專利名稱：一種禽流感病毒乳膠凝集檢測試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于禽類免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及免疫學(xué)、應(yīng)用化學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。具體地講本發(fā)明涉及一種禽流感病毒乳膠凝集檢測試劑盒及該試劑盒在禽流感病毒檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
眾所周知，禽流感是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)和危及人類健康的烈性傳染病。1997年“香港禽流感”事件是第一次禽流感直接跨種傳播給人，2004年的東南亞禽流感，更加引起全世界對禽流感跨種傳播的極大關(guān)注。我國2004年也有16個省市50個疫點(diǎn)也大面積暴發(fā)了禽流感疫情，引起了我國養(yǎng)禽業(yè)的重大損失。
目前，檢測禽流感的病原學(xué)方法主要有病毒的分離鑒定、中和試驗(yàn)(SN)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)、RT-PCR、免疫熒光試驗(yàn)(IF)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。病毒的分離鑒定是檢測AIV的最根本、最經(jīng)典的方法，但該方法存在著固有的一些不足之處，比如操作相對繁瑣、需要的時間長，容易受到污染以及生物安全性等問題。中和試驗(yàn)比較煩瑣，而且需要很有經(jīng)驗(yàn)的人員來操作。瓊脂擴(kuò)散和免疫熒光試驗(yàn)在敏感性和特異性方面都不盡人意，且田間樣本復(fù)雜多變，干擾大，樣本處理難，使得這些方法在臨床檢測中的應(yīng)用受到一定限制。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雖然相對容易一些，但仍然需要一定的儀器設(shè)備和操作技能。乳膠凝集試驗(yàn)(Latex Aagglutination Test，LAT)由于其迅速、簡單和無須專門的技能和任何儀器設(shè)備而具有巨大的優(yōu)勢。
從上個世紀(jì)中葉聚苯乙烯乳膠顆粒開始用做凝集試驗(yàn)的材料以來，由于其所具有的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，如操作簡便，不需要特殊的儀器，肉眼判斷，也不需要對操作過程進(jìn)行培訓(xùn)；時間短，一般在2分鐘之內(nèi)可以出結(jié)果；價格低廉，檢測單份樣品比其它血清學(xué)、病原學(xué)方法便宜得多；適合于現(xiàn)場檢測等，在臨床檢驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用。其意義有①傳染性疾病的診斷細(xì)菌、真菌、寄生蟲、立克次體、病毒的感染檢測；②自身免疫病診斷如抗核抗體、類風(fēng)濕因子等檢測；傳統(tǒng)的乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)是以惰性聚苯乙烯膠乳顆粒作為載體，吸附特定的抗原或抗體，當(dāng)遇到相應(yīng)的抗體和抗原成份時，會形成肉眼可見的凝集顆粒。在應(yīng)用乳膠凝集技術(shù)建立病原學(xué)檢測方法時，一般是將特異性抗體致敏到乳膠顆粒表面，普通聚苯乙烯膠乳和抗體的結(jié)合為無選擇性的物理靜電吸附，由于抗體的分子量小，很難結(jié)合到乳膠表面，即使致敏上的抗體也容易從乳膠顆粒上脫落或者變性失活，導(dǎo)致致敏好的乳膠試劑保存期短，難以適合產(chǎn)品開發(fā)的需要。為此，本申請人以帶有羧基基團(tuán)(-COOH)的羧化聚苯乙烯膠乳為載體，以雙功能試劑水溶性碳化二亞胺(EDAC)為介質(zhì)，經(jīng)化學(xué)反應(yīng)將抗體(IgG)分子偶聯(lián)到乳膠表面。本發(fā)明的方法克服了普通乳膠致敏抗體時，致敏量少，不穩(wěn)定，抗體容易脫落等缺點(diǎn)，提高了抗體的結(jié)合效率，而且致敏上的抗體不容易從乳膠顆粒上脫落，進(jìn)而提高乳膠的敏感性和保質(zhì)期，適合了產(chǎn)品開發(fā)和大規(guī)模生產(chǎn)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是組裝一種用于檢測所有亞型禽流感病毒的乳膠凝集試劑盒。
本發(fā)明的第二個目的是試劑盒在禽流感病毒檢測中的應(yīng)用。
本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖見圖1所示。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本申請人從分離得到的禽流感病毒毒株QLG-001(該毒株保藏在CCTCC，保藏編號CCTCC-V200512)中提取核蛋白，然后免疫家兔得到免疫血清，從該免疫血清中提取IgG，用該IgG制敏羧化乳膠得到乳膠診斷試劑，并以該乳膠診斷試劑為核心試劑組裝了一種用于快速檢測禽流感病毒的乳膠凝集試劑盒。本發(fā)明的試劑盒是由盒體和包含在盒體內(nèi)的乳膠診斷試劑、樣品處理液A，樣品處理液B，陽性對照樣品和陰性對照樣品組成。
所述的樣品處理液A和B的組分及含量按重量/體積為樣品處理液ANa2B4O7·10H2O 13.3g/LH3BO316.08g/LNaCl 8.5g/L補(bǔ)充蒸餾水至1L。
樣品處理液BNa2B4O7·10H2O 13.3g/LH3BO316.08g/LNaCl8.5g/LN-乙酰-L-半胱氨酸 5g/LNonidetP-40(NP-40) 5ml/L補(bǔ)充蒸餾水至1L。
所述的陽性對照樣品是滅活的禽流感病毒 1ml/管陰性對照樣品是無特定病原微生物(SPF)雞胚尿囊液1ml/管其中所說的陽性對照樣品的血清型是經(jīng)過滅活的禽流感病毒H9N2亞型。
適用于權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的檢測試劑盒的禽流感Avian influenza virus病毒株QLG-001，保藏在CCTCC，保藏編號CCTCC-V200512。
顯而易見，本發(fā)明制備的試劑盒不僅適用于在檢測禽流感病毒上的應(yīng)用，其中包括在檢測禽流感病毒H9亞型上的應(yīng)用。
能直接對樣本中的禽流感病毒進(jìn)行檢測。若樣本中含有禽流感病毒，則乳膠試劑在30秒內(nèi)出現(xiàn)明顯均勻一致的凝集，判為陽性結(jié)果；若樣本中不含有禽流感病毒，則乳膠試劑在30秒內(nèi)液滴仍然呈原有的均勻乳狀，判為陰性結(jié)果。
與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、直接對禽流感病毒進(jìn)行檢測，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測時間短(30秒之內(nèi)出結(jié)果)，檢測樣品范圍寬(雞胚尿囊液、喉頭拭子和各種內(nèi)臟組織)的特點(diǎn)；2、本發(fā)明的試劑盒適用于對禽流感病毒H1-H15所有亞型進(jìn)行檢測，顯而易見，本發(fā)明組裝的試劑盒也可用于普通禽流感病毒的特異檢測。
3、本發(fā)明的檢測方法不需要任何特殊儀器、設(shè)備，具有檢測成本低的特點(diǎn)。試劑盒操作簡便，不需由專業(yè)人員操作。保存期長，在4℃條件下放置半年不會影響其敏感性。


