專利名稱：對微量蛋白質(zhì)或多肽同步富集、脫鹽并直接進(jìn)行分析的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化分析鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微量蛋白質(zhì)或多肽脫鹽、富集和鑒定分析的方法。利用氧化硅納米粒子高效抗鹽作用以及其對蛋白質(zhì)/多肽分子的富集能力，實(shí)現(xiàn)痕量蛋白質(zhì)/多肽高效脫鹽富集，以及直接的基質(zhì)輔助激光解吸離子化/質(zhì)譜分析和鑒定。
背景技術(shù)：
基質(zhì)輔助激光解吸離子化/質(zhì)譜(MALDI/MS)以其分析速度快、靈敏度高、易于操作等特點(diǎn)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的有效工具。但是存在于分析樣品中的大量鹽或其它非蛋白質(zhì)成分(樣品前期處理過程中加入)會使得質(zhì)譜靈敏度大大降低，被稱為質(zhì)譜研究中的壓制效應(yīng)(suppression effect)。避免壓制效應(yīng)的有效方法就是對樣品進(jìn)行脫鹽處理。另外在蛋白質(zhì)組學(xué)研究過程中，有大量承擔(dān)生物體重要生命活動(dòng)的蛋白質(zhì)是低豐度蛋白質(zhì)，其極低的含量給后續(xù)的分析和檢測帶來困難。因此，實(shí)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)的有效富集是實(shí)現(xiàn)其準(zhǔn)確分析和鑒定的首要條件之一。目前最常用的溶劑蒸發(fā)法在樣品濃縮的同時(shí)也會使其中鹽等雜質(zhì)得到富集，而傳統(tǒng)的脫鹽方法是采用Millipore公司推出的用于微量樣品制備帶有C18填料的ZipTipTM吸嘴脫鹽或采用去離子水對樣品進(jìn)行靶上洗脫去鹽，但是這兩種方法脫鹽能力有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、價(jià)格便宜、效果良好，能對痕量多肽或蛋白質(zhì)進(jìn)行富集并同步脫鹽以實(shí)現(xiàn)其質(zhì)譜鑒定的新方法。
本發(fā)明提出的微量蛋白質(zhì)或多肽同步富集、脫鹽并直接進(jìn)行分析的方法，是利用氧化硅納米粒子極強(qiáng)的抗鹽能力和對多肽或蛋白質(zhì)樣品良好的吸附能力，以及納米尺寸的粒徑與有機(jī)基質(zhì)極好的相容性，對痕量蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行富集并脫鹽，中間無需洗脫步驟，然后直接進(jìn)行MALDI/MS的分析檢測。其具體步驟如下(1)以氧化硅納米粒子作為納米吸附劑，加入多肽或蛋白質(zhì)樣品的水溶液或鹽溶液中，通過靜電吸附、親/疏水作用富集樣品并脫鹽；樣品濃度是10-11M-10-6M，富集時(shí)間5-60分鐘，富集溫度4-60攝氏度，氧化硅納米粒子用量是樣品重量的1％-10％；(2)被富集的樣品直接與基質(zhì)均勻混合，形成均勻細(xì)致的結(jié)晶，進(jìn)行MALDI/MS分析；(3)根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，鑒定多肽或蛋白質(zhì)。
上述方法中，氧化硅納米粒子與蛋白質(zhì)或多肽的極稀的水溶液或者含鹽溶液混合，優(yōu)選富集溫度35-50℃，優(yōu)選富集時(shí)間25-34分鐘。然后離心，棄除上清液，收集下層氧化硅相，得到富集樣品。富集樣品后的氧化硅納米粒子與有機(jī)基質(zhì)混合后，進(jìn)行MALDI/MS測定。其中有機(jī)基質(zhì)可以是2-氰基-4-羥基肉桂酸(α-CHCA)或芥子酸、2，5-二羥基苯甲酸等。
本發(fā)明的氧化硅納米粒子粒徑為3-200nm范圍較為合適。該范圍的氧化硅納米粒子具有大的比表面積，豐富可調(diào)的表面性質(zhì)。
本發(fā)明利用氧化硅納米粒子對蛋白質(zhì)和多肽良好的吸附作用，高效的脫鹽能力以及它與MALDI過程的高度相容性，建立了納米氧化硅富集同時(shí)脫鹽并進(jìn)行MALDI/MS直接分析的方法，分析痕量蛋白質(zhì)和多肽。
本發(fā)明的氧化硅納米粒子對多肽或蛋白質(zhì)有富集和脫鹽作用，與傳統(tǒng)的溶劑蒸發(fā)濃縮方法相比，氧化硅納米粒子在富集樣品同時(shí)可以高效脫鹽，其脫鹽能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于商品化ZipTipTM吸嘴。
