專利名稱：二氧化碳診斷/測定試劑盒及二氧化碳的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種二氧化碳診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定二氧 化碳濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血液內(nèi)二氧化碳的含量對人體內(nèi)酸堿平衡的調(diào)節(jié)起著重要的作用。血液
pH的恒定是維持生命活動必不可少的條件，血漿中的多種緩沖系統(tǒng)中以碳酸 氫鹽緩沖系統(tǒng)最為重要，直接影響血液的pH。
血液內(nèi)二氧化碳的含量變化主要反映代謝性酸堿平衡紊亂。單純代謝性 酸或堿中毒時，血液碳酸氫根[HC(V]下降或升高，總二氧化碳也隨之下降或 升高。而單純呼吸性酸或堿中毒時，血液碳酸氫根升高或下降。
總二氧化碳和碳酸氫根的測定方法較可分為直接測定和間接推算兩類。 直接測定主要有量氣法、量壓法、滴定法、比色法、Conway微量擴(kuò)散法、流 動注射氣體擴(kuò)散法等。間接推算是利用血氣分析儀測得的PH與PC02，根據(jù)H-H 方程的變換形式
HC03— (m mol /L) =0. 03XPC02(mm Hg) X antilog (PH-p ka)或 HC03—(m mol/L)=0. 225XPC02(k Pa) Xantilog(PH-p Ka) 計算獲得。
式中PH為37。 C時測得值，pka在37。 C為6. 10。
目前，以間接推算法應(yīng)用較普遍，由血液分析儀的微處理計算機(jī)并與血氣 分析結(jié)果一起報告，準(zhǔn)確性基本可以符合臨床要求。
直接測定法以滴定法應(yīng)用最廣泛，但由于受多種因素影響，測定誤差較大。 酶法測定適合自動化分析，結(jié)果可靠，應(yīng)當(dāng)是很有前途的測定方法，但 目前尚有待深入研究。檢索中國專利發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?6190276.0、申請日為1996. 02. 06的發(fā)明
專利申請公開了一種用來導(dǎo)出病人血液中氣體含量的非侵入性的系統(tǒng)和方 法。該系統(tǒng)相應(yīng)于體積測量呼氣中的二氧化碳濃度。然后處理該數(shù)據(jù)導(dǎo)出動 脈血中二氧化碳?xì)怏w水平。若數(shù)據(jù)為時間域，處理可將時間域數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成體 積域。該方法也經(jīng)迭代評估了多個變量的顯著性，所得的關(guān)系可供快速和準(zhǔn) 確地對健康人和患肺病病人進(jìn)行血中氣體含量的測定。近年來，申請?zhí)枮?02282386. 7、申請日為2002. 10. 29的實用新型專利公開了一種醫(yī)用的血液碳 酸氫根測定儀，主要由操作面板、進(jìn)樣檢測機(jī)構(gòu)、定滴加液機(jī)構(gòu)、攪拌機(jī)構(gòu) 和以單片機(jī)為主控元件的電器控制部分組成。其操作面板包括有手動按鍵、 輸入鍵盤和顯示屏；進(jìn)樣檢測機(jī)構(gòu)由沿圓周均布樣本孔且在孔內(nèi)放置樣本瓶 的樣本轉(zhuǎn)盤和豎直裝配在轉(zhuǎn)盤下面的驅(qū)動電機(jī)及對應(yīng)于檢測位樣本孔設(shè)置的 光電檢測器組成；定滴加液機(jī)構(gòu)由配置電機(jī)的微量泵和設(shè)置于樣本孔上方的 定滴頭及配置在定滴頭滴液口處的計滴器組成；攪拌機(jī)構(gòu)由設(shè)置在樣本轉(zhuǎn)盤 下方相應(yīng)位置的攪拌電機(jī)和裝配在攪拌電機(jī)軸上的磁盤及放置于樣本瓶內(nèi)的 攪拌棒組成。
以上專利均與酶法測定無關(guān)，這從一個側(cè)面說明，國內(nèi)此方面的實驗研 究十分缺乏。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型 煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定二氧化 碳濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的二氧化碳診斷/測定 試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀 上進(jìn)行二氧化碳濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實 的推廣應(yīng)用。
5本發(fā)明二氧化碳濃度測定方法原理如下
二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
草酰乙酸+磷酸根 草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+輔酶 這種方法應(yīng)用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase; EC4丄1.31)酶(偶)聯(lián)蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase; EC 1丄1.37)酶 促反應(yīng)速率比色法。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶解二氧化碳反應(yīng)產(chǎn)生草酰乙 酸，再通過(偶)聯(lián)合蘋果酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm 處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型 輔酶在340nm處吸光度下降的程度，通過測量340nm處吸光度下降的程度， 可以測算二氧化碳的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明二氧化碳診斷/測定試劑盒 較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L
蘋果酸脫氫酶 10000 U/L
磷酸烯醇式丙酮酸 6 mmol/L
本發(fā)明的二氧化碳診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫
氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶。 還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮 酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前 加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮 酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在 使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定二氧化碳濃度的方法，其還原型 輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的 一種。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實施例一
本實施例的二氧化碳診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L
蘋果酸脫氫酶 10000 U/L
磷酸烯醇式丙酮酸 6 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度 1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測二氧化碳樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間0分鐘，檢測 時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出二氧化碳的濃度大小。
實施例二
本實施例的二氧化碳診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸
6 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
磷酸烯醇式丙酮酸羧化
500畫ol/L 6000 U/L
蘋果酸脫氫酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度
1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測二氧化碳樣品與試劑
1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間0
分鐘，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出二氧化碳的濃度大小。
實施例三
本實施例的二氧化碳診斷/測定試劑為三試劑， 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 磷酸烯醇式丙酮酸 試劑2
包括
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 6 mmol/L
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L蘋果酸脫氫酶 10000 U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定二氧化碳濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間 10分鐘，起始吸光度1.8±0.7,測試主波長340nm，測試副波長405nm，被 測二氧化碳樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向 為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間O分鐘，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出二氧化碳的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá) 到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.05;吸光度 時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈下降曲線直至終點；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可 達(dá)25mmol/L;試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對偏差不超過士5 %;試劑測試的 精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達(dá)0.068 ± 0.034 △A/mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣 應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的二氧化碳濃度測定方法，其方法原理如下二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水 <u>磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶</u> 草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶 <u>蘋果酸脫氫酶</u> 蘋果酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出二氧化碳的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種二氧化碳診斷/測定試劑盒，主要成分包括:緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化S蘋果酸脫氫酶磷酸烯醇式丙酮酸20-500 mmol/L-4000 mmol/L0.1-0.35 mmol/L1000——80000 U/L1000-80000 U/L1-50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；濃度在上述范圍內(nèi)效果較好， 在此范圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫 酶、磷酸烯醇式丙酮酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫 酶、磷酸烯醇式丙酮酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原 型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇 式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶組成。還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶、蘋果酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸在試劑1或試劑2中的位置可以 不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫 酶、磷酸烯醇式丙酮酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原 型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫 氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶組成。 還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮 酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑1一4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的二氧化碳診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定二氧化碳濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出二氧化碳的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464270SQ20071019142
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司