專利名稱：使用原地蛋白質(zhì)置換離子交換膜層析清除污染物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般地說，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)純化。具體地說，本發(fā)明涉及使用原地(indigenous) 蛋白質(zhì)置換離子交換膜層析清除污染物的方法。
背景技術(shù)：
大規(guī)模的、經(jīng)濟的蛋白質(zhì)純化日益成為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要問題。一般而言，通過 細(xì)胞培養(yǎng)來生產(chǎn)蛋白質(zhì)，使用通過插入含有感興趣蛋白質(zhì)的基因的重組質(zhì)粒而改造成生成 該蛋白質(zhì)的真核或原核細(xì)胞系。由于通常所使用的細(xì)胞是活的有機體，因此必須給它們進 料含有糖、氨基酸、和生長因子(通常自動物血清的制備物來供應(yīng))的復(fù)合生長培養(yǎng)基。將 期望的蛋白質(zhì)與進料給細(xì)胞的化合物混合物及與細(xì)胞自身的副產(chǎn)物分開至足以用作人治 療劑的純度提出了艱難的挑戰(zhàn)。用于自細(xì)胞碎屑純化蛋白質(zhì)的規(guī)程首先取決于蛋白質(zhì)表達的部位。一些蛋白質(zhì)能 自細(xì)胞直接分泌入周圍的生長培養(yǎng)基中，其它蛋白質(zhì)是胞內(nèi)制備的。對于后一類蛋白質(zhì)，純 化過程的第一步涉及裂解細(xì)胞，這可以通過多種方法來進行，包括機械剪切、滲壓震擾、或 酶處理。此類破壞將細(xì)胞的整個內(nèi)含物釋放入勻漿中，而且另外生成由于尺寸小而難以清 除的亞細(xì)胞碎片。這些一般通過差速離心或通過過濾來清除。由于蛋白質(zhì)生成運行的過程 中細(xì)胞的天然死亡和胞內(nèi)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的釋放，直接分泌的蛋白質(zhì)存在同樣的問題，只 是程度較小。一旦獲得含有感興趣蛋白質(zhì)的澄清溶液，通常使用不同層析技術(shù)的組合來試圖將 它與細(xì)胞生成的其它蛋白質(zhì)分開。這些技術(shù)基于蛋白質(zhì)的電荷、疏水性程度、或大小將蛋 白混合物分開。這些技術(shù)每一種可利用數(shù)種不同層析樹脂，從而容許為所涉及的具體蛋白 質(zhì)精確剪裁純化方案。這些分離方法每一種的本質(zhì)是能使蛋白質(zhì)以不同速率沿長柱向下移 動，從而實現(xiàn)隨它們沿柱進一步向下移動時增大的物理分離，或者是能使蛋白質(zhì)選擇性粘 附至分離介質(zhì)，然后用不同溶劑差異洗脫。在一些情況中，當(dāng)雜質(zhì)特異性粘附至柱而感興趣 蛋白質(zhì)不粘附至柱時，將期望蛋白質(zhì)與雜質(zhì)分開，也就是說，感興趣的蛋白質(zhì)存在于“流出 液”中。關(guān)注蛋白質(zhì)純化的出版物包括Fahrner et al.，Biotechnol Genet Eng Rev. 2001 ；18 :301_27。—種典型的大規(guī)模純化工藝的建立常常涉及采用固定化蛋白A作為初級捕捉和 純化步驟，與其它柱操作組合。蛋白A柱操作一般產(chǎn)生超過98%的產(chǎn)物相關(guān)純度，大部分工 藝雜質(zhì)在流出級分中被洗掉。因為這一點，隨之發(fā)生的工藝操作單元被認(rèn)為是濃縮、純化、 或精制(polishing)步驟，負(fù)責(zé)將產(chǎn)物相關(guān)異構(gòu)體分開及清除剩余量的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)/ DNA、浸出的(leached)蛋白Α、和病毒。發(fā)明概述本文中的發(fā)明關(guān)注用于自包含多肽和至少一種污染物的組合物純化多肽的方法， 該方法包括按序步驟(a)使組合物通過離子交換膜，其中所述多肽和所述膜具有相反的 電荷，操作條件包括具有與所述多肽的Pl具有與所述多肽的Pl足夠不同以增強多肽的電荷的PH和有效防止緩沖劑離子屏蔽電荷的低離子強度的緩沖液，這使得膜結(jié)合多肽和至 少一種污染物，并(b)自流出液回收純化的多肽。在一個備選方案中，本發(fā)明關(guān)注一種用于自包含多肽和至少一種污染物的組合物 純化多肽的方法，該方法包括按序步驟(a)使組合物通過陽離子交換膜，其中所述多肽和 所述膜具有相反的電荷，操作條件包括具有低于多肽的Pl約1個至約5個pH單位的pH和 彡約40mS/cm的電導(dǎo)率的緩沖液，這使得膜結(jié)合多肽和至少一種污染物，并(b)自流出液回 收純化的多肽。在另一個備選方案中，本發(fā)明關(guān)注一種用于自包含多肽和至少一種污染物的組合 物純化多肽的方法，該方法包括按序步驟(a)使組合物通過陰離子交換膜，其中所述多肽 和所述膜具有相反的電荷，操作條件包括具有高于多肽的Pl約1個至約5個pH單位的pH 和彡約40mS/cm的電導(dǎo)率的緩沖液，這使得膜結(jié)合多肽和至少一種污染物，并(b)自流出液 回收純化的多肽。在一方面，所述污染物是中國倉鼠卵巢蛋白質(zhì)(CHOP)。在另一方面，所述多肽包含 CH2/CH3區(qū)。在又一方面，所述多肽是抗體。在還又一方面，所述抗體是單克隆抗體。在其它方面，所述方法進一步包括在步驟a至b之前、期間或之后對包含多 肽的組合物進行一個或多個別的純化步驟，所述純化步驟在一個備選方案中為蛋白A 親和層析，而在另一個備選方案中為離子交換層析，使用柱或膜，以結(jié)合/洗脫、流通 (flow-through)、或原地蛋白質(zhì)置換模式操作。另外，本發(fā)明提供通過將純化的多肽與藥學(xué)可接受載體組合來制備藥物組合物。附圖簡述

