專(zhuān)利名稱(chēng)：4－(n，n－二甲氨基)偶氮苯－4’－磺酰氟及其合成方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬標(biāo)記試劑合成技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種新型標(biāo)記試劑(NewLabeling Reagent)4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟及其合成和應(yīng)用。這種標(biāo)記試劑不僅可用于蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定、進(jìn)行蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組學(xué)研究，還可以用于新藥研究開(kāi)發(fā)，用于醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)診斷疑難病癥、藥效評(píng)估和作為國(guó)家藥檢單位、質(zhì)檢單位進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控的標(biāo)準(zhǔn)試劑。
背景技術(shù)：
目前在蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域所用的標(biāo)記試劑，其中某些產(chǎn)品對(duì)于組成人體蛋白質(zhì)的某些氨基酸例如二級(jí)氨基酸、色氨酸、半胱氨酸不能完全適用。此外由于某些產(chǎn)品與氨基酸反應(yīng)生成的衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性低、影響后續(xù)檢測(cè)操作正常進(jìn)行。而某些標(biāo)記試劑或是對(duì)空氣中的水分敏感、或是檢測(cè)靈敏度不夠、或是合成工序繁復(fù)、或是價(jià)格昂貴也顯示出若干不足之處。由于在4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟(英文名4-(Dimethylamino)azobenzene-4’-Sulfonylfluoride，簡(jiǎn)稱(chēng)dabsyl.fluoride，代號(hào)SINORO-4D)的分子中同時(shí)含有在可見(jiàn)光區(qū)或是在近紫外光區(qū)可以進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)構(gòu)和可以與蛋白質(zhì)、氨基酸或其他具有氨基或羥基的化合物反應(yīng)的活性基團(tuán)，從而達(dá)到化學(xué)衍生化一儀器檢測(cè)的效果。作為標(biāo)記試劑化解了現(xiàn)有標(biāo)記試劑產(chǎn)品的不足之處。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可以檢測(cè)的、儀器響應(yīng)值高的、合成方便、成本較低的、新型標(biāo)記試劑4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟(簡(jiǎn)稱(chēng)dabsyl.fluoride，代號(hào)SINORO-4D)。
本發(fā)明的另一目的是提供標(biāo)記試劑dabsyl.fluoride的合成方法及其中間產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟(英文名p-acetamidobenzenesulfonyl fluoride，簡(jiǎn)稱(chēng)aabsyl.fluoride，代號(hào)SINORO-4A)的合成方法。
本發(fā)明的又一目的是提供標(biāo)記試劑dabsyl.fluoride在蛋白質(zhì)、氨基酸分析中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一目的是提供標(biāo)記試劑dabsyl.fluoride的中間產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟(aabsyl.fluoride)在蛋白質(zhì)、氨基酸分析中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下措施來(lái)達(dá)到本發(fā)明所述的4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟，其分子式為(CH3)2C6H4N＝NC6H4SO2F(簡(jiǎn)稱(chēng)dabsyl.fluoride，代號(hào)SINORO-4D)。為紅色粉狀固體，分子量307.33，熔點(diǎn)151℃。
該化合物可以通過(guò)以下連續(xù)反應(yīng)步驟進(jìn)行合成和應(yīng)用1)以苯胺為原料在50-60℃間經(jīng)乙酐乙?；频靡阴１桨?；2)乙酰苯胺與氯磺酸在溫度不高于60℃的條件下進(jìn)行氯磺化反應(yīng)，生成對(duì)乙酰氨基苯磺酰氯；3)對(duì)乙酰氨基苯磺酰氯與金屬氟化物在水溶液中發(fā)生氟代反應(yīng)生成對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟，其分子式為p-CH3CONHC6H4SO2F(簡(jiǎn)稱(chēng)aabsyl.fluoride，代號(hào)SINORO-4A)。為白色晶狀固體，分子量217.22，熔點(diǎn)175.19℃。金屬氟化物優(yōu)選氟化鈉或氟化鉀；溫度在60-110℃，優(yōu)選為80-90℃。
