專利名稱：胸腺嘧啶dna糖基化酶對信號轉(zhuǎn)導途徑的調(diào)控作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)參與調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑的新功能。
背景技術(shù)：
信號轉(zhuǎn)導是生物學研究的前沿領(lǐng)域之一，近年來發(fā)現(xiàn)在不同種族個體間，存在一個非常保守的信號通路，它的信號分子是一類糖蛋白超家族-Wnt蛋白，故稱其為Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑。Wnt信號分子家族包括十幾個成員，目前發(fā)現(xiàn)不同的Wnt分子引起的信號反應(yīng)有所差異，分為經(jīng)典的Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑(Wnt/β-連環(huán)蛋白)，例如Wnt3和Wnt8，及非經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑(Wnt/Ca2+和Wnt/JNK途徑，其中Wnt/JNK途徑目前尚未找到確定的Wnt配體)，例如Wnt11和Wnt5a。其中對經(jīng)典Wnt信號途徑研究較多，對其的信號轉(zhuǎn)導分子機制也相對而言更清晰。
Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)節(jié)控制了許多生命過程，這些過程包括生物體的生長、發(fā)育、疾病、衰老與死亡等等；也包括細胞形態(tài)與功能的分化與維持、免疫、應(yīng)激、細胞癌變與細胞凋亡等等。Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑具有如此重要的生物學意義，因此對其的研究也是近十幾年來的一個研究熱點。Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑在不同物種之間具有高度的保守性，通過對果蠅、爪蟾、小鼠等模式生物的研究，已經(jīng)大體確立了經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑的分子框架。
發(fā)育過程中，特定的時間和特定的環(huán)境誘導下，某些組織或細胞群體分泌Wnt蛋白，結(jié)合受體卷曲蛋白(Frizzled)家族成員，和共受體低密度脂蛋白LRP5/6，將信號傳遞至細胞內(nèi)。在沒有Wnt信號刺激時，這條信號轉(zhuǎn)導途徑的關(guān)鍵分子β-連環(huán)蛋白(β-catenin)參與由支架蛋白Axin，結(jié)腸癌抑制因子(APC)，糖原合酶激酶3β(GSK3β)，酪蛋白激酶1(CK1)，以及β-TrCP蛋白形成的巨大的蛋白質(zhì)復(fù)合物，在GSK3β和CK1作用下受到磷酸化標記，進而在β-TrCP蛋白介導的泛素化修飾后被蛋白酶體降解。在Wnt信號刺激下，胞內(nèi)的蓬亂蛋白(Dishevelled，Dvl)和Frat等Wnt途徑的正向調(diào)節(jié)分子打散Axin、APC和GSK3等形成的降解復(fù)合物，Axin被LRP帶上膜進而降解。β-連環(huán)蛋白磷酸化水平降低，進而可以在細胞質(zhì)中大量積累。部分β-連環(huán)蛋白進入細胞核，與核內(nèi)的含有HMG-Box的轉(zhuǎn)錄因子-淋巴細胞增強因子1/T細胞轉(zhuǎn)錄因子(LEF1/TCF)家族的相互作用，啟動下游靶基因的開放。經(jīng)典Wnt信號的最終效應(yīng)是通過β-連環(huán)蛋白在核內(nèi)與TCF/LEF1結(jié)合后激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。一般認為這種激活機制是通過β-連環(huán)蛋白結(jié)合TCF/LEF1，使TCF的轉(zhuǎn)錄抑制作用變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活。TCF在沒有與Arm/β-連環(huán)蛋白結(jié)合時能與轉(zhuǎn)錄抑制因子Groucho家族成員形成復(fù)合物，通過HMG結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。當有Wnt信號傳入時，TCF與入核的β-連環(huán)蛋白結(jié)合，從而與Groucho的結(jié)合下降，解除抑制作用(Gumbiner BM.1998.van Noort M.&Clevers H.2002.Wodarz A.&Nusse R.1998.)。
Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑不僅影響胚胎發(fā)育中的體軸誘導、胚層建立、體節(jié)分化、組織或器官形成等一系列重要的早期事件，參與體細胞的分化和極化；而且在成體中Wnt信號途徑的異?；罨呀?jīng)證明與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，大約90％的結(jié)腸癌都是由于Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑的激活性突變而引起的，此外Wnt信號途徑的異常活化還與一系列的腫瘤發(fā)生有關(guān)，比如小腸腺瘤、肝癌、胃癌、食道腺癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌(Giles RH，van Es JH，Clevers H.2003)中均發(fā)現(xiàn)了Wnt信號異?；蛘呤寝D(zhuǎn)導途徑中信號分子的突變。