圖1。單抗1陰離子交換集合在pH 5. 5,6. OmS/cm, Mustang S (小規(guī)模，0. 18mL MV, 667MV/小時)的CHOP清除。圖2。單抗2陰離子交換集合在pH 5. 5和6. %iS/cm及在pH 8. 0和5. 0mS/cm， Mustang S (小規(guī)模，0. 18mL MV，667MV/ 小時)的 CHOP 清除。圖3。單抗2陰離子交換集合在pH 5. 5和6. %iS/cm及在pH 8. 0和5. 0mS/cm， Mustang S (小規(guī)模，0. 18mL MV，667MV/小時)的收率。圖 4。單抗 1 蛋白 A 集合在 pH 5. 5,3. 2mS/cm, Mustang S (小規(guī)模，0. 18mL MV, 1333MV/小時)的CHOP清除。圖 5。單抗 3 在 pH 8. 0，Mustang Q(小規(guī)模，0. 35mL MV,600MV/ 小時)的 CHOP(柱)和抗體結(jié)合容量(線)。圖6。單抗3陽離子交換集合在pH 8. 0,Mustang Q(小規(guī)模，0. 35mL MV,600MV/ 小時)的收率。圖 7。單抗 4 在 pH 8. 0 禾口 4. 0mS/cm, Mustang Q (小規(guī)模，0. 18mL MV, 1333MV/ 小 時)及然后 PH 5. 5 和 6. lmS/cm, Mustang S (小規(guī)模，0. 18mL MV, 1333MV/ 小時)的 CHOP 水平。圖 8。單抗 1 在 pH 8. 0 禾Π 4. 7mS/cm 以 100cm/ 小時流通模式(f low-throughmode) 運行的Q Sepharose Fast Flow柱上(條紋)及然后進一步在大約pH 5. 5和6mS/cm在分 批(菱形)和連續(xù)(實心灰色)模式的Mustang S上純化(小規(guī)模，0. 18mL MV，538MV/小 時)的CHOP清除。
圖 9。單抗 1 在 pH 5. 5 禾口 6mS/cm, Sartobind S (小規(guī)模，0. 14mL MV,857MV/ 小 時)的CHOP清除。圖 10。單抗 1 在 pH 5. 5 禾口 6mS/cm, Mustang S (小規(guī)模，0. 18mL MV)的 CHOP 清除。圖 11。單抗 1 在 pH 5. 5 禾口 6mS/cm，Mustang S(中試規(guī)模，IOmL MV, 546MV/ 小 時)的CHOP清除。圖12。蛋白質(zhì)生產(chǎn)概要，其中陽離子交換層析以結(jié)合/洗脫模式(bind/ elutemode)運行。圖13。蛋白質(zhì)生產(chǎn)概要，將以結(jié)合/洗脫模式運行的陽離子交換層析用以原地蛋 白質(zhì)置換模式(indigenous protein displacement mode)運行的陽離子交換膜替換。發(fā)明詳述定義在本文中，術(shù)語“約”之后的數(shù)值范圍或量明確包括精確的范圍或精確的數(shù)值量。本文中要純化的“組合物”包含感興趣的多肽和一種或多種污染物。所述組合物 可以是“部分純化的”(即已經(jīng)進行過一個或多個純化步驟，諸如蛋白A層析)或者可以是 自生成抗體的宿主細(xì)胞或生物體直接獲得的(例如所述組合物可以包含收獲的細(xì)胞培養(yǎng) 液)。在用于本文時，“多肽”通常指具有多于約十個氨基酸的肽和蛋白質(zhì)。優(yōu)選的是， 所述多肽是哺乳動物蛋白質(zhì)，其例子包括腎素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激 素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A 鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子，諸如 因子VIIIC、因子IX、組織因子、和von Willebrands因子；抗凝血因子，諸如蛋白C ；心房 鈉尿因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物，諸如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物 (t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子- α和- β ；腦啡肽酶；RANTES (在 激活后受到調(diào)節(jié)，正常情況下由T細(xì)胞表達和分泌)；人巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1-α)； 血清清蛋白，諸如人血清清蛋白；Muellerian抑制性物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛 素原；小鼠促性腺素相關(guān)肽；微生物的蛋白質(zhì)，諸如β -內(nèi)酰胺酶；DNA酶；IgE ；細(xì)胞毒性 T-淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)，諸如CTLA-4;抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)； 激素的或生長因子的受體；蛋白A或D ；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子，諸如骨衍生的神經(jīng) 營養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或_6(ΝΤ_3、ΝΤ_4、ΝΤ-5或ΝΤ-6)，或神經(jīng)生 長因子，諸如NGF-β ；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長因子，諸如aFGF和 bFGF;表皮生長因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β 1、 TGF-β 2、TGF-β 3、TGF-β 4 或 TGF-β 5 ；胰島素樣生長因子-I 禾口 -II (IGF-I 禾口 IGF-II)； des (1-3)-IGF-I (腦IGF-I)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP) ；CD蛋白，諸如CD3、CD4、 ⑶8、⑶19和⑶20 ；(促)紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干 擾素，諸如干擾素-α、- β和-γ ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF ；白介 素(IL)，例如IL-I至IL-10 ；超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病 毒抗原，諸如例如AIDS被膜的一部分；轉(zhuǎn)運蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白， 諸如 CDlla、CDllb、CDllc、CD18、ICAM、VLA-4 和 VCAM ；腫瘤相關(guān)抗原，諸如 HER2、HER3 或HER4受體；及任何上文所列多肽的片段和/或變體，以及結(jié)合任何上文所列多肽的抗體，包 括抗體片段?！