4)對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟在強(qiáng)酸中加熱回流水解，生成對(duì)氨基苯磺酰氟；強(qiáng)酸優(yōu)選濃鹽酸、濃硫酸；5)對(duì)氨基苯磺酰氟在鹽酸和亞硝酸鈉水溶液中，溫度低于10℃條件下進(jìn)行重氮化反應(yīng)，生成氯化磺酰氟重氮苯；6)氯化磺酰氟重氮苯與N，N-二甲苯胺在低溫下、pH 6-9的水溶液中進(jìn)行偶合反應(yīng)，得到最終產(chǎn)物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟。反應(yīng)條件優(yōu)選為10℃以下、pH 6-8。
將按照上述方法得到的4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟在介質(zhì)pH為9.3，溫度為35℃時(shí)，和組成人體蛋白質(zhì)的20種氨基酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)30分鐘，即可生成用紫外分光光度計(jì)在可見(jiàn)光區(qū)432-438nm處進(jìn)行檢測(cè)的衍生化產(chǎn)物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰-氨基酸(dabsyl-NHCHRCOOH)。檢測(cè)靈敏度達(dá)到pmol級(jí)。
上述步驟3)得到的中間體對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟(分子式p-CH3CONHC6H4SO2F，簡(jiǎn)稱(chēng)aabsyl.fluoride，代號(hào)SINORO-4A)同樣是一種很好的標(biāo)記試劑。在介質(zhì)pH 9.3，溫度35℃時(shí)，和組成人體蛋白質(zhì)的20種氨基酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)30分鐘，即可生成用紫外分光光度計(jì)在紫外光區(qū)250-255nm處進(jìn)行檢測(cè)的衍生化產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基苯磺酰-氨基酸(aabsyl-NHCHRCOOH)。檢測(cè)靈敏度達(dá)到pmol級(jí)。
由本發(fā)明方法制備的4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟和對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟相對(duì)于其它標(biāo)記試劑的優(yōu)勢(shì)a)在溫和條件下(35℃、pH 9.3、30分鐘內(nèi))和一級(jí)或二級(jí)氨基酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)。以及在適當(dāng)條件下和一級(jí)或二級(jí)醇羥基，或酚羥基進(jìn)行衍生化反應(yīng)，生成便于檢測(cè)的衍生化產(chǎn)物。
b)衍生化產(chǎn)物用紫外分光光度計(jì)在可見(jiàn)光區(qū)或近紫外光區(qū)內(nèi)檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到pmol級(jí)。
c)標(biāo)記試劑穩(wěn)定，便于純化和保存。
d)經(jīng)化學(xué)衍生化反應(yīng)后生成的衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定。故分析結(jié)果可靠和重復(fù)性好。
e)經(jīng)化學(xué)衍生化反應(yīng)生成的衍生化產(chǎn)物不會(huì)發(fā)生消旋作用。有利于結(jié)構(gòu)測(cè)定和適合于高活性肽的合成。
f)在標(biāo)記試劑合成，衍生化反應(yīng)和衍生化產(chǎn)物分離，檢測(cè)過(guò)程中不需要采用毒性強(qiáng)、價(jià)格昂貴試劑或溶劑。
g)合成方便、成本相應(yīng)較低。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但其并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1(1)乙?；?8.6克苯胺溶于500毫升水和17克濃硫酸配成的溶液中，攪拌加熱到50℃。加入25毫升乙酐。當(dāng)乙酐全溶時(shí)，加入濃度為30％的醋酸鈉水溶液100毫升，用冰水冷卻。過(guò)濾析出的白色產(chǎn)物、水洗、在40℃干燥，得產(chǎn)物乙酰苯胺22克，產(chǎn)率81.5％。熔點(diǎn)115℃。
(2)氯磺化在裝有攪拌器、溫度計(jì)和氯化氫氣體吸收器的三口瓶中、加入58克氯磺酸，攪拌冷卻到15℃以下。加入13.5克乙酰苯胺，加熱到60℃，反應(yīng)2小時(shí)。冷卻后倒入冰水中，沉淀、過(guò)濾、水洗到中性。得產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基苯磺酰氯19克，產(chǎn)率81％。熔點(diǎn)149℃。