經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑的生物學功能主要是通過下游靶基因的表達而得以實現(xiàn)。而很多靶基因比如c-myc、細胞周期蛋白D1，在細胞增殖中起到重要作用。研究表明，在很多癌癥細胞里可以檢測到β-連環(huán)蛋白在細胞核中的大量積累以及c-myc、細胞周期蛋白D1的高表達，說明這些腫瘤細胞中Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑下游的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物處于高轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)，使下游的靶基因大量表達。因為轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的活性高低直接關(guān)系到Wnt信號效應(yīng)，那么對轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的分子調(diào)控機制的研究，也就具有十分重要的意義。近幾年許多研究工作揭示了越來越多的調(diào)節(jié)分子參與Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑下游的β-連環(huán)蛋白-TCF/LEF1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物極其分子機制。例如PHD指結(jié)構(gòu)蛋白pygopus(pygo)，通過泛素識別酶BCL9結(jié)合到β-連環(huán)蛋白，促進了β-連環(huán)蛋白的細胞核定位和它的轉(zhuǎn)錄活性。β-連環(huán)蛋白還結(jié)合一些轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物分子，如TATA結(jié)合蛋白(TBP)，DNA螺旋酶橋蛋白(pontin)52，此外β-連環(huán)蛋白還與染色體異構(gòu)變形相關(guān)復(fù)合物Swi/Snf的中心分子Brg-1相互作用。一個重要的多功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子-乙?；D(zhuǎn)移酶CBP/p300也被發(fā)現(xiàn)是β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄激活子。(Kramps T，Basler K.2002.Townsley FM，Bienz M.2004.Hecht A，KemlerR.1999，2000.Wood MA，Clevers H.2001)這些發(fā)現(xiàn)，一方面表明這個轉(zhuǎn)錄復(fù)合物召集多種調(diào)節(jié)分子，另一方面也提示了這個轉(zhuǎn)錄復(fù)合物受到了復(fù)雜的調(diào)控。
胸腺嘧啶DNA糖苷酶(TDG)，其最初是作為一種DNA錯配堿基對的修復(fù)酶被克隆發(fā)現(xiàn)，主要參與識別和修復(fù)錯配的G·T/G·U堿基對的過程。在DNA雙鏈發(fā)生G·T或者G·U錯配的位點，TDG發(fā)揮糖苷酶的功能，水解T或者U的糖苷鍵，使之從DNA雙鏈上解離，形成無嘧啶位點，招募無嘧啶位點內(nèi)切酶到此位點發(fā)揮作用，進而發(fā)生一系列的DNA修復(fù)過程。因此TDG在DNA錯配堿基修復(fù)中起到重要作用。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)TDG也參與了基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。已有報道TDG可以與一些核受體發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用，參與這些信號途徑下游轉(zhuǎn)錄復(fù)合物并且影響其轉(zhuǎn)錄活性。還有研究表明TDG和乙酰化酶CBP有蛋白質(zhì)相互作用，并且調(diào)節(jié)CBP的轉(zhuǎn)錄活性。這些發(fā)現(xiàn)為聯(lián)系DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了新的線索。(Neddermann P，Lettieri T.1996.Harbers US，Chambon P.1998.Tini M，Chambon P.2002.Chen D，Ali S.2003)。
但是，目前還沒有發(fā)現(xiàn)TDG參與Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑的報導。找到一種新的參與調(diào)節(jié)Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑的分子并對其發(fā)揮作用的分子調(diào)節(jié)機制加以影響，可為Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)的疾病提供新的預(yù)防或治療手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種參與調(diào)節(jié)Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑的分子。
本發(fā)明的目的還在于提供一種篩選調(diào)節(jié)TDG與LEF1相互作用的物質(zhì)的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供胸腺嘧啶DNA糖苷酶(TDG)或其拮抗劑或抑制劑的用途，用于制備抑制經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑的藥物。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，提供胸腺嘧啶DNA糖苷酶或其拮抗劑或抑制劑用于制備藥物的用途，所述藥物抑制經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑異?；罨?，或治療經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑異?；罨鶎е碌募膊　?br> 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑異?；罨鶎е碌募膊∵x自腫瘤、一些家族性遺傳病如Alzheimer’s疾病、或多囊腎病。