專利名稱：基于蝦夷扇貝毒素對細胞磷酸二酯酶的激活檢測魚產(chǎn)品中的這種毒素的定量方法以及這 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明描述了依據(jù)蝦夷扇貝毒素(yessotoxins)激活其細胞靶之一——磷酸二酯酶的能力來對所述毒素進行的體外檢測和定量。它也描述了從蝦夷扇貝毒素-磷酸二酯酶結(jié)合衍生的治療應(yīng)用。
海洋藻毒素是藻類產(chǎn)生的，代表一個嚴重公共健康問題的物質(zhì)。這些毒素以一定方式聚集在軟體動物和魚體內(nèi)，從而當(dāng)人攝入軟體動物和魚時它們就會導(dǎo)致食物中毒。依據(jù)藻毒素所產(chǎn)生的中毒類型將其分成五大組麻痹性毒素(PSP)、腹瀉性毒素(DSP)、神經(jīng)毒性毒素(NSP)、雪卡毒素(CFP)和遺忘性毒素(ASP)(Van Dolah，2000)。還有一些會產(chǎn)生不同癥狀且不包含在前述組中的其他藻毒素組，它們是扇貝毒素(pectenotoxin)(PTXs)、azaspiracids和蝦夷扇貝毒素(YTXs)(Van Dolah，2000)。最初PTXs和YTXs與DSPs分在一組，因為它們都是親脂性毒素，經(jīng)常在中毒事件中共存。但是，最近十年，卻認為它們是不同的組，因為它們不會導(dǎo)致腹瀉，口服毒性低，且分子量也不同(Draisci，Lucentini等人，2000)。在這些最近確定的組中，蝦夷扇貝毒素(下文稱為YTXs)代表一個嚴重的經(jīng)濟問題，因為它們最近且普遍存在，而且缺乏檢測它們的敏感且特異的方法。
在日本、歐洲、新西蘭和智利已經(jīng)檢測到了YTXs，且它們由網(wǎng)狀原角藻(Protoceratium reticulatum)和Lingulodinium polyedrum(多邊膝溝藻(Gonyaulaxpolyedra))甲藻產(chǎn)生。這些毒素聚集在海洋軟體動物體內(nèi)，且具有熱穩(wěn)定性，因此在烹飪海產(chǎn)品的過程中不會受到破壞。雖然大鼠口服YTXs后，在其肝臟和胰腺內(nèi)檢測到到組織病理改變，但YTXs從消化道的吸收低，因此口服攝入不會中毒(Terao，Ito等人，1990)。然而腹膜內(nèi)注射這些毒素后則會引起嚴重的心臟中毒效應(yīng)，并顯現(xiàn)出高致死性潛能(Draisci，Lucentini等人，2000)。必須考慮這些腹膜內(nèi)效應(yīng)，因為前面已經(jīng)提到，YTXs與DSP毒素共存，且當(dāng)在生物測定中檢測后者時，YTXs可能產(chǎn)生導(dǎo)致檢測呈假陽性的干擾。因為這一原因，當(dāng)制備魚產(chǎn)品提取物時，為監(jiān)測這些毒素的存在，需要用分離YTXs和DSP毒素的有機溶劑來進行額外的提取?？墒沁@些改良意味著提取出大量的脂肪酸，其也可能產(chǎn)生假陽性(Yasumoto，Murata等人，1984)。
海洋產(chǎn)品提取物樣品中的藻毒素的檢測方法被分為測定方法和分析方法。測定方法是那些通過測量包括了樣品中所有毒素活性的單一生物或生物化學(xué)反應(yīng)，來提供總毒素含量值的方法。分析方法是那些關(guān)于儀器反應(yīng)對樣品中毒素進行分離、鑒定和個體定量的方法。第一種方法包括大鼠或小鼠的體內(nèi)測定方法，以及體外測定方法，其中必須強調(diào)的是酶抑制測定方法、細胞測定方法、受體測定方法等。在這些情形中，用每組中的一種代表性的毒素來獲取劑量-反應(yīng)曲線，依據(jù)該曲線來確定毒性。其中，可通過比色測定、熒光測定、發(fā)光、偏振熒光方法或利用生物傳感器實時確定配體-受體的相互作用來對反應(yīng)進行定量。第二種方法是需要先用每種毒素的已知濃度標準來校準儀器設(shè)備的體外測定方法。這些測定包括化學(xué)方法，例如高效液相層析(HPLC)、質(zhì)譜法或毛細管電泳。一般來說，當(dāng)需要對樣品中存在的每一種毒素進行鑒定和定量時，就使用儀器化學(xué)方法。但是在監(jiān)控或健康檢查項目中，這種潛在的總毒性知識被給予了更大的關(guān)聯(lián)性，因此使用測定方法，也稱為功能方法(Fernández，Míguez等人，2002)。