圖1是本發(fā)明總體技術(shù)路線圖；圖1是本發(fā)明分離、鑒定的禽流感病毒株QLG-001負(fù)染病毒粒子的電鏡照片(×60000)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1禽流感毒株的分離和鑒定用于本發(fā)明的編號為QLG-001禽流感毒株，于2003年4月5日從湖北省某地送檢鴨中分離得到，經(jīng)中國流感中心鑒定為H9N2亞型，通過電鏡觀察、血清學(xué)試驗(yàn)、致病力及動物回歸試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該病毒分離株為典型的A型流感病毒。EID50及致病性試驗(yàn)(IVPI以及ICPI)表明該病毒為低致病力毒株(LPAIV)。該禽流感毒株QLG-001于2005年9月2日保藏在CCTCC，保藏編號為CCTCC-V200512。該病毒株的保藏方式是將其置于-80℃條件下凍干保存。
具體分離、鑒定步驟如下(1)送檢病鴨發(fā)病情況及剖檢病變蛋鴨產(chǎn)蛋量迅速下降(下降至10％)，產(chǎn)小型蛋、畸形蛋。剖檢可見卵泡萎縮，有的充血、出血。種鴨苗在20日齡開始發(fā)病，飲食頹廢，甚至廢絕，拉白色稀糞，呼吸道癥狀并不典型，主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀，時而臥地不起，時而高高躍起，垂死掙扎，與以前有關(guān)同亞型禽流感毒株癥狀的報道差別較大。6天后，死亡率達(dá)到高峰，日死淘率在5％以上，剖檢發(fā)現(xiàn)，心臟冠狀溝脂肪有出血點(diǎn)，心肌出現(xiàn)大面積灰白色條狀壞死，這一點(diǎn)也正是發(fā)病鴨的典型病變。此后雖使用過多種抗菌藥和抗病毒藥，仍無明顯效果。
(2)病毒分離采集病鴨氣管、肺、腎臟，用玻璃勻漿器勻漿后加入滅菌的生理鹽水，制成10％的懸液，加入雙抗(最終濃度為1000U/mL)于37℃孵育30min后，6000r/min離心30min后取上清，將上清作無菌檢驗(yàn)，合格者保存?zhèn)溆?。將無菌上清液經(jīng)尿囊腔接種9日齡雞胚，0.2mL/胚。將接種后的雞胚置37℃孵育，棄去24h內(nèi)死亡雞胚。24h后死亡雞胚，無菌收獲絨毛尿囊液。雞胚分別于36h-48h死亡，收獲雞胚尿囊液，每一代尿囊液作無菌檢驗(yàn)后再繼續(xù)傳代。經(jīng)雞胚接種收獲的第2代含病毒的雞胚尿囊液對雞紅細(xì)胞凝集作用(HA)明顯增高2-5個滴度。經(jīng)無菌檢驗(yàn)合格者作為連續(xù)傳代用毒種。
(3)病毒鑒定1)血清學(xué)鑒定取病毒分離為陽性的尿囊液，用ND、IB、IBD及EDS-76抗血清進(jìn)行HI試驗(yàn)，不產(chǎn)生抑制現(xiàn)象，表明分離株并非上述病毒株。AGP試驗(yàn)表明，制備的AGP抗原與A型禽流感病毒的陽性血清之間在48小時后可產(chǎn)生沉淀線，與陽性抗原和陽性血清之間的沉淀線恰好相連，從而初步證實(shí)該分離株為A型流感病毒。
2)血凝素亞型鑒定分離株尿囊液經(jīng)與H5、H7和H9血凝素分型血清進(jìn)行交互試驗(yàn)，證明該分離株為H9亞型。該毒株提交用于專利程序的生物材料的名稱為QLG-001，該禽流感病毒株已于2005年9月2日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號CCTCC NOV200512?？寺≡摱局闚A基因，經(jīng)測序、Blast比較，證明與H9N2亞型流感病毒同源性最高可達(dá)99％。
3)電鏡觀察電子顯微鏡下，經(jīng)負(fù)染處理的病毒粒子呈圓形或橢圓形，直徑80～120nm，有囊膜，為典型的禽流感病毒粒子(見圖2)。
(4)禽流感病毒株QLG-001的生物學(xué)特性1)EID50的測定該病毒分離株尿囊液EID50結(jié)果見表1。按Reed和Muench法計算EID50為10-6.59/0.2ml。
表1AIV分離株EID50測定結(jié)果

