專利名稱：一種中性陰離子熒光化學(xué)傳感器、制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中性的陰離子熒光化學(xué)傳感器，并提供了制備該中性陰離 子熒光化學(xué)傳感器的方法及其用途，屬生物分析和醫(yī)藥生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于二羧酸陰離子在生物過程中具有特殊意義，其識(shí)別和傳感持續(xù)引起了 人們研究的興趣。單、雙羧酸及其陰離子廣泛存在于抗生素(antibiotics)、止痛藥 (analgesics)、抗炎齊U(anti-inflammatory)中。而一些含羧酸的生物活性分子如葉酸 (folic acid)、膽酸(bile acid)、前列腺素(prostaglandin)、膽紅素(billirubin)等，是分 子識(shí)別領(lǐng)域中重要的靶標(biāo)。二羧酸是某些生物活性分子如氨基酸、蛋白質(zhì)等的重 要結(jié)構(gòu)組成單元，如戊氨酸是神經(jīng)傳輸系統(tǒng)中重要的興奮神經(jīng)遞質(zhì)。二羧酸(戊 二酸、己二酸、癸二酸等)也是體內(nèi)脂肪酸代謝的微量產(chǎn)物，是眾多代謝過程(如 檸檬酸和乙醛酸(glyoxylate灘環(huán))的關(guān)鍵組分。動(dòng)物體內(nèi)貯存的脂肪酸進(jìn)行a-氧 化，不產(chǎn)生二羧酸，但機(jī)體內(nèi)存在有少量的十二碳以下的脂肪酸，如十碳的癸酸 和十一碳酸，通過co-氧化途徑降解為a, a-二羧酸，w-氧化在脂肪酸分解代謝過 程中不占主要地位。脂肪酸代謝先天不足(如酸血癥或?；鵆oA脫氫酶缺乏)或糖 尿病酮酸中毒的病人，體液中二羧酸含量上升。測(cè)定二羧酸對(duì)代謝紊亂的迅速診 斷和準(zhǔn)確治療有著重要意義。二羧酸陰離子的比色檢測(cè)可用于測(cè)定飲料中檸檬 酸、酒石酸及蘋果酸陰離子的含量。此外，二羧酸在高能磷酸酯鍵的生成和重要 中間體的生物合成等方面起著重大作用。正是由于二羧酸或其陰離子在生物學(xué)上 具有極為重要的意義，其靈敏性檢測(cè)在生物分析和醫(yī)藥生物學(xué)中備受矚目，人們 致力于計(jì)合成具有選擇性識(shí)別二羧酸陰離子的受體，結(jié)合熒光方法的高靈敏性檢 測(cè)性能，開發(fā)二羧酸類陰離子熒光化學(xué)傳感器。吳世康(M. Mei， S. Wu, Fluorescent Sensor for a， co—Dicarboxylate Anions, WevvJ Ctem. 2001，乃,471.)等曾經(jīng)報(bào)道了一種基于萘環(huán)的雙臂熒光化學(xué)傳感器， 并研究了其在有機(jī)溶劑中傳感二羧酸陰離子的性質(zhì)。在本申請(qǐng)專利中，利用膽酸 分子骨架的特殊構(gòu)型和氫鍵給體基團(tuán)(硫)脲可以選擇性絡(luò)合特定鏈長(zhǎng)的二羧酸 陰離子，本發(fā)明制備出了基于膽酸分子骨架的中性熒光陰離子傳感器，絡(luò)合行為 則通過引入的熒光基團(tuán)靈敏地表達(dá)出來，并進(jìn)一步探索了其在二羧酸陰離子熒光 檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種生物相容性好、具有特定光學(xué)性質(zhì)的中性陰離 子熒光化學(xué)傳感器。本發(fā)明的又一目的在于提供一種具有特定光學(xué)性質(zhì)的中性陰離子熒光化學(xué) 傳感器的制備方法。本發(fā)明的再一目的在于提供一種具有特定光學(xué)性質(zhì)的中性陰離子熒光化學(xué) 傳感器的生物熒光檢測(cè)用途。本發(fā)明所述的一種中性陰離子熒光化學(xué)傳感器為一種以膽酸分子骨架為基 礎(chǔ)，同時(shí)引入兩個(gè)中性陰離子鍵合基和熒光探針分子，使得其在溶劑中對(duì)生物二 羧酸陰離子具有特定的熒光響應(yīng)。具體而言是以膽酸分子為分子骨架，在其3 位碳原子和24位碳原子上引入中性硫脲或脲基，作為鍵合單元；在3位碳原子 和24位碳原子上或其他位置引入具有熒光化學(xué)官能團(tuán)，作為信號(hào)單元，合成中 性陰離子熒光化學(xué)傳感器。本發(fā)明提供的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器，包括膽酸 分子骨架、陰離子鍵合單元硫脲或者脲基以及傳感的信號(hào)單元熒光分子基團(tuán)，其 通式為[R「(麗CXNH)—R2—]2—(Cholic acid) 其中，間隔基Ri為含苯環(huán)的芳烴或稠環(huán)芳烴；R2為烷烴或芳烴；X為O 或S元素；Cholic acid為膽酸，即3，7,12-三羥基甾代異戊酸。