本發(fā)明的氧化硅納米粒子可以與基質(zhì)均勻混合形成均勻細(xì)致的結(jié)晶，納米粒子與基質(zhì)的混晶體的形成有利于基質(zhì)將吸收的激光能量轉(zhuǎn)移給氧化硅納米粒子吸附的樣品，實(shí)現(xiàn)樣品的基質(zhì)輔助激光解析離子化過程；同時(shí)均勻細(xì)致的結(jié)晶體保證了分析的重現(xiàn)性和結(jié)果的可靠性。
本發(fā)明樣品富集后可直接進(jìn)行MALDI質(zhì)譜鑒定，無需樣品洗脫步驟，操作簡單，避免了洗脫過程帶來的樣品損失。本方法成本低廉，濃縮效率高，對蛋白質(zhì)的富集效率可達(dá)100倍，除鹽能力強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)10-10M蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的成功鑒定。


圖1本發(fā)明使用一種氧化硅納米粒子的掃描電鏡照片。由圖可看出納米氧化硅粒子尺寸分布均勻，其粒徑均小于100nm。
圖2為10-7M泛素樣品的MALDI/MS譜圖。
圖3為氧化硅納米粒子富集泛素樣品的MALDI/MS譜圖。樣品濃度，10-8M，實(shí)驗(yàn)方法依照實(shí)施例1。對比圖2和圖3可以看出，氧化硅納米粒子對泛素樣品有很強(qiáng)的富集能力。
圖4為含4M氯化鈉的細(xì)胞色素C樣品的MALDI/MS譜圖。細(xì)胞色素C濃度為10-7M。
圖5為氧化硅納米粒子富集細(xì)胞色素C同步除氯化鈉后的MALDI/MS譜圖。細(xì)胞色素C濃度10-7M。氯化鈉濃度4M。對比圖4和圖5可以看出，氧化硅納米粒子在富集細(xì)胞色素C的同時(shí)可以克服高濃度無機(jī)鹽對質(zhì)譜信號的干擾。
圖6為含8M尿素的細(xì)胞色素C樣品的MALDI/MS譜圖。細(xì)胞色素C濃度10-7M。
圖7為氧化硅納米粒子富集細(xì)胞色素C同步除尿素后的MALDI/MS譜圖。細(xì)胞色素C濃度10-7M。尿素濃度8M。對比圖6和圖7可以看出，氧化硅納米粒子在富集細(xì)胞色素C的同時(shí)可以克服高濃度有機(jī)鹽對質(zhì)譜信號的干擾。
圖8為含有1M氯化鈉的細(xì)胞色素C溶液使用靶上脫鹽后的MALDI/MS譜圖。細(xì)胞色素C濃度10-7M。對比圖5和圖8可以看出，當(dāng)溶液中鹽濃度很高時(shí)，靶上脫鹽方法效果很差。
圖9為含有1M氯化鈉的細(xì)胞色素C溶液使用ZipTipTM吸嘴脫鹽后的MALDI TOF/MS譜圖。細(xì)胞色素C濃度10-7M。
圖10為含有400mM尿素的細(xì)胞色素C溶液使用ZipTipTM吸嘴脫鹽后的MALDITOF/MS譜圖。細(xì)胞色素C濃度10-7M。對比圖5和圖9，圖7和圖10可以看出，本發(fā)明脫鹽方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)ZipTipTM吸嘴脫鹽。
圖11為含有100mM碳酸氫銨的10-10M馬心肌紅蛋白質(zhì)酶解樣品經(jīng)氧化硅納米粒子同步富集并脫鹽后的的MALDI/MS譜圖。氧化硅納米粒子富集，實(shí)驗(yàn)方法依照實(shí)施例8，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果列于表1。良好的數(shù)據(jù)結(jié)果表明該方法對于復(fù)雜的蛋白質(zhì)酶解樣品同樣適用。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例是對本發(fā)明所提供氧化硅納米粒子材料進(jìn)行樣品富集同時(shí)脫鹽和MALDI/TOF MS直接分析過程的進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1，氧化硅納米粒子對蛋白質(zhì)溶液的富集和MALDI TOF/MS測定取1mL濃度10-8M的泛素蛋白質(zhì)樣品溶液中加入2μL的10mg/mL氧化硅納米懸浮液，在37℃下振蕩30min；17000g下離心20min，棄除上清，在氧化硅沉淀中加入5μL50％乙腈，振蕩使之懸浮。
取前述懸浮液0.5μL滴到MALDI耙板上，再加入等體積基質(zhì)溶液，待結(jié)晶干燥后，進(jìn)行質(zhì)譜分析。所用質(zhì)譜MALDI TOF/TOF(4700 Proteomics Analyzer，AppliedBiosystems)；激光器為Nd-YAG激光，波長355nm，激光脈沖頻率200Hz；加速電壓20kV，正離子模式線性TOF檢測，檢測結(jié)果見圖3。