注距離比例＝(高于50％死亡率的百分?jǐn)?shù)-50％)/(高于50％百分?jǐn)?shù)-低于50％死亡率的百分?jǐn)?shù))＝(91.6-50)/(91.6-22.2)＝0.59logEID50＝距離比例×稀釋度對數(shù)之間的差+高于50％死亡率的稀釋度的對數(shù)＝0.59×(-1)+(-6)＝-6.59EID50＝10-6.59/0.2ml。
2)IVPI的測定每只雞靜脈接種0.2ml 1∶10倍稀釋的濾菌尿囊液，觀察10天，在接種后第5天有1只死亡，第6天死亡1只，到第10天無死亡雞，計算IVPI為0.74(見表2)。
表2AIV分離株IVPI測定結(jié)果

注IVPI＝累計分?jǐn)?shù)/正常、發(fā)病、死亡共計總和＝(43×0)+(26×1)+(11×3)/(43+26+11)＝59/80＝0.743)ICPI的測定每只雞腦內(nèi)接種0.05ml 1∶10倍稀釋的濾菌尿囊液，觀察8天，在接種后第2天雞群開始發(fā)病，到第5天，試驗(yàn)雞全部死亡，計算ICPI為1.30(見表3)。
表3AIV分離株ICPI測定結(jié)果

注ICPI＝累計分?jǐn)?shù)/正常、發(fā)病、死亡共計總和＝(26×0)+(4×10)+(50×2)/(26+4+50)＝104/80＝1.304)對雞的致病力試驗(yàn)以0.2ml/只感染非免疫雞后，在第3天，有2只出現(xiàn)輕度的臨床癥狀，精神呆滯，瞌睡，流涎，流淚，飲食較差，拉白色糞便，第5天有1只雞死亡，其余的或正發(fā)病或已逐漸康復(fù)，最終死亡1只。在接種病毒后第7天采血，攻毒組血清中能檢測到抗H9亞型流感抗體，HI價為5-6log2，對照組HI為陰性，并且從病料中均分離出該亞型毒株。
5)動物回歸試驗(yàn)以0.2ml/只接種非免疫鴨后，第2天有1只鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，扭頭歪頸，4天后有2只鴨死亡，剖檢癥狀與臨床中一致。血凝實(shí)驗(yàn)表明，攻毒組血清中能檢測到抗H9亞型流感抗體，對照組HI為陰性，接種雞胚后亦能分離出該亞型毒株。剖檢可見，腿部肌肉有出血點(diǎn)，喉頭、氣管有明顯淤血肝臟腫大，有出血點(diǎn)；十二指腸及小腸黏膜紅腫，有程度不同的出血點(diǎn)或出血斑；腺胃與食道，腺胃與肌胃交界處有帶狀出血；胰腺出血，有淡黃色斑點(diǎn)狀壞死點(diǎn)；花斑腎。
(5)病毒的理化特性1)血凝素?zé)岱€(wěn)定性試驗(yàn)分離株尿囊液經(jīng)56℃水浴5min，其HA效價下降2個滴度，56℃水浴200min后已檢測不到HA效價，說明其血凝素為熱不穩(wěn)定型(見表4)。
表456℃水浴不同時間(min)后血凝素?zé)岱€(wěn)定性測定結(jié)果