本發(fā)明提供的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器，其中的一種結(jié)構(gòu)式如下其中，R為任意化學(xué)基團(tuán)；X為O或S元素；3、 7、 12和24分別表示3-碳原子(C3)、 7-碳原子(C7)、 12-碳原子(C12)和24-碳原子(C24);間隔基 Ri為含苯環(huán)的芳烴或稠環(huán)芳烴；R2為烷烴或芳烴。進(jìn)一步R,為苯、萘、蒽、芘、 菲或1,10-菲繞啉基，或者它們的衍生物。具體而言為以膽酸分子為分子骨架， 在其C3和C24上引入中性硫脲或脲基，作為鍵合單元；在C3和C24或其他位 置引入具有熒光化學(xué)官能團(tuán)，作為信號(hào)單元，合成中性陰離子熒光化學(xué)傳感器。本發(fā)明提供的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的制備方法，還可以在膽酸C3 和C24上引入中性硫脲或脲基，作為鍵合單元；在C7和C12上或其他位點(diǎn)引入 具有熒光的化學(xué)官能團(tuán)，作為信號(hào)單元，合成中性陰離子熒光化學(xué)傳感器。在C原子上引入某化學(xué)基團(tuán)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，具體而 言是通過以下方法來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明采用一類中性陰離子鍵合基團(tuán)(硫)脲，通過 多步化學(xué)衍生引入膽酸分子骨架，同時(shí)引入熒光探針分子，使得化學(xué)傳感器分子 在選擇性絡(luò)合二羧酸陰離子時(shí)，其絡(luò)合行為可以通過熒光分子探針的熒光變化表 達(dá)出來。各步合成如下(1) 合成在膽酸分子的C3上引入氨基的衍生物第一步2， 2-二甲氧基丙垸和無水甲醇中與膽酸混合，以對(duì)甲基苯磺酸為催化劑，反應(yīng)液在5(TC下攪拌過夜，減壓蒸出溶劑，向殘余物中加入CH2C12，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌三次，無水硫酸鈉干燥后過濾。濾液旋干，得白色泡沫狀固體；第二步在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向(1)第一步中所得白色固體在有機(jī)醚溶液和4-(M iV-二甲基)氨基吡啶的混合溶劑中與甲基磺酸反應(yīng)，三苯基磷和有機(jī)堿做催化劑， 攪拌數(shù)分鐘后加入甲基磺酸，立即有大量白色固體沉淀生成。在15分鐘內(nèi)向反 應(yīng)液滴加偶氮二甲酸二乙酯(EDAD)，繼續(xù)在室溫下攪拌48h。減壓蒸除溶劑， 殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離，得到白色固體。該步中有機(jī)溶劑以四氫呋喃(THF) 和二氧六環(huán)為佳，有機(jī)催化堿以4-(W， W-二甲基)氨基吡啶或吡啶為佳。第三步該白色固體溶于1,3-二甲基-3，4,5,6-四氫-2(lH)-吡啶酮(DMPU)中， 加入疊氮化鈉，干燥條件下室溫?cái)嚢?8h。反應(yīng)完畢后，反應(yīng)液傾入蒸餾水中， 用乙醚萃取，收集有機(jī)相，用蒸餾水洗三次，硫酸鈉干燥，過濾，濾液旋干，殘 余物經(jīng)硅膠柱層析分離，得白色固體，為膽酸C3位上羥基被疊氮基取代的化合 物；該步中可用iV，iV-二甲基甲酰胺(DMF)取代DMPU。第四步向(1)第三步中經(jīng)與疊氮化鈉反應(yīng)后所得白色固體溶在優(yōu)級(jí)純(GR 級(jí))的冰醋酸中，干燥條件下加入鋅粉室溫劇烈攪拌，過濾除去殘余鋅粉，固體 用冰醋酸和甲苯依次洗滌，收集濾液，旋干，所得產(chǎn)物用三乙胺調(diào)節(jié)溶液至略呈 堿性，用的乙酸乙酯從水相萃取，有機(jī)相用硫酸鈉干燥，過濾，旋干，得白色泡 沫狀固體，即為膽酸分子的3-碳原子(C3)上引入氨基的衍生物；(2) 合成在膽酸分子的24-碳原子(C24)上引入氨基的衍生物 向醇溶液中加入(1)第三步所得白色固體和大大過量的水合肼，室溫下密封攪拌，減壓蒸除醇和絕大部分的水合肼后，向殘余物中加入冰水?dāng)嚢?5min， 過濾，所得固體用大量的冰水洗滌數(shù)次，真空中6(TC干燥過夜，得到白色固體。 此步中的醇以甲醇和乙醇為優(yōu)。當(dāng)加入水合肼后，如果體系變渾濁，可以適量添 加少量的氯仿或二氯甲烷溶液，增強(qiáng)體系的溶解性。(3) 基于膽酸的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的合成向干燥的非質(zhì)子性溶劑中加入(2)中所得白色固體與適量的含異硫氰酸酯 基或異氰酸酯基的芳香化合物或稠環(huán)芳烴，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，5(TC加熱24h。