拔廴疚铩敝概c期望的多肽產(chǎn)物不同的物質(zhì)。污染物包括但不限于宿主細(xì)胞物 質(zhì)，諸如中國倉鼠卵巢蛋白質(zhì)(CHOP)；浸出的蛋白Α;核酸；期望多肽的變體、片段、聚集物、 異構(gòu)體或衍生物；其它多肽；內(nèi)毒素；病毒污染物；細(xì)胞培養(yǎng)基成分(例如硫酸慶大霉素； GENTAMYCIN )等。本文中感興趣的多肽是包含CH2/CH3區(qū)并因此適合通過蛋白A親和層析來純化的 多肽。術(shù)語“Ch2/Ch3區(qū)”在本文中使用時指免疫球蛋白分子FC區(qū)中與蛋白A相互作用的那 些氨基酸殘基。在優(yōu)選的實施方案中，CH2/CH3區(qū)包含完整CH2區(qū)，接著是完整CH3區(qū)，而且 最優(yōu)選免疫球蛋白的Fc區(qū)。含有CH2/CH3區(qū)的多肽的例子包括如下的抗體、免疫粘附素和 融合蛋白，其包含與CH2/CH3區(qū)融合或偶聯(lián)的感興趣多肽。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本文中要純化的抗體是重組抗體?！爸亟M抗體”指在 經(jīng)編碼所述抗體的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或者因同源重組而生成所述抗體的宿主細(xì)胞中生成的 抗體。“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”可互換使用，指將核酸導(dǎo)入細(xì)胞中的過程。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后，該核酸 可整合入宿主細(xì)胞基因組中，或者可作為染色體外元件存在?！八拗骷?xì)胞”包括體外細(xì)胞培 養(yǎng)物中的細(xì)胞以及宿主動物內(nèi)的細(xì)胞。例如美國專利No. 5，534，615記載了用于重組生產(chǎn) 多肽的方法，通過述及明確收入本文。術(shù)語“抗體”以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆 抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們保留或經(jīng)修飾而包含如 本文中定義的Ch2/Ch3區(qū)。本文中的抗體針對感興趣的“抗原”。優(yōu)選的是，所述抗原是在生物學(xué)上重要的多 肽，而且對患有疾病或病癥的哺乳動物施用所述抗體能在該哺乳動物中產(chǎn)生治療好處。然 而，還涵蓋針對非多肽抗原(諸如腫瘤相關(guān)糖脂抗原；參見美國專利5，091，178)的抗體。 在抗原是多肽的情況中，它可以是跨膜分子(例如受體)或配體(諸如生長因子)。例示性 的抗原包括上文討論的那些多肽。本發(fā)明所涵蓋的抗體的優(yōu)選分子靶物包括CD多肽，諸如 CD3、CD4、CD8、CD19、CD20 和 CD34 ；HER 受體家族的成員，諸如 EGF 受體(HERl)、HER2、HER3 或 HER4 受體；細(xì)胞粘附分子，諸如 LFA-I、Macl、pl50、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM 禾Π av/b3 整 聯(lián)蛋白包括其a或b亞基(例如抗⑶11a、抗⑶18或抗⑶lib抗體)；生長因子，諸如VEGF ； IgE ；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖癥(OB)受體；mpl受體；CTLA-4 ；多肽C等。可以使用 可溶性抗原或其片段(任選偶聯(lián)至其它分子)作為免疫原來生成抗體。對于跨膜分子，諸 如受體，可以使用這些的片段(例如受體的胞外域)作為免疫原?；蛘?，可以使用表達跨膜 分子的細(xì)胞作為免疫原。此類細(xì)胞可衍生自天然來源(例如癌細(xì)胞系)或者可以是已經(jīng)通 過重組技術(shù)轉(zhuǎn)化以表達跨膜分子的細(xì)胞。本文中要純化的抗體的例子包括但不限于HER2抗體，包括曲妥珠單抗 (trastuzumab) (HERCEPTIN ) (Carter et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 4285-4289 (1992)，美國專利 No. 5，725，856)和帕妥珠單抗(pertuzumab) (OMNITARG ) (WOO 1/00245) ；CD20 抗體(見下文)；IL-8 抗體(St John et al.，Chest，103 :932(1993), 及國際公開No. WO 95/23865) ；VEGF或VEGF受體抗體，包括人源化的和/或親和力 成熟的VEGF抗體，諸如人源化VEGF抗體huA4. 6. 1貝伐單抗(AVASTIN )和攔你單抗(ranibizumab) (LUCENTIS ) (Kim et al. , Growth Factors, 7 :53-64 (1992)， 國際公開 No. WO 96/30046，及 WO 98/45331,1998 年 10 月 15 日公布)；PSCA 抗體 (W001/40309) ；CDlla 抗體，包括依法利珠單抗(efalizumab) (RAPTIVA )(美國 專利 No. 5，622，700，W098/23761，乂印口一 et al. , Transplant Intl. 4 :3-7(1991),及 Hourmant et al. , Transplantation 58 :377-380 (1994))；結(jié)合 IgE 的抗體，包括奧瑪珠 單抗(omalizumab) (XOLAIR ) (Presta et al.，J. Immunol. 151 :2623-2632(1993), 及國際公開No. WO 95/19181 ；美國專利No. 5，714，338，1998年2月3日公告或美國專 利No. 5,091, 313，1992年2月25日公告，WO 93/04173,1993年3月4日公布，或國際 申請 No. PCT/US98/13410,1998 年 6 月 30 日提交，美國專利 No. 5，714，338) ；CD18 抗 體(美國專利No. 