2)耐熱性AIV分離株的耐熱性鑒定的結(jié)果見表5。AIV分離株在4℃放置60min后，對雞胚的感染力不變，50℃放置60min、60℃放置10min后均檢測不到HA效價，表明該分離株對熱敏感(見表5)。
表5不同溫度、時間處理后接種雞胚的感染數(shù)*

注分母為接種雞胚數(shù)，分子為尿囊液HA陽性胚數(shù)3)化學(xué)特性AIV分離株化學(xué)特性鑒定見表6。AIV分離株經(jīng)乙醚、氯仿和酸處理接種雞胚后，均檢測不到HA效價，表明該分離株對乙醚、氯仿和酸均敏感(見表6)。
表6AIV分離株經(jīng)不同方法處理后對雞胚的感染數(shù)*

注分母為接種雞胚數(shù)，分子為尿囊液HA陽性胚數(shù)實(shí)施例2兔抗禽流感病毒核蛋白免疫血清的制備及檢驗(yàn)1免疫抗原的制備(1)病毒的增殖取QLG-1毒株，用滅菌生理鹽水作10-4稀釋，無特定病原微生物(SPF)雞胚尿囊腔接種，每胚0.2mL，接種后密封針孔，37℃繼續(xù)孵育。每12小時照蛋1次，將24小時前死亡雞胚棄去，24小時至72小時死亡的雞胚置于4℃冷卻過夜，收獲雞胚尿囊液，HA效價≥9log2，方為合格。
(2)病毒的滅活將收獲合格的雞胚尿囊液凍融3次后，加入終濃度為0.2％的甲醛，充分混合均勻后置換至另一無菌容器內(nèi)，37℃作用24小時，每隔6小時振搖1次。滅活雞胚尿囊液抽樣接種9-11日齡SPF雞胚，每胚0.2mL。雞胚在觀察期內(nèi)無死亡，連續(xù)傳2代收獲雞胚尿囊液HA均為陰性，即確認(rèn)為病毒滅活完全。滅活病毒置4℃保存待用，保存期不超過1個月。
(3)病毒的提純滅活的雞胚尿囊液10,000r/min離心，取上清，再經(jīng)27,000r/min離心2小時，棄去上清，收取沉淀病毒，用PBS緩沖液制備成病毒懸液。溶解的病毒懸液再進(jìn)行蔗糖梯度離心，27,000r/min離心2小時，收獲40％處的蛋白沉淀帶，再經(jīng)27,000r/min離心2小時脫糖。
(4)禽流感病毒核蛋白的制備在提純的病毒懸液中加入2％(V/V)的Triton-X100，37℃作用6h后35,000r/min離心2小時，沉淀用生理鹽水溶解，即為純化的核蛋白。用紫外分光光度計(280nm)測定純化抗原的濃度，調(diào)整蛋白濃度為1mg/mL。
2免疫程序用體重2.0kg以上的健康家兔，首次免疫于后足皮內(nèi)各注射弗氏完全佐劑抗原250μg，1周后，于兩后肢腫大的腘窩淋巴結(jié)內(nèi)各注射弗氏不完全佐劑抗原1mg，第2周于肌肉和皮下多點(diǎn)注射弗氏不完全佐劑抗原5mg，4周后耳靜脈注射無佐劑抗原5mg，1周后采血測試效價。待瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)效價達(dá)到1∶32時頸動脈放血。收集血清置-70℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。具體免疫程序見表7。
表7制備兔抗禽流感病毒核蛋白的免疫程序

