專利名稱：5’-核苷酸酶診斷試劑盒及5’-核苷酸酶活性濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種5，-核苷酸酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定5'-核苷酸酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。 背景4支術(shù)
醫(yī)學(xué)研究表明，5'-核苷酸酶(5NT)增高主要見(jiàn)于阻塞性黃膽，也可 見(jiàn)于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發(fā)膽管炎、原發(fā)性和繼發(fā)性膽汁性肝硬化 和慢性肝炎時(shí)，5NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時(shí)5NT升 高的敏感性高于堿性磷酸酶。因?yàn)?'-核苷酸酶活性無(wú)生理性升高，對(duì)于 診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性磷酸酶不但敏感，而且有特 異性。因此測(cè)定5'-核苷酸酶的活性對(duì)于疾病的診斷具有重要意義。
5'-核苷酸酶的活性測(cè)定方法很多，主要有同位素底物法、化學(xué)強(qiáng)酸測(cè) 磷法(1925年)。據(jù)申請(qǐng)人了解，目前國(guó)際上普遍采用同位素底物測(cè)試法， 方法為5，-核苷酸酶作用于H3-dUMP，終止反應(yīng)后，通過(guò)離子交換層析柱 分析結(jié)果，求得5'-核苷酸酶活性?；蛘呃?'-核苷酸酶作用于單磷酸腺 苷后產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷，再用化學(xué)強(qiáng)酸法分析無(wú)機(jī)磷含量得以計(jì)算出5'-核苷酸 酶的活性。
同位素底物法方法復(fù)雜還有同位素污染，而且需要同位素測(cè)定儀，因 此難以切實(shí)推廣應(yīng)用。無(wú)機(jī)磷測(cè)定法是1925年發(fā)明的方法，準(zhǔn)確度不好， 強(qiáng)酸污染環(huán)境等等，也不適合推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè) 還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)
4定5'-核苷酸酶活性濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的 5'-核苷酸酶診斷試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、 全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行5，-核苷酸酶活性濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn) 確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明5'-核苷酸酶活性濃度測(cè)定方法原理如下
核苷單磷酸+水5核苷酸酶核苷+磷酸根 磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水 二氧化碳+丙酮酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化)
L-蘋果酸+輔酶
核苷單磷酸可以是腺苷單磷酸、肌苷單磷酸、尿苷單磷酸等 這種方法應(yīng)用5，-核苷酸酶(5'-Nucleotidase; EC3丄3.5)酶(偶)聯(lián)磷酸 烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase; EC 4.1.1.31)、蘋 果酸脫氫酶(脫羧化)(malatedehydrogenase(decarboxylation); EC 1丄1.38; EC 1丄1.39;EC 1丄1.40;EC 1丄1.83)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。5，-核苷酸酶酶 解核苷單磷酸反應(yīng)產(chǎn)生磷酸根，再通過(guò)(偶)聯(lián)合磷酸烯醇式丙酮酸羧化 酶、蘋果酸脫氫酶(脫羧化)的作用，最終將還te型輔酶(在340nm處有吸 收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型辨 酶在340nm處吸光度下降的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度下降的速度， 可以測(cè)算5'-核苷酸酶的活性濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明5'-核苷酸酶診斷試劑 較為理想
緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 還原型輔酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化f
蘋果酸脫氫酶(脫羧化)
核苷單磷酸
草酰乙酸
丙酮酸
500誦ol/L 0.25 mmol/L 10000U/L 12000 U/L 8 mmol/L 12 mmol/L 16 mmol/L
本發(fā)明的5'-核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸 脫氫酶(脫羧化)、核苷單磷酸、草酰乙酸、丙酮酸。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、核苷單磷酸、草酰乙酸、丙酮酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶(脫 羧化)。
還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶(脫羧化)、核苷 單磷酸、草酰乙酸、丙酮酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒 可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直
接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、核苷單磷酸、草酰乙酸、丙酮酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶(脫羧化)。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。 還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶(脫羧化)、核苷 單磷酸、草酰乙酸、丙酮酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。
無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定5，-核苷酸酶活性濃度的方法， 其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的5'-核苷酸酶診斷試劑為單試劑， 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
還原型輔酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化
蘋果酸脫氫酶(脫羧化)
核苷單磷酸
草酰乙酸
丙酮酸
包括
100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 6000 U/L 10000U/L 8 mmol/L 12 mmol/L 16 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光 度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)5，-核苷酸酶樣 品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大 約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值一4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出5'-核苷酸酶的 活性濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的5'-核苷酸酶診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 核苷單磷酸 草酰乙酸 丙酮酸