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種篩選抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1(LEF1)相互作用的抑制劑的方法，包括以下步驟(a)在測試組中，向胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的反應(yīng)體系中添加待篩選的候選物，并檢測胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1的相互作用情況；并且，在對照組中，在不添加所述候選物的、胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的反應(yīng)體系中，檢測胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1的相互作用情況；(b)將步驟(a)測試組中胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1的相互作用情況與對照組中胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1的相互作用情況進行比較，如果測試組中胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1的相互作用在統(tǒng)計學上弱于對照組，就表明該候選物是抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的抑制劑。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的反應(yīng)體系選自含有胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1的溶液；或含有胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1的細胞。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的含有胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1的細胞為酵母細胞。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種用前面所述的方法所獲得的抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的抑制劑。
在本發(fā)明的第四方面，提供一種前面所述的抑制劑的用途，用于制備藥物，所述藥物用于抑制經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑異?；罨蛘咧委熃?jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑異?；罨鶎е碌募膊　?br> 在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑異常活化所導致的疾病選自腫瘤、一些家族性遺傳病如Alzheimer’s疾病、或多囊腎病。
在本發(fā)明的第五方面，提供一種胸腺嘧啶DNA糖苷酶的用途，用于篩選抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1(LEF1)相互作用的抑制劑。
在本發(fā)明的第六方面，提供一種藥物組合物，所述的藥物組合物中含有有效量(所述的有效量為0.001-99.9wt％；更優(yōu)選的為0.01-90wt％；最優(yōu)選的，為0.1-50wt％)的所述的抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶與LEF1相互作用的抑制劑，以及余量的藥學上可接受的載體。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1A顯示了在免疫共沉淀實驗中胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)和淋巴細胞增強因子1(LEF1)發(fā)生相互作用。
圖1B顯示了體外pull-down實驗說明TDG可以直接結(jié)合LEF1。
圖1C顯示了熒光共聚焦中TDG和LEF1共定位結(jié)果。
圖2A顯示了表達TDG可以明顯增加LEF1報告基因活性。
圖2B顯示了RNA干擾技術(shù)降低內(nèi)源TDG水平，對LEF1報告基因活性有抑制作用。
圖3顯示了TDG在LEF1報告基因上表現(xiàn)出的活性與其DNA修復(fù)酶活性無關(guān)。
圖4顯示了TDG和CBP在LEF1報告基因活性上有協(xié)同激活作用。
圖5A顯示了CBP在LEF1報告基因上的活性依賴TDG。
圖5B顯示了TDG在LEF1報告基因上的活性依賴CBP，而CBP同源物p300沒有效應(yīng)。
圖6顯示了TDG下調(diào)可以抑制腫瘤發(fā)生。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)胸腺嘧啶DNA糖苷酶(TDG)參與經(jīng)典Wnt信號途徑的分子機制，并且TDG還與腫瘤發(fā)生相關(guān)。依據(jù)TDG參與Wnt下游轉(zhuǎn)錄復(fù)合物活性調(diào)節(jié)的分子機制，可為抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供新的藥物靶點?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。
更具體地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)TDG能夠與Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑中的淋巴細胞增強因子(LEF1)發(fā)生相互作用。并且TDG在經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑中起到正向調(diào)節(jié)作用。進一步的研究還發(fā)現(xiàn)，TDG能夠促進腫瘤的發(fā)生。因此，開發(fā)抑制TDG的物質(zhì)，能夠抑制腫瘤的發(fā)生。
