鋰診斷/測定試劑盒及鋰濃度測定方法

文檔序號：5920171閱讀：130來源：國知局

專利名稱：鋰診斷/測定試劑盒及鋰濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種鋰診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鋰濃度的方法，屬于醫(yī)學/工業(yè)/環(huán)境檢驗測定技術領域。
背景技術：
20世紀40年代，Cade首次用鋰鹽治療躁狂癥成功，總有效率約70%，鋰鹽對躁狂和抑郁的復發(fā)有預防作用，也用于治療分裂情感性精神病。另外，鋰鹽可使雙相障礙維持治療階段的自殺行為減少86%，而當停用鋰鹽后，自殺危險性會增加7.5倍。當血鋰濃度達到或超過1.5mmol/L，會出現不同程度的中毒癥狀，血鋰濃度3.0mmo1 / L以上可危及生命。
近幾年，臨床實驗室多數方法學都有了新的發(fā)展，但鋰的測定方法基本維持火焰原子發(fā)射法、火焰原子吸收法及離子選擇電極法。原子吸收的方法是將稀釋的標本吸入乙炔火焰中，利用空心陰極元素燈光源發(fā)出被測元素的特征輻射光，為火焰原子化器產生的樣品蒸汽中的待測元素基態(tài)原子所吸收。鋰在波長670.8 nm處的被吸光的特征輻射光的大小與標本中的鋰濃度成正比。但目前國內的臨床實驗室沒有統(tǒng)一的實驗方法和實驗操作規(guī)程，也很難在精神病醫(yī)院的實驗室中査找到其使用情況。
自然界中無游離鋰，因此實際指鋰離子或鋰鹽，而碳酸鋰是最重要的鋰化物。碳酸鋰被用于陶瓷釉料的生產、特種玻璃、鋁的熔煉和鋼鐵鑄造粉末。氫氧化鋰和氯化鋰應用在潤滑劑、空調和干燥系統(tǒng)中。丁基鋰、鋰金屬、特種無機物和特種有機物，被用于制藥、合成橡膠等領域。鋰是一種稀有金屬，鋰電池就以它為主要原料,航空航天工業(yè)也離不開鋰。金屬鋰與鋰合金在核能發(fā)電、輕質高比強合金、輕金屬焊接等諸多領域都有著廣闊的開發(fā)利用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定鋰濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現該方法的鋰診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行鋰濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。本發(fā)明鋰濃度測定方法原理如下
肌醇_1_磷酸+水肌醇-1-磷酸酶/^^2+/0+肌醇+磷酸根
磷酸根+谷氨酰胺+腺苷二磷酸谷氨酰胺合成酶氨+
谷氨酸+腺苷三磷酸氨離子+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸
+水+輔酶
這種方法應用能被鋰抑制活性的肌醇-l-磷酸酶(inositol-l-phosphase; EC3丄3.25)酶(偶)聯谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC6.3丄2)、丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase; EC 1.4.1.1)酶促反應連續(xù)監(jiān)測法/ 速率比色法。肌醇-l-磷酸酶(需要鎂離子激活其活性，鋰離子能抑制鎂離子的激活作用)酶解肌醇-l-磷酸反應產生磷酸根，再通過(偶)聯合谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/速度，比較對照及鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，可以測算鋰的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明鋰診斷/測定試劑盒較為理想
緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
還原型輔酶0.25 mmol/L
氯化鎂0.6 mmol/L
肌醇-l-磷酸酶10000U/L
谷氨酰胺合成酶10000U/L
丙氨酸脫氫酶10000U/L
肌醇-l-磷酸8 mmol/L
谷氨酰胺8 mmol/L
腺苷二磷酸8 mmol/L
丙酮酸20 mmol/L
氯化鎂可以用其它鎂鹽取代；如硫酸鎂等。本發(fā)明的鋰診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、肌醇-l-磷酸酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶。
還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫
酶、肌醇-l-磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶。試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、肌醇-l-磷酸酶。還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定鋰濃度的方法，其還原型輔f
可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。實施例一
本實施例的鋰診斷/測定試劑為單試劑，包括: 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶氯化鎂
肌醇-l-磷酸酶
谷氨酰胺合成酶
丙氨酸脫氫酶
肌醇-l-磷酸
谷氨酰胺
腺苷二磷酸
丙酮酸
畫mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 0.6 mmol/L 10000U/L 10000 U/L 10000U/L 8 mmol/L 8 mmol/L 8 mmol/L 20 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測對照及鋰樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約
l分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。分別加入對照及樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置
于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，比較對照及鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測算出鋰的濃度大小。實施例二
本實施例的鋰診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
氯化鎂
肌醇-l-磷酸
谷氨酰胺
腺苷二磷酸
丙酮l
畫mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 0.6 mmol/L 8 mmol/L 8 mmol/L 8 mmol/L 20 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
肌醇-l-磷酸酶
谷氨酰胺合成酶
100mmol/L 500 mmol/L 10000U/L 10000 U/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7,測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測對照及鋰樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
分別加入對照及樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，比較對照及鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測算出鋰的濃度大小。實施例三
本實施例的鋰診斷/測定試劑為三試劑，包括試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶氯化鎂肌醇-l-磷酸谷氨酰胺腺苷二磷酸
丙酮酸
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 0.6 mmol/L 8 mmol/L 8 mmol/L 8 mmol/L 20 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
谷氨酰胺合成酶
丙氨酸脫氫酶
100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L 10000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L
肌醇-l-磷酸酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。測定鋰濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37X:，反應時間10 分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測對照及鋰樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。分別加入對照及樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，比較對照及鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測算出鋰的濃度大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發(fā)明內容中記載的測定方法均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0015; 吸光度時間反應曲線應呈直線下降；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達0.5mmol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±5%;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(CV)《2 %;試劑的靈敏度可達0.060 ± 0.03 AA/mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應用。
1權利要求
1. 一種利用能被鋰抑制活性的酶比色法及酶聯法技術的鋰濃度測定方法，其方法原理如下肌醇-1-磷酸+水 肌醇-1-磷酸酶/Mg2+/Li+ 肌醇+磷酸根磷酸根+谷氨酰胺+腺苷二磷酸 谷氨酰胺合成酶 氨+ 谷氨酸+腺苷三磷酸氨離子+丙酮酸+還原型輔酶 丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸+水+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，比較對照及鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，測算出鋰的濃度大小測定結果。
2. —種鋰診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20——500 mmol/L穩(wěn)定劑1——-4000 mmol/L還原型輔酶0.1——0.35 mmol/L氯化鎂0.1—50 mmol/L肌醇-l-磷酸酶1000———誦00 U/L谷氨酰胺合成酶1000———80000 U/L丙氨酸脫氫酶1000———訓00 U/L肌醇-l-磷酸1—50 mmol/L谷氨酰胺1—50 mmol/L腺苷二磷酸1—50 mmol/L丙酮酸1—50 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。氯化鎂可以用其它鎂鹽取代。
3. 根據權利要求2所述鋰診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述鋰診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、肌醇-l-磷酸酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶組成。還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述鋰診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、肌醇-l-磷酸酶組成。還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據權利要求2所述鋰診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用能被鋰抑制活性的酶比色法及酶聯法技術的鋰診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鋰濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/工業(yè)/環(huán)境檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-1-磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、肌醇-1-磷酸酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過分別將對照及鋰樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，比較對照及鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測算出鋰的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464315SQ200710192108
公開日2009年6月24日申請日期2007年12月19日優(yōu)先權日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司

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