3IgG抗體的提取及保存待提純的血清先于4℃，12,000r/min離心10min，棄雜質(zhì)，然后每份血清加4倍體積0.06M，pH4.5的醋酸鹽緩沖液，然后在室溫下緩慢加入辛酸(25L/mL)，邊滴加邊攪拌，滴完后室溫繼續(xù)攪拌30min，然后4℃靜置2h，12,000r/min離心10min，取上清調(diào)pH值至7.4，用45％的飽和硫酸銨沉淀，pH7.4，0.01MPBS溶解后透析過夜。透析完后分裝到1.5mLEP管中，分裝量為1mL，凍存于-80℃，待用。注意避免反復(fù)凍融和污染。
實(shí)施例3禽流感病毒乳膠凝集檢測方法的建立取125μL10％羧化乳膠放入EP管中，pH9.6，0.1M碳酸緩沖液洗3遍，再用pH4.5，0.01M磷酸緩沖液選3遍，然后加入0.5％的水溶性碳化二亞胺在磷酸緩沖液中室溫作用4h，后用pH8.5，0.01M硼酸緩沖液洗3遍，將乳膠用1ml硼酸緩沖液懸浮后加入適量的IgG致敏一定時間后加入終止劑終止反應(yīng)。。
1最佳偶聯(lián)IgG量的確定在1mL硼酸緩沖液懸浮的羧化乳膠中，分別加入不同量的IgG，從200μg、400μg、600μg遞增至1800μg，第6步后收集上清，經(jīng)UV-120分光光度計測定上清中剩余的蛋白量，計算IgG的偶聯(lián)效率，公式如下IgG的偶聯(lián)效率(％)＝(IgG的初始加入量-剩余的IgG量)/IgG的初始加入量×100％經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在1mL濃度為1％的羧化乳膠中，當(dāng)加入的IgG量為800-1000μg時，偶聯(lián)效率達(dá)到最大，此時乳膠檢測的靈敏度最高，穩(wěn)定性最好。具體結(jié)果見表8表8不同IgG加入量時的偶聯(lián)效率

2最佳偶聯(lián)時間的選擇在1mL硼酸緩沖液懸浮的羧化乳膠中，加入1000μgIgG，在室溫作用不同的時間(0.5、1、2、4、，6、8、10、12、14h)，作用完后收集上清，經(jīng)UV-120分光光度計測定上清中剩余的蛋白量，計算IgG的偶聯(lián)效率，公式如下IgG的偶聯(lián)效率(％)＝(IgG的初始加入量-剩余的IgG量)/IgG的初始加入量×100％經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)偶聯(lián)時間達(dá)到8h時，偶聯(lián)到乳膠微球上的IgG量基本上不再變化，此時偶聯(lián)效率達(dá)到最大，所以選用8h作為最佳偶聯(lián)時間。具體結(jié)果見表9表9不同致敏時間時的偶聯(lián)效率

3偶聯(lián)反應(yīng)終止劑的選擇抗體與乳膠微球過度偶聯(lián)會導(dǎo)致抗體失活，從而降低抗體-微球基質(zhì)與抗原結(jié)合的能力。所以需要在反應(yīng)體系中引入其它氨基基團(tuán)以終止偶聯(lián)反應(yīng)。常用的終止劑為乙醇胺和甘氨酸。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證乙醇胺的終止效果要好于甘氨酸，故選用乙醇胺作為終止劑，所用的濃度為0.1M，劑量為1mL濃度為1％的羧化乳膠中加入50μL 0.1M乙醇胺，反應(yīng)時間為15min。
實(shí)施例4LAT的敏感性試驗(yàn)和特異性試驗(yàn)
1、敏感性試驗(yàn)將禽流感各亞型(H1～15)尿囊液病毒倍比稀釋，分別用致敏好的乳膠診斷試劑檢測，發(fā)現(xiàn)可與1∶64稀釋的尿囊液毒反應(yīng)(+++)，達(dá)到了較好的敏感性(該試驗(yàn)結(jié)果由國家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證)。結(jié)果見表10表10敏感性試驗(yàn)(n＝5)

注“++++”全部乳膠凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明；“+++”大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁；“++”約50％乳膠凝集，但顆粒較細(xì)，液體較混濁“+”有少許凝集，液體呈混濁；“-”液滴呈原有的均勻乳狀。
2、特異性試驗(yàn)致敏好的乳膠試劑禽流感病毒反應(yīng)呈強(qiáng)陽性，與雞主要的呼吸道病毒如雞新城疫病毒(NDV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(52、120株)、雞減蛋綜合癥病毒(EDSV-76)、禽副粘病毒2型(PMV-2)、SPF雞胚尿囊液均不反應(yīng)，達(dá)到了較好的特異性。結(jié)果見表11。
表11特異性試驗(yàn)(n＝5)

實(shí)施例5乳膠凝集試劑盒的重復(fù)性試驗(yàn)1批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)制備3批禽流感病毒乳膠凝集檢測試劑盒(批號為0481、0482、0483)，每批5個(試劑盒編號從01-05)，在每批試劑盒中隨機(jī)抽取3個試劑盒對滅活的H9N2亞型、H4N6亞型、H3N2亞型、H1N1亞型禽流感病毒和雞新城疫病毒(NDV)進(jìn)行檢測，觀察其敏感性、特異性和穩(wěn)定性。結(jié)果表明，其敏感性、特異性和穩(wěn)定性沒有變化，說明本LAT方法的批內(nèi)重復(fù)性良好。結(jié)果見表12、13、14表12批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)(試劑盒批號0481)