淋巴細胞增強因子1(LEF1)和胸腺嘧啶DNA糖苷酶基因(TDG)相互作用的研究有著多方面的用途，這些用途包括(但不限于)篩選調(diào)節(jié)(促進或抑制)LEF1和TDG相互作用的調(diào)節(jié)劑(促進劑或抑制劑)、從而達到調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號途徑的目的。
這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠?qū)τ谡{(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號途徑有用的藥物。
所述的TDG與LEF1相互作用的促進劑或抑制劑，可以施用于個體，調(diào)節(jié)Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮下給藥。
本發(fā)明還提供了一種組合物(如藥物組合物)，它含有安全有效量(如0.001-99.9wt％，較佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-50wt％)的(a)TDG與LEF1相互作用的調(diào)節(jié)劑，以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。這些組合物可以用于調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號途徑。
通常，這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。
目前，已知DNA序列，將該目的DNA序列引入到各種已知DNA分子(如載體)和細胞中是本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)，一般人員只要根據(jù)本發(fā)明的提示，都可以方便的進行操作。此外，將各種形式的突變引入到各種DNA分子中也是本領(lǐng)域熟知的技術(shù)。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知?？晒┻x擇的是用Mg Cl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達目的多肽。
在本發(fā)明中，檢測蛋白與蛋白之間相互作用以及相互作用的強弱可采用多種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，比如GST沉降技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)或免疫共沉淀技術(shù)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，采用了酵母雙雜交系統(tǒng)來篩選與LEF1相互作用的蛋白。更具體的，在酵母細胞中，一種與DNA-結(jié)構(gòu)域融合的誘餌蛋白與一種與活化域融合的獵物蛋白相互作用，所述獵物蛋白可以是已知的，也可以是從cDNA文庫中選出來的。相互作用的成對分子結(jié)合于專一的序列模式，從而活化兩個獨立的報告基因的轉(zhuǎn)錄。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方式中，采用免疫沉淀技術(shù)來驗證蛋白與蛋白之間的特異性相互作用。免疫共沉淀技術(shù)的原理是在保持蛋白-蛋白相互作用的條件下，收獲和裂解細胞，從細胞提取液中特異性地免疫沉淀目的蛋白，然后通過電泳等方法分離免疫沉淀物。具有已知特性的蛋白的共沉淀，可采用抗該蛋白的抗體，通過比如western印跡來檢測。此外，如果細胞在裂解前用標記物進行過標記，則可通過放射自顯影或其它免疫學技術(shù)來觀察共沉淀的蛋白。
在本發(fā)明的另外一個優(yōu)選方式中，采用酵母雙雜交的技術(shù)來驗證蛋白與蛋白之間的特異性相互作用。酵母雙雜交技術(shù)是一種檢測兩個蛋白(X和Y)是否相互作用的常用方法。其原理為在酵母細胞中表達兩種融合蛋白DB-X和AD-Y，DB為轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)，AD為轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，只有同時具有DNA結(jié)合和激活活性，才能形成有活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。當X與Y相互作用時，DB與AD可以在空間上靠近，形成活性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，使報告基因表達。
此外，在本發(fā)明的另外一個優(yōu)選方式中，也可用酵母雙雜交的技術(shù)來檢測或篩選調(diào)節(jié)胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的物質(zhì)。將候選物質(zhì)加入到上述構(gòu)建的蛋白與蛋白相互作用的系統(tǒng)中，觀察所述候選物質(zhì)對蛋白之間相互作用的影響關(guān)系；當兩種蛋白的相互作用發(fā)生減弱時，說明所述候選物質(zhì)是一種抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的拮抗劑或抑制劑；防止，則說明所述候選物質(zhì)是一種促進胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的激動劑或促進劑。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)首次提出并證明TDG參與經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑，通過調(diào)節(jié)TDG和LEF1的相互作用，可調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑。
