專利名稱：中藥水提取液中微量馬兜鈴酸a的含量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥水提取液中毒性成分的含量測(cè)定方法，尤其涉及中藥水提取液中馬兜鈴酸A的含量測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
馬兜鈴酸A是中藥中含有的一種毒性成分，能夠引起腎臟損害。含有馬兜鈴酸A的中藥主要是馬兜鈴科植物，主要包括馬兜鈴屬植物馬兜鈴、關(guān)木通、廣防己、青木香、天仙藤、朱砂蓮、尋骨風(fēng)，細(xì)辛屬植物細(xì)辛、杜衡，木通屬植物木通，鐵線蓮屬植物川木通、威靈仙，風(fēng)龍屬植物青風(fēng)藤，千金藤屬植物防己，川木香屬植物川木香，蝙蝠葛屬植物北豆根，云木香屬植物木香。純凈的馬兜鈴酸A在甲醇等有機(jī)溶劑中有較好的溶解性，但難容易水。對(duì)于中藥中馬兜鈴酸A的含量測(cè)定，一般以甲醇為提取溶劑，將馬兜鈴酸A從中藥材中提取出來，再采用靈敏度較高的方法，如高效液相色譜法，進(jìn)行含量測(cè)定。在中藥工業(yè)化生產(chǎn)工藝中，水是經(jīng)常采用的提取溶劑。根據(jù)純凈的馬兜鈴酸A難溶于水的性質(zhì)，馬兜鈴酸A似乎不能夠被提取。但是，多味中藥以水為溶劑共同提取過程中，普遍存在助溶、共溶等作用，中藥材中的馬兜鈴酸A還是能夠被少量提取出來。為了研究中藥的工業(yè)化生產(chǎn)提取工藝的合理性，有必要對(duì)水提取液中的微量馬兜鈴酸A進(jìn)行含量測(cè)定。由于馬兜鈴酸A難溶于水，即使是有共溶、助溶作用的存在，馬兜鈴酸A在水溶液中的含量仍然很低，即使是采用靈敏度很高的高效液相色譜方法，也不能夠定量檢測(cè)。因此，必須采用有效方法，對(duì)中藥水提取液中微量的馬兜鈴酸A成分進(jìn)行濃縮，以便采用合適的含量測(cè)定方法，準(zhǔn)確測(cè)定水提取液中馬兜鈴酸A的含量。
固相萃取(Solid phase extraction，SPE)技術(shù)是一個(gè)包括液相和固相的物理萃取技術(shù)。在固相萃取中，固相對(duì)分離物的吸附力比溶解分離物的溶劑更大。當(dāng)樣品溶液通過吸附劑床時(shí)，分離物濃縮在其表面，其它樣品成分通過吸附劑床。通過只吸附分離物而不吸附其它樣品成分的吸附劑，可以得到高純度和濃縮的分離物。
本發(fā)明將SPE前處理技術(shù)與高效液相色譜技術(shù)聯(lián)合使用，成功將水溶液中微量馬兜鈴酸A進(jìn)行濃縮，使進(jìn)行高效液相色譜分析的樣品溶液含有高濃度的馬兜鈴酸A，能夠準(zhǔn)確測(cè)定中藥提取液中含有的微量馬兜鈴酸A。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是要提供一種中藥水提取液中微量馬兜鈴酸A的含量測(cè)定方法。
本發(fā)明通過以下方案予以實(shí)施中藥的水提取液經(jīng)固相萃取技術(shù)處理后，再用高效液相色譜測(cè)定馬兜鈴酸A的含量。
上述中藥的水提取液可采用加熱或超聲提取方式，提取液離心或過濾，取上清液或?yàn)V液作為提取液。上述高效液相色譜測(cè)定的條件可采用十八烷基鍵合硅膠固定相，乙腈-醋酸水溶液系統(tǒng)流動(dòng)相。
上述中藥的水提取液經(jīng)固相萃取技術(shù)處理，是將中藥的水提取液直接上處理好的固相萃取小柱，用10～70％甲醇或乙醇沖洗，最后用丙酮洗脫，收集丙酮洗脫液，定容，搖勻，即得供測(cè)試用的溶液。
上述固相萃取小柱的處理方法為稱取30～400目固相萃取填料0.2～5g，置于內(nèi)徑0.5～3cm玻璃小柱內(nèi)，加甲醇、乙醇或丙酮5～50mL沖洗后，再用水5～50mL沖洗，備用。固相萃取小柱的填料可為石墨碳反相填料、離子交換樹脂填料、金屬配合物吸附劑填料、鍵合硅膠填料、聚合物吸附劑填料、免疫親和吸附劑填料、分子嵌入聚合物填料、大孔吸附樹脂填料。優(yōu)選大孔吸附樹脂SPE填料。大孔吸附樹脂SPE填料可為GDX-101填料、AB-8填料或其它大孔吸附樹脂填料；優(yōu)選GDX-101SPE填料。
采用本發(fā)明對(duì)中藥水提取液進(jìn)行SPE處理后，水溶液中的微量馬兜鈴酸A被濃縮，能夠采用高效液相色譜法進(jìn)行準(zhǔn)確含量測(cè)定。未使用SPE技術(shù)處理中藥水提取液，將中藥水提取液直接采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，馬兜鈴酸A色譜峰峰高低于最低定量限度，不能準(zhǔn)確測(cè)定馬兜鈴酸A含量，結(jié)果不準(zhǔn)確。