減壓蒸除溶劑，向殘余物中加入二氯甲烷，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌三次，Na2S04 干燥，過濾，濾液旋干后殘余物經(jīng)硅膠柱層析(EtOH/CH2Cl2)分離得固體目標(biāo)產(chǎn) 物。此步中非質(zhì)子性溶劑以氯仿或DMF為優(yōu)選。本發(fā)明提供的另一種中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的制備方法，具體為-第一步在上述制備方法中的(1)中的第三步制備膽酸C3位上羥基被疊 氮基取代的化合物；第二步在C7和C12上引入熒光基團(tuán)。向膽酸C3位上羥基被疊氮基取代 的化合物的鄰二甲苯/二氯甲垸的混和溶液中加入的氫化鈣和苯基三乙基氯化銨 作為催化劑，反應(yīng)體系在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流10mim后，加入含有甲酰氯的熒光分 子(萘、蒽、芘、菲或l,10-菲繞啉基，或者它們的衍生物)的鄰二甲苯溶液(IO mL)，繼續(xù)回流24 h。停止加熱，冷卻后減壓過濾，濾液用的乙酸乙酯稀釋， 用NaHCO3(10X)的水溶液洗滌三次。有機(jī)相用無水Na2S04干燥后減壓蒸除溶劑 (可以反復(fù)加入乙酸乙酯以帶出鄰二甲苯)，殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離(乙酸乙酯/ 石油醚(60-8(TC))后，收集強(qiáng)的綠色熒光帶，再用純的二氯甲垸作淋洗劑進(jìn)行第 二次硅膠柱層析分離，得目標(biāo)固體；第三步該固體化合物依次重復(fù)上述制備方法(1)中第四步和其后的反應(yīng) 步驟，得一種中性陰離子熒光化學(xué)傳感器。本發(fā)明還提供了該中性陰離子熒光化學(xué)傳感器在生物二羧酸陰離子檢測(cè)中 的應(yīng)用。尤其是中性陰離子熒光化學(xué)傳感器在對(duì)已二酸、癸二酸以及天冬氨酸和 谷氨酸陰離子的選擇性的熒光響應(yīng)和熒光檢測(cè)方面的應(yīng)用。陰離子識(shí)別熒光檢測(cè)在CH3OH/H20(l:l, 0.01 M HEPPS緩沖溶液，pH=7.4， HEPPS = 4-羥乙基哌嗪丙磺酸)溶液或二甲亞砜(DMSO)或乙腈(CH3CN)中 進(jìn)行。配制一系列中性陰離子熒光化學(xué)傳感器濃度固定(5.0X10—6 mol七—"而二 羧酸陰離子濃度變化的溶液，靜置4小時(shí)后測(cè)其熒光光譜。配制中性陰離子熒光化學(xué)傳感器和丙二酸、己二酸陰離子的總濃度不變其濃 度比例不斷變化的一系列溶液，靜置4小時(shí)后測(cè)其熒光光譜。本發(fā)明提供一種制備具有特殊光學(xué)性質(zhì)的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的新 方法，利用膽酸分子骨架的特殊構(gòu)型和氫鍵給體基團(tuán)(硫)脲可以選擇性絡(luò)合特 定鏈長(zhǎng)的二羧酸陰離子，制備出了基于膽酸分子骨架的中性熒光陰離子傳感器， 該陰離子化學(xué)傳感器可以在溶液中選擇性靈敏響應(yīng)二羧酸陰離子，最低檢測(cè)濃度 可達(dá)10—8mol/L，其靈敏性檢測(cè)在生物分析和醫(yī)藥生物學(xué)中具有重要意義。


圖1: 一種含蒽熒光探針的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的核磁氫譜圖(溶 劑DMSO-c4)。圖2: —種含芘熒光探針的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的核磁氫譜圖(溶劑CDC13)。圖3: —種含蒽熒光探針的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器在不同溶劑體系中 的熒光譜圖。圖4: 一種含蒽熒光探針的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器在DMSO中檢測(cè) 己二酸陰離子熒光光譜圖。圖5: —種含蒽熒光探針的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器在CH3OH/H20(l:l, 0.01 M HEPPS緩沖溶液，pH=7.4， HEPPS = 4-羥乙基哌嗪丙磺酸)溶液中檢測(cè)N-甲?；?L-谷氨酸陰離子熒光光譜圖。圖6:—種含蒽熒光探針的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器在CH30H/H20(1:1， 0.01 M HEPPS緩沖溶液，pH=7.4， HEPPS = 4-羥乙基哌嗪丙磺酸)溶液中與不同二 羧酸陰離子相互作用熒光變化圖。