(2)本發(fā)明提供了很好的藥物篩選方案，可用于篩選抑制TDG和LEF1的相互作用的藥物，進而抑制經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑異?；罨?br> 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1 TDG的克隆TDG是以LEF1(GenBank登錄號NM_010703)作為“誘餌”，通過酵母雙雜交篩選小鼠10.5天胚胎庫(購自GIBCO)得到的含完整讀碼框的克隆(GenBank登錄號NM_011561.1)，具體序列如下(SEQ ID NO1)ATGATGGCAG AAGTTCCTAA CATGGCAGTC ACGACTGGAC AGCAGGTGCC AGCAGTAGCT60
CCTAACATGG CAACCGTGAC AGAACAGCAG GTGCCCGCAG ACGCTCCTGT CCAGGAACCT 120GCACCAGAAG CTCCAAAGAG AAGGAAAAGG AAACCCAGAG CAGCAGAGCC CCAGGAACCA 180GTGGAGCCCA AAAAACCTGC TACGTCGAAG AAATCCGGCA AGTCTACAAA ATCAAAGGAA 240AAGCAGGAGA AAATCACAGA CGCGTTTAAA GTGAAAAGGA AAGTGGACCG CTTCAACGGC 300GTCTCTGAAG CTGAGCTTCT GACCAAGACT CTTCCTGACA TTTTGACCTT CAATCTGGAT 360ATTGTGATCA TTGGCATTAA CCCGGGATTA ATGGCTGCTT ACAAAGGACA TCACTACCCT 420GGGCCTGGAA ATCACTTCTG GAAGTGTCTG TTCATGTCGG GGCTGAGTGA GGTGCAGCTG 480AATCACATGG ATGACCACAC CTTACCCGGC AAGTACGGCA TCGGATTCAC CAACATGGTG 540GAACGGACGA CGCCGGGCAG CAAGGATCTG TCTAGTAAAG AGTTCCGGGA AGGAGGGCGC 600ATCCTGGTGC AGAAACTGCA GAAATATCAG CCACGAATAG CGGTGTTTAA TGGAAAATGT 660ATTTATGAAA TTTTCAGTAA AGAAGTTTTT GGAGTAAAGG TTAAGAACTT GGAATTTGGG 720CTTCAACCCC ACAAGATCCC AGACACAGAA ACTCTGTGCT ACGTCATGCC GTCGTCCAGC 780GCCAGATGTG CTCAGTTTCC CCGGGCCCAG GACAAAGTTC ATTACTACAT TAAGCTGAAG 840GACTTGAGAG ACCAGCTGAA AGGCATTGAA CGCAACACCG ACGTTCAGGA AGTGCAGTAT 900ACATTTGACC TGCAGCTTGC GCAAGAGGAC GCAAAGAAGA TGGCTGTTAA GGAAGAAAAG 960TATGATCCAG GCTATGAGGC AGCTTACGGC GGCGCCTATG GGGAAAACCC ATGTAATGGG1020GAACCTTGTG GCATTGCTTC AAATGGGCTA ACAGCCCACA GTGCGGAGCC GAGAGGAGAA1080GCGACCCCCG GCGATGTTCC AAATGGGCAG TGGATGGCAC AGTCGTTTGC AGAGCAGATC1140CCTTCTTTTA ATAATTGTGG GACCCGAGAG CAGGAAGAAG AGAGCCACGC TTAG 1194然后通過SalI/NotI雙酶切得到TDG插入物(insert)。
將上述插入物分別和pCMV(XhoI/NotI)及pET28c(SalI/NotI)載體(Novagen)連接(其中XhoI和SalI是同尾酶)，構(gòu)建出在真核細胞和原核細胞的表達質(zhì)粒，分別通過轉(zhuǎn)染常規(guī)的人的胚胎腎細胞HEK293T細胞，子宮頸癌HeLa細胞(各細胞株購自中科院上海生化細胞所、或可購自ATCC)和轉(zhuǎn)化常規(guī)的大腸桿菌DH5α細胞和BL21細胞，導入細胞，用于后續(xù)進行功能分析。
實施例2.TDG和LEF1蛋白質(zhì)相互作用1.TDG和LEF1之間的相互作用TDG是以LEF1為“誘餌”通過酵母雙雜交篩選得到，提示TDG和LEF1之間可能存在蛋白質(zhì)相互作用。
為了證實TDG和LEF1之間這一相互作用，首先本發(fā)明人在人的胚胎腎細胞HEK293T細胞中瞬時轉(zhuǎn)染外源的帶有GG小肽標記的TDG(帶有GG的載體(pGG)改造自STRATAGENE的pCMV質(zhì)粒合成兩端帶有XbaI/XhoI酶切位點的GG小肽序列(atgtctctagaagaagaagaatacatgccgatggaagcc(SEQ ID NO2))，連接入XbaI/XhoI酶切好的購自STRATAGENE的pCMV載體；然后將前述重組載體用SalI/NotI酶切，將用相同酶切的TDG插入物克隆入所述載體，獲得帶有GG小肽標記和TDG的重組載體)和HA標記的LEF1(帶有HA的載體(pHA)改造自STRATAGENE的pCMV質(zhì)粒合成兩端帶有XbaI/XhoI酶切位點的GG小肽序列(atgtctctagaatacccttatgatgtcccagactatgcc(SEQID NO3)，連接入XbaI/XhoI酶切好的購自STRATAGENE的pCMV載體；然后將前述重組載體用XhoI/NotI酶切，將用相同酶切的LEF1克隆入所述載體，獲得帶有HA小肽標記和TDG的重組載體)。轉(zhuǎn)染24小時后，收細胞，用1×裂解緩沖液(lysis Buf)(NP401％，甘油10％，NaCl 0.135M，Tis-Cl PH8.0，PMSF0.5M，PPi 1mM，NaF 10mM，Na3VO4 2mM)裂解細胞，離心(14,000rpm/10min)后取上清，加入GG抗體(購自Babco)和蛋白A/G Plus瓊脂糖珠子(購自Santa CruzBiotechnology)，低溫旋轉(zhuǎn)3小時，TDG被GG抗體吸附到珠子上。離心(5000rpm/1min)收集珠子，通過western檢測珠子上所帶的蛋白。
由圖1A所示，用GG免疫沉淀的樣品，只有共轉(zhuǎn)染TDG和LEF1時LEF1可以被檢測到，說明LEF1通過和TDG相互作用，一起被GG抗體吸附到珠子上而得以免疫沉淀。單獨轉(zhuǎn)染LEF1無法在免疫沉淀樣品中檢測到LEF1。這提示了TDG和LEF1在細胞內(nèi)可以發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用。