有幾種檢測污染的軟體動物體內(nèi)YTXs的液相層析-質(zhì)譜法(Draisci，Palleschi等人，1999；Goto，Igarashi等人，2001)和熒光HPLC(Ramstad，Larsen等人，2001；Yasumoto和Takizawa，1997)分析方法。在檢測這些毒素的體外功能測定方法中有兩種新近的方法E-鈣粘著蛋白檢測測定(Pierotti，Malaguti等人，2003；Rossini，2002)和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶激活測定(Malaguti，Ciminello等人，2002)。但是依照2002年3月15日的委員會決定(CommissionDecision)2002/225/EEC，官方接受的唯一方法是小鼠生物測定方法。這項決定提供的軟體動物樣品中YTXs的最高水平為lmgYTXs/kg軟體動物肉。生物測定方法在于觀察腹膜內(nèi)接種了提取物的三只小鼠24小時，其中提取物相當(dāng)于5g通常會蓄積YTXs的軟體動物消化腺或25g全軟體動物。因為腹膜內(nèi)施用允許的最大量YTX在6小時內(nèi)會導(dǎo)致死亡，因此通過縮短觀察時間和在該方法中導(dǎo)入另外的提取物對這種測定進行了改良。(Yasumoto，Murata等人，1984)。雖然這些另外的提取物意味著提取出大量的脂肪酸，但它們允許從YTXs中分離出DSP、PTX和azaspiracid毒素。如果三只接種小鼠中的兩只死亡，就認為提取物中有YTX。這種方法意味著要殺死動物，不能提供毒素濃度的準確值，幾乎不可重復(fù)，會產(chǎn)生假陽性，且為了能與其他毒素的存在相區(qū)別需要額外的提取過程。提到的其他檢測YTXs的生物方法是比較慢的方法，其在少于24-48小時的時間里不能獲得結(jié)果，而且需要仔細的毒素提取過程。更進一步地，因為其他的DSPs和這些毒素一起被檢測，所以這些方法不是基于YTXs的特殊和獨特的特性的。
為了確定YTXs的細胞靶，并因此進而確定其作用機制，已經(jīng)進行了幾項研究。YTX具有一個親脂性分子，該親脂性分子由通過醚基與不飽和側(cè)鏈和兩個磺酸酯結(jié)合的十一個環(huán)組成。

圖1中顯示了一些側(cè)鏈取代基不同的YTXs天然類似物，雖然最近已經(jīng)描述了超過50種天然衍生物，但還沒有鑒定出它們的結(jié)構(gòu)。在體外對YTX的研究中已經(jīng)觀察到Y(jié)TX能產(chǎn)生凋亡，但其潛能比一種通常和YTX相關(guān)聯(lián)的DSP毒素——甲基軟海綿酸的潛能低(Leira，Alvarez等人，2001)；而且與甲基軟海綿酸相反，YTX不抑制細胞磷酸酶(Draisci，Lucentini等人，2000)。因為YTX能抑制人肝細胞癌細胞(HEP-G2)的生長，所以其具有細胞毒性效應(yīng)，并因此可以用作抗腫瘤藥物。也有人描述YTX會改變淋巴細胞的胞質(zhì)鈣水平(De la Rosa，L.A.，Alfonso，A.等人.，2001)，并增加這些細胞中maitotoxin誘導(dǎo)的鈣流動(De la Rosa，L.A，Alfonso，A.等人，2001)。最近也觀察到Y(jié)TX能通過激活破壞cAMP的細胞磷酸二酯酶(PDEs)來降低環(huán)腺苷酸(cAMP)第二信使的細胞內(nèi)水平，這表明磷酸二酯酶可能是YTXs的細胞靶之一(Alfonso，de la Rosa A.等人，2003)。另一方面，已經(jīng)觀察到Y(jié)TX是大鼠肥大細胞中由免疫學(xué)刺激激活的組胺釋放抑制劑，且因此可將其用作抗變應(yīng)性藥或止喘藥。
