專(zhuān)利名稱(chēng)：蛋白質(zhì)同種型的測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)測(cè)定以及這些蛋白質(zhì)測(cè)定所用的試劑盒，該蛋白質(zhì)具有兩種或者更多種不同糖基化模式的同種型，例如，糖基化與未糖基化同種型或完全糖基化與部分糖基化同種型。
不同的蛋白質(zhì)以兩種或者更多種的不同糖基化模式的同種型存在。不同糖基化同種型的這種差別，或相對(duì)比例，可能是疾病和機(jī)能紊亂或者藥物濫用的征兆，因此需要能夠區(qū)分不同糖基化同種型的測(cè)定系統(tǒng)。
然而，用抗體來(lái)區(qū)分內(nèi)源性蛋白質(zhì)的不同糖基化同種型是比較困難的，因?yàn)榕c內(nèi)源性糖基化蛋白質(zhì)的具體同種型特異性或者優(yōu)先結(jié)合的抗體制備成功率比較低。
臨床上測(cè)定一種內(nèi)源性蛋白質(zhì)的不同糖基化同種型的相對(duì)濃度有臨床意義的一個(gè)實(shí)例是血液蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)鐵蛋白。轉(zhuǎn)鐵蛋白的氨基酸骨架有兩個(gè)位點(diǎn)(Asn 413和Asn 611)，可以接納具有末端唾液酸基團(tuán)的雙、或三觸角低聚糖側(cè)鏈。一個(gè)健康的病人，大部分的血液轉(zhuǎn)鐵蛋白分子帶有4個(gè)或者5個(gè)唾液酸基團(tuán)；然而，如果該病人酗酒，那么轉(zhuǎn)鐵蛋白分子中，沒(méi)有唾液酸基團(tuán)、或者含有2個(gè)或者3個(gè)唾液酸基團(tuán)的比率就會(huì)相對(duì)增加。事實(shí)上，缺少1個(gè)或2個(gè)完整聚糖鏈，也是酗酒者體內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白同種型的一個(gè)特征。(見(jiàn)例如Arndt in Clinical Chemistry 4713-27(2001))。轉(zhuǎn)鐵蛋白同種型的這種非正常的相對(duì)豐度，也出現(xiàn)在碳水化合物不足糖蛋白綜合癥(CDGS)或先天性糖基化疾病(CDG)的病人中，如Keir等在Ann.Clin.Biochem.3620-36(1999).中所討論的那樣。
已經(jīng)提出這樣的“碳水化合物不足轉(zhuǎn)鐵蛋白(CDT)”或者“無(wú)碳水化合物轉(zhuǎn)鐵蛋白(CFT)”的各種測(cè)定方法；然而那些適合于自動(dòng)化的方法一般都依賴于應(yīng)用離子交換樹(shù)脂，基于在不同pH時(shí)不同轉(zhuǎn)鐵蛋白同種型被樹(shù)脂吸附和釋放不同，將具有3個(gè)或者更少唾液酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子與具有4個(gè)或者5個(gè)唾液酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子進(jìn)行分離。這些測(cè)定方法的實(shí)例在US-A-4626355(Pharmacia)，WO 96/26444(Axis)和WO 01/42795(Axis)中有所描述。
翻譯后糖基化的任何蛋白質(zhì)，都可能出現(xiàn)不同的糖基化同種型。因此，除了轉(zhuǎn)鐵蛋白外，其他臨床上有關(guān)的蛋白質(zhì)也存在不同的糖基化同種型，包括癌癥以及其他疾病的糖基化標(biāo)記，例如堿性磷酸酯酶(AP)(見(jiàn)Magnusson等Clinical Chemistry441621-1628(1998))、α-甲胎蛋白(AFP)、人絨毛膜促性腺激素(HCG))以及可能的朊病毒蛋白(CD230)。
哺乳動(dòng)物堿性磷酸酯酶包括一個(gè)普遍存在的酶家族。AP是一種糖蛋白酶，存在于細(xì)胞質(zhì)膜的外層糖基磷脂酰肌醇部分作為膜錨著點(diǎn)。肝AP、骨AP和腎AP的(天然)分子量經(jīng)測(cè)定分別為152、166和168kDa。除了在正常骨礦化中的作用外，L/B/KAP在生理學(xué)和腫瘤學(xué)中的其他功能還不為所知。堿性磷酸酯酶在人血清中以幾種同種型存在。由于翻譯后修飾的多樣性，血清中不同同種型的鑒別是很復(fù)雜的。兩個(gè)主要的循環(huán)AP同工酶，骨骼和肝臟的，因?yàn)槭菃位虍a(chǎn)品，只是糖基化不同，所以難于區(qū)分。在常規(guī)臨床測(cè)定中，經(jīng)常需要總的血清AP來(lái)確定骨骼和肝膽管的狀況。已經(jīng)表明，對(duì)總AP活性有貢獻(xiàn)的不同同種型提供有用的臨床信息。事實(shí)上，血清中骨AP(BAP)活性的定量測(cè)量，能夠提供骨形成程度的指數(shù)。