2.TDG和LEF1之間為直接作用的相互作用進一步的，為了確定TDG和LEF1之間的蛋白質(zhì)相互作用是否為直接作用，本發(fā)明人分別從大腸桿菌中純化了重組表達質(zhì)粒GST-LEF1和TDG-His，具體方法如下重組表達質(zhì)粒GST-LEFpGEX4T2(帶有GST標記的pGEX4T2，購自Stratagen)用SalI/NotI酶切，克隆入用XhoI/NotI酶切好的LEF插入物。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種單克隆菌落于LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)過夜；取上述過夜菌1∶100接種于新鮮的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)1小時，22℃培養(yǎng)至A600為0.6～0.8，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)達終濃度10μM，37℃培養(yǎng)4h。離心收集菌體，將菌體溶于含有0.5mg/ml溶菌酶的GST破菌緩沖液中，液氮凍融，反復(fù)三次，加入DNase I至終濃度為25mg/ml以及MgSO4至終濃度20mM，冰上消化至不粘，高速離心(16000rpm/20min)后取上清得到破菌抽提物。取破菌抽提液上GSH-Sepharose 4B柱，用GST純化緩沖液(20hM Tris-Cl PH 8.0，50mM NaCl，2mM EDTA，5％甘油，0.01％Triton)洗滌至本底，待用。
重組表達質(zhì)粒TDG-HispET28c(帶有6His標記的pET28c，購自Novagen)用SalI/NotI酶切，克隆入用SalI/NotI酶切好的TDG插入物。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，接種單克隆菌落于LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)過夜；取上述過夜菌1∶100接種于新鮮的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)1小時，22℃培養(yǎng)至A600為0.6～0.8，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)達終濃度10μM，37℃培養(yǎng)4h。離心收集菌體，將菌體溶于含有0.5mg/ml溶菌酶的NTA緩沖液中，液氮凍融，反復(fù)三次，加入DNaseI至終濃度為25mg/ml以及MgSO4至終濃度20mM，冰上消化至不粘，高速離心(16000rpm/20min)后取上清得到破菌抽提物。取破菌抽提液上NTA-Ni柱，用含有5mM、20mM咪唑的NTA緩沖液洗滌至本底，用含有100mM、250mM咪唑的NTA緩沖液洗脫，用GST純化緩沖液透析去除咪唑，待用。
pull down實驗方法取一定量透析后TDG-His蛋白與結(jié)合了GST-LEF的GSH樹脂在4C混合3hr，用GST純化緩沖液洗三次，樹脂加SDS樣品緩沖液100℃煮沸5min。樣品進行SDS-PAGE電泳后進行Western檢測。
由圖1B所示，在體外pull down實驗中用GST-LEF1可以沉淀到His-TDG，而GST不能。這說明TDG和LEF1之間的蛋白質(zhì)相互作用是直接的。
3.TDG和LEF1的細胞定位此外，本發(fā)明人還通過熒光共聚焦的方法，觀察TDG和LEF1在子宮頸癌HeLa細胞中的細胞定位。在子宮頸癌細胞中瞬時轉(zhuǎn)染外源的HA標記的LEF1和綠色熒光蛋白GFP融合表達的TDG(GFP載體質(zhì)粒購自BD.Inc，同樣用XhoI/NotI酶切好的載體連接入前述SalI/NotI的插入物)。轉(zhuǎn)染24小時后，收帶有細胞的國產(chǎn)玻璃片，用冷PBS清洗后加入4％PFA固定15分鐘，冷PBS清洗后再加70％乙醇，冰上放置15分鐘。GFP融合TDG的蛋白質(zhì)可以通過熒光共聚焦顯微鏡(LEICA)直接觀察綠色熒光蛋白的位置確定目標蛋白的細胞定位，而帶有HA標記的LEF1的定位則通過免疫染色的方法檢測，即用加HA抗體(1∶300，購自Babco)反應(yīng)1小時，然后加入帶有紅色熒光集團的二抗(Jackson Immuno Research)反應(yīng)1小時。用DAPI(Sigma)染細胞核，反應(yīng)1分鐘。用封片劑(polysciences，Inc.)封閉后，即可進行觀察。
由圖1C所示，TDG和LEF1單獨表達時，在細胞核中呈現(xiàn)彌散分布，當兩者共表達時，有明顯的共定位，特別是以一種點狀分布方式。這些實驗一致證明了TDG和LEF1之間的確存在蛋白質(zhì)相互作用。
實施例3.TDG在經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑的功能1.TDG在經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑中起到正向調(diào)節(jié)作用在本實施例中，TDG在經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑的功能主要利用LEF1報告基因活性系統(tǒng)來檢測。
在常規(guī)的人的胚胎腎細胞293細胞和子宮頸癌HeLa細胞中轉(zhuǎn)染熒光素酶啟動子區(qū)帶有LEF1結(jié)合位點的報告基因如TOPflash/FOPflash(購自upstate公司)和LEF-luc(購自Panomics公司)，綠色熒光蛋白GFP(購自BD公司)，TDG及ΔN-β-catenin(缺失N端45個氨基酸，不受Wnt信號調(diào)節(jié)，具有組成性活性的β-catenin)。轉(zhuǎn)染約18小時，換液為帶有Wnt3a糖蛋白(常見Willert K，Nature，2003，423448-452)的培養(yǎng)基進行刺激約6小時。收細胞，24孔盤中每孔加200ul1×lysis buf(Roche)裂解細胞5分鐘，在測活的96孔板中每點加40ul細胞裂解液，在加入20ul熒光酶底物(Roche)，在酶標儀中計熒光量。以熒光值反映轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性。
