專利名稱：生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能容易地對試樣中的基質(zhì)進(jìn)行迅速而高精度定量的生物傳感器。
背景技術(shù)：
作為對蔗糖和葡萄糖等糖類的定量分析方法，近年來開發(fā)了利用酶具有的特殊催化作用的各種類型生物傳感器。這里作為對試樣液中基質(zhì)定量方法的一個(gè)例子，對于葡萄糖的定量方法進(jìn)行說明。作為電化學(xué)的葡萄糖定量方法，眾所周知的是使用葡糖氧化酶(EC1.1.3.4，以下簡稱為GOD)和氧電極或過氧化氫電極進(jìn)行定量的方法。
GOD，是以氧作為電子傳遞體，有選擇性地對基質(zhì)β-D-葡萄糖進(jìn)行氧化，形成D-葡萄糖酸δ-內(nèi)酯。在氧存在的條件下，在由GOD引起的氧化反應(yīng)過程中，氧被還原成過氧化氫。通過氧電極測定氧的減少量，或者通過過氧化氫電極測定過氧化氫的增加量。氧的減少量和過氧化氫的增加量與試樣液中的葡萄糖含量成比例，所以通過氧的減少量或過氧化氫的增加量就可以對葡萄糖進(jìn)行定量。
在上述方法中，正如從反應(yīng)過程可以推斷的那樣，存在有測定結(jié)果受試樣液中所含氧濃度影響大的缺點(diǎn)，此外，當(dāng)試樣液中不存在氧時(shí)，就不可能進(jìn)行測定。于是，開發(fā)了不使用氧作為電子傳遞體，而以鐵氰化鉀、二茂鐵衍生物和苯醌衍生物等有機(jī)化合物和金屬絡(luò)合物作為電子傳遞體使用的新型葡萄糖傳感器。
在這種類型的傳感器中，通過使酶反應(yīng)結(jié)果生成的電子傳遞體的還原體在電極上氧化，從其氧化電流的量，求出試樣液中所含的葡萄糖濃度。使用這樣的有機(jī)化合物和金屬絡(luò)合物替代氧作為電子傳遞體，有可能在穩(wěn)定的狀態(tài)下準(zhǔn)確地使電極擔(dān)載已知量的GOD及其電子傳遞體，形成試劑層。這時(shí)，也可以在接近干燥的狀態(tài)下使試劑層與電極體系形成一個(gè)整體。
例如，如專利文獻(xiàn)1中所述，近年來以這種技術(shù)為基礎(chǔ)的一次性使用的葡萄糖傳感器受到很大關(guān)注。在一次性使用的葡萄糖傳感器中，傳感器可以安裝在測試儀器上，并可以從測試儀器上拆卸下來，僅通過向傳感器中導(dǎo)入試樣液，就可以很容易地用測試儀器測定葡萄糖的濃度。用這種方法，不僅可以對葡萄糖進(jìn)行定量，而且還可以用于對試樣液中所含的其它基質(zhì)進(jìn)行定量。
使用上述傳感器進(jìn)行測定時(shí)，可以在工作電極(作用極)上對還原型電子傳遞體進(jìn)行氧化，根據(jù)該過程中流過的氧化電流的值求出基質(zhì)濃度。但是，以血液和果汁等作為試樣使用時(shí)，在工作電極上，試樣中所含的抗壞血酸和尿酸等易氧化性干擾物質(zhì)和還原型電子傳遞體同時(shí)被氧化。并且，這種易氧化性干擾物質(zhì)的氧化反應(yīng)有時(shí)會(huì)對測定結(jié)果產(chǎn)生正誤差。同時(shí)，有時(shí)由于氧化型電子傳遞體和易氧化性干擾物質(zhì)接觸，會(huì)生成和酶反應(yīng)毫無關(guān)系的還原型電子傳遞體，從而對測定結(jié)果產(chǎn)生正誤差。
用生物傳感器進(jìn)行測定的測試試樣中，多數(shù)情況下含有對測定特定成分有影響的干擾物質(zhì)。為了降低由該干擾物質(zhì)產(chǎn)生的影響，例如在專利文獻(xiàn)2中提出了在生物傳感器的上游，通過酶使干擾物質(zhì)氧化的技術(shù)。另外專利文獻(xiàn)3中提出了在傳感器的上游，通過電極使干擾物質(zhì)氧化的技術(shù)。但是即使通過這些技術(shù)，也不能完全消除對測定結(jié)果的誤差。
美國專利第5120420號的說明書[專利文獻(xiàn)2]日本專利第3102613號的說明書[專利文獻(xiàn)3]美國專利第6340428號的說明書發(fā)明內(nèi)容于是，本發(fā)明的研究目的在于提供不受試樣中所含易氧化性干擾物質(zhì)的影響，并能夠迅速、高精度而且容易地對試樣中的基質(zhì)進(jìn)行定量的生物傳感器。