α-甲胎蛋白(AFP)是哺乳動(dòng)物胎兒發(fā)育的主要蛋白質(zhì)，主要由胎兒肝臟和卵黃囊合成。由于肝癌和卵黃囊瘤經(jīng)常生成這種蛋白質(zhì)，因此它通常在診斷中作為腫瘤標(biāo)記使用。具體的說(shuō)，在肝細(xì)胞癌(HCC)和非精原細(xì)胞瘤的生殖細(xì)胞瘤(NSGCT)診斷中，AFP作為血清學(xué)標(biāo)記而廣泛使用。AFP在正常妊娠、良性肝臟疾病以及癌癥時(shí)也會(huì)升高。AFP表現(xiàn)為幾種與疾病相關(guān)的碳水化合物結(jié)構(gòu)不同的同種型?，F(xiàn)有的測(cè)定方法還不能容易的區(qū)分這些同種型。
本發(fā)明的其他目的糖蛋白包括α-1-酸糖蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、結(jié)合球蛋白、甲狀腺球蛋白、前列腺特異性抗原、HEMPAS紅細(xì)胞帶形核粒細(xì)胞3(它與先天性紅細(xì)胞生成不良性貧血II型相關(guān))、PC-1漿細(xì)胞膜糖蛋白、CD41糖蛋白II b、CD42b糖萼素、CD43白細(xì)胞唾液糖蛋白、CD63溶酶體膜結(jié)合糖蛋白3、CD66a膽糖蛋白、CD66f妊娠特異性b1糖蛋白、CD164多-糖基化核蛋白質(zhì)24，和CD235血型糖蛋白族。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，采用抗體或者其他配偶體來(lái)識(shí)別測(cè)定中的不同糖基化蛋白質(zhì)同種型的問(wèn)題，可以通過(guò)在測(cè)定中附加使用蛋白水解酶來(lái)解決，該蛋白水解酶可以使目的蛋白質(zhì)裂解成很多肽片段，所得片段的圖譜具有樣品分析物中糖基化圖譜的特征。分析物蛋白質(zhì)同種型的這種蛋白水解作用，可以產(chǎn)生其他同種型水解不能產(chǎn)生的片段，并且該片段能夠相應(yīng)的被特征片段的特異性結(jié)合配偶體所識(shí)別；或者一種同種型的蛋白水解作用可以產(chǎn)生一系列的片段，在應(yīng)用碎片分離技術(shù)(例如色譜、質(zhì)譜等)時(shí)，這些片段顯示出與其他同種型產(chǎn)生的碎片系列不同的分布類(lèi)型(光譜)。具體地說(shuō)，蛋白水解酶是一種在特異性位點(diǎn)，例如在特異性的氨基酸殘基或者在特異性的氨基酸殘基序列上起裂解肽鏈作用的酶。通過(guò)這樣的方式，當(dāng)酶處于目的同種型中時(shí)，該同種型就會(huì)在這樣的位點(diǎn)發(fā)生裂解，但當(dāng)酶處于其他同種型中，由于其他同種型中糖基化么模式不同，使酶被例如碳水化合物側(cè)鏈或者不同三級(jí)結(jié)構(gòu)所遮蔽，就不會(huì)發(fā)生裂解。
如果一種同種型蛋白水解產(chǎn)生的片段不能由其他同種型蛋白水解所產(chǎn)生，那么就可以提供特征抗原表位，這些特征片段的特異性結(jié)合配偶體，可以用來(lái)測(cè)定樣品中其母體同種型的濃度。如果蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的片段相似(例如抗原性或者沿分離中軸位置相似)但相對(duì)濃度不同時(shí)，可以測(cè)定兩種或者更多種這樣片段的相對(duì)濃度，并且用其來(lái)測(cè)定該樣品中不同同種型的相對(duì)豐度以及相應(yīng)濃度。
因此從一方面來(lái)看，本發(fā)明提供一種用于具有至少兩種含不同糖基化模式同種型的蛋白質(zhì)的測(cè)定方法，所述方法包括使含有所述蛋白質(zhì)的樣品與蛋白水解酶接觸，該蛋白水解酶優(yōu)選蛋白質(zhì)位點(diǎn)特異性蛋白水解酶，并且檢測(cè)由該蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)生的至少一種肽片段的含量或者相對(duì)含量。