結(jié)果如圖2A所示，在報告基因系統(tǒng)中，外源轉(zhuǎn)染的TDG可以明顯上調(diào)報告基因活性，也就是對Wnt信號效應(yīng)起到正向調(diào)節(jié)。
2.Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑受到TDG表達降低的影響RNA干擾技術(shù)沉默TDG的基因表達，將pAPT載體(pAPT載體改造自STRATAGENE的pCMV合成兩端帶有ClaI/XhoI酶切位點的AP序列(GenBank登錄號BC068501)，連接入ClaI/XhoI酶切好的購自STRATAGENE的pCMV載體)用XhoI/NotI酶切好，連接入SalI/NotI的插入物。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞表達設(shè)計好的21bp長度的DNA雙鏈片斷，可以和內(nèi)源的TDG基因互補結(jié)合，抑制內(nèi)源TDG的基因轉(zhuǎn)錄。當細胞中內(nèi)源的TDG蛋白質(zhì)水平下降后，圖2B所示，報告基因反映出的Wnt活性也在一定程度上受到抑制，這些數(shù)據(jù)一致表明了TDG在Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑對下游的β-連環(huán)蛋白-LEF-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄激活具有正向調(diào)節(jié)功能。
3.TDG在LEF1報告基因上的轉(zhuǎn)錄激活能力不依賴于其DNA修復(fù)酶活性因為TDG是一個DNA修復(fù)酶，本發(fā)明人欲進一步證實TDG的DNA修復(fù)酶活力對于它在LEF1報告基因上表現(xiàn)出的轉(zhuǎn)錄激活能力的影響。采用人TDG的一個突變體N140A(GenBank登錄號NM 003211.3)，這是位于TDG修復(fù)酶活中心的一個天冬酰胺突變成丙氨酸，從而使TDG喪失了DNA修復(fù)酶活力。如圖3所示，N140A突變和野生型TDG(TDG-wt)對LEF1報告基因的激活能力沒什么差別，說明TDG在LEF1報告基因上的轉(zhuǎn)錄激活能力不依賴于它的DNA修復(fù)酶活力。
4.TDG和CBP/p300的協(xié)同效應(yīng)已有報導，TDG和CBP/p300有相互作用，而CBP/p300則是已知的β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄共激活子。在本發(fā)明人的實驗系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)染人的胚胎腎細胞293細胞，導入熒光素酶啟動子區(qū)帶有LEF1結(jié)合位點的報告基因TOPflash(購自upstate)，綠色熒光蛋白GFP，TDG和CBP(購自Tokyo MetropoLItan Instituteof Medical Science，Japan)。轉(zhuǎn)染約18小時，換液為含有Wnt3a糖蛋白的培養(yǎng)基進行刺激約6小時。收細胞，24孔盤中每孔加200ul 1×lysis buf(購自Roche)裂解細胞5分鐘，在測活的96孔板中每點加40ul細胞裂解液，在加入20ul熒光酶底物(購自Roche)，在酶標儀中計熒光量。以熒光值反映轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性。
實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)TDG和CBP對Wnt調(diào)控的報告基因活性具有明顯的協(xié)同激活效應(yīng)，如圖4所示。
用構(gòu)建好的pAPT-TDG質(zhì)粒和化學合成的CBP的21bp的RNA片斷(Emami，K.H.，PNAS，2004，10112682-12687)，轉(zhuǎn)染細胞后，利用RNA干擾的原理，降低細胞內(nèi)的TDG或者CBP的蛋白水平。
同樣用報告基因的熒光值換算轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性的方法，發(fā)現(xiàn)TDG和CBP的轉(zhuǎn)錄激活能力是互相依賴的，即TDG或CBP要發(fā)揮β-連環(huán)蛋白-LEF-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的激活子作用，需要彼此的存在。當缺失其中一個時，另一個分子的轉(zhuǎn)錄激活子活性也受到抑制，如圖5A和5B所示。
實施例4.TDG促進腫瘤發(fā)生為了研究TDG是否和腫瘤發(fā)生相關(guān)，本發(fā)明人構(gòu)建了HeLa中TDG的RNAi穩(wěn)定細胞株，建立了內(nèi)源TDG蛋白水平被降低的細胞系統(tǒng)。
方法帶有Neomycin抗性的載體pPERL(購自美國康州大學健康中心，或可用常規(guī)的方法改造自O(shè)ligoengine的pSUPER載體)，用XhoI/NotI酶切好，連接入SalI/NotI的TDG插入物。轉(zhuǎn)染HeLa細胞后，用含G418的培液培養(yǎng)細胞，此過程中可以觀察到細胞的大量死亡，而存活下來的細胞很有可能在染色體組中整合了外源質(zhì)粒而帶有Neo抗性，可以在G418培養(yǎng)中生長。兩周左右后，可以觀察到細胞單克隆的形成。吸除培養(yǎng)液，在單克隆細胞團位置放入接種環(huán)，加入20ul胰酶，消化約4分鐘，鏡下觀察到細胞變圓，加入100ul培養(yǎng)液，用去尖槍頭吹打3-4次，轉(zhuǎn)移至24孔盤。細胞長滿后擴盤，用于檢測和保存。檢測后，取Hela細胞中TDG被無效降低和有效降低的兩組穩(wěn)定細胞株，擴增培養(yǎng)，收集量約6×106細胞，注射到3～4周的裸鼠背部兩側(cè)，每兩天觀察一次。
結(jié)果如下無效降低TDG的HeLa細胞株注射后10天后可觀察到有腫瘤塊生成，10個注射部位長出6個腫瘤塊，相比而言，有效降低TDG的HeLa細胞株注射后12天才觀察到腫瘤塊，而且10個注射部位僅長出1個腫瘤塊。如圖6所示。
實施例5.