為了解決上述問題，本發(fā)明在具備有電絕緣基板、測定體系、至少含有氧化還原酶和電子傳遞體的試劑層的生物傳感器上，設(shè)置干擾物質(zhì)處理部件，該處理部件含有對測試試樣中所含干擾物質(zhì)具有作為氧化劑作用的氧化還原物質(zhì)和對前述氧化還原物質(zhì)進(jìn)行固定的載體。
在前述生物傳感器中，優(yōu)選設(shè)置由前述基板，隔片部件和遮蓋部件構(gòu)成的試樣供給通路。
而且前述干擾物質(zhì)處理部件，在把測試試樣供給到生物傳感器的過程中，只要將其設(shè)置在能與該測試試樣接觸的部位即可。具體講，也就是可以把前述試劑層和前述干擾物質(zhì)處理部件都設(shè)置在前述試樣供給通路內(nèi)。并且在這種情況下，優(yōu)選將前述干擾物質(zhì)處理部件設(shè)置在距離前述試劑層的上游側(cè)位置。
優(yōu)選前述測試試樣為生物試樣，前述干擾物質(zhì)為易氧化性物質(zhì)。
優(yōu)選前述氧化還原物質(zhì)為鐵氰化物。
還優(yōu)選前述載體含有離子交換性高分子。
還優(yōu)選前述測定體系含有在前述基板上形成的工作電極和對電極。
如上所述，如果按照本發(fā)明的生物傳感器，則可以在不受干擾物質(zhì)影響的情況下，很容易對測試試樣中的基質(zhì)進(jìn)行迅速而高精度的定量。
附圖的簡單說明[

圖1]是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中使用的葡萄糖傳感器的分解斜視圖。
是圖1所示葡萄糖傳感器的X-X線斷面圖。
符號的說明1基板2、3 引線4工作電極5絕緣層6對電極7隔片8遮蓋層實(shí)施本發(fā)明的最佳方案為了解決上述問題，本發(fā)明的特征是在具備有電絕緣基板、至少含有氧化還原酶和電子傳遞體的試劑層的生物傳感器上，設(shè)置干擾物質(zhì)處理部件，該處理部件含有對測試試樣中所含干擾物質(zhì)具有作為氧化劑作用的氧化還原物質(zhì)和對前述氧化還原物質(zhì)進(jìn)行固定的載體。
這里本發(fā)明中所說的干擾物質(zhì)是指在測試試樣中，與測試對象化合物共同存在的、并對測定對象化合物的傳感器響應(yīng)信號產(chǎn)生影響的物質(zhì)。例如使用血液作為測試試樣，通過對電子傳遞體進(jìn)行氧化來對測定對象化合物進(jìn)行定量時(shí)，血液中所含的抗壞血酸、尿酸、乙酰胺基苯酮等成為主要干擾物質(zhì)。這些物質(zhì)是易氧化性化合物。
在本發(fā)明涉及的生物傳感器中，通過含有對于這類干擾物質(zhì)起氧化劑作用的氧化還原物質(zhì)和對此氧化還原物質(zhì)進(jìn)行固定的載體的干擾物質(zhì)處理部件，可以對含有抗壞血酸和尿酸等易氧化性干擾物質(zhì)的生物試樣和果汁等試樣液進(jìn)行處理，并抑制干擾物質(zhì)對傳感器響應(yīng)的影響。
如上所述，通過傳感器電極體系上擔(dān)載的氧化型電子傳遞體與易氧化性干擾物質(zhì)接觸，有時(shí)還會(huì)生成與酶反應(yīng)沒有關(guān)系的還原型電子傳遞體。本發(fā)明就是利用這一特性來抑制干擾物質(zhì)的影響。例如，如果有含抗壞血酸的溶液接觸，則在鐵氰化離子和抗壞血酸之間發(fā)生氧化還原反應(yīng)，鐵氰化離子被還原成亞鐵氰化離子，抗壞血酸被氧化成不可逆的生成物。并且，如果該亞鐵氰化離子擴(kuò)散到傳感器電極體系上，則會(huì)對傳感器的響應(yīng)值造成正誤差。
與此相比，本發(fā)明的生物傳感器，干擾物質(zhì)處理部件中，在對干擾物質(zhì)具有氧化劑作用的氧化還原物質(zhì)中所含的亞鐵氰化離子等被靜電固定(固定方法的一種，參照Oyamaetal.Anal.Chem.，58(4)，979-981(1986)。)在構(gòu)成載體的陽離子性高分子膜上因此可以抑制上述易氧化性物質(zhì)的影響。同時(shí)，關(guān)于抗壞血酸，一旦受到氧化就被穩(wěn)定，所以其還原能大幅度降低，可以大幅度減輕對一系列傳感器電極反應(yīng)的影響。
此外，根據(jù)試樣液中所含的基質(zhì)，可以適當(dāng)選擇試劑層中所含的氧化還原酶。作為氧化還原酶，可以使用果糖脫氫酶、葡萄糖氧化酶、醇氧化酶、乳酸氧化酶、膽甾醇氧化酶、黃嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶等。