本發(fā)明的方法優(yōu)選包括對(duì)樣品或者產(chǎn)生樣品的物質(zhì)(例如血液)中目的蛋白質(zhì)同種型濃度或者相對(duì)濃度示數(shù)，例如定量、半-定量、或者定性的示數(shù)的測(cè)定。例如該同種型的濃度可以測(cè)定，以該同種型存在的蛋白質(zhì)的片段可以測(cè)定，或者該同種型的濃度或片段可以簡(jiǎn)單的通過(guò)在預(yù)定的閾值，例如病人健康或者不健康情況的閾值之上或之下來(lái)測(cè)定。然而，一般優(yōu)選以糖類(lèi)缺乏同種型的百分比(例如摩爾百分比)來(lái)代表糖類(lèi)的缺乏。為此目的，本發(fā)明的測(cè)定方法優(yōu)選包括糖蛋白總量的測(cè)定，例如不使用蛋白水解酶平行操作測(cè)定。
因?yàn)樵诤芏喹h(huán)境下，樣品在含有目的蛋白質(zhì)的同時(shí)還會(huì)含有很多其他蛋白質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍姿猱a(chǎn)生目的蛋白質(zhì)某一同種型的特征片段時(shí)，會(huì)出現(xiàn)“干擾”，例如其他蛋白質(zhì)所得的肽片段，因此盡管不是嚴(yán)格必要，也希望在與蛋白水解酶接觸之前，將目的蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)分離，以避免這些干擾。這可以通過(guò)色譜法、選擇性的吸附到底物上以及從底物上釋放、離心分離、以及其他的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分離技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，為了簡(jiǎn)化測(cè)定操作，優(yōu)選采用樣品與底物接觸的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，該底物上結(jié)合著至少對(duì)目的蛋白質(zhì)的目的同種型有特異性結(jié)合的配偶體，特別優(yōu)選用于捕獲目的蛋白質(zhì)所有同種型的特異性結(jié)合配偶體。在此情況下，特異性結(jié)合的配偶體優(yōu)選為抗體或者是抗體片段。那么底物結(jié)合蛋白質(zhì)就會(huì)與非結(jié)合蛋白質(zhì)分離例如通過(guò)漂洗分離，并且可以任選的在與蛋白水解酶接觸之前，從底物中釋放出來(lái)。
因此，從另一方面來(lái)看，本發(fā)明提供一種用于本發(fā)明測(cè)定方法的試劑盒，該試劑盒包括蛋白水解酶和用于所述蛋白質(zhì)的至少兩種和優(yōu)選所有同種型的底物結(jié)合的特異性結(jié)合的配偶體(sbp)。該底物結(jié)合的sbp優(yōu)選是在遠(yuǎn)離糖基化位點(diǎn)的位點(diǎn)與蛋白質(zhì)結(jié)合sbp。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將底物結(jié)合的sbp固定在多孔膜上。
只要蛋白質(zhì)水解發(fā)生，就可以通過(guò)任何常規(guī)技術(shù)對(duì)特征片段或者特征裂解圖進(jìn)行測(cè)定。然而，為了簡(jiǎn)化測(cè)定操作，優(yōu)選對(duì)特征片段與特異性結(jié)合的配偶體形成的片段sbp結(jié)合物進(jìn)行測(cè)定，從而對(duì)特征片段進(jìn)行直接或間接測(cè)定。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步含有至少一種任選的標(biāo)記了的特異性結(jié)合的配偶體，該配偶體對(duì)于目的蛋白質(zhì)的一種同種型經(jīng)酶蛋白水解作用而產(chǎn)生的肽片段具有特異性。
所述試劑盒也優(yōu)選含有本測(cè)定方法的操作說(shuō)明書(shū)，還可以任選含有其他任選標(biāo)記的能夠與蛋白質(zhì)sbp結(jié)合物和/或片段結(jié)合的sbp相結(jié)合的第二配偶體。
本發(fā)明測(cè)定中所使用的sbp典型地為抗體或者抗體片段、寡肽、寡核苷酸、或者小的有機(jī)分子?？贵w和抗體片段優(yōu)選，尤其是單克隆抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可以制備抗體來(lái)抗具有與特征蛋白質(zhì)片段的全部或者部分氨基酸序列相符合(或者相似)的序列的寡肽免疫結(jié)合物，如US-A-5773572中所述的那樣。