5，622，700，1997年4月22日公告，或W097/^6912，1997年7月31日 公布)；Αρο-2受體抗體抗體(W0 98/51793,1998年11月19日公布)；組織因子(TF) 抗體(歐洲專利No. 0420937Β1,1994年11月9日授權(quán))；α 4- α 7整聯(lián)蛋白抗體(TO 98/06248,1998年2月19日公布)；EGFR抗體(例如嵌合的或人源化的225抗體，西 妥昔單抗(cetuximab)，ERBUTIX , W096/40210，1996 年 12 月 19 日公布)；CD3 抗 體，諸如0KT3 (美國專利No. 4，515，893，1985年5月7日公告)；CD25或Tac抗體，諸 如 CHI-621 (SIMULECT )知 ZENAPAX (參見美國專利 No. 5，693，762，1997 年 12 月 2 日公告)；CD4 抗體，諸如 cM-7412 抗體(Choy et al. Arthritis Rheum 39(1) 52-56(1996)) ；CD52 抗體，諸如 CAMPATH-1H(ILEX/Berlex)(Riechmann et al. Nature 332 :323-337(1988)) ；Fc 受體抗體，諸如針對 FcyRI 的 M22 抗體(Graziano et al.J. Immunol. 155(10) :4996-5002(1995))；癌胚抗原(CEA)抗體，諸如 hMN-14(Sharkey et al. Cancer Res. 55 (23Suppl) :5935s_5945s (1995))；針對乳房上皮細(xì)胞的抗體，包 括 huBrE-3、hu-Mc 3 和 CHL6(Ceriani et al. Cancer Res.55(23) :5852s_5856s (1995)； 及 Richman et al. Cancer Res. 55 (23Supp) :5916s_5920s (1995))；結(jié)合結(jié)腸癌細(xì)胞的 抗體，諸如 C242 (Litton et al. Eur J. Immunol.洸(1) 1-9 (1996)) ;CD38 抗體，例如 AT 13/5(Ellis et al. J. Immunol. 155(2) :925-937(1995)) ；CD33 抗體，諸如 Hu M195(Jurcic et al. Cancer Res 55(23Suppl) :5908s_5910s (1995))和 CMA-676 或 CDP771 ;EpCAM 抗體，諸如17-1A (PANOREX ); GpIIb/IIIa抗體，諸如阿昔單抗(abciximab)或 c7E3Fab (REOPRO ); RSV 抗體，諸如 MEDI-493 (SYNAGIS ); CMV 抗體，諸如 PROTOVIR ； HIV抗體，諸如PR0542 ；肝炎抗體，諸如H印B抗體OSTAVIR ; CA 125 抗體OvaRex ；獨特型⑶3表位抗體BEC2 ； α νβ 3抗體(例如VITAXIN ;Medimmune)；人 腎細(xì)胞癌抗體，諸如ch-G250 ；ING-I ；抗人17_1Αη抗體(3622W94)；抗人結(jié)腸直腸腫瘤抗體 (A33)；針對GD3神經(jīng)節(jié)苷脂的抗人黑素瘤抗體R24;抗人鱗狀細(xì)胞癌(SF-25)；人白細(xì)胞抗 原(HLA)抗體，諸如 Smart ID 10 和抗 HLA DR 抗體 Oncolym(Lym-I) ；CD37 抗體，諸如 TRU 016 (Trubion) ；IL-21 抗體(Zymogenet ics/Novo Nordi sk)；抗 B 細(xì)胞抗體(Impheron)； B 細(xì)胞靶向單抗(Immunogen/Aventis) ； 1D09C3 (Morphosys/GPC) ； LymphoRad 131 (HGS)； Lym-I 抗體，諸如 Lym-lY-90 (USC)或抗 Lym-10ncolym(USC/Peregrine) ；LIF226 (Enhanced Lifesci.) ；BAFF 抗體(例如 WO 03/33658) ；BAFF 受體抗體(參見例如 WO 02/24909)； BR3 抗體；Blys 抗體，諸如 beIimumab ；LYMPH0STAT-B ；ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen)； gomilixima(Idec 152 ；Biogen Idec) ；IL-6 受體抗體，諸如 atlizumab (ACTEMRA ;Chugai/Roche) ；IL-15抗體，諸如HuMax_Il_15 (Genmab/Amgen)；趨化因子受體抗體，諸如CCR2抗 體(例如MLN1202 ；Millieneum)；抗補體抗體，諸如C5抗體(例如eculizumab，5G1. 1 ； Alexion)；人免疫球蛋白口服配制劑(例如IgPO frotein Therapeutics) ；IL-12抗體， 諸如 ABT-874 (CAT/Abbott) ；Teneliximab (BMS-224818 ；BMS) ；CD40 抗體，包括 S2C6 及 其人源化變體(W000/75348)和TNX 100 (Chiron/Tanox) ；TNF-α抗體，包括cA2或英夫 利昔單抗(infliximab) (REMICADE )、CDP571、MAK-195、阿達木單抗(adalimumab) (HUMIRA )、PEG 化 TNF-α 抗體片段，諸如 CDP-870 (Celltech)、D2E7 (Knoll)、抗 TNF-α 多克隆抗體(例如PassTNF ；Verigen) ；CD22抗體，諸如LL2或依帕珠單抗(印ratuzumab) (LYMPHOCIDE ; Immunomedics)，包括依帕珠單抗 Y-90 和依帕珠單抗 1-131、Abiogen 的 CD22 抗體(Abiogen, Italy)、CMC 544 (Wyeth/Celltech)、combotox (UT Soutwestern)、 BL22 (NIH)、禾口 Lympo Scan Tc99 (Immunomedics)。 CD20抗體的例子包括“C2B8”，現(xiàn)在稱作“利妥昔單 抗”(rituximab) (RITUXAN )(美國專利 No. 5，736，137)；釔[90]標(biāo)記的 2B8 鼠抗體， 稱作 “Y2B8” 或"Ibritumomab Tiuxetan”(ZEVALIN ),可以從 IDEC Pharmaceuticals 公司購買(美國專利No. 