作為電子傳遞體，可以列舉鐵氰化鉀、p-苯醌、吩嗪甲硫酸鹽、亞甲藍(lán)、二茂鐵衍生物等。同時(shí)以氧作為電子傳遞體時(shí)，也可以得到電流響應(yīng)。電子傳遞體可以使用這些物質(zhì)中的一種或兩種或兩種以上。在本說明書中，把能與氧進(jìn)行電子交換的物質(zhì)稱為電子傳遞體。
特別是在測定體系中使用光學(xué)方式時(shí)，可以使用色素體(色素體)作為電子傳遞體。而且上面敘述的鐵氰化鉀和吩嗪甲硫酸鹽也可以作為色素使用。
這里，最具有本發(fā)明特征的干擾物質(zhì)處理部件含有對干擾物質(zhì)起氧化劑作用的氧化還原物質(zhì)和對前述氧化還原物質(zhì)進(jìn)行固定的載體。當(dāng)干擾物質(zhì)是抗壞血酸時(shí)，與抗壞血酸相比，作為對干擾物質(zhì)起氧化劑作用的氧化還原物質(zhì)，優(yōu)選其具有正側(cè)的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位(抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位為0.058V)的物質(zhì)。
此外，還優(yōu)選對于干擾物質(zhì)起氧化劑作用的氧化還原物質(zhì)與電子傳遞體屬于同一種類的化合物。這時(shí)，可以使傳感器具有結(jié)構(gòu)簡單，使用方便的特點(diǎn)。
作為對前述氧化還原物質(zhì)進(jìn)行固定的載體，優(yōu)選使用離子交換性高分子。通過靜電相互作用，前述氧化還原物質(zhì)被固定在離子交換性高分子上。因此，當(dāng)使用陰離子氧化還原性物質(zhì)時(shí)，優(yōu)選使用陽離子性離子交換性高分子。例如作為對鐵氰化物離子進(jìn)行固定的載體，可以使用聚乙烯基吡啶。另一方面，當(dāng)使用陽離子氧化還原性物質(zhì)時(shí)，優(yōu)選使用陰離子性離子交換性高分子。其具體例子可以列舉鐵噻吩甲基三甲基銨(Pc-CH2-NMe3)向全氟碳磺酸(美國杜邦公司制造的那菲昂(ナフイオン))的固定。
對前述氧化還原物質(zhì)進(jìn)行固定的載體，也可以是能夠?qū)η笆鲅趸€原物質(zhì)進(jìn)行共價(jià)鍵或配位鍵固定的載體。例如，聚賴氨酸具有氨基殘基，所以如果使用戊二醛作為交聯(lián)劑，則可以使具有氨基的氧化還原物質(zhì)形成共價(jià)鍵而固定。聚乙烯基咪唑的咪唑基可以起到配位基的作用，所以可以對例如鋨絡(luò)合物(Os(bpy)2Cl)等的金屬絡(luò)合物進(jìn)行固定。
也可以通過把試劑層固定在工作電極上，而使酶或電子傳遞體不溶解。進(jìn)行固定時(shí)，優(yōu)選使用交聯(lián)固定法或吸附法。還可以使其混合在電極材料中。
作為構(gòu)成工作電極的材料，可以是在對電子傳遞體進(jìn)行氧化的過程中，其自身不被氧化的導(dǎo)電性物質(zhì)。同時(shí)作為電極體系的制作方法，優(yōu)選采用絲網(wǎng)印刷法、濺射法、蒸鍍法等方法。
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例《實(shí)施例1》作為生物傳感器的一例，制作具有圖1和圖2所示結(jié)構(gòu)葡萄糖傳感器。圖1是除去試劑層等的葡萄糖傳感器的分解斜視圖。圖2是圖1的X-X線的斷面圖。
在由聚對苯二甲酸乙二醇酯制成的電絕緣基板1上，通過絲網(wǎng)印刷印上銀糊，形成引線2和3。接著在基板1上，印刷含有樹脂粘合劑的導(dǎo)電性碳糊，形成工作電極4。使工作電極4與引線2接觸。
接著，在基板1上，印刷絕緣糊形成絕緣層5。用絕緣層5覆蓋工作電極4的外周部分，通過這種方法，保證工作電極4露出部分的面積一定。而且用絕緣層5覆蓋引線2和3的一部分。再在基板1上印刷含有樹脂粘合劑的導(dǎo)電性碳糊，并使碳糊與引線3接觸，形成對電極6。
接著在具有工作電極4和對電極6的電極體系上，滴下羧甲基纖維素(CMC)水溶液，使其干燥后形成CMC層。再于CMC層上滴下含有作為酶的GOD、含鐵氰化鉀作為電子傳遞體的水溶液，使其干燥形成試劑層9。