在哺乳動物細胞中大約有含有不同同工型的11個家族的PDE(Houslay和Adams，2003)。這些酶能夠調(diào)節(jié)并維持cAMP和環(huán)鳥苷酸(cGMP)的水平穩(wěn)定，cGMP是參與多種生命機能的細胞發(fā)揮其功能所必需的第二信使(Soderling和Beavo，2000)。從制藥觀點來說，這些酶家族是非常重要的，因為它們的調(diào)節(jié)涉及到治療疾病，例如哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和癌癥(Houslay和Adams，2003)。因為這個原因，對影響PDEs的天然或合成分子的描述，以及可用于HTS(高通量篩選)方案的研究這些分子活性的方法，是發(fā)現(xiàn)對這些疾病的新治療方法的非常重要的工具。從這一點上來說，描述YTXs對腫瘤細胞生長的抑制效應(yīng)和其對組胺釋放的調(diào)節(jié)是這些分子對于其可能的治療應(yīng)用的藥理學(xué)重要性的兩個指征。
利用最近對YTX作用機制的描述，本發(fā)明開發(fā)了一種基于這些毒素對細胞PDEs的特異性親和力，來檢測魚產(chǎn)品提取物中這些毒素的方法。這些方法是功能測定方法，在這些方法中，存在的其他作用機制不同的毒素時不會產(chǎn)生干擾，也就是說，這些其他毒素不對PDEs產(chǎn)生作用，但它們與YTX在中毒事件中共存。更進一步地，這種方法避免了假陽性和殺死動物，且因為在1-2小時內(nèi)就能獲得準確的毒素濃度，所以加快了所述產(chǎn)品的污染監(jiān)控進程。
基于YTX是PDE激活劑并能將這種激活轉(zhuǎn)化成可測量信號的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明描述了三種用途。
用途1利用親和傳感器確定PDE-YTX生物分子結(jié)合的方法利用生物傳感器實時確定分子間的相互作用是一種新技術(shù)，其應(yīng)用正延伸到不同的研究領(lǐng)域(Hide，Tsutsui等人，2002；Lee，Mozsolits等人，2001；Mariotti，Minunni等人，2002；Tsoi和Yang，2002)。使用的生物傳感器是檢測被稱為配體的生物活性分子，與另一種和它結(jié)合的被稱為受體的分子之間的分子反應(yīng)的設(shè)備。配體與這種設(shè)備的支持表面結(jié)合，所述設(shè)備通常為杯或板。在發(fā)生結(jié)合的支持表面上生成對質(zhì)量變化非常靈敏的電磁場，也稱為漸消場(evanescentfield)。生物傳感器能將由配體-受體結(jié)合導(dǎo)致的支持表面上的質(zhì)量變化轉(zhuǎn)換成電信號?？捎糜诒景l(fā)明的商業(yè)生物傳感器是那些由Biacore或Thermo Labsystems公司在市場上銷售的傳感器。在本發(fā)明中，將作為配體起作用的PDEs和作為受體起作用的含有YTX的樣品加在一起。依賴于附著到PDEs上的毒素的量，并因此也依賴于樣品中存在的YTX，生物傳感器的信號將變得更大或更小。
作為配體起作用的細胞PDEs與支持表面結(jié)合。接下來將已知濃度的作為受體起作用的YTX加入到這個表面上。利用平面表面或基質(zhì)形成的表面能很好地實施這一技術(shù)。PDE-YTX結(jié)合遵循調(diào)節(jié)為準一級方程的動力學(xué)，從所述方程可獲得被稱為表觀結(jié)合速率(Rap)的常數(shù)，且毒素的每個濃度的Rap不同。利用Rap和毒素濃度數(shù)據(jù)畫出了校正線。將檢測樣品(魚產(chǎn)品的提取物)加入到表面上，計算出該樣品的Rap，將這個Rap值放到校正線上就可獲得檢測樣品中的YTX濃度。
發(fā)明的實施方案在22-37℃的溫度下實施該方法。
a.將pH值為7.7，濃度為0.1-0.24mg/ml的PDEs溶液加入到活化的二室表面。通過不可離解的共價鍵將這些酶結(jié)合到支持表面上。接著用不同的封閉溶液(BSA、Etanolamine、Tris-HCl...)封閉沒有結(jié)合PDEs的活性基團。
b.將已知濃度的含有YTX的溶液加入到一室中。另一室中用作空白，并向其中加入毒素溶劑。記錄PDE和YTX的結(jié)合動力學(xué)15分鐘。
c.用pH值為7.7的緩沖溶液洗滌二室來實施配體受體的離解，從而從PDEs上離解YTX。