由蛋白質(zhì)片段形成的結(jié)合物的測(cè)定，如上所述，可以是直接或者間接的。可以測(cè)定結(jié)合物或sbp的特性(例如放射吸收、發(fā)射、或散射)，或者可應(yīng)用其他具有可測(cè)定性質(zhì)或者能夠引起可測(cè)定性質(zhì)或事項(xiàng)的試劑。該其他結(jié)合試劑是與所述結(jié)合物結(jié)合或者與自由sbp結(jié)合的試劑，或者是在與其他底物結(jié)合中與所述結(jié)合物競(jìng)爭(zhēng)的試劑。采用任選標(biāo)記的結(jié)合試劑對(duì)分析物進(jìn)行的這種直接或者間接測(cè)定在診斷測(cè)定領(lǐng)域是常規(guī)的。
所述蛋白質(zhì)片段的測(cè)定方式，當(dāng)然要取決于結(jié)合試劑的性質(zhì)，亦即它們是否用報(bào)道分子部分，例如放射性標(biāo)記、發(fā)色團(tuán)、或者熒光染料(亦即熒光基團(tuán))標(biāo)記；它們是否是酶活性的(亦即能催化過(guò)程可以測(cè)定的反應(yīng)，例如通過(guò)產(chǎn)生光或者是產(chǎn)生可測(cè)定的物質(zhì))；它們是否形成用光散射可以測(cè)定的聚集物，等等。這樣的測(cè)定系統(tǒng)在診斷測(cè)定領(lǐng)域是常規(guī)的。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，將特征蛋白質(zhì)片段的sbp固定在多孔底物上，例如任選具有也固定在相同底物上的目的蛋白質(zhì)sbp的膜，并且隨著蛋白水解以及特征片段與底物的結(jié)合，片段-sbp或者片段-sbp片段結(jié)合物的標(biāo)記的結(jié)合配偶體與底物相接觸。隨著對(duì)底物的漂洗，底物保留的標(biāo)記可以直接或間接的表示出特征片段的濃度以及產(chǎn)生該片段的同種型的濃度。
在本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將特征片段與特征片段形成大小足夠被多孔膜保留的結(jié)合物的標(biāo)記sbp與樣品相接觸，樣品在水解之后，通過(guò)多孔膜(該膜也可以任選是固定有該蛋白質(zhì)sbp的膜)。漂洗之后，該膜就可以提供保留在其上的片段標(biāo)記sbp的直接示數(shù)，以及產(chǎn)生該片段的同種型的相應(yīng)示數(shù)。
在類(lèi)似的實(shí)施方案中，可以使用競(jìng)爭(zhēng)性抗原(例如粒子，如帶有抗原的乳膠粒子)，該抗原與片段-sbp結(jié)合產(chǎn)生可被膜保留的結(jié)合物。在該實(shí)施方案中，最好競(jìng)爭(zhēng)抗原和片段-sbp中的一個(gè)或者兩個(gè)要被標(biāo)記，并且膜的孔徑應(yīng)該足夠大，不能保留未結(jié)合的片段-sbp，并且如果片段-sbp被標(biāo)記，那么對(duì)該片段-sbp片段結(jié)合物也不能保留。漂洗之后，該膜可以提供保留的抗原片段-sbp結(jié)合物的濃度示數(shù)，并間接提供該片段的濃度示數(shù)。
在這后兩個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的標(biāo)記為發(fā)色團(tuán)、熒光染料，或者尤其是微粒，例如膠體金，如在US-A-5691207、US-A-5650333和EP-A-564449中所述的那樣。
這三個(gè)實(shí)施方案都尤其適用于在WO 02/090995中所述的平板測(cè)定。
正如前面提到過(guò)的，對(duì)片段的測(cè)定也可以通過(guò)不需要使用特異性結(jié)合配偶體的方法來(lái)進(jìn)行，例如色譜、質(zhì)譜、核磁共振等。
本發(fā)明測(cè)定方法中所用的蛋白水解酶，可以是能夠裂解蛋白質(zhì)的任何酶。然而，尤其優(yōu)選那些只在特異性位點(diǎn)裂解蛋白質(zhì)的酶，例如靠近特性異氨基酸殘基或者序列的位置。這樣的特異性蛋白酶的一個(gè)實(shí)例為天冬酰胺內(nèi)肽酶類(lèi)，例如豆球蛋白，它在天冬酰胺部分的C端側(cè)裂解酰胺鍵。這種內(nèi)肽酶的制備例如在US-A-5094952中說(shuō)明，并且可以從Takara Shuzo Co.Ltd.，Kyoto，Japan商業(yè)獲得該酶。