(3)制取對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟把70克對(duì)乙酰氨基苯磺酰氯加入到盛有19克氟化鈉溶于400毫升水的三口瓶?jī)?nèi)。攪拌加熱至60-110℃，反應(yīng)1小時(shí)。冷卻、過(guò)濾，在冰醋酸中重結(jié)晶后，得產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟，熔點(diǎn)175-176℃。
(4)水解向上述反應(yīng)物中加入20％鹽酸75毫升，加熱回流30分鐘，待懸浮物消失后，冷卻過(guò)濾。用10％的氫氧化鈉溶液中和濾液到白色的游離胺析出。過(guò)濾、水洗、乙醇重結(jié)晶后得31克產(chǎn)物對(duì)氨基苯磺酰氟，熔點(diǎn)68-69℃。(3)、(4)兩步合并產(chǎn)率為60％。
(5)重氮化把1.4克對(duì)氨基苯磺酰氟溶于10毫升水和2毫升濃鹽酸中，攪拌下在0-5℃間向?qū)Π被交酋７}酸溶液中加入濃度為23％的亞硝酸鈉水溶液2.4毫升進(jìn)行重氮化反應(yīng)，制得氯化磺酰氟重氮苯。
(6)偶合把上述氯化磺酰氟重氮苯的水溶液在攪拌下加入到冷卻到10℃以下的0.97克N，N-二甲苯胺溶于1.5毫升濃鹽酸和9毫升水配成的溶液中。用濃度為10％的碳酸鈉水溶液調(diào)整pH到6-8，得紅色沉淀。靜置分層，過(guò)濾、干燥后得紅色粉狀固體產(chǎn)物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟2克，產(chǎn)率84％。分子量307.33，熔點(diǎn)151℃。
實(shí)施例2將實(shí)施例1步驟(3)中的氟化鈉改用氟化鉀，反應(yīng)溫度控制在80-90℃，其它均與實(shí)施例1相同，同樣制得產(chǎn)物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟2克，收率83％。
實(shí)施例3將實(shí)施例1步驟(3)中的氟化鈉改用氟化銣，反應(yīng)溫度控制在80-90℃，其它均與實(shí)施例1相同，同樣制得產(chǎn)物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟2克，收率83％。
實(shí)施例4(應(yīng)用)衍生化反應(yīng)準(zhǔn)確稱(chēng)取20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶入100μl濃度為0.1mol/L、pH為9.3的碳酸氫鈉緩沖液中(每種氨基酸濃度為3.5nmol)，再加入200μl濃度為4μmol/mL的4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟溶于乙醇中的溶液。在pH 9.3、35℃反應(yīng)30分鐘，即得衍生化產(chǎn)物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰-氨基酸(dabsyl-NHCHRCOOH)。
高效液相色譜分離檢測(cè)向上述衍生液中加入體積比為1/1的乙醇/磷酸氫二鈉(pH7、濃度為50mmol)的反應(yīng)終止稀釋液700μl。離心，取20μl上層清液進(jìn)樣。用含有4％N-二甲基甲酰胺、pH 6.5、濃度為25mM的醋酸鈉緩沖液作為洗脫液A，100％的乙醇作為洗脫液B，進(jìn)行二元梯度洗脫，在可見(jiàn)光區(qū)432-438nm處進(jìn)行檢測(cè)。靈敏度達(dá)到pmol級(jí)。
實(shí)施例5(應(yīng)用)衍生化反應(yīng)取濃度為0.05mol/L的對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟的乙醇溶液200μL，注入到盛有38μL溶有20種氨基酸的，每種氨基酸濃度為0.002mol/L的硼酸鈉緩沖液中，再加入5μL乙醇(甲醇)。在pH 9.3、35℃時(shí)反應(yīng)30分鐘，即得衍生化產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基苯磺酰-氨基酸(aabsyl-NHCHRCOOH)。甲醇和乙醇均可作為衍生化反應(yīng)的溶劑。對(duì)于大多數(shù)氨基酸而言，甲醇用量為氨基酸劑量的5-7倍時(shí)，達(dá)到最高的衍生化產(chǎn)率。
毛細(xì)管電泳分離檢測(cè)采用由20mM的硼酸、140mM的十二烷基硫酸鈉和20mM的氯化鈉配成的緩沖溶液作為流動(dòng)相，20種氨基酸的衍生化產(chǎn)物可以在15分鐘內(nèi)得到分離和檢測(cè)。(其流出順序?yàn)?.賴(lài)氨酸，2.谷氨酰胺，3.苯丙氨酸，4.蘇氨酸，5.天冬酰胺，6.異亮氨酸，7.亮氨酸，8.吉氨酸，9.絲氨酸，10.蛋氨酸，11.脯氨酸，12.丙氨酸，13.甘氨酸，14.苯丙氨酸，15.色氨酸，16.半胱氨酸，17.對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟，18.色氨酸，19.天冬氨酸，20精氨酸，21.谷氨酸，22.組氨酸，23.酪氨酸.)檢測(cè)靈敏度對(duì)于大多數(shù)氨基酸而言達(dá)到0.1-0.4pmol。
采用本發(fā)明方法制備的化合物作為標(biāo)記試劑與現(xiàn)有標(biāo)記試劑的性能對(duì)比參見(jiàn)下表
柱前標(biāo)記試劑性能比較表

權(quán)利要求
1.4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟，分子式為(CH3)2NC6H4N＝NC6H4SO2F。
2.按照權(quán)利要求1所述的標(biāo)記試劑，其特征在于該試劑為紅色粉狀固體，分子量307.33，熔點(diǎn)151℃。