5，736，137 ；2B8于1993年6月22日保藏于ATCC，編號HBl 1388)； 鼠IgG2a “Bi”，也稱作“Tositumomab”，任選用1311標(biāo)記以產(chǎn)生“ 131I-B1 ”或“碘131 tositumomab”抗體(BEXXAR )，可以從Corixa購買(還可參見美國專利No. 5，595，721)； 鼠單克隆抗體“1F5”(Press et al.，Blood69 (2) :584-591 (1987))及其變體，包括“框 架修補的”或人源化的 1F5 (W02003/002607, Leung, S. ； ATCC 保藏物 HB-96450)；鼠 2H7 和嵌合 2H7 抗體(美國專利 No. 5，677，180)；人源化 2H7(W0 2004/056312，Lowman et al.) ；2F2 (HuMax-⑶20)，一種完全人的高親和力抗體，靶向B細(xì)胞細(xì)胞膜中的⑶20分 子(Genmab, Denmark ；參見例如 Glennie and van de Winkel, Drug DiscoveryToday 8 :503-510(2003) ；Cragg et al.，Blood 101 :1045-1052(2003) ；W02004/035607 ；US 2004/0167319) ；WO 2004/035607 和 US 2004/0167319 (Teeling et al.)中所列出的人 單克隆抗體；US 2004/0093621 (Shitara et al.)中所記載的Fc區(qū)結(jié)合有復(fù)雜N-糖苷 連接的糖鏈的抗體；諸如HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11的與CD20結(jié)合的單克隆 抗體和抗原結(jié)合片段(W02005/000901, Tedder et al.)；諸如AME系列抗體的CD20結(jié) 合分子，例如 W02004/103404 和 US 2005/0025764 (ffatkins et al.，Eli Lilly/Applied MolecularEvolution, ΑΜΕ)中所列出的 AME 33 抗體；諸如 US 2005/0025764 (ffatkins etal.)中所記載的CD20結(jié)合分子；A20抗體或其變體，諸如嵌合的或人源化的A20抗 體(分別是 cA20 和 hA20)或 IMMU-106 (US 2003/0219433，Immunomedics) ；CD20 結(jié)合 抗體，包括表位消減的Leu-16、1H4或2B8，任選偶聯(lián)有IL-2，如US 2005/0069545A1 和TO 2005/16969 (Carr et al.)中的；與CD22和CD20結(jié)合的雙特異性抗體，例如 hLL2xhA20 (W0 2005/14618，Changet al.)；單克隆抗體 L27、G28-2.93-1B3, B-Cl 或 NU-B2，可以從國際白細(xì)胞分類研究組(International Leukocyte Typing Workshop)獲得 (Valentine et al.,于Leukocyte Typing III,McMichael編，p. 440,Oxford University Press (1987) ； 1H4(Haisma et al.，Blood 92 :184(1998))；抗 CD20auristatin E 偶聯(lián) 物 GeattleGenetics)；抗 CD20-IL2 (EMD/Biovation/City of Hope)；抗 CD20 單抗療法 (EpiCyte)；抗 CD20 抗體 TRU 015 (Trubion)。
術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成 群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。單克隆抗體是高 度特異性的，針對單一抗原性位點。此外，與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗 體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。修飾語 “單克隆”指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法 來生成抗體。例如，要依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler et al. ,Nature 256 =495(1975)記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法(參見例如美國專 利No. 4，816，567)來制備。在又一個實施方案中，可以從使用McCafferty et al. ,Nature, 348 =552-554(1990)所記載的技術(shù)構(gòu)建的噬菌體抗體庫分離“單克隆抗體”。Clackson et al.，Nature, 352 :624-628 (1991)和 Markset al.，J. Mol. Biol.，222 :581-597 (1991)分別 記載了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。后續(xù)出版物記載了通過鏈改組(Marks et al., Bio/Technology, 10 :779-783 (1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌 體文庫的策略(ffaterhouse et al.，Nuc. Acids. Res. ,21 :2265-2266 (199 )，生成高親和 力(nM范圍)的人抗體。如此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤 技術(shù)的可行替代方法?；蛘?，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在 免疫后生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突 變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種 系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在抗原攻擊后生成人抗體。