其他可以使用的蛋白酶包括，例如無(wú)色肽酶、酰氨肽酶、曲霉胃蛋白酶、羧肽酶(A、B或者C)、組織蛋白酶(B、D、G或者H)、木瓜凝乳蛋白酶、二肽基肽酶(I和IV)、內(nèi)肽酶K、內(nèi)蛋白酶精氨酸-C、腸肽酶、無(wú)花果蛋白酶、明膠酶、γ-Glu-X羧肽酶、谷氨酰基內(nèi)肽酶、亮氨酰氨肽酶、膜丙氨酰胺氨基肽酶、膜Pro-C羧肽酶、微生物膠原酶、多催化內(nèi)肽酶復(fù)合物、胰彈性蛋白酶、胃蛋白酶A、肽基-Asp金屬內(nèi)切肽酶、肽基二肽酶、血漿激肽釋放酶、纖維蛋白質(zhì)溶酶、t-纖溶酶原活化劑、u-纖溶酶原活化劑、焦谷氨酰肽酶、腎素、逆胃蛋白酶、莖菠蘿蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、凝血酶、組織激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶、鈣蛋白酶、蛋白酶K、梭菌蛋白酶、凝固因子X(jué)a、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶。如果需要，可以同時(shí)或者順序使用兩種或者更多種這樣的蛋白酶。尤其優(yōu)選使用胰凝乳蛋白酶。
在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選用蛋白水解酶在使蛋白質(zhì)被裂解的條件下，將蛋白質(zhì)培養(yǎng)一定時(shí)間，以釋放出不同同種型產(chǎn)生的特征片段。
培養(yǎng)一般要持續(xù)1～120分鐘，優(yōu)選為5～40分鐘，尤其優(yōu)選溫度從室溫到42℃之間，特別是從室溫到38℃之間。
對(duì)于任一種具體的目的蛋白質(zhì)，為了確定哪些片段要作為分析物應(yīng)用，通常希望將糖基化和非糖基化同種型裂解，將用色譜方法產(chǎn)生的片段分離后對(duì)它們進(jìn)行比較。之后可以用光譜學(xué)來(lái)鑒別要選擇的合適片段，并且，如果該蛋白質(zhì)序列是已知的，且該蛋白酶的裂解是位點(diǎn)特異性的，那么這個(gè)被選擇的片段序列就能從一系列可能的片段中被鑒別出來(lái)。如此鑒別得到的片段，它的sbp就可以用常規(guī)技術(shù)來(lái)制備。
特別優(yōu)選采用二模式分離和光譜技術(shù)，例如色譜與質(zhì)譜、或核磁共振聯(lián)用對(duì)特征片段進(jìn)行鑒別。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振技術(shù)(SPR)來(lái)進(jìn)行測(cè)定，該技術(shù)是一種非侵入性光學(xué)技術(shù)，當(dāng)分子結(jié)合或者離解時(shí)，SPR感應(yīng)可以反映出測(cè)定器表面上質(zhì)量濃度的變化。
SPR可以通過(guò)叫做Biacore分析(可以從Biacore AB，Uppsala，Sweden獲得)的專(zhuān)用系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行。
本發(fā)明的方法尤其適合于多樣品測(cè)定，例如使用多孔微量滴定板(典型地為n×m孔板，其中n和m是正整數(shù)，最大值為20，尤其是96孔微量滴定板)。
本發(fā)明測(cè)定方法中所用的樣品，典型的為機(jī)體組織、器官或體液(例如尿、唾液、粘液、血液等)樣品或者它們產(chǎn)生的樣品。優(yōu)選樣品為血液或者血液產(chǎn)生的樣品，例如血清。采集樣品的受試種屬，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物、爬行類(lèi)動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)或甲殼類(lèi)動(dòng)物，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物(特別是人類(lèi))。
如果該糖蛋白是細(xì)胞結(jié)合的、或者是被細(xì)胞包囊的，樣品可以用常規(guī)方式處理以釋放該糖蛋白。類(lèi)似的，如果需要，糖蛋白可以進(jìn)行金屬化(例如如果該蛋白質(zhì)是一種結(jié)合鐵的蛋白質(zhì)，可以加入鐵離子)、去金屬化或者變性。經(jīng)預(yù)先處理樣品的準(zhǔn)確性質(zhì)取決于所要測(cè)定的具體糖蛋白。
本發(fā)明中轉(zhuǎn)鐵蛋白測(cè)定方法的一個(gè)實(shí)例如附圖的

