Ccl15趨化因子在制備篩選甲狀腺濾泡癌試劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及CCL15趨化因子在制備篩選甲狀腺濾泡癌試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明以確診為甲狀腺濾泡癌的新鮮甲狀腺濾泡腫瘤組織標(biāo)本為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行了蛋白提取、細(xì)胞因子抗體芯片檢測、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)和抗體中和實(shí)驗(yàn)等，驗(yàn)證了甲狀腺濾泡癌中CCL15高表達(dá)，而且CCL15高表達(dá)組的巨噬細(xì)胞浸潤密度顯著大于CCL15低表達(dá)組，F(xiàn)TC培養(yǎng)上清可促進(jìn)Thp-1單核細(xì)胞株的遷移。所以，CCL15可作為潛在的生物標(biāo)記物，應(yīng)用于甲狀腺濾泡癌的篩選試劑中，同時(shí)也為CCL15應(yīng)用在甲狀腺濾泡癌的篩選試劑中提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。
【專利說明】CCL15趨化因子在制備篩選甲狀腺濾泡癌試劑中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及CCL15趨化因子在制備篩選甲狀腺濾泡癌試 劑中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 甲狀腺濾泡癌（follicular thyroid carcinoma, FTC)作為分化型甲狀腺癌的 類型之一，其發(fā)病率僅次于甲狀腺乳頭狀癌。大多數(shù)分化好的FTC和甲狀腺濾泡性腺瘤 (follicular adenoma, FA)無論在臨床表現(xiàn)還是影像學(xué)特點(diǎn)上幾乎無法鑒別；在細(xì)胞學(xué)形 態(tài)上，細(xì)針穿刺（fine needle aspiration, FNA)不能可靠地判斷濾泡性腫瘤是否浸潤包膜 外或侵犯包膜血管，因此不能用于區(qū)分濾泡性癌或腺瘤。
[0003] 同樣，在術(shù)中行冷凍切片診斷時(shí)，也不可能對(duì)包膜做徹底檢查，因此只有在多取材 后才能作出明確診斷。在組織病理學(xué)上，這兩種腫瘤的實(shí)質(zhì)成分基本相同，唯一能區(qū)別的是 包膜外和（或）血管侵犯。由于甲狀腺濾泡性腫瘤大多為孤立性、有包膜，即使石蠟切片證 實(shí)包膜外有微小浸潤，術(shù)中行甲狀腺腺葉切除術(shù)已能達(dá)到治療目的，預(yù)后很好，10年存活率 為70%?100%。而廣泛浸潤的甲狀腺濾泡癌通常在大體和光鏡下容易證實(shí)浸潤性生長， 腫瘤可侵犯到甲狀腺外，手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)和血道轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，10年存活率僅25%? 45%。
[0004] 但是，對(duì)于冷凍切片病理報(bào)告診斷為"甲狀腺濾泡性腫瘤，須等石蠟切片確定腫瘤 有無包膜和/或血管侵犯"的患者，面臨著二次手術(shù)的可能。正是由于甲狀腺濾泡癌和甲狀 腺腺瘤的鑒別困難，外科醫(yī)生難以制定合適的手術(shù)方案。
[0005] 因此，如果能對(duì)甲狀腺濾泡癌進(jìn)行有效地檢測和篩選，對(duì)病人的及時(shí)治療有著至 關(guān)重要的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是研究CCL15細(xì)胞因子在甲狀腺濾泡癌（FTC)中的作用，為臨床上 治療和檢測甲狀腺濾泡癌提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
[0007] 甲狀腺濾泡癌的病理特征是顯示侵襲性的濾泡細(xì)胞腫瘤，同時(shí)缺少乳頭狀癌診斷 性的核特征。腫瘤微環(huán)境是指除腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞以外的其他所有細(xì)胞總稱，其中數(shù)量最多的 是經(jīng)血液運(yùn)輸遷移至腫瘤部位的巨噬細(xì)胞，為腫瘤微環(huán)境中的主要成分。巨噬細(xì)胞來源于 骨髓CD34+祖細(xì)胞，首先在骨髓中增殖分裂，再以單核細(xì)胞的形式經(jīng)血液運(yùn)輸遷移。
[0008] 本研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞浸潤散在分布于甲狀腺濾泡性腫瘤的濾泡間質(zhì)，在癌旁正 常甲狀腺組織中幾乎不存在。在甲狀腺濾泡癌中，巨噬細(xì)胞的浸潤密度顯著高于其在甲狀 腺瘤中的密度。甲狀腺濾泡癌中的巨噬細(xì)胞表型傾向于M2型。
[0009] 在本課題中，我們分析了甲狀腺濾泡癌（FTC)和甲狀腺濾泡性腺瘤（FA)的細(xì)胞因 子譜，二者均分泌MCP-1、CSF-1、VEGF等細(xì)胞因子，其中CCL15的表達(dá)差異最為顯著。
[0010] CCL15是巨噬細(xì)胞炎癥蛋白家族的一員，對(duì)單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞具有 趨化作用。在我們的研究中，甲狀腺濾泡癌細(xì)胞上CCL15的表達(dá)顯著高于其在FA中的表達(dá)， 并與巨噬細(xì)胞的浸潤密度顯著相關(guān)。在細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中，CCL15中和抗體可抑制FTC133的 上清對(duì)Thp-Ι的趨化作用。結(jié)合組織芯片上FTC浸潤的巨噬細(xì)胞傾向于M2表型，顯示甲狀 腺濾泡癌細(xì)胞通過分泌CCL15招募血液中的單核細(xì)胞遷移至腫瘤中心，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā) 展。