接著，為了更順利地把試樣液供給到前述試劑層，使卵磷脂的甲苯溶液從試樣液的供給口擴(kuò)散到試劑層上、并使其干燥，在前述試劑層上形成卵磷脂層(圖中沒有示出)。為了形成卵磷脂層使用了甲苯，也可以使用其它有機(jī)溶劑。
然后，于通過在遮蓋部件8上貼附隔片部件7而劃分出的部分表面設(shè)置干擾物質(zhì)處理部件。在前述劃分部分的表面滴下適量的聚乙烯基吡啶(陽離子性高分子)溶液(水/甲醇/2-丙醇三元溶劑體系)，風(fēng)干，形成作為載體的高分子層。把該高分子層在含有0.2mM鐵氰化鉀的水溶液中浸漬1小時(shí)左右，在使其進(jìn)行離子交換反應(yīng)的同時(shí)，將鐵氰化物離子濃縮固定在前述高分子層內(nèi)。用這種方法形成干擾物質(zhì)處理部件10。
與溶液濃度相比，通過循環(huán)伏安譜計(jì)算出的高分子層內(nèi)的鐵氰化物離子濃度是其2000-3000倍。把用上述方法制作的含有干擾物質(zhì)處理部件的隔片/遮蓋部件按照圖1中點(diǎn)劃線所示的位置關(guān)系接合，制成本發(fā)明的葡萄糖傳感器。
把該葡萄糖傳感器安裝在測試儀器上，供給葡萄糖水溶液(360mg/dl)。經(jīng)過規(guī)定時(shí)間后，對工作電極4-對電極6之間施加500mV的電壓，測定5秒鐘后的電流值。液體中的鐵氰化物離子、葡萄糖、GOD發(fā)生反應(yīng)，其結(jié)果葡萄糖被氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯，鐵氰化物離子被還原成亞鐵氰化物離子，通過對該亞鐵氰化物離子進(jìn)行氧化可以得到電流響應(yīng)。這種電流響應(yīng)與試樣液中的葡萄糖濃度有依賴關(guān)系。
接著，供給含有10mg/dl抗壞血酸的葡萄糖水溶液(360mg/dl)，進(jìn)行同樣的測定。與除了不含干擾物質(zhì)處理部件以外其它條件完全相同的葡萄糖傳感器，在響應(yīng)方面進(jìn)行比較，結(jié)果表明在具有干擾物質(zhì)處理部件的傳感器中，可以大幅度抑制伴隨添加抗壞血酸而引起的響應(yīng)增大。
在上述實(shí)施例中，采用了相同的物質(zhì)作為對于干擾物質(zhì)起氧化劑作用的氧化還原物質(zhì)和電子傳遞體，但是并不局限于此，也可以采用各自不同的物質(zhì)。
此外在本實(shí)施例中，為得到電流響應(yīng)，把對電極體系施加的電壓定為500mV，但并不局限于此，也可以是能觀察到電信號變化的電壓，還可以是使電子傳遞體產(chǎn)生氧化的電壓。
在本實(shí)施例中，示出了電極體系、引線/端子的一個(gè)例子，但是其形狀、設(shè)置等情況不受本實(shí)施例的限制。
《實(shí)施例2》本實(shí)施例中，使用玻璃制的基板1和遮蓋部件8。按照與實(shí)施例1相同的方法制作生物傳感器。但是沒有進(jìn)行通過印刷絕緣糊而形成電極和引線。
在基板1上滴下羧甲基纖維素(CMC)水溶液，使其干燥形成CMC層，再于CMC層上，作為酶，滴下含有作為酶的GOD和含有作為電子傳遞體的1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓(1-メトキシ-5-メチルフエナジウム)的水溶液，使其干燥形成試劑層。
接著，為了更順利地把試樣液供給到前述試劑層上，使卵磷脂的甲苯溶液從試樣液的供給口擴(kuò)散到試劑層、并使其干燥，在前述試劑層上形成卵磷脂層。
然后，于通過在遮蓋部件8上貼附隔片部件7而劃分出的部分表面設(shè)置干擾物質(zhì)處理部件。在前述劃分部分的表面滴下適量的那菲昂(陰離子性高分子)溶液，風(fēng)干，形成作為載體的高分子層。對該高分子層進(jìn)行0.2mM1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓離子的濃縮固定。
把用上述方法制作的含有干擾物質(zhì)處理部件的隔片/遮蓋部件按照圖1中點(diǎn)劃線所示位置關(guān)系接合，制成本發(fā)明的葡萄糖傳感器。