圖1使用SPE技術(shù)處理樣品的HPLC色譜圖。
圖2未使用SPE技術(shù)處理樣品的HPLC色譜圖。
圖3馬兜鈴酸A對(duì)照品的HPLC色譜圖。
具體實(shí)施例方式
下面列舉實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，該實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而對(duì)本發(fā)明并沒有限制。
實(shí)施例一和對(duì)比例細(xì)辛水提取液中馬兜鈴酸A含量測(cè)定細(xì)辛為含有馬兜鈴酸A的中藥。在工業(yè)化生產(chǎn)中，經(jīng)常采用水作為提取溶劑。純凈的馬兜鈴酸A是難溶于水的，但是，由于細(xì)辛中其它成分對(duì)馬兜鈴酸A的助溶、共溶作用，細(xì)辛中的馬兜鈴酸A能夠少量被提取，由于馬兜鈴酸A是一種毒性成分，有必要準(zhǔn)確測(cè)定水提取液中馬兜鈴酸A的含量。用本發(fā)明方法可準(zhǔn)確測(cè)定水提取液中馬兜鈴酸A的含量。
1、儀器、藥品及試劑Agilent 1100型高效液相色譜儀，配置四元泵，在線真空脫氣機(jī)，二極管陣列檢測(cè)器，柱溫箱。細(xì)辛(天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司提供)。馬兜鈴酸A對(duì)照品，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào)0746-200103，含量測(cè)定用)。甲醇(分析純，天津化學(xué)試劑二廠)，冰醋酸(分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)，乙腈(色譜純，Merck公司)，純化水。大孔樹脂填料GDX-101(購(gòu)自天津市化學(xué)試劑二廠)。
2、色譜條件色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)，柱溫30℃。以乙腈-1％冰醋酸水溶液(39∶61)為流動(dòng)相，流速為0.8mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為317nm。
3、溶液的制備(1)對(duì)照品溶液取馬兜鈴酸A對(duì)照品適量，用甲醇溶解，定容，制成濃度為5.25μg·mL-1的馬兜鈴酸A對(duì)照品溶液。
(2)-1實(shí)施例一的供試品溶液取細(xì)辛藥材粉末5g，精密稱定，置250mL燒瓶中，加水200mL，超聲提取30min，離心，取上清液100mL，上處理好的GDX-101小柱(稱取50～100目GDX-101填料1g，置于內(nèi)徑1cm玻璃小柱內(nèi)，加甲醇20mL沖洗，再用水20mL沖洗，備用)，控制上樣和洗脫過程的流速不大于0.7mL·min-1，以70％甲醇10mL沖洗，再用丙酮10mL沖洗，收集丙酮液，定容至10mL，搖勻，即得。
(2)-2對(duì)比例的的供試品溶液取細(xì)辛藥材粉末5g，精密稱定，置250mL燒瓶中，加水200mL，超聲提取30min，離心，取上清液，即得。
4、測(cè)定分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各15μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。
5、結(jié)果表1細(xì)辛水提取液中馬兜鈴酸A含量測(cè)定結(jié)果

從表中能夠看出來，使用SPE技術(shù)處理樣品后，樣品色譜圖中，馬兜鈴酸A色譜峰峰高遠(yuǎn)大于最低定量限的峰高(信號(hào)噪音的平均峰高的10倍)(見圖1)，能夠?qū)?xì)辛水溶液中的馬兜鈴酸A進(jìn)行準(zhǔn)確定量；而不使用SPE技術(shù)處理樣品，直接進(jìn)樣分析時(shí)，馬兜鈴酸A峰高小于最低定量限的峰高，不能定量(見圖2)。