d.為了徹底去除YTX，用酸或堿溶液來再生所述室。這樣PDEs將容易接近新加入的YTX。
e.使用5中不同濃度的YTX，重復(fù)步驟b、c和d。
f.從每一種濃度的毒素的結(jié)合動力學(xué)來獲得表觀結(jié)合速率(Rap)。作出的Rap值對YTX濃度的圖遵循回歸系數(shù)大于0.9的線性擬合。因此可獲得一條線，當(dāng)知道一個樣品的Rap時，利用這條線就能夠確定所述樣品中YTX的濃度。
g.對待研究的魚產(chǎn)品的肉進行提取。依據(jù)2002年3月15日的決定2002/225/EEC或任何其他官方方法(D.O.G.A，1986)中確定的最高水平和不同魚產(chǎn)品中某種海洋毒素的分析方法來實施提取。取等分試樣的提取物(檢測樣品)，并將其加入到結(jié)合在表面上的PDE上。獲取結(jié)合動力學(xué)，并據(jù)此計算出Rap。將檢測的Rap值放在獲得的回歸線上，就能夠確定樣品中YTX的濃度。
圖2顯示這種方法中所使用的步驟的曲線圖，所述步驟從表面活化到加入檢測樣品。圖3顯示了Rap值對已知YTX濃度的回歸線。
用途2利用熒光分子確定YTX激活PDE的方法檢測細胞PDE活性的常規(guī)方法是觀察它們破壞cAMP的能力。有一種cAMP熒光衍生物——鄰氨基苯甲酰cAMP(激發(fā)波長350nm，發(fā)射波長445nm)，當(dāng)它降解時，其熒光下降。熒光隨時間推移的下降可表現(xiàn)為cAMP的破壞速率。在PDEs存在時，破壞速率增加，而且如果這些酶被活化，則降解速率將會更高。在本發(fā)明中確定了PDEs存在時熒光指示劑鄰氨基苯甲酰cAMP的降解速率，也研究了在加入含有YTX的樣品時，所述降解速率的變化。用為讀取微量滴定板而準備的熒光計讀出所述熒光。確定幾種已知濃度的YTX存在時的破壞速率。破壞速率對毒素濃度的圖遵循回歸系數(shù)大于0.9的線性擬合。因此可獲得一條回歸線，在這條線中可將從魚產(chǎn)品樣品(檢測樣品)中獲得的破壞速率值轉(zhuǎn)換成YTX濃度。
發(fā)明的實施方案在22-37℃的溫度下，在微量滴定板中實施該方法，且在360nm的激發(fā)波長和460nm的發(fā)射波長處測量熒光。
有四種類型的孔，且每一種孔都重復(fù)實驗2次。
A孔用來計算cAMP濃度的孔。往其中加入5個濃度的鄰氨基苯甲酰cAMP(熒光指示劑)，濃度范圍為2-10μM。
B孔含有8μM熒光指示劑和酶的對照孔。
C孔含有8μM熒光指示劑、酶和已知濃度YTX的校正孔。
D孔含有8μM熒光指示劑、酶和任何魚產(chǎn)品提取物樣品的檢測樣品孔。
a.在所有孔中加入檢測緩沖液(10mM Tris HCl+1mM CaCl2，pH7.4)使最終的溫育體積為100μL。依據(jù)孔的類型加入相應(yīng)量的鄰氨基苯甲酰cAMP。第一次讀數(shù)2分鐘。
b.在B孔、C孔和D孔中加入2-5μg的PDEs，并再一次讀數(shù)2分鐘。
c.在C孔和D孔中加入已知濃度YTX或從魚產(chǎn)品中獲得的樣品。加入的YTX濃度范圍為0.1-10μM。依據(jù)2002年3月15日的決定2002/225/EEC或任何其他官方方法(D.O.G.A，1986)中確定的最高水平和不同魚產(chǎn)品中某種海洋毒素的分析方法來獲得提取物樣品。
d.加入這些物質(zhì)后，振蕩所述板，進行15分鐘的連續(xù)熒光測量，從而獲取每分鐘的數(shù)據(jù)。
e.用從A孔中獲得的熒光數(shù)據(jù)對每一孔中的指示劑濃度作圖，可獲得回歸系數(shù)大于0.999的線。
f.利用前面在鄰氨基苯甲酰cAMP濃度方面的線將從其他孔中獲得的在鄰氨基苯甲酰cAMP濃度的熒光數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換。從毒素加入時，即零時間的cAMP濃度和10分鐘后的濃度可獲得每單位時間被破壞的指示劑的量，也就是AMPc的破壞速率。
g.將B孔獲得的破壞速率數(shù)據(jù)視為對照破壞速率。
h.將從C孔中獲得的破壞速率對YTX濃度作圖可獲得YTX濃度標準線。在這條線上用從D孔中獲得的破壞速率進行替換可確定所述樣品中的YTX。