圖7: —種含芘中性陰離子熒光傳感器在i:H3CN中檢測(cè)辛二酸陰離子的 熒光光譜圖。圖8: —種含芘中性陰離子熒光傳感器在CH3CN中檢測(cè)辛二酸陰離子的 熒光光譜變化圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述 實(shí)施例l: 一種含蒽熒光探針的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的合成 (1)合成在膽酸分子的C3上引入氨基的衍生物第一步在150 mL的燒瓶中加入4.08 g (10 mmol)3a，7a, 12a-三羥基-5(3-氫 -24-羥基膽酸，2.08 g (20 mmol) 2, 2-二甲氧基丙垸和100 mL的無水甲醇，催化 劑量的對(duì)甲基苯磺酸(0.01 g)，反應(yīng)液在5(TC下攪拌過夜。減壓蒸出溶劑，向殘 余物中加入100mL的CH2Cl2，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌三次，無水硫酸鈉干燥 后過濾。濾液旋干，得白色泡沫狀固體甲基-3a,7a, 12a-三羥基-5(3-氫-24-膽酸甲 酯4.23 g，產(chǎn)率100% 。 & NMR (CDC13, 270 MHz) & 0.68 (s, 3 H, CH3), 0.89 (s, 3 H, CH3)， 0.98 (d, /= 5.94 Hz, 3 H， CH3), 3.44 (m, 1 H, H3a), 3.85 (br, 1 H, H7a), 3.97 (br, 1 H, H12a)。與目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)一致。第二步在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向100 mL的三口瓶中加入1.75 g (4.15 mmol)甲基 -3a,7a, 12a-三羥基-5p-氫-24-膽酸甲酯，3.38 g (12.5 mmol)三苯基磷，1.07 g (8.7 mmol)4-(7V， iV-二甲基)氨基吡啶和15 mL的干燥THF溶液，攪拌數(shù)分鐘后加入 0.6mLC9.24mmol)的甲基磺酸，立即有大量白色固體沉淀生成。在15分鐘內(nèi)向 反應(yīng)液滴加2.0 mL (12.5 mmol)偶氮二甲酸二乙酯(EDAD)，反應(yīng)液逐漸變澄清， 攪拌片刻后又有沉淀生成，反應(yīng)體系變得粘稠，繼續(xù)在室溫下攪拌48h。減壓蒸 除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離(乙酸乙酯/石油醚(60-80°。)/二氯甲烷=1:4:0.5 (v/v/v))，得到白色固體1.80 g。第三步(1)中第二步所得白色固體溶于15mL的l，3-二甲基-3，4，5,6-四氫 -2 (1H)-吡啶酮(DMPU)中，加入1.25 g(19.25 mmol)的疊氮化鈉，干燥條件下室 溫?cái)嚢?8 h。反應(yīng)完畢后，反應(yīng)液傾入50 mL的蒸餾水中，用乙醚萃取(30 mLx3)，收集有機(jī)相，用蒸餾水洗三次，硫酸鈉干燥，過濾，濾液旋干，殘余物 經(jīng)硅膠柱層析分離(乙酸乙酉旨/石油醚(60-80。Chl:3(v/v)),得白色固體1.30g，產(chǎn) 率76X。m. p. 109-110°C; ^NMR(CDCl3, 270 MHz) & 0.69 (s, 3 H, CH3)， 0.91 (s, 3 H， CH3)， 0.98 (d, /= 5.9 Hz, 3 H， CH3), 3.11-3.20 (m， 1 H， H3a), 3.67 (s, 3 H, OCH3)， 3.86 (br， 1 H, H7a), 3.99 (br, 1 H， H12a)。第四步將活化的鋅粉0.83 g (12.6 mmol)和(1)中第三步所得白色固體溶 在lOmL的GR級(jí)的冰醋酸中，干燥條件下室溫劇烈攪拌24h。過濾除去殘余鋅 粉，固體用冰醋酸(5 mLx2)和甲苯(10 mLx2)依次洗滌，收集濾液，旋干，殘余 的冰醋酸在減壓蒸除時(shí)通過反復(fù)加入加甲苯帶出，所得產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)物的醋酸 鹽。將該醋酸鹽溶于50 mL的飽和食鹽水中，用三乙胺調(diào)節(jié)溶液至略呈堿性， 用30 mLx2的乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用硫酸鈉干燥，過濾，旋干得純的白色泡 沫狀固體0.36g，產(chǎn)率90%。 