表13批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)(試劑盒批號0482)

表14批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)(試劑盒批號0483)

2批間重復(fù)性試驗(yàn)在不同時間制備3批禽流感病毒乳膠凝集檢測試劑盒(批號為0481、0482、0483)，對同一份滅活的H9N2亞型、H4N6亞型、H3N2亞型、H1N1亞型禽流感病毒和新城疫病毒進(jìn)行檢測，觀察其敏感性、特異性和穩(wěn)定性。結(jié)果表明，其敏感性、特異性和穩(wěn)定性沒有變化，說明本LAT方法的批間重復(fù)性良好。結(jié)果見表15表15批間重復(fù)試驗(yàn)

實(shí)施例6試劑盒對試驗(yàn)感染動物不同樣本的檢測1動物感染試驗(yàn)方案動物試驗(yàn)均在通過驗(yàn)收許可的具有負(fù)壓裝置的小動物房中的雞高效隔離器中進(jìn)行，所有的淘汰動物都經(jīng)焚尸爐焚燒處理。
1)禽流感病毒毒株本發(fā)明分離得到的禽流感毒株編號為QLG-1，該毒株于2005年9月2日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC-V200512，(HA效價210)；H1N1尿囊液原毒(HA效價210)；H3N2尿囊液原毒(HA效價211)H4N6尿囊液原毒(HA效價211)NDV尿囊液原毒(HA效價28)；由華農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物病毒室提供。
2)試驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)前測定所有雞的血凝抑制(HI)效價，選取抗體水平為陰性的雞120只進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。試驗(yàn)分為H9N2、H1N1、H3N2、H4N6四個人工感染組，每組30只，同時平行設(shè)1000EID50、100EID50、10EID50、1EID50和0.1EID505個攻毒劑量，每個劑量組6只。攻毒方式為胸部肌肉注射0.3mL/只。
2試驗(yàn)樣本檢測結(jié)果表16禽試驗(yàn)樣本檢測結(jié)果

四個不同亞型的流感病毒對雞的致病力相當(dāng)，當(dāng)攻毒劑量為1000EID50時，第3天有4只雞死亡，死亡率為3.3％(4/120)，但其它的雞都能夠耐過并且表現(xiàn)出良好的精神狀態(tài)，直到20天時雞只仍然沒有出現(xiàn)死亡，20天后我們將所有存活的雞處死并收集內(nèi)臟組織進(jìn)行LAT檢測。從表中可以看出，我們制備的乳膠試劑可以從各組攻毒雞的喉頭拭子和組織臟器中檢測出禽流感病毒，其中肺臟的檢出率最高，可以達(dá)到96.7％，其次是腎臟，脾臟、肝臟、胰臟的檢出率相當(dāng)，胸部肌肉的檢測結(jié)果都為陰性。喉頭拭子的檢出率大約在80％左右。四個亞型的禽流感病毒中。對H3N2的檢出率要略低于其它亞型一些，這與敏感性試驗(yàn)結(jié)果(見表10)是一致的。
3陰性符合率80份陰性喉頭拭子和15份內(nèi)臟組織均采自SPF雞，病毒分離鑒定的結(jié)果均為陰性，結(jié)果見表17表17陰性符合率檢測結(jié)果

從表11中可以看出，對于不帶毒的健康雞的樣本，檢測結(jié)果其陰性符合率分別達(dá)到100％，基本上消除了由樣本中的雜質(zhì)所引起的非特異性凝集。
4新城疫病毒(NDV)感染雞LAT檢測結(jié)果用新城疫尿囊液病毒(HA211)攻毒20只，胸部肌肉注射尿囊液原毒0.5mL。由表18的結(jié)果可以看出，特異性符合率達(dá)到了100％。
表18新城疫病毒(NDV)感染雞LAT檢測結(jié)果

5動物試驗(yàn)的結(jié)果分析從動物試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，將兔抗禽流感病毒核蛋白(NP)免疫血清提取IgG后致敏羧化聚苯乙烯乳膠，可以檢測出所有亞型的禽流感病毒，與新城疫等其它病毒不反應(yīng)，說明本發(fā)明具有良好的特異性和敏感性。從攻毒后雞的喉頭拭子和內(nèi)臟組織中均可以檢測到禽流感病毒，內(nèi)臟組織的檢出率要高于喉頭拭子，與病毒分離鑒定的結(jié)果相比，肺臟組織浸出液的檢出率最高，達(dá)到了96.7％，而且陰性符合率也達(dá)到了100％。符合了診斷試劑的要求。
實(shí)施例7LAT試劑盒與其它檢測禽流感病毒方法的比較1LAT試劑盒與病毒分離的比較在湖南省獸醫(yī)總站進(jìn)行田間試驗(yàn)評估，共檢測臨床送檢樣本123份，與病毒分離鑒定進(jìn)行比較，兩者的符合率為96％。具體結(jié)果見表19表19LAT試劑盒與病毒分離的比較結(jié)果