參見例 如 Jakobovitset al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :2551 (1993) Jakobovits et al., Nature,362 :255-258(1993) ；Bruggermann et al. , Year in Immuno. ,7 :33(1993)；及 Duchosal et al. Nature 355:258(1992)。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的 一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而 鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或 同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國專利No. 4，816，567 ； Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984))。術(shù)語“高變區(qū)”在用于本文時指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含 來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(即輕鏈可變域中的殘基對-34仏1)、50-56仏2) 和 89-97 (L3)及重鏈可變域中的殘基 31-35(H1)、50-65(H2)和 95-102 (H3) ； Kabat et al. , Sequences of Polypeptides of Immunologicallnterest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))和 / 或那些來自“高 變環(huán)”的殘基(即輕鏈可變域中的殘基沈-32仏1)、50-52仏2)和91-96 (L3)及重鏈可變 域中的殘基 26-32 (HI)、53-55(H2)和 96_101(H3) ；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 901-917(1987))?！翱蚣堋被颉癋R”殘基指可變域中那些除此處定義的高變區(qū)殘基以外的殘 基。非人(例如鼠)抗體的“人源化式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序 列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基 用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長 類動物的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有 找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含 至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人 免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任 選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。用于構(gòu)建人源化抗體的人可變域的選擇，包括輕鏈和重鏈二者，對于降低抗原性 非常重要。依照所謂的“最適”(best-fit)方法，用嚙齒類抗體的可變域序列對已知的人 可變域序列的整個文庫進行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人 框架(FR) (Sims et al.，J. Immunol. 151 :2296 (1993) ；Chothia et al.，J. Mol. Biol. 196 901(1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框 架。同一框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體barter et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :4285(1992) ；Presta et al.，J. Immunol. 151 :2623 (1993))。更為重要的是，抗體在人源化后保持對抗原的高親和力及其它有利的生物學(xué)特 性。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析 親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是公眾 可獲得的，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉?？色@得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可 能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序。檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列行 使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受 體和輸入序列中選出FR殘基并進行組合，從而獲得期望抗體特征，諸如對靶抗原的親和力 提高。一般而言，CDR殘基直接且最實質(zhì)地涉及對抗原結(jié)合的影響。“抗體片段”包含全長抗體的一部分，一般是其抗原結(jié)合或可變區(qū)?？贵w片段的 例子包括Fab、Fab'、F(ab‘ )2和Fv片段；雙抗體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子； 及由抗體片段形成的多特異性抗體。