m.p. 98-100°C; ^ NMR (CDC13, 270 MHz) & 0.69 (s, 3 H， CH3)， 0.90 (s, 3 H, CH3), 0.98 5.9 Hz, 3 H， CH3), 2.56 (m, 1 H, H3a),3.66 (s, 3 H, OCH3), 3.85 (br, 1 H, H7a), 3.97 (br, 1 H, H12a)。(2) 合成在膽酸分子的C24上引入氨基的衍生物向5mL甲醇溶液中加入0.21g(5mmo1) (1)中第四步所得白色固體和0.5 mL(大大過量)水合肼，室溫下密封攪拌48h，減壓蒸除甲醇和絕大部分的水合 肼后，向殘余物中加入30 mL的冰水?dāng)嚢?5 min，過濾，所得固體用大量的冰 水洗滌數(shù)次，真空中6(TC干燥過夜，得到白色固體0.20g ，產(chǎn)率96%。111. . 166°C 時(shí)分解；'H NMR (270MHz, DMSO-^) : 3 0.57 (s, 3 H, CH3), 0.81 (s， 3 H， CH3)， 0.91 (d, 3 H, J= 6.4 Hz, CH3), 2.38 (m, 1 H, H3a), 3.60 (br， 1 H, H7a), 3.77 (br, 1 H, H12a), 4.08-4.13 (m, 3 H,NH2) 。 MALDITOF HRMS: C24H43N303 + H，理論值 422.3382;實(shí)測(cè)值，422.3394。(3) —種含蒽熒光探針的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的合成向5 mL干燥的DMF溶液中加入0.13 g(0.3 mmol) (2)中所得白色固體與 0.18g(0.7mmol)9-異硫氰酸酯亞甲基蒽，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，50'C加熱24h。減壓蒸 除DMF，向殘余物中加入50 mLCH2Cl2，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌三次，Na2S04 干燥，過濾，濾液旋干后殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離(EtOH/CH2Cl^l: 20(v/v))， 得黃色固體0.11 g，產(chǎn)率37%。 m. p. 198-200°C; & NMR (270MHz, DMSO-c/6): ^ 0.51 (s， 3 H, CH3), 3.87 (m, 1 H， H3a), 4.04 (br, 1 H, H7a)， 4.11 (br, 1 H， H12a), 5.57,5.67 (2s， total 4 H， CH2)， 7.20 (s, 1 H, NH), 7.46 (s, 1 H, NH), 7.54-7.68 (m, 8 H， AnH)， 7.93 (br， 1 H, NH), 8.16 (m， 4 H， AnH), 8.42 (m, 4 H， AnH), 8.68 (s， 1 H,AnH)， 9.51 (br， 2 H, NH)。 MALDI TOF HRMS: C56H65N503S2 + H，理論值 920.4607;實(shí)測(cè)值，920.4645。實(shí)施例2: —種含芘熒光探針的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的合成(1) 如實(shí)施例1 (1)中的第三步制備膽酸C3位上羥基被疊氮基取代的化合物；(2) 合成在膽酸分子的C7和C12上引入芘熒光基團(tuán)的中間產(chǎn)物向0.45 g(l mmol)實(shí)施例1 (1)中第三步所得白色固體的鄰二甲苯/二氯甲 烷(10:1， 5 mL)的混和溶液中加入0.63 g(15 mmol)的氫化鈣和0.01g(0.04mmo1) 苯基三乙基氯化銨，反應(yīng)體系在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流IO mim后，加入含有0.79 g(3 mmol)l-芘基甲酰氯的鄰二甲苯溶液(10 mL)，繼續(xù)回流24 h。停止加熱，冷卻 后減壓過濾，濾液用50mL的乙酸乙酯稀釋，用NaHCO3(10X)的水溶液洗滌三 次。有機(jī)相用無水Na2S04干燥后減壓蒸除溶劑(可以反復(fù)加入乙酸乙酯以帶出鄰 二甲苯)，殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離(乙酸乙酯/石油醚(60-8(TC"l:4(v/v))后，收 集強(qiáng)的綠色熒光帶，再用純的二氯甲烷作淋洗劑進(jìn)行第二次硅膠柱層析分離，得 純的黃色固體0.33g，產(chǎn)率37%。 