圖1所示。附圖的圖2和圖3表示糖基化和非糖基化轉(zhuǎn)鐵蛋白被胰凝乳蛋白酶消化后所得蛋白質(zhì)片段的反相HPLC圖譜。圖1表示本發(fā)明測(cè)定方法的原理，亦即如何通過(guò)它們蛋白質(zhì)水解的不同，將無(wú)唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白與正常轉(zhuǎn)鐵蛋白區(qū)分開(kāi)。柱A是四唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白，柱B表示無(wú)唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白。步驟1表示從血清中固相捕獲轉(zhuǎn)鐵蛋白。非糖基化和糖基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白同種型都被捕獲。步驟2是抗體-轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物的消化。只有非糖基化的被消化生成獨(dú)特的片段圖譜，步驟3是對(duì)特異性蛋白質(zhì)片段的測(cè)定。抗體將辨認(rèn)出肽上的抗原表位，而不是完整的完全糖基化轉(zhuǎn)鐵蛋白上的抗原。圖2表示糖基化轉(zhuǎn)鐵蛋白的圖譜，圖3表示非糖基化轉(zhuǎn)鐵蛋白的圖譜。如圖所示，非糖基化同種型有幾個(gè)特征碎片(即基本上是獨(dú)特的)。圖4是非糖基化轉(zhuǎn)鐵蛋白肽序列的一個(gè)實(shí)例，該肽序列由胰凝乳蛋白酶裂解產(chǎn)生，通過(guò)MALDI-TOF和MS-MS進(jìn)行鑒別。
下表1～3中列出了分子量大于500g/mol的肽片段，這些片段理論上可以由轉(zhuǎn)鐵蛋白分別經(jīng)胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、溶媒體-C裂解而得到。通過(guò)將片段的免疫結(jié)合物應(yīng)用到載體分子上的抗體制備方法，如US-A-5773572中所述的那樣，可以很容易的制備這些片段的抗體。此測(cè)定方法可以簡(jiǎn)單的通過(guò)HPLC并測(cè)定非糖基化轉(zhuǎn)鐵蛋白特征峰出現(xiàn)的量來(lái)實(shí)現(xiàn)。
表1
表2
表3
圖4顯示由MALDI-TOF和電噴霧MS-MS實(shí)驗(yàn)測(cè)定的肽序列實(shí)例，該肽序列是從非糖基化轉(zhuǎn)鐵蛋白用胰凝乳蛋白酶裂解釋放得到的。該序列是NKSDNCEDTPEAGYF。
該序列是制備只識(shí)別非糖基化轉(zhuǎn)鐵蛋白的裂解產(chǎn)物的單克隆抗體的理想候選物。該序列與去酰胺基的非糖基化15殘基肽結(jié)合(compound)，經(jīng)反相HPLC分離的峰部分MALDI-MS測(cè)定的單同位素分子量(mass value)為1690。該肽片段與表1中列出的第9片段緊密結(jié)合。
實(shí)施例1測(cè)定1.向預(yù)先涂有抗轉(zhuǎn)鐵蛋白單克隆抗體的96孔微滴定板單個(gè)孔中，加入150μL的血清試驗(yàn)樣品或者對(duì)照樣品，并且于37℃溫和混合下培養(yǎng)大約30分鐘。
2.用200μL 100mM pH7.8含有0.05％的吐溫20的tris HCl緩沖液洗滌孔2次。再用200μL 100mM pH7.8的不含吐溫20的tris HCl緩沖液洗滌1次。
3.向每個(gè)孔中加入150μL預(yù)熱的100mM pH7.8的tris HCl緩沖液，然后加入10μL測(cè)序級(jí)胰凝乳蛋白酶(2μg/μL)，并且于37℃培養(yǎng)30分鐘。
4.通過(guò)加入10μL于4℃預(yù)冷的乙酸終止反應(yīng)。
5.加入30μL 100mM的TCEP，并繼續(xù)培養(yǎng)10分鐘。
6.將每個(gè)孔的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到預(yù)先涂有肽的新孔中。
7.加入50μL125I標(biāo)記的抗肽抗體，并在37℃培養(yǎng)60分鐘。
8.用100Mm pH7.8含0.05％吐溫20的tris HCl緩沖液洗滌孔3次，并測(cè)定結(jié)合在板上的125I標(biāo)記的抗肽抗體的量。
9.將結(jié)合抗體的量與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，測(cè)定肽以及最初樣品中相應(yīng)CDT的量。
實(shí)施例2熒光偏振免疫1.向適當(dāng)容器中加入50μL血清試驗(yàn)樣品或者對(duì)照樣品，用150μL預(yù)熱100mM pH7.8含測(cè)序級(jí)胰凝乳蛋白酶(40μg)tris HCl緩沖液，于35℃培養(yǎng)30分鐘。