[0011] 基于CCL15在FTC中的高表達(dá)，CCL15可作為潛在的生物標(biāo)記物，應(yīng)用于FTC患者 血清或甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺細(xì)胞盥洗液的檢驗(yàn)，為鑒別FTC奠定一定的理論基礎(chǔ)。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：1、本發(fā)明驗(yàn)證了甲狀腺濾泡癌中 CCL15高表達(dá)，甲狀腺濾泡癌細(xì)胞通過分泌CCL15招募血液中的單核細(xì)胞遷移至腫瘤中心， 促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。所以，CCL15可作為潛在的生物標(biāo)記物，應(yīng)用于甲狀腺濾泡癌的檢查。 2、本發(fā)明為CCL15應(yīng)用在甲狀腺濾泡癌的篩選試劑中提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1為CCL15在甲狀腺濾泡癌中的表達(dá)圖，其中，圖中的A為CCL15高表達(dá)組，圖 中的B為CCL15低表達(dá)組。
[0014] 圖2為CCL15對(duì)Thp-Ι細(xì)胞株的趨化作用圖。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0016] 實(shí)施例1
[0017] 將確診為甲狀腺濾泡癌的新鮮手術(shù)組織標(biāo)本，迅速放入組織凍存管，保存于液氮 罐中備用。
[0018] 1、甲狀腺濾泡癌分泌細(xì)胞因子譜分析
[0019] 本組實(shí)驗(yàn)中，我們提取了 FTC和FA的液氮冷凍標(biāo)本的蛋白，進(jìn)行細(xì)胞因子譜分析。 購自RayBio公司的人細(xì)胞因子抗體芯片G5含80種細(xì)胞因子。共對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行了芯片 分析，4例來自FTC，2例FA。從細(xì)胞因子芯片原始檢測圖中可以看到無論是甲狀腺濾泡癌 還是甲狀腺腺瘤，都表達(dá)CCL2、CSF-1、VEGF等趨化因子，但是表達(dá)差異最顯著的是巨噬細(xì) 胞炎癥蛋白 1 δ (macrophage inflammatory proteinl δ，ΜΙΡ-1 δ )，又名 CCL15 (chemokine C-C motif ligandl5，CCL15)。
[0020] 2、CCL15 在 FTC 中的表達(dá)
[0021] CCL15是一種單核細(xì)胞趨化因子。在觀察到FTC和FA細(xì)胞因子譜中CCL15的表 達(dá)差異后，我們在甲狀腺濾泡性腫瘤組織芯片上進(jìn)行免疫組化染色驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，76. 7 %的FTC 病例高表達(dá)CCL15,具體如圖1所述，圖中的A為CCL15高表達(dá)組，圖中的B為CCL15低表 達(dá)組。此外，通過分析FTC和FA中CCL15的表達(dá)與⑶68陽性的巨噬細(xì)胞浸潤密度的關(guān)系 發(fā)現(xiàn)，CCL15高表達(dá)組的巨噬細(xì)胞浸潤密度顯著大于CCL15低表達(dá)組。
[0022] 3、CCL15促進(jìn)甲狀腺濾泡癌細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞的招募
[0023] 基于上述CCL15高表達(dá)與巨噬細(xì)胞的密度顯著相關(guān)，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了 FTC細(xì) 胞是否通過分泌CCL15招募單核細(xì)胞。FTC133是人的甲狀腺濾泡癌細(xì)胞株，Thp-Ι是人 的單核細(xì)胞株，細(xì)胞表面表達(dá)CCR1受體。我們收集FTC133的條件培養(yǎng)基（conditional 1^虹11111，01)，與11^-1共培養(yǎng)2411后，觀察11^-1生物學(xué)行為的改變。如圖2所示，與空白 對(duì)照組相比FTC133的細(xì)胞培養(yǎng)上清能促進(jìn)Thp-1細(xì)胞的遷移。在FTC133-CM的刺激下， Thp-Ι穿過細(xì)胞小室上層粘附在鼠尾膠上，說明FTC133可以通過其分泌的細(xì)胞因子直接作 用于單核細(xì)胞。
[0024] 綜上所述，甲狀腺濾泡癌中CCL15高表達(dá)，而且CCL15高表達(dá)組的巨噬細(xì)胞浸潤密 度顯著大于CCL15低表達(dá)組，F(xiàn)TC培養(yǎng)上清可促進(jìn)Thp-Ι單核細(xì)胞株的遷移。所以，CCL15 可作為潛在的生物標(biāo)記物，應(yīng)用于甲狀腺濾泡癌的篩選試劑中，同時(shí)也為CCL15應(yīng)用在甲 狀腺濾泡癌的篩選試劑中提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。
【權(quán)利要求】
1. CCL15趨化因子在制備篩選甲狀腺濾泡癌試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104122392SQ201410286443
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】寧光, 黃鳳嬌, 王曙, 葉蕾 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院