m.p. 130-131°C; 'HNMR (270MHz, CDC13): <5 0.88 (s， 3 H, CH3), 0.96 (d, /= 8.91 Hz， 3 H, CH3), 1.11 (s， 3 H, CH3)， 3.03 (m, 1 H, H3a)， 3.52 (s, 3 H, OCH3), 5.48 (br, 1 H, H7a), 5.70 (br， 1 H， H12a), 7.58-8.61 (m， 16 H， PyH), 9.16-9.57 (m, 2 H, PyH)。(3) 合成在膽酸分子的C3和C24上引入氨基的衍生物第一步將活化的鋅粉0.65 g(10 mmol)和0.45 g(0.5 mmol)實(shí)施例2 (2)中 第一步所得黃色固體溶于10 mL的GR級(jí)的冰醋酸中，在干燥條件下室溫劇烈攪 拌24h。過濾除去殘余鋅粉，固體用冰醋酸(5mLx2)和甲苯(10mLx2)依次洗滌， 收集合并濾液，旋干，殘余的冰醋酸在減壓蒸除時(shí)通過反復(fù)加入加甲苯帶出，所 得產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)物的醋酸鹽。將該醋酸鹽溶于50 mL的飽和食鹽水中，用三乙 胺調(diào)節(jié)溶液至略呈堿性，用30 mLx2的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相用硫酸鈉干 燥，過濾，濾液旋干得純的黃色泡沫狀固體0.44g，產(chǎn)率99%。 m.p. 122-124'C; 'H NMR (270MHz, CDC13): <5 3.54 (s, 3 H， OCH3), 5.47 (br, 1 H， H7a), 5.68 (br, 1 H, H12a)， 7.26-8.56 (m, 16 H， PyH), 9.24-9.30 (m, 2 H, PyH); IR (KBr): 3437, 2949, 2912， 2876， 1735， 1704, 1632， 1607， 1456, 1446, 1389， 1255， 1231, 1193， 1145, 1133， 1086,849,721 cm—1; MALDI TOF HRMS: C59H59N06 + H，理論值878.4420; 實(shí)測(cè)值878.4405。第二步向0.44 g (0.5 mmol)實(shí)施例2 (2)中第二步所得黃色固體和1.0 mL (大大過量)的水合肼中加入10 mL的CH3OH/CH2Cl2(v:v=3:l)，室溫下密封攪拌 48 h，減壓蒸除甲醇和絕大部分的水合肼后，向殘余物中加入30mL的蒸餾水?dāng)?拌15 min，過濾，所得固體用大量的蒸餾水洗滌數(shù)次，真空中6(TC干燥過夜，得到黃色固體0.33 g ，產(chǎn)率76%。 m. p. 166。C時(shí)分解；& NMR (270MHz, CDC13): <5 3.72 (br, 4 H, NH2), 5.46 (br, 1 H, H7a), 5.67 (br, 1 H, H12a)， 6.55 (br， 1 H， CONH), 7.60-8.55 (m， 16 H, PyH), 9.24-9.30 (m, 2 H, PyH)。(4) 一種含芘熒光探針的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的合成把0.26 g (0.3 mmol)實(shí)施例2G)中第二步所得黃色固體與0.15 g ( 0.7 mmol) 4-三氟甲基苯基異硫氰酸酯溶于lOmL干燥的二氯甲垸溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下， 于小于40 5(TC下加熱攪拌36 h。減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離(乙 酸乙酯/二氯甲烷=20:100 (v/v))，得黃色固體0.20 g，產(chǎn)率52%。 m. p. 164-166 °C;NMR (270MHz, DMSO-c/6): 3 0.81 (d, /= 8.1 Hz, 3 H, CH3), 3.86 (m, 1 H， H3a)， 5.39 (br， 1 H, H7a), 5.57 (br, H, H12a), 7.33- 8.49 (m, 26 H, PhH, PyH和NH), 9.04-9.25 (m, 4 H, PyH和NH), 9.70 (br， 1 H, NH); ESI TOF HRMS: 理論值 C74H67F6N505S2 + Na，理論值1306.4385;實(shí)測(cè)值1306.4436。實(shí)施例3: —種含芘熒光探針的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的合成(1) 如實(shí)施例l (1)中的第三步制備膽酸CJ位上羥基被疊氮基取代的化合物；(2) 合成在膽酸分子的C7和C12上引入芘熒光探針的中間產(chǎn)物向0.45 g(l mmol)實(shí)施例1(1)中第三步所得白色固體的的鄰二甲苯/二氯 甲烷(10:1, 5 mL)的混和溶液中加入 0.63 g(15 mmol)的氫化鈣和 0.01g(0.04mmol)苯基三乙基氯化銨，反應(yīng)體系在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流10 mim后，加 入含有0.92 g(3 mmol)l-芘基丁酰氯的鄰二甲苯溶液(lO mL)，繼續(xù)回流24h。 