實(shí)施例2，氧化硅納米粒子對含有高濃度無機(jī)鹽蛋白質(zhì)樣品的抗鹽富集以及MALDITOF/MS測定取1mL含有4M氯化鈉的細(xì)胞色素C蛋白質(zhì)樣品溶液，細(xì)胞色素C濃度為10-7M，按照實(shí)施例1的方法加入氧化硅納米懸浮液，離心后點(diǎn)樣，正離子模式線性TOF檢測，檢測結(jié)果見圖5。
實(shí)施例3，氧化硅納米粒子對含有高濃度無機(jī)鹽蛋白質(zhì)樣品的抗鹽富集以及MALDITOF/MS測定取1mL含有8M尿素的細(xì)胞色素C蛋白質(zhì)樣品溶液，細(xì)胞色素C濃度為10-7M，按照實(shí)施例1的方法加入氧化硅納米懸浮液，離心后點(diǎn)樣，正離子模式線性TOF檢測，檢測結(jié)果見圖7。
實(shí)施例4，氧化硅納米粒子對蛋白質(zhì)酶解樣品的抗鹽富集以及MALDI TOF/MS測定初始濃度5mg/ml馬心肌紅蛋白溶液經(jīng)胰蛋白酶酶解后，用100mM碳酸氫銨溶液將產(chǎn)物稀釋至10-10M，取0.8mL樣品加入2μL的1mg/mL的納米氧化硅懸濁液，依照實(shí)例1的方法進(jìn)行樣品富集，正離子模式反射式TOF檢測的方法進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜結(jié)果通過Mascot進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。
下表是實(shí)施例4的馬心肌紅蛋白酶解樣品數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果。“+”代表檢索到肽段

權(quán)利要求
1.一種微量蛋白質(zhì)或多肽同步富集脫鹽并直接進(jìn)行分析的方法，其特征是利用氧化硅納米粒子極強(qiáng)的抗鹽能力和對多肽或蛋白質(zhì)樣品良好的吸附能力，以及納米尺寸的粒徑與有機(jī)基質(zhì)極好的相容性，對痕量蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行富集、脫鹽后，無需洗脫步驟直接完成MALDI/MS的分析檢測，其具體步驟如下(1)以氧化硅納米粒子作為納米吸附劑，加入多肽或蛋白質(zhì)樣品的水溶液或鹽溶液中，通過靜電吸附、親/疏水作用富集樣品并脫鹽；樣品濃度是10-11M-10-6M，富集時(shí)間5-60分鐘，富集溫度4-60攝氏度，氧化硅納米粒子用量是樣品重量的1％-10％；(2)被富集的樣品直接與基質(zhì)均勻混合，形成均勻細(xì)致的結(jié)晶，進(jìn)行MALDI/MS分析；(3)根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，鑒定多肽或蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是氧化硅納米粒子粒徑為3-200nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是多肽或蛋白質(zhì)樣品的鹽溶液是無機(jī)鹽或者有機(jī)鹽溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所用基質(zhì)為2-氰基-4-羥基肉桂酸、芥子酸或2，5-二羥基苯甲酸。
全文摘要
本發(fā)明屬生化分析鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種以氧化硅納米粒子作為吸附劑，對痕量蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)酶解樣品脫鹽富集并直接進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸離子化/質(zhì)譜(MALDI/MS)分析的方法。氧化硅納米粒子能克服高濃度鹽的干擾，對蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)酶解多肽有很好的吸附效果。與傳統(tǒng)耙上洗滌脫鹽以及商業(yè)ZipTip
文檔編號G01N30/08GK1873407SQ200610028369
公開日2006年12月6日 申請日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月29日
發(fā)明者于錫娟, 張亞紅, 王曉燕, 唐頤, 楊芃原 申請人:復(fù)旦大學(xué)