向該葡萄糖傳感器中供給葡萄糖水溶液(360mg/dl)。經(jīng)過規(guī)定時(shí)間后，用620nm的光對基板1和遮蓋部件8的面進(jìn)行垂直照射，使用吸光光度計(jì)測定它的吸光度。經(jīng)過規(guī)定時(shí)間后，再次測定吸光度?？梢源_認(rèn)由于1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓、葡萄糖和GOD發(fā)生反應(yīng)，葡萄糖被氧化，1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓被還原，所以隨著時(shí)間的經(jīng)過，吸光度降低。該吸光度的降低程度與測試試樣中的葡萄糖濃度有依賴關(guān)系。
接著，供給含有10mg/l抗壞血酸的葡萄糖水溶液(360mg/dl)，進(jìn)行同樣的測定。可以確認(rèn)吸光度的降低程度與使用不含抗壞血酸的葡萄糖水溶液時(shí)相同。
為了進(jìn)一步進(jìn)行比較，除了不設(shè)置干擾物質(zhì)處理部件以外，其它按照與上述相同的操作制作比較用傳感器，并進(jìn)行同樣的測定。如果對于吸光度降低程度進(jìn)行比較，則可以確認(rèn)在比較用傳感器中，可以看到更大的吸光度降低。一般認(rèn)為這是由于作為電子傳遞體而使用的1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓不通過與葡萄糖的酶反應(yīng)，而直接被抗壞血酸還原的結(jié)果。這樣可以了解到，即使在光學(xué)式的傳感器中，在具有干擾物質(zhì)處理部件的傳感器中，也可以大幅度抑制伴隨添加抗壞血酸而引起的誤差。
權(quán)利要求
1.生物傳感器，其特征是具備電絕緣基板、測定體系和至少含有氧化還原酶和電子傳遞體的試劑層，并且包括有干擾物質(zhì)處理部件，該處理部件含有對測試試樣中所含干擾物質(zhì)起氧化劑作用的氧化還原物質(zhì)和對前述氧化還原物質(zhì)進(jìn)行固定的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的生物傳感器，其中，具有由前述基板、隔片部件和遮蓋部件構(gòu)成的試樣供給通路。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的生物傳感器，其中，把前述干擾物質(zhì)處理部件設(shè)置在距離前述試劑層的上游側(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)中所述的生物傳感器，其中，前述測試試樣為生物試樣，前述干擾物質(zhì)為易氧化性物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任意一項(xiàng)中所述的生物傳感器，其中，前述氧化還原物質(zhì)為鐵氰化物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5任意一項(xiàng)中所述的生物傳感器，其中，前述載體含有離子交換性高分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6任意一項(xiàng)中所述的生物傳感器，其中，前述測定體系包括在前述基板上形成的工作電極和對電極。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～7任意一項(xiàng)中所述的生物傳感器，其中，前述電子傳遞體和前述氧化還原物質(zhì)是同一種類的化合物。
全文摘要
提供可以對基質(zhì)進(jìn)行更高精度定量的生物傳感器。在具備電絕緣基板、在前述基板上形成的工作電極、對電極和至少含有氧化還原酶和電子傳遞體的試劑層的生物傳感器中，設(shè)置由對干擾物質(zhì)起氧化劑作用的氧化還原物質(zhì)和對前述氧化還原物質(zhì)進(jìn)行固定的載體構(gòu)成的干擾物質(zhì)處理部件。
文檔編號G01N33/487GK1573322SQ20041004577
公開日2005年2月2日 申請日期2004年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月28日
發(fā)明者池田信, 中南貴裕, 吉岡俊彥, 桑畑進(jìn) 申請人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社