實(shí)施例二關(guān)木通水提取液中馬兜鈴酸A含量測(cè)定供試品溶液的制備取關(guān)木通藥材粉末6g，精密稱定，置250mL燒瓶中，加水200mL，加熱提取30min，離心，取上清液100mL，上處理好的AB-8小柱(稱取200～400目AB-8填料4g，置于內(nèi)徑2cm玻璃小柱內(nèi)，加甲醇40mL沖洗，再用水40mL沖洗，備用；大孔樹脂填料AB-8購(gòu)自南開大學(xué)化工廠)，控制上樣和洗脫過程的流速不大于0.7mL·min-1，以30％甲醇10mL沖洗，再用丙酮10mL沖洗，收集丙酮液，定容至10mL，搖勻，即得。
其它均同實(shí)施例一結(jié)果水提取液中馬兜鈴酸A含量為126μg。
權(quán)利要求
1.一種中藥水提取液中馬兜鈴酸A的含量測(cè)定方法，其特征在于，中藥的水提取液經(jīng)固相萃取技術(shù)處理后，再用高效液相色譜測(cè)定馬兜鈴酸A的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述中藥的水提取液為中藥用水加熱或超聲提取，提取液離心或過濾，取上清液或?yàn)V液作為提取液；所述高效液相色譜的測(cè)定條件采用的是十八烷基鍵合硅膠固定相，乙腈-醋酸水溶液系統(tǒng)流動(dòng)相。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述中藥的水提取液經(jīng)固相萃取技術(shù)處理，是將中藥的水提取液直接上處理好的固相萃取小柱，用10～70％甲醇或乙醇沖洗，最后用丙酮洗脫，收集丙酮洗脫液，定容，搖勻，即得供高效液相色譜測(cè)試用的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述固相萃取小柱的處理方法為稱取30～400目固相萃取填料0.2～5g，置于內(nèi)徑0.5～3cm玻璃小柱內(nèi)，加甲醇、乙醇或丙酮5～50mL沖洗后，再用水5～50mL沖洗，備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述固相萃取小柱的填料為石墨碳反相填料、離子交換樹脂填料、金屬配合物吸附劑填料、鍵合硅膠填料、聚合物吸附劑填料、免疫親和吸附劑填料、分子嵌入聚合物填料、大孔吸附樹脂填料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述固相萃取小柱的填料為大孔吸附樹脂填料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述固相萃取小柱的填料為大孔吸附樹脂GDX-101填料或大孔吸附樹脂AB-8填料。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述方法為取中藥0.2～2g，加水，加熱或超聲提取，提取液離心或?yàn)V過，取上清液或?yàn)V液，上處理好的固相萃取小柱，先用10～70％甲醇或乙醇沖洗，再用丙酮洗脫，收集丙酮洗脫液，定容，搖勻，即得供試品溶液；取馬兜鈴酸A對(duì)照品配制成對(duì)照品溶液；高效液相色譜條件采用十八烷基鍵合硅膠固定相和乙腈-冰醋酸水溶液系統(tǒng)流動(dòng)相；將供試品溶液和對(duì)照品溶液分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述供試品溶液的制備為取中藥0.2～2g，精密稱定，置燒瓶中，加水50～300mL，加熱或超聲提取0.2～2.5h，放冷，離心；取上清液，上處理好的大孔樹脂小柱，控制上樣和洗脫過程的流速在0.3～2mL·min-1范圍內(nèi)，以10～70％甲醇或乙醇沖洗，再用丙酮洗脫，收集丙酮洗脫液，定容，搖勻，即得供試品溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中藥水提取液中微量馬兜鈴酸A的含量測(cè)定方法，包括先用水提取中藥樣品，得到中藥水提取液，用固相萃取技術(shù)處理水提取液，所得供試品溶液再進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定；固相萃取小柱的填料為大孔樹脂填料。采用本發(fā)明對(duì)中藥水提取液進(jìn)行固相萃取技術(shù)處理后，能夠?qū)λ芤褐械鸟R兜鈴酸A準(zhǔn)確定量。
文檔編號(hào)G01N30/38GK1847841SQ200510013310
公開日2006年10月18日 申請(qǐng)日期2005年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月12日
發(fā)明者高鈞, 魏峰 申請(qǐng)人:天津天士力制藥股份有限公司