篩選抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的物質(zhì)為了篩選抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的物質(zhì)，本發(fā)明人主要使用了酵母雙雜交的技術(shù)，它是一種檢測兩個蛋白(X和Y)是否相互作用的常用方法。
酵母雙雜交技術(shù)的原理為在酵母細胞中表達兩種融合蛋白DB-X和AD-Y，DB為轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)，AD為轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，只有同時具有DNA結(jié)合和激活活性，才能形成有活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。當X與Y相互作用時，DB與AD可以在空間上靠近，形成活性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而使報告基因發(fā)生表達。
在本實施例中，將pDB-LEF和pPC86-TDG兩種質(zhì)粒(pDB和pPC86購自GIBCO，都是用SalI/NotI酶切構(gòu)建載體)，共轉(zhuǎn)化酵母MAV203a細胞(GIBCO)，涂于營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(缺失亮氨酸和色氨酸)的平板，30度培養(yǎng)48小時。因為以上兩種質(zhì)粒分別編碼亮氨酸和色氨酸，只有同時轉(zhuǎn)入兩種質(zhì)粒的細胞才可能在營養(yǎng)缺失的培養(yǎng)基上存活。挑選長出的酵母單克隆，進行X-gal測活。因為有相互作用時，開放酵母菌中帶有的報告基因，表達LacZ(半乳糖苷酶)，和X-gal反應(yīng)，使菌斑變藍。
本發(fā)明人在此過程中，將備選的藥物庫和酵母混和培養(yǎng)，如果有藥物可以打斷LEF1和TDG的相互作用，則本來在對照組中X-gal測活中顯藍的菌斑在加藥組無法再變藍。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>胸腺嘧啶DNA糖基化酶對信號轉(zhuǎn)導途徑的調(diào)控作用<130>060604<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1194<212>DNA<213>Mus musculus<400>1atgatggcag aagttcctaa catggcagtc acgactggac agcaggtgcc agcagtagct 60cctaacatgg caaccgtgac agaacagcag gtgcccgcag acgctcctgt ccaggaacct 120gcaccagaag ctccaaagag aaggaaaagg aaacccagag cagcagagcc ccaggaacca 180gtggagccca aaaaacctgc tacgtcgaag aaatccggca agtctacaaa atcaaaggaa 240aagcaggaga aaatcacaga cgcgtttaaa gtgaaaagga aagtggaccg cttcaacggc 300gtctctgaag ctgagcttct gaccaagact cttcctgaca ttttgacctt caatctggat 360attgtgatca ttggcattaa cccgggatta atggctgctt acaaaggaca tcactaccct 420gggcctggaa atcacttctg gaagtgtctg ttcatgtcgg ggctgagtga ggtgcagctg 480aatcacatgg atgaccacac cttacccggc aagtacggca tcggattcac caacatggtg 540gaacggacga cgccgggcag caaggatctg tctagtaaag agttccggga aggagggcgc 600atcctggtgc agaaactgca gaaatatcag ccacgaatag cggtgtttaa tggaaaatgt 660atttatgaaa ttttcagtaa agaagttttt ggagtaaagg ttaagaactt ggaatttggg 720cttcaacccc acaagatccc agacacagaa actctgtgct acgtcatgcc gtcgtccagc 780gccagatgtg ctcagtttcc ccgggcccag gacaaagttc attactacat taagctgaag 840gacttgagag accagctgaa aggcattgaa cgcaacaccg acgttcagga agtgcagtat 900acatttgacc tgcagcttgc gcaagaggac gcaaagaaga tggctgttaa ggaagaaaag 960tatgatccag gctatgaggc agcttacggc ggcgcctatg gggaaaaccc atgtaatggg1020
gaaccttgtg gcattgcttc aaatgggcta acagcccaca gtgcggagcc gagaggagaa 1080gcgacccccg gcgatgttcc aaatgggcag tggatggcac agtcgtttgc agagcagatc 1140ccttctttta ataattgtgg gacccgagag caggaagaag agagccacgc ttag1194<210>2<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>2atgtctctag aagaagaaga atacatgccg atggaagcc 39<210>3<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>3atgtctctag aataccctta tgatgtccca gactatgcc 39
權(quán)利要求
1.胸腺嘧啶DNA糖苷酶或其拮抗劑或抑制劑的用途，其特征在于，用于制備抑制經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑的藥物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，用于制備藥物，所述藥物抑制經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑異常活化，或治療經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑異?；罨鶎е碌募膊　?br> 3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑異?；罨鶎е碌募膊∵x自腫瘤、Alzheimer’s疾病、或多囊腎病。
4.一種篩選抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的抑制劑的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)在測試組中，向胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的反應(yīng)體系中添加待篩選的候選物，并檢測胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1的相互作用情況；并且，在對照組中，在不添加所述候選物的、胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的反應(yīng)體系中，檢測胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1的相互作用情況；(b)將步驟(a)測試組中胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1的相互作用情況與對照組中胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1的相互作用情況進行比較，如果測試組中胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1的相互作用在統(tǒng)計學上弱于對照組，就表明該候選物是抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的抑制劑。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的反應(yīng)體系選自含有胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1的溶液；或含有胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1的細胞。
6.一種權(quán)利要求如4或5的方法所獲得的抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的抑制劑。
7.一種如權(quán)利要求6所述的抑制劑的用途，其特征在于，用于制備藥物，所述藥物用于抑制經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑異常活化，或者治療經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑異常活化所導致的疾病。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑異常活化所導致的疾病選自腫瘤、Alzheimer’s疾病、或多囊腎病。
9.一種胸腺嘧啶DNA糖苷酶的用途，其特征在于，用于篩選抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶與淋巴細胞增強因子1相互作用的抑制劑。
10.一種藥物組合物，其特征在于，含有有效量的權(quán)利要求6所述的抑制胸腺嘧啶DNA糖苷酶與LEF1相互作用的抑制劑，以及余量的藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胸腺嘧啶DNA糖苷酶或其激動劑或拮抗劑的用途，用于制備調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑的藥物。本發(fā)明還公開了一種篩選調(diào)節(jié)Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑異常活化的物質(zhì)的方法。本發(fā)明首次揭示胸腺嘧啶DNA糖苷酶參與經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑，為篩選調(diào)節(jié)Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑的藥物、或預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物提供了極好的靶點。
文檔編號G01N33/68GK101020044SQ20061002387
公開日2007年8月22日 申請日期2006年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月15日
發(fā)明者李林, 賈瑩瑩, 黃濤, 王偉, 葉央兒 申請人:中國科學院上海生命科學研究院