圖4代表針對鄰氨基苯甲酰cAMP濃度的熒光單位校正線。圖5代表用于標準測定方法的cAMP破壞速率對YTX濃度的標準線。
用途3利用磷酸二酯酶作為YTX的治療靶以及誘導(dǎo)激活磷酸二酯酶的化合物。
a.1.YTX作為肥大細胞和嗜堿性粒細胞的免疫學(xué)激活抑制劑的用途。
肥大細胞和嗜堿性粒細胞的免疫學(xué)激活需要臨時增加cAMP。這種增加對細胞反應(yīng)激活是必不可少的(Botana和MacGlashan，1994)。PDE激活消除了這種開始的cAMP峰，并因此能防止細胞激活。在YTX存在時，也就是激活的PDEs存在時，細胞反應(yīng)將被抑制。所述抑制效應(yīng)可用于抗變應(yīng)性藥或止喘藥治療策略中，所述變態(tài)反應(yīng)和哮喘是肥大細胞起主要作用的兩種病理狀態(tài)(Metcalfe，Baram，D.等人，1997)。此處的用途描述了YTX對細胞激活的抑制的定量，所述細胞激活由在大鼠體內(nèi)肥大細胞的免疫學(xué)刺激所誘導(dǎo)。可參照文獻中描述的不同方案來確定細胞反應(yīng)抑制。下面列出一種方案，在該方案中依據(jù)大鼠肥大細胞釋放到細胞外基質(zhì)中的組胺來對反應(yīng)進行定量(Alfonso，Cabado，A.G.等人，2000；Estévez，Vieytes等人，1994)。
發(fā)明的實施方案a.在進行實驗前15天致敏大鼠。將每只大鼠皮下注射含有150mg卵清蛋白和109個百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的1ml生理血清。
b.從致敏大鼠的胸和腹提取肥大細胞。將獲得的兩種群體混合得到細胞懸浮液。
c.將細胞懸浮液與各種濃度的YTX一起預(yù)溫育10分鐘，接著在5mg/ml的卵清蛋白存在時溫育10分鐘。
d.在低溫條件下終止反應(yīng)，并通過離心從細胞中殘留的組胺中分離出釋放的組胺。
e.移去含有釋放到培養(yǎng)基中的組胺的上清液，并用鹽酸和超聲波切割細胞以使其釋放對刺激作用不敏感的組胺。
f.用三氯乙酸去除兩種培養(yǎng)基中的蛋白。
g.最后對組胺進行定量，從而通過在含有鄰苯二醛(o-phthalic dialdehyde)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)換成熒光分子。用鹽酸終止反應(yīng)，并在360nm激發(fā)處和460nm的發(fā)射處讀出熒光。
圖6顯示幾種濃度的YTX存在時，卵清蛋白誘導(dǎo)的組胺釋放被抑制的百分比。
a.2.YTX作為贅生性細胞增殖抑制劑的用途。
贅生性細胞生長抑制是一個描述抗腫瘤活性的指標，廣泛用于描述新藥物的抗腫瘤特性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)YTX對人肝細胞癌細胞具有細胞毒性，更進一步地，也已經(jīng)描述這種毒素在成神經(jīng)細胞瘤細胞中能誘導(dǎo)細胞凋亡(程序性細胞死亡)(Leira，Alvarez等人，2001)，這些都表明YTX容易被用作抗腫瘤藥物。在此項用途中定量分析了YTX作為肝癌腫瘤細胞的細胞毒性藥物的能力?？蓞⒄瘴墨I中描述的不同方案來確定細胞的生長抑制。下面列出這些方案中的一種，在該方案中通過結(jié)晶紫染色和接下來的乙酰化作用在HEP-G2細胞系中對反應(yīng)進行定量。
發(fā)明的實施方案a.在微量滴定板上以10000個細胞/孔的密度接種HEP-G2細胞。用生長培養(yǎng)基在37℃和5％CO2的條件下溫育細胞24小時。
b.加入不同濃度的YTX，在37℃和5％CO2的條件下溫育48小時。
c.加入10μL 11％的戊二醛以固定細胞，并將其溫育15分鐘。用蒸餾水洗滌3-4次。
d.加入0.1％的結(jié)晶紫溶液，并振蕩所述板15分鐘。
e.通過用蒸餾水洗滌去除染料，接著進行干燥。
f.加入10％的乙酸，并維持振蕩15分鐘。
g.在595納米處用分光光度計讀出吸光度。
h.用這種方案發(fā)現(xiàn)10μM的YTX可以誘導(dǎo)大約82+/-1％的細胞生長抑制。