已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上， 通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如Morimoto et al. , Journal of Biochemical and Biophysical Methods24 :107-117(1992) ；Brennan et al. , Science 229:81(1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片段。例如，可從上文討論的 噬菌體抗體庫中分離抗體片段?；蛘?，可直接從大腸桿菌回收Fab' -SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以 形成 F(ab' )2 片段(Carter et al. , Bio/Technology 10:163-167(1992))。在另一個實 施方案中，使用亮氨酸拉鏈GCN4以促進F(ab' )2分子的裝配來形成F(ab‘ )2。依照另一 種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離F(ab' )2片段。用于生成抗體片段的其它技術(shù) 對于熟練從業(yè)人員將是顯而易見的。在其它實施方案中，所選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見W093/16185?！皢?鏈Fv”或“sFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。 一般而言，F(xiàn)v多肽在Vh與\結(jié)構(gòu)域之間進一步包含多肽接頭，其使得sFv能夠形成結(jié)合抗 原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pluckthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 編，Springer-Verlag, New York,第 269-315 頁，1994。術(shù)語“雙抗體”指具有兩個抗原結(jié)合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(Vh-Vl)中包含相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域。通過使用過短的接頭使得同一條 鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn) 生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體更完整的記載于例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 (1993)。表述“線性抗體”在遍及本申請使用時指Zapata et al. , Polypeptide Eng, 8(10) :1057-1062(1995)中所描述的抗體。簡言之，這些抗體包含一對串聯(lián)的Fd區(qū)段 (Vh-ChI-Vh-ChI)，其形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的?！岸嗵禺愋钥贵w”具有對至少兩種不同表位的特異性，其中所述表位通常來自不同 抗原。盡管此類分子通常只會結(jié)合兩種抗原(即雙特異性抗體，BsAb)，但是此表述在用于 本文時涵蓋具有額外特異性的抗體，諸如三特異性抗體。BsAb的例子包括一個臂針對腫瘤 細(xì)胞抗原而另一個臂針對細(xì)胞毒性觸發(fā)分子的BsAb，諸如抗Fc y RI/抗⑶15、抗pl85HEK2/ FcyRIII (CD16)、抗 CD3/ 抗惡性 B 細(xì)胞(1D10)、抗 CD3/ 抗 pl85HEK2、抗 CD3/ 抗 p97、抗 CD3/ 抗腎細(xì)胞癌、抗⑶3/抗0VCAR-3、抗⑶3/L-D1 (抗結(jié)腸癌)、抗⑶3/抗黑色素細(xì)胞刺激激素 類似物、抗EGF受體/抗⑶3、抗⑶3/抗CAMAl、抗⑶3/抗⑶19、抗⑶3/MoV18、抗神經(jīng)細(xì)胞 粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗葉酸結(jié)合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相關(guān)抗原(AM0C-31)/抗 CD3 ；一個臂特異性結(jié)合腫瘤抗原而另一個臂結(jié)合毒素的BsAb，諸如抗皂草素/抗Id-Ι、抗 ⑶22/抗皂草素、抗⑶7/抗皂草素、抗⑶38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A鏈、抗干擾 素-a (IFN-α)/抗雜交瘤獨特型、抗CEA/抗長春花生物堿類；用于轉(zhuǎn)變酶活化的前體藥物 的BsAb，諸如抗CD30/抗堿性磷酸酶(其催化磷酸絲裂霉素前體藥物轉(zhuǎn)變成絲裂霉素醇)； 可用作溶纖劑的BsAb，諸如抗血纖維蛋白/抗組織型纖溶酶原激活物(tPA)、抗血纖維蛋白 /抗尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)；用于將免疫復(fù)合物靶向細(xì)胞表面受體的BsAb，諸如抗 低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受體(例如Fc γ RI或FcyRIII)；用于傳染病治療的BsAb，諸 如抗⑶3/抗單純皰疹病毒(HSV)、抗T細(xì)胞受體CD3復(fù)合物/抗流感、抗Fc γ R/抗HIV ；用 于體外或體內(nèi)腫瘤檢測的BsAb，諸如抗CEA/抗E0TUBE、抗CEA/抗DPTA、抗ρ185ΗΕΚ2/抗半抗 原；作為疫苗佐劑的BsAb ；及作為診斷工具的BsAb，諸如抗家兔IgG/抗鐵蛋白、抗辣根過 氧化物酶(HRP) /抗激素、抗促生長素抑制素/抗物質(zhì)P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β -半 乳糖苷酶。三特異性抗體的例子包括抗⑶3/抗⑶4/抗⑶37、抗⑶3/抗⑶5/抗⑶37和抗 CD3/抗CD8/抗CD37。雙特異性抗體可以制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特 異性抗體)。涵蓋具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt et al., J. Immunol. 147 :60(1991)。為了本文中的目的，“裸抗體”或“裸露的抗體”指未偶聯(lián)細(xì)胞毒性模塊或放射性標(biāo) 記物的抗體?！巴暾贵w”在本文中指包含兩個抗原結(jié)合區(qū)及Fc區(qū)的抗體。優(yōu)選的是，完整抗體 具有功能性Fc區(qū)?！爸委煛敝钢委熜蕴幚砗皖A(yù)防性或防范性措施二者。需要治療的受試者包括早就患 有病癥的受試者以及要預(yù)防病癥的受試者。“病癥”指任何會受益于如本文所述純化的抗體治療的疾患。這包括慢性和急性這 兩類病癥和疾病，及那些使哺乳動物傾向于所討論病癥的病理狀況。