2LAT試劑盒與禽流感病毒免疫層析試劑盒的比較在湖南省獸醫(yī)總站進(jìn)行田間試驗(yàn)評估，共檢測臨床送檢樣本123份，與禽流感病毒免疫層析試紙條檢測試劑盒(Animal Genetics，Inc.(476-1 Pajang-dong，Jangan-gu，Suwon-si，Kyonggi-do，Korea))進(jìn)行比較，，兩者的符合率為96.7％。具體結(jié)果見表20表20LAT試劑盒與免疫層析試劑盒的比較結(jié)果

3LAT試劑盒與禽流感病毒熒光RT-PCR的比較在深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局進(jìn)行田間試驗(yàn)評估，與禽流感病毒熒光RT-PCR試劑盒(深圳太太基因有限公司)進(jìn)行比較，共檢測樣本218份，其中雞胚培養(yǎng)尿囊液病毒2份，陽性結(jié)果2份；雞大腿(骨髓)23份，其中4份陽性；雞翅膀(骨髓)23份，其中6份陽性；喉頭拭子30份，全部為陰性；肝臟10份，其中3份陽性；胰臟10份，其中1份陽性；脾臟30份，其中6份陽性；肺臟30份，其中10份陽性；腎臟30份，其中7份陽性；肌肉(腿部)30份，其中3份陽性；218份樣本中共有陽性結(jié)果42份。在檢測過的30只雞中有10只為禽流感陽性(以肺臟、腎臟檢出結(jié)果為主要判斷依據(jù))。熒光RT-PCR檢測上述218份樣品，其中陽性8份。在檢測過的30只雞中有3只為禽流感陽性。初步分析，LAT的檢出率要高于熒光RT-PCR。結(jié)果見表21表21LAT試劑盒與熒光RT-PCR試劑盒的比較結(jié)果

實(shí)施例9本發(fā)明的試劑盒保存期試驗(yàn)1、致敏乳膠試劑的保存期試驗(yàn)結(jié)果將同一批致敏的乳膠試劑分裝成小份，分別在4℃和室溫下保存1至6個月，每月定期進(jìn)行LAT試驗(yàn)，分別與滅活的H9N2亞型、H4N6亞型、H3N2亞型、H1N1亞型禽流感病毒和新城疫病毒反應(yīng)，觀察其敏感性、特異性和穩(wěn)定性，以確定乳膠試劑的保存期。在本試驗(yàn)中，申請人制備了三批乳膠診斷試劑(批號分別為0405、0406、0407)，同時進(jìn)行平行試驗(yàn)。通過本試驗(yàn)，乳膠試劑經(jīng)4℃保存6個月以上其特異性，穩(wěn)定性、敏感性均不發(fā)生改變。結(jié)果見表22、23、24表22乳膠診斷試劑保存期試驗(yàn)(批號0405)

注“#”表示“++++”的凝集程度表23乳膠診斷試劑保存期試驗(yàn)(批號0406)

注“#”表示“++++”的凝集程度表24乳膠診斷試劑保存期試驗(yàn)(批號0407)