停止加熱，冷卻后減壓過濾，濾液用50mL的乙酸乙酯稀釋，用NaHCO3(10X) 的水溶液洗滌三次。有機(jī)相用無水Na2S04干燥后減壓蒸除溶劑(可以反復(fù)加入乙 酸乙酯以帶出鄰二甲苯)，殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離(乙酸乙酯/石油醚(60-80 'C一l:5(v/v))后，收集強(qiáng)的綠色熒光帶，再用純的二氯甲烷作淋洗劑進(jìn)行第二次 硅膠柱層析分離，得純的黃色固體0.34 g，產(chǎn)率35%。 m. p. 90-91°C; NMR (270MHz, CDC13): 3 0.75 (s, 3 H， CH3), 0.81 (d, 3 H， CH3), 0.94 (s, 3 H， CH3), 3.10-3.28 (m, 5 H， H3a$n CH2-Py), 3.57 (s, 3 H， OCH3), 5.02 (br, 1 H, H7a, 5.17 (br, 1H， H12a), 7.68-8.19 (m, 18 H， PyH); MALDI TOF HRMS: C65H69N306，理論 值987.5186;實(shí)測(cè)值987.5204。(3) 依次重復(fù)實(shí)施例2 (3)和其后操作步驟，得一種含芘熒光探針的中性 陰離子熒光化學(xué)傳感器。實(shí)施例4: 一種含蒽熒光探針的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的二羧酸陰離子 熒光檢測(cè)的應(yīng)用配制一系列含相同濃度由實(shí)施例1所得的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的不 同溶劑的溶液，靜置0.5小時(shí)后測(cè)熒光光譜。相同濃度的含蒽中性陰離子熒光化學(xué)傳感器在溶劑中隨著溶劑極性的增強(qiáng)，其熒光強(qiáng)隊(duì)逐漸降低。在極性較小的溶 劑如三氯甲烷中其熒光強(qiáng)度約為在甲醇中的五倍、在甲醇和水的混合體系(體積 比l: 1)中的十倍。陰離子識(shí)別熒光檢測(cè)在CH3OH/H20(l:l, 0.01 M HEPPS緩沖溶液，pH=7.4， HEPPS)溶液或DMSO中進(jìn)行。配制一系列實(shí)施例1中所得到的含蒽中性陰離子 熒光化學(xué)傳感器的濃度固定(5.0X 10—6 mollT"而二羧酸陰離子濃度變化的溶 液，靜置4小時(shí)后測(cè)其熒光光譜。含蒽中性陰離子熒光傳感器在DMSO中檢測(cè) 己二酸陰離子時(shí)，其熒光強(qiáng)度隨著己二酸陰離子的濃度增大而下降，至達(dá)到平衡 時(shí)，其熒光強(qiáng)度約為原來的二分之一。含蒽熒光中性陰離子熒光化學(xué)傳感器在 CH3OH/H20 (1:1, 0.01 M HEPPS緩沖溶液，pH=7.4， HEPPS )溶液檢測(cè)W-甲酰基 -L-谷氨酸陰離子時(shí)，隨著該陰離子濃度的增大，含蒽熒光陰離子傳感器的熒光 強(qiáng)度也逐漸下降，但達(dá)平衡時(shí)，其總體下降約為原值的20%。對(duì)于不同的二羧 酸陰離子，在檢測(cè)時(shí)，含蒽熒光陰離子傳感器的熒光猝滅程度也不同，表現(xiàn)出對(duì) 特定二羧酸陰離子的選擇性熒光傳感性能。實(shí)施例5: —種含芘熒光探針的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器二羧酸陰離子熒 光檢測(cè)的應(yīng)用陰離子識(shí)別熒光檢測(cè)在乙腈(CH3CN)溶液中進(jìn)行。配制一系列實(shí)施例2 中所得到的含芘中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的濃度固定(5.0X 10—6 moI七—"而二 羧酸陰離子濃度變化的溶液，靜置4小時(shí)后測(cè)其熒光光譜。隨著二羧酸陰離子濃 度的增大，含芘中性陰離子熒光傳感器在乙腈中的熒光強(qiáng)度強(qiáng)烈減弱其單體熒 光(398nm處)猝滅了約50%，基激締合物熒光(488nm處)猝滅了約90%， 可高靈敏響應(yīng)二羧酸陰離子，對(duì)濃度為10—SM的辛二酸陰離子和癸二酸陰離子 仍具有靈敏的響應(yīng)。實(shí)施例6: —種含芘熒光探針的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器二羧酸陰離子熒 光檢測(cè)的應(yīng)用陰離子識(shí)別熒光檢測(cè)在乙腈(CH3CN)溶液中進(jìn)行。