3.權(quán)利要求1所述標(biāo)記試劑的合成方法，其特征在于通過(guò)以下連續(xù)反應(yīng)步驟進(jìn)行合成1)以苯胺為原料在50-60℃間經(jīng)乙酐乙酰化制得乙酰苯胺；2)乙酰苯胺與氯磺酸在溫度不高于60℃的條件下進(jìn)行氯磺化反應(yīng)，生成對(duì)乙酰氨基苯磺酰氯；3)對(duì)乙酰氨基苯磺酰氯與金屬氟化物在60-110℃間的水溶液中反應(yīng)生成對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟；4)對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟在強(qiáng)酸中加熱回流水解，生成對(duì)氨基苯磺酰氟；5)對(duì)氨基苯磺酰氟在鹽酸和亞硝酸鈉水溶液中，低溫10℃下進(jìn)行重氮化反應(yīng)，生成氯化磺酰氟重氮苯；6)氯化磺酰氟重氮苯與N，N-二甲苯胺在低溫下、pH 6-9的水溶液中進(jìn)行偶合反應(yīng)，得到最終產(chǎn)物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于步驟3)中金屬氟化物為氟化鈉或氟化鉀。
5.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于步驟3)中溫度為80-90℃。
6.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于步驟4)中強(qiáng)酸為濃鹽酸或濃硫酸中的一種或兩種。
7.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于步驟6)中反應(yīng)溫度為10℃以下、pH為6-8。
8.按照權(quán)利要求3所述標(biāo)記試劑對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟的合成方法，其特征在于通過(guò)以下連續(xù)反應(yīng)步驟進(jìn)行合成1)以苯胺為原料在50-60℃間經(jīng)乙酐乙?；频靡阴１桨罚?)乙酰苯胺與氯磺酸在溫度不高于60℃的條件下進(jìn)行氯磺化反應(yīng)，生成對(duì)乙酰氨基苯磺酰氯；3)對(duì)乙酰氨基苯磺酰氯與金屬氟化物在60-110℃水溶液中反應(yīng)生成對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟。
9.權(quán)利要求1所述標(biāo)記試劑的用途，其特征在于4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟和組成人體蛋白質(zhì)的20種氨基酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)，生成用紫外分光光度計(jì)在可見(jiàn)光區(qū)432-438nm處進(jìn)行檢測(cè)的衍生化產(chǎn)物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4-磺酰-氨基酸。
10.權(quán)利要求8方法制備的標(biāo)記試劑的用途，其特征在于對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟與組成人體蛋白質(zhì)的20種氨基酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)，生成用紫外分光光度計(jì)在紫外光區(qū)250-255nm處進(jìn)行檢測(cè)的衍生化產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基苯磺酰-氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種可以與蛋白質(zhì)、氨基酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)的新型標(biāo)記試劑4－(N，N－二甲氨基)偶氮苯－4’－磺酰氟及其合成方法和該化合物在蛋白質(zhì)、氨基酸分析中的應(yīng)用，及其中間體對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟的合成方法和該化合物在蛋白質(zhì)、氨基酸分析中的應(yīng)用。該標(biāo)記試劑以苯胺為原料經(jīng)過(guò)乙酰化、氯磺化和氟代反應(yīng)制備對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟，再把對(duì)乙酰氨基苯磺酰氟水解、經(jīng)重氮化、偶合反應(yīng)后制得。該標(biāo)記試劑合成方便、易于保存、在溫和條件下和一級(jí)或二級(jí)氨基酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)、衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定、液相或毛細(xì)色譜分離方便和儀器響應(yīng)值高、檢測(cè)靈敏度達(dá)pmol級(jí)。達(dá)到化學(xué)衍生化—儀器檢測(cè)的效果。
文檔編號(hào)G01N33/58GK1776424SQ200510095680
公開(kāi)日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2005年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月28日
發(fā)明者李壽椿 申請(qǐng)人:李壽椿