文獻Alfonso，A.，Cabado，A.G.，Vieytes，M.R.and Botana，L.M，(2000).″Calcium-pHcrosstalks in rat mast cellscytosolic alkalinization，but not intracellular calcium release，is a sufficient signal for degranulation.″Br J Pharmacol 130(8)1809-1816.
Alfonso，A.，de la Rosa，L.A.，Vieytes，M.R.，Yasumoto，T.and Botane，L.M.(2003).″Yessotoxin a novel phycotoxin，activates phosphodiesterase activity.Effect ofyessotoxin on cAMP levels in human lymphocytes.″Biochem Pharmacol 65193-208.
Botana，L.M.and MacGlashan，D.W.(1994).″Differential effects of cAMP-elevating drugs on stimulus-induced cytosolic calcium changes in human basophils.″JLeukocyte Biol 55(6)798-804.
D.O.G.A.(1986).″Diarlo oficial de Galicia″.
De la Rosa，L.A.，Alfonso，A.， ，N.，Vieytes，M.R.and Botana，L.M.(2001).″Modulation of cytosolic calcium levels of human lymphocytes by yessotoxin，anovel marine phycotoxin.″Biochem.Pharmacol.61(7)827-833.
De la Rosa，L.A.，Alfonso，A.， ，N.，Vieytes，M.R.，Yasumoto，T.andBotane，L.M.(2001).″Maitotoxin-induced calcium entry in human lymphocytes-Modulation by yessotoxin，Ca2+channel blockers and kinases.″Cell Signal 13(10)711-716.
Draisci，R.，Lucentini，L.and Mascioni，A.(2000).Enteric toxic episodes.Pectenotoxins and yessotoxinschemistry，toxicology，pharmacology and analysis.Seafood and freshwater toxinspharmacology，physiology and detection.Botana，L.M.New York，Marcel Dekker289-324.
Draisci，R.，Palleschi，L.，Giannetti，L.，Lucentini，L.，James，K.J.，Bishop，A.G.，Satake，M.and Yasumoto，T.(1999).″New approach to the direct detection of knownand new diarrhoeic shellfish toxins in mussels and phytoplankton by liquidchromatography-mass spectrometry.″J Chromatogr A 847(1-2)213-221.
Estévez，M.D.，Vieytes，M.R.，Louzao，M.C.and Botana，L.M.(1994).″Effectof okadaic acid on immunologic and non-immunologic histamine release in rat mastcells.″Biochem Pharmacol 47(3)591-593.