短語“離子交換層析”指一種分開技術(shù)，其中基于化合物的凈電荷將它們分開。分 子被歸類為陰離子(具有負(fù)電荷)或陽離子(具有正電荷)。一些分子(例如多肽)可具 有陰離子和陽離子兩種基團。離子交換層析膜會結(jié)合具有總體正或負(fù)電荷的化合物。結(jié)合位點位于吸附器 (adsorber)的孔沿途。化合物通過對流被運輸至結(jié)合位點。帶正電荷的膜(陰離子交換 劑)會結(jié)合具有總體負(fù)電荷的化合物。相反，帶負(fù)電荷的膜(陽離子交換劑)會結(jié)合具有 總體正電荷的化合物。離子交換膜可以進一步歸類為強的或弱的。強離子交換膜在寬范圍的PH水平上 帶電荷(電離)。弱離子結(jié)合膜在窄PH范圍內(nèi)電離。四種最常見的離子交換化學(xué)是
權(quán)利要求
1.一種用于自包含多肽和至少一種污染物的組合物純化多肽的方法，該方法包括按序 步驟(a)使組合物通過離子交換膜，其中所述多肽和所述膜具有相反的電荷，操作條件包括 具有與所述多肽的Pl具有與所述多肽的Pl足夠不同以增強多肽的電荷的PH和有效防止 緩沖劑離子屏蔽電荷的低離子強度的緩沖液，這使得膜結(jié)合多肽和至少一種污染物，并(b) 自流出液回收純化的多肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述離子交換膜具有0.1至100 μ m的孔徑。
3.一種用于自包含多肽和至少一種污染物的組合物純化多肽的方法，該方法包括按序 步驟(a)使組合物通過陽離子交換膜，其中所述多肽和所述膜具有相反的電荷，操作條件包 括具有低于多肽的Pl約1個至約5個pH單位的pH和彡約40mS/cm的電導(dǎo)率的緩沖液，這 使得膜結(jié)合多肽和至少一種污染物，并(b)自流出液回收純化的多肽。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述pH低于多肽的pi約1個至約4個pH單位。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述pH低于多肽的pi約1個至約3個pH單位。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述pH低于多肽的pi約1個至約2個pH單位。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述pH低于多肽的pi約1個pH單位。
8.權(quán)利要求3的方法，其中所述電導(dǎo)率為彡約20mS/cm。
9.權(quán)利要求3的方法，其中所述電導(dǎo)率為彡約lOmS/cm。
10.一種用于自包含多肽和至少一種污染物的組合物純化多肽的方法，該方法包括按 序步驟(a)使組合物通過陰離子交換膜，其中所述多肽和所述膜具有相反的電荷，操作條件包 括具有高于多肽的Pl約1個至約5個pH單位的pH和彡約40mS/cm的電導(dǎo)率的緩沖液，這 使得膜結(jié)合多肽和至少一種污染物，并(b)自流出液回收純化的多肽。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述pH高于多肽的pi約1個至約4個pH單位。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述pH高于多肽的pi約1個至約3個pH單位。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述pH高于多肽的pi約1個至約2個pH單位。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述pH高于多肽的pi約1個pH單位。
15.權(quán)利要求10的方法，其中所述電導(dǎo)率為彡約20mS/cm。
16.權(quán)利要求10的方法，其中所述電導(dǎo)率為彡約lOmS/cm。
17.權(quán)利要求1至16任一項的方法，其中所述膜是混合模式吸附器。
18.權(quán)利要求1至17任一項的方法，其中所述污染物是中國倉鼠卵巢蛋白質(zhì)(CHOP)。
19.權(quán)利要求1至18任一項的方法，其中所述多肽包含CH2/CH3區(qū)。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述多肽是抗體。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
22.權(quán)利要求1至21任一項的方法，進一步包括在步驟a至b之前、期間或之后對包含 多肽的組合物進行一個或多個別的純化步驟，所述純化步驟為蛋白A親和層析。
23.權(quán)利要求1至21任一項的方法，進一步包括在步驟a至b之前、期間或之后對包含多肽的組合物進行一個或多個別的純化步驟，所述純化步驟為離子交換層析。
24.權(quán)利要求1至21任一項的方法，進一步包括在步驟a至b期間對包含多肽的組合 物進行連續(xù)運行的一個或多個別的純化步驟，所述純化步驟為離子交換層析。
25.權(quán)利要求1至M任一項的方法，進一步包括通過將純化的多肽與藥學(xué)可接受載體 組合來制備藥物組合物。
全文摘要
描述了用于自包含多肽和至少一種污染物的組合物純化多肽的方法，該方法包括按序步驟(a)使組合物通過離子交換膜，其中所述多肽和所述膜具有相反的電荷，操作條件包括具有與所述多肽的pI具有與所述多肽的pI足夠不同以增強多肽的電荷的pH和有效防止緩沖劑離子屏蔽電荷的低離子強度的緩沖液，這使得膜結(jié)合多肽和至少一種污染物，并(b)自流出液回收純化的多肽。
文檔編號C07K1/18GK102149724SQ200880131059
公開日2011年8月10日 申請日期2008年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月14日
發(fā)明者克里斯托弗.道德, 小杰羅姆.比爾, 蒂莫西.塔利, 阿里克.布朗 申請人:健泰科生物技術(shù)公司