注“#”表示“++++”的凝集程度2試劑盒其它試劑保存期試驗(yàn)結(jié)果申請人制備了三批試劑盒，將其同時放于4-8℃進(jìn)行保存期試驗(yàn)，結(jié)果表明，陽性樣品對照在4-8℃保存6個月后進(jìn)行LAT試驗(yàn)，其敏感性不發(fā)生改變。陰性樣品對照在4-8℃條件下保存6個月后進(jìn)行LAT試驗(yàn)，結(jié)果仍為陰性。樣本處理液A、B在4-8℃保存6個月后其質(zhì)量和性狀也不發(fā)生改變。說明試劑盒其它試劑在4-8℃可以保存6個月。
實(shí)施例10禽流感病毒乳膠凝集檢測試劑盒的組裝1快速檢測雞禽流感病毒抗體的試劑盒包括1)乳膠抗原 1管 (1ml/管)2)陽性對照 1管 (1ml/管)3)陰性對照 1管 (1ml/管)4)樣品處理液A 1瓶 (100ml/瓶)5)樣品處理液B 1瓶 (100ml/瓶)2相關(guān)溶液的配制1)樣品處理液A的配制稱取Na2B4O7·10H2O 13.3g，H3BO3 16.08g，NaCl 8.5g，ddH2O 800mL，調(diào)pH值為8.4后定容至1000mL。高壓滅菌(121℃，30分鐘高壓蒸汽)后分裝，置4℃貯存，用于處理內(nèi)臟組織。
2)樣品處理液B的配制稱取Na2B4O7·10H2O 13.3g，H3BO3 16.08g，NaCl 8.5g，ddH2O 800mL，調(diào)pH值為8.4后定容至1000mL。高壓滅菌(121℃，30分鐘高壓蒸汽)后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40，混勻后分裝，置4℃貯存，用于處理喉頭拭子。
3)陽性對照的配制用經(jīng)甲醛滅活的H9亞型禽流感病毒作為陽性對照樣品。
4)陰性對照的配制無菌收取SPF雞胚尿囊液，4℃，12,000r/min離心30min后加入0.02％NaN3防腐。分裝成0.5mL/管，置-20℃貯存。
實(shí)施例11本發(fā)明試劑盒的使用方法1、樣品制備1)臨床雞胚分離病毒尿囊液樣本的處理方法尿囊液樣本于12000rpm離心5min取上清待檢。
2)內(nèi)臟組織檢測樣本的處理方法稱取內(nèi)臟組織塊0.5克，置于勻漿器中，加樣本處理液A1ml，研磨完全后取出組織浸出液，凍融3遍，然后于4℃，12000rpm離心15min，取上清待檢。
3)喉頭拭子檢測樣本的處理方法用無菌棉拭子于雞喉頭部沾取滲出液，然后浸泡于0.8ml樣本處理液B中，在蝸漩儀上劇烈震蕩1min后擠出棉拭子中的液體，棄棉拭子，液體部分凍融3次后于37℃溫箱中作用15min，后于4℃，12000rpm離心15min，取上清待檢。
2、檢測取檢測樣品、陽性對照、陰性對照各8-10μl，分置于玻璃片上，各加等量的乳膠，攪拌混勻，搖動30秒后觀察結(jié)果。
3、結(jié)果判定1)對照試驗(yàn)30秒內(nèi)出現(xiàn)如下結(jié)果，試驗(yàn)方可成立陽性對照與乳膠診斷試劑作用出現(xiàn)明顯均勻一致的凝集，陰性對照與乳膠診斷試劑不凝集。
2)30秒內(nèi)出現(xiàn)明顯均勻一致的凝集者判為陽性30秒內(nèi)液滴呈原有的均勻乳狀為陰性。
盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)施例進(jìn)行說明，但是不能認(rèn)為是對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對本發(fā)明進(jìn)行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種適用于禽流感病毒檢測的乳膠凝集試劑盒，它包含盒體和設(shè)在盒體內(nèi)的檢測試劑，其特征在于，所述的檢測試劑是能與禽流感病毒特異反應(yīng)的乳膠試劑，其它組分包括樣品處理液A和樣品處理液B，陽性對照樣品和陰性對照樣品。
2.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的的乳膠試劑是從禽流感病毒中提取核蛋白，然后免疫家兔得到免疫血清，從該免疫血清中提取IgG，用該IgG制敏羧化乳膠得到的，所述的樣品處理液A和B的組分及含量按重量/體積為樣品處理液ANa2B4O7·10H2O13.3g/LH3BO316.08g/LNaCl 8.5g/L補(bǔ)充蒸餾水至1L。樣品處理液BNa2B4O7·10H2O 13.3g/LH3BO316.08g/LNaCl8.5g/LN-乙酰-L-半胱氨酸 5g/LNonidet P-40(NP-40) 5ml/L補(bǔ)充蒸餾水至1L。所述的陽性對照樣品是滅活的禽流感病毒1ml/管所述的陰性對照樣品是SPF雞胚尿囊液 1ml/管
3.權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，其中所說的陽性對照樣品的血清型是H9N2亞型。
4.適用于權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的檢測試劑盒的禽流感Avian influenza virus病毒株QLG-001，保藏在CCTCC，保藏編號CCTCC NOV200512。
5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的試劑盒在檢測禽流感病毒上的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中包括在檢測禽流感病毒H9亞型上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于快速檢測禽流感病毒的乳膠凝集試劑盒。利用水溶性碳化二亞胺將兔抗禽流感病毒核蛋白IgG偶聯(lián)到羧化聚苯乙烯膠乳顆粒的表面，建立了禽流感病毒乳膠凝集檢測方法，再輔以其它配套試劑制備了禽流感病毒乳膠凝集檢測試劑盒。禽流感病毒乳膠凝集檢測試劑盒由盒體和設(shè)在盒體內(nèi)的乳膠診斷試劑、樣本處理液A，樣本處理液B，陽性對照樣品和陰性對照樣品組成。所述的試劑盒能夠直接對禽流感病毒進(jìn)行檢測，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便和診斷快速的顯著優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N33/569GK101025420SQ20051001951
公開日2007年8月29日 申請日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者金梅林, 陳劍鋒, 喻正軍, 張安定, 李紅超, 陳煥春 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)