Fernández，M.L.，Miguez，A.，Cacho，E.，Martinez，A.，Diogéne，J.andYasumoto，T.(2002).Bioensayos con mamíferos y ensayos bioquímicos y celularespara la detección de phycotoxins.Floraciones algales nocivas en el cono suramericeno.Sar，E.A.，F(xiàn)errario，M.E.and Reguera，M.Madrid，UNESCO y Ministeriode Ciencia y Tecnología.
Goto，H.，Igarashi，T.，Yamamoto，M.，Yasuda，M.，Sekiguchi，R.，Watai，M.，Tanno，K.and Yasumoto，T.(2001).″Quantitative determination of marine toxinsassociated with diarrhetic shellfish poisoning by liquid chromatography coupled withmass spectrometry.″J Chromatogr A 907(1-2)181-189.
Hide，M.，Tsutsui，T.，Sato，H.，Nishimura，T.，Morimoto，K.，Yamamoto，S.andYoshizato，K.(2002).″Real-time enalysis of ligand-induced cell surface andintracellular reactions of living mast cells using a surface plasmon resonance-basedbiosensor.″Anal Biochem 302(1)28-37.
Houslay，M.D.and Adams，D.R.(2003).″PDE4 cAMP phosphodiesterasesmodular enzymes that orchestrate signalling cross-talk，desentization andcompartimentalization.″Biochem J.3701-18.
Lee，T.H.，Mozsolits，H.and Aguilar，M.l.(2001).″Measurement of the affinityof melittin for zwitterionic and anionic membranes using immobilized lipid biosensors.″J Pept Res 58(6)464-476.
Leira，F(xiàn).，Alvarez，C.，Vieites，J.M.，Vieytes，M.R.and Botana，L.M.(2001).″Okadaic acid and yessotoxin induce caspase-3 mediated apoptosis in neuroblastomacells.Characterization of distinct apoptotic changes induced by these phycotoxins inthe BE(2)-M17 cell line by means of new fluorimetric microplate assays.″Toxicology invitro 15277-283.
Malaguti，C.，Ciminello，P.，F(xiàn)attorusso，E.and Rossini，G.P.(2002).″Caspaseactivation and death induced by yessotoxin in HeLa cells.″Toxicol in Vitro 16(4)357-363.
Mariotti，E.，Minunni，M.and Mascini，M.(2002).″Surface plasmon resonancebiosensor for genetically modified organisms detection.″Anal Chim Acta 453(2)165-172.
Metcalfe，D.D.，Baram，D.and Mekori，Y.A.(1997).″Mast cells.″Physiol Rev77(4)1033-1079.
Pierotti，S.，Malaguti，C.，Milandri，A.，Poletti，R.and Rossini，P.(2003).″Functional assay to measure yessotoxins in contaminated mussel samples.″AnalBiochem 312(2)208-216.
Ramstad，H.，Larsen，S.and Aune，T.(2001).″Repeatability and validity of afluorimetric HPLC method in the quantification of yessotoxin in blue mussels(Mytilusedulis)related to the mouse bioassay.″Toxicon 39(9)1393-1397.
Rossini，G.P.(2002).Process for measurement of dinophysistoxin and ofyessotoxin.WO02/03060A2.lnternational Application publlshed under the patentcooperation treaty.
Soderling，S.H.and Beavo，J.A.(2000).″Regulation of cAMP and cGMPsignalingnew phosphodiesterases and new functions.″Curr.Opin.Cell.Biol.12(174-179).
Terao，K.，lto，E.，Oarada，M.，Murata，M.and Yasumoto，T.(1990).″Histopathological studies on experimental marine toxin poisoning--5.The effects inmice of yessotoxin isolated from Patinopecten yessoensis and of a desulfatedderivative.″Toxicon 281095-1104.
Tsoi，P.Y.and Yang，M.S.(2002).″Kinetic study of various binding modesbetween human DNA polymerase beta and different DNA substrates by surface-plasmon-resonance biosensor.″Biochem J 361(2)317-325.
Van Dolah，F(xiàn).M.(2000).Diversity of marine and freshwater algal toxins.Seafood and freshwater toxinspharmacology，physiology and detection.Botana，L.M.New York.Marcel Dekker19-44.