配制一系列實(shí)施例3 中所得到的含芘中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的濃度固定(5.0X 10—6 mol'L—"而二 羧酸陰離子濃度變化的溶液，靜置4小時(shí)后測(cè)其熒光光譜。隨著二羧酸陰離子濃 度的增大，含芘中性陰離子熒光傳感器在乙腈中的熒光強(qiáng)度強(qiáng)烈減弱其單體熒 光(375 nm處)猝滅了約50%，基激締合物熒光(475 nm處)猝滅了約60。％。 隨著二羧酸陰離子濃度的進(jìn)一步增加，其在375 nm處的單體熒光反而增強(qiáng)，直 至恢復(fù)原值，而基激締合物的熒光繼續(xù)下降至約為原值的90%。該類含芘中性 陰離子熒光傳感器可高靈敏響應(yīng)二羧酸陰離子。對(duì)濃度為10—SM的辛二酸陰離 子和癸二酸陰離子仍具有靈敏的響應(yīng)。
權(quán)利要求
1. 一種中性陰離子熒光化學(xué)傳感器，包括膽酸分子骨架、陰離子鍵合單元硫脲或者脲基以及傳感的信號(hào)單元熒光分子基團(tuán)，其特征在于通式為[R1-(HNCXNH)-R2-]2-(Cholic acid)其中，間隔基R1為含苯環(huán)的芳烴或稠環(huán)芳烴；R2為烷烴或芳烴；X為O或S元素；Cholic acid為膽酸，即3，7，12-三羥基甾代異戊酸。
2. 如權(quán)利要求1所述的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器，其特征在于結(jié)構(gòu)式如下<formula>formula see original document page 2</formula>其中，R為任意化學(xué)基團(tuán)；X為O或S元素；3、 7、 12和24分別表示膽酸分 子骨架中3位、7位、12位和24位上的碳原子，分別記作C3、 C7、 C12和C24; 間隔基Ri為含苯環(huán)的芳烴或稠環(huán)芳烴；R2為垸烴或芳烴。
3.如權(quán)利要求1或者2所述的中性陰離子熒光化學(xué)傳感器，其特征在于& 為苯、萘、蒽、芘、菲或1,10-菲繞啉基，或者它們的衍生物。
4. 一種中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于以膽酸分子為分 子骨架，在其C3和C24上引入中性硫脲或脲基，作為鍵合單元；同時(shí)在C3和C24 上或其他位點(diǎn)引入具有熒光的化學(xué)官能團(tuán)，作為信號(hào)單元，合成中性陰離子熒光化 學(xué)傳感器。
5. 如權(quán)利要求4所述的一種中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在 于在膽酸C3和C24上引入中性硫脲或脲基，作為鍵合單元；在C7和C12上引入 具有熒光的化學(xué)官能團(tuán)，作為信號(hào)單元，合成中性陰離子熒光化學(xué)傳感器。
6. —種中性陰離子熒光化學(xué)傳感器在二羧酸陰離子熒光檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中性的陰離子熒光化學(xué)傳感器，并提供了制備該中性陰離子熒光化學(xué)傳感器的方法及其用途，屬生物分析和醫(yī)藥生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明所述的一種中性陰離子熒光化學(xué)傳感器為一種以膽酸分子骨架為基礎(chǔ)，同時(shí)引入兩個(gè)中性陰離子鍵合基和熒光探針分子，使得其在溶劑中對(duì)生物二羧酸陰離子具有特定的熒光響應(yīng)。具體而言是以膽酸分子為分子骨架，在其3位碳原子和24位碳原子上引入中性硫脲或脲基，作為鍵合單元；在3位碳原子和24位碳原子上或其他位置引入具有熒光化學(xué)官能團(tuán)，作為信號(hào)單元，合成中性陰離子熒光化學(xué)傳感器。傳感器可以在溶液中選擇性靈敏響應(yīng)二羧酸陰離子，最低檢測(cè)濃度可達(dá)10^-8mol/L，其靈敏性檢測(cè)在生物分析和醫(yī)藥生物學(xué)中具有重要價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N21/76GK101261268SQ200710044109
公開日2008年9月10日 申請(qǐng)日期2007年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月23日
發(fā)明者余家會(huì), 劉順英, 張淑彥, 羅淑芳, 峰 高 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)