10Ommol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 8 mmol/L 12 mmol/L 16 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
蘋果酸脫氫酶(脫羧化) 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光
畫mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L 10000U/L度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405mn，被測(cè)5，-核苷酸酶樣 品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))， 延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出5'-核苷酸酶的 活性濃度大小。 實(shí)施例三
本實(shí)施例的5，-核苷酸酶診斷試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 核苷單磷酸 草酰乙酸 丙酮酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
蘋果酸脫氫酶(脫羧化) 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體
10Ommol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 8 mmol/L 12 mmol/L 16 mmol/L
100mmol/L 500mmol/L 10000 U/L
100 mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L 二試劑，可以直接使用。測(cè)定5'-核苷酸酶活性濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C， 反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度1.8± 0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波 長(zhǎng)405nm，被測(cè)5'-核苷酸酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢 測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出5，-核苷酸酶的 活性濃度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能 達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析 儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0015; 吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線下降；試劑可測(cè)有效(RX).99)線形范圍可 達(dá)300U/L;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過(guò)士 5%;試劑測(cè)試的 精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達(dá)0.0002-0.0004 AA/min/U/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推 廣應(yīng)用。
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權(quán)利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的5’-核苷酸酶活性濃度測(cè)定方法，其方法原理如下核苷單磷酸+水 <u>5核苷酸酶</u> 核苷+磷酸根磷酸根+草酰乙酸 <u>磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶</u>二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水二氧化碳+丙酮酸+還原型輔酶 <u>蘋果酸脫氫酶(脫羧化)</u>L-蘋果酸+輔酶核苷單磷酸可以是腺苷單磷酸、肌苷單磷酸、尿苷單磷酸等將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出5’-核苷酸酶的活性濃度大小結(jié)果。
2. —種5'-核苷酸酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液20--500 mmol/L 穩(wěn)定劑 1—4000 mmol/L還原型輔酶0.1--0.35 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1000--80000 U/L蘋果酸脫氫酶(脫羧化)1000--80000 U/L核苷單磷酸1-50 mmol/L草酰乙酸1-50 mmol/L丙酮酸1-50 mmol/L 試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在 此范圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫 氫酶(脫羧化)、核苷單磷酸、草酰乙酸、丙酮酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫 氫酶(脫羧化)、核苷單磷酸、草酰乙酸、丙酮酸組成雙劑試劑；試劑l， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、核苷單磷酸、草酰乙酸、丙酮酸組成； 試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶 (脫羧化)組成。還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶 (脫羧化)、核苷單磷酸、草酰乙酸、丙酮酸在試劑1或試劑2中的位置 可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫 氫酶(脫羧化)、核苷單磷酸、草酰乙酸、丙酮酸組成多劑試劑；試劑l， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、核苷單磷酸、草酰乙酸、丙酮酸組成； 試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶(脫羧化)組成；試劑3，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶組成。還原型輔酶、磷酸烯 醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶(脫羧化)、核苷單磷酸、草酰乙酸、 丙酮酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的5’-核苷酸酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定5’-核苷酸酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、核苷單磷酸、草酰乙酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶(脫羧化)及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的速度，從而測(cè)算出5’-核苷酸酶的活性濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101464262SQ20071019141
公開(kāi)日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司