2.通過(guò)加入標(biāo)準(zhǔn)抗胰凝乳蛋白酶抑制劑(例如100μM的TPCK或抑肽酶)來(lái)終止反應(yīng)。
3.加入30μL 100mM的TCEP，并繼續(xù)培養(yǎng)10分鐘。
4.將蛋白水解的裂解混合物轉(zhuǎn)移到新孔中，新孔內(nèi)含有預(yù)先規(guī)定量的已知熒光標(biāo)記的肽。
5.測(cè)量偏振熒光程度，mP。
6.加入50μL抗肽抗體，并于35℃培養(yǎng)5分鐘。
7.第二次測(cè)量偏振熒光程度mP’。
8.偏振熒光的差值，反映了與抗體結(jié)合的肽的相對(duì)量，將差值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，測(cè)定肽以及最初樣品中相應(yīng)CDT的量。
權(quán)利要求
1.一種用于具有至少兩種含不同糖基化模式的同種型蛋白質(zhì)的測(cè)定方法，該方法包括使含有所述蛋白質(zhì)的樣品與蛋白水解酶接觸，并且檢測(cè)由所述蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)生的至少一種肽片段的含量或者相對(duì)含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自轉(zhuǎn)鐵蛋白、堿性磷酸酯酶、絨毛膜促性腺激素和α-甲胎蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶為蛋白質(zhì)位點(diǎn)特異性蛋白水解酶。
4.根據(jù)前述各項(xiàng)權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中目的蛋白質(zhì)在與蛋白水解酶接觸之前，與其他蛋白質(zhì)分離。
5.一種用于前述各項(xiàng)權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)定方法的試劑盒，該試劑盒包括蛋白水解酶以及底物結(jié)合的對(duì)所述蛋白質(zhì)的至少兩種同種型特異性結(jié)合的配偶體(sbp)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中所述sbp適用于所述蛋白質(zhì)的所有同種型。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6任一所述的試劑盒，其中所述sbp為抗體或者抗體片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求5～7中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述sbp在遠(yuǎn)離糖基化位點(diǎn)的位點(diǎn)與蛋白質(zhì)結(jié)合。
9.根據(jù)權(quán)利要求5～8中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中檢測(cè)是指對(duì)特征肽片段sbp結(jié)合物的檢測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求5～9中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述的sbp是標(biāo)記的。
11.根據(jù)權(quán)利要求5～10中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述的sbp是用熒光染料標(biāo)記的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有至少兩種含不同糖基化模式的同種型蛋白質(zhì)的測(cè)定方法，該方法包括使含有所述蛋白質(zhì)的樣品與蛋白水解酶接觸，并且檢測(cè)由所述蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的至少一種肽片段的含量或者相對(duì)含量。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1768269SQ200480009126
公開(kāi)日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2004年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月6日
發(fā)明者菲利普·D·賴伊 申請(qǐng)人:阿克西斯-希爾德公司