度試驗(yàn)圖譜1圖26精密度試驗(yàn)圖譜3圖28精密度試驗(yàn)圖譜5圖30重復(fù)性試驗(yàn)圖譜1圖32重復(fù)性試驗(yàn)圖譜3圖34重復(fù)性試驗(yàn)圖譜5圖36回收率試驗(yàn)圖譜1圖38回收率試驗(yàn)圖譜3圖40回收率試驗(yàn)圖譜5圖42回收率試驗(yàn)圖譜7圖44回收率試驗(yàn)圖譜9圖46是wm0201批含量測定圖譜2圖48是win0202批含量測定圖譜2圖50是wra0203批含量測定圖譜權(quán)利要求1、一種新的用于頭孢噻肟鈉與舒巴坦鈉復(fù)方原料和制劑的檢測方法。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法采用高效液相色譜法，所采用的流動相可以是正已烷，氯仿，二氯甲烷，四丁基氫氧化胺、乙腈、磷酸二氫鉀、甲醇、水等，其中優(yōu)選的采用四丁基氫氧化胺和乙腈。3、根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的方法，其特征在于該方法所采用的檢測波長可以是21(T260nm，優(yōu)選的波長采用230nra。4、根據(jù)權(quán)利要求l、2、3所述的方法，其特征在于該方法所采用的流動相流速可以是0.13.Oml/min，優(yōu)選地流速采用1.Oml/min;5、根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述的方法，其特征在于該方法所采用的色譜柱可以是胺基柱，氰基柱，十八垸基硅垸鍵合硅膠柱，八烷基硅烷鍵合硅膠柱，四烷基硅烷鍵合硅膠柱，苯基硅垸鍵合硅膠柱等；優(yōu)選地采用十八烷基硅垸鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(C18柱)。6、根據(jù)權(quán)利要求l、2、3、4、5所述的方法，其特征在于該方法對于不同比例的頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉復(fù)方均能檢測，頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉兩者成分的比例可以包括1:5050:1，優(yōu)選地用于1:20~20:1。7、根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6所述的方法，其特征在于該方法可以用于頭孢噻肟鈉舒巴坦坦鈉復(fù)方的原料檢測，也可以用于該復(fù)方的制劑檢測。8、根據(jù)權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7所述方法，這種檢測頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉復(fù)方的方法，對兩個組分的含量及雜質(zhì)能很好地檢測，并且這樣的檢驗(yàn)不受另一成分的干擾，有很好的靈敏度、專屬性、簡便易行，該方法可以用于制藥公司在該復(fù)方的原料與制劑生產(chǎn)過程中對于產(chǎn)品質(zhì)量的檢測，也可以用于藥檢所、醫(yī)院等單位對制劑質(zhì)量的監(jiān)控。全文摘要一種新的高效液相色譜(HPLC)方法，可以同時檢測頭孢噻肟鈉與舒巴坦鈉復(fù)方制劑中兩種單一成分的含量及有關(guān)雜質(zhì)，兩種成分不相互干擾與影響，該方法操作簡單易行，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，線性范圍大，穩(wěn)定性好，可用于復(fù)方制劑與原料的檢測。文檔編號G01N30/00GK101592636SQ200810028348公開日2009年12月2日申請日期2008年5月28日優(yōu)先權(quán)日2008年5月28日發(fā)明者孫明杰,霆王,鄧桂興,馬宏強(qiáng)申請人:廣州威爾曼新藥開發(fā)中心有限公司;湘北威爾曼制藥有限公司