Yasumoto，T.，Murata，M.，Oshima，Y.，Matsumoto，G.K.and Glardy，J.(1984).Diarrhetic shellfish poisoning.ACS Symp.Series.No 262.Seafood toxins.Ragelis，E.P.Washington，D.C.，American Chemical Society207-214.
Yasumoto，T.and Takizawa，A.(1997).″Fluorometric measurement ofyessotoxins in shellfish by high-pressure liquid chromatography.″Biosci BiotechnolBiochem 61(10)1775-1777.
權(quán)利要求
1.一種檢測魚產(chǎn)品中蝦夷扇貝毒素(YTXs)的定量方法，該方法基于所述毒素對細胞磷酸二酯酶的激活，以及這種激活的治療應(yīng)用；以及YTX和其化學(xué)類似物(YTXs)對磷酸二酯酶活性的激活作用在檢測YTXs(或具有類似活性的化合物)的定量方法中的用途，或者作為以PDEs為治療靶的策略的用途。
2.權(quán)利要求1所述的檢測魚產(chǎn)品中YTXs的方法，所述方法基于YTX對PDEs的激活，其特征在于使用與平面或基質(zhì)支持表面結(jié)合的PDEs作為配體的親和生物傳感器，在所述傳感器上加入作為受體起作用的YTXs，所述傳感器在20-37℃的溫度范圍內(nèi)通過漸消效應(yīng)能產(chǎn)生可定量的分子相互作用，從而調(diào)節(jié)這種結(jié)合為準一級動力學(xué)，從所述動力學(xué)特征獲得表觀YTX-PDE結(jié)合速率(Rap)。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于確定已知濃度的YTXs的表觀結(jié)合速率并繪制校正線，在知道魚產(chǎn)品提取物檢測樣品的表觀結(jié)合速率時，利用校正線可計算出該樣品的YTX濃度。
4.權(quán)利要求1所述的檢測魚產(chǎn)品中YTXs的方法，其特征在于利用類似的cAMP熒光底物通過PDE活性熒光來進行檢測，并利用從已知濃度的YTX獲得的熒光底物破壞速率制備出的校正線計算出魚產(chǎn)品樣品中的YTX濃度。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于利用鄰氨基苯甲酰cAMP作為底物通過PDE活性熒光來進行檢測。
6.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于確定YTX結(jié)合PDEs時偏振的熒光強度的變化。
7.權(quán)利要求2、3或6所述的方法，其用于檢測天然或合成的化學(xué)化合物中等同于YTX的活性(PDE激活)。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其在HTS(高通量篩選)方案中利用PDEs活性。
9.權(quán)利要求1所述的用途，其為YTXs作為抗變應(yīng)性藥或止喘藥化合物對肥大細胞的作用的用途。
10.權(quán)利要求1所述的用途，其為YTXs作為抗腫瘤化合物對贅生性細胞的作用的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測魚產(chǎn)品中蝦夷扇貝毒素的定量方法，該方法基于所述毒素對細胞磷酸二酯酶的激活以及這種激活的治療有效性。蝦夷扇貝毒素(YTX)和其類似物的細胞靶是激活磷酸二酯酶(PDEs)。PDEs－YTX結(jié)合產(chǎn)生可測量的信號。利用親和生物傳感器或熒光可以對這種結(jié)合進行定量。生物傳感器能檢測生物分子之間的相互作用，并使得可能利用YTX和PDEs的相互作用來確定YTX的存在。平板熒光使得可能確定熒光衍生物鄰氨基苯甲酰cAMP的降解速率的變化。當(dāng)YTX存在時，PDEs降解所述分子的速率增加。YTX抑制大鼠肥大細胞的免疫學(xué)激活，而且在人肝癌細胞中能誘導(dǎo)細胞毒性作用，這提供了YTX可作為抗變應(yīng)性藥和抗腫瘤化合物的兩種治療用途。
文檔編號G01N21/64GK1852988SQ200480021338
公開日2006年10月25日 申請日期2004年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月25日
發(fā)明者L·M·博塔納洛佩斯, A·阿方索蘭卡尼奧, M·J·帕索斯古爾德里斯, M·羅德里格斯比埃特斯, M·I·羅薩加西亞, J·M·維埃特斯巴普蒂斯塔德索薩 申請人:圣地亞哥德·岡波忒拉大學(xué)