專利名稱：一種診斷非典型性肺炎試劑盒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及診斷非典型性肺炎的試劑盒領(lǐng)域，尤其涉及一種SARS冠狀病毒S蛋白或其部分多肽和前兩者的免疫血清的診斷非典型肺炎試劑盒的制備方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)稱為非典型肺炎的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe Acute RespiratorySydrome，SARS)已經(jīng)在全世界100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生。據(jù)世界衛(wèi)生組織13日在瑞士日內(nèi)瓦公布的全球最新薩斯(非典)疫情報(bào)告說(shuō)，截止6月13日國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間17點(diǎn)整，全球共有薩斯病人和部分疑似病人8454例，其中死亡792例，痊愈6793例。這3個(gè)數(shù)字分別比前一天的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)增加了10例、2例和125例。有疫情的國(guó)家和地區(qū)的數(shù)目仍然是32個(gè)。其中中國(guó)大陸有病人和疑似病人5327例，343人死亡；中國(guó)香港1755例，293人死亡；中國(guó)澳門(mén)1例；中國(guó)臺(tái)灣693例，81人死亡；新加坡206例，31人死亡；加拿大242例，32人死亡；越南63例，5人死亡；泰國(guó)9例，馬來(lái)西亞5例，菲律賓14例，這3個(gè)國(guó)家的死亡病例都為2人；南非1例，1人死亡。
由于在感染到發(fā)病之間存在著長(zhǎng)達(dá)十天左右的潛伏期，快速大范圍的篩選出已經(jīng)感染而尚無(wú)臨床癥狀的帶病原體者以及疑似病例的確切診斷現(xiàn)得十分重要首先在普通人群中篩選出已經(jīng)感染而尚無(wú)臨床癥狀的帶病原體者，可以阻止非典型肺炎傳給健康人，避免更大范圍的感染；其次，對(duì)疑似病例的確切診斷可以區(qū)分真正感染者和非感染者，使感染者能夠得到及時(shí)而全面的治療，而對(duì)未感染者能夠解除隔離，避免國(guó)家和個(gè)人在時(shí)間和經(jīng)濟(jì)上的損失。由此可見(jiàn)對(duì)非典型肺炎的早期和準(zhǔn)確診斷具有十分重大的意義。但是目前市面上大量使用的非典型肺炎診斷試劑盒不能在非典型肺炎的發(fā)病早期對(duì)其進(jìn)行診斷，而且準(zhǔn)確率非常低，約為40％，往往病人已經(jīng)有了明顯的臨床癥狀后，仍然不能用檢測(cè)試劑盒檢測(cè)出來(lái)。目前的非典型肺炎診斷試劑盒的缺陷是由其設(shè)計(jì)的原理所造成的它是以病毒顆?；蛲ㄟ^(guò)基因工程表達(dá)的蛋白質(zhì)作為包被物，檢測(cè)人血清中的特異性抗體來(lái)判斷。該原理的缺陷在于1.直接將引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒進(jìn)行包被可能會(huì)造成檢測(cè)人員感染上非典型肺炎；2.人血清中的特異性抗體的產(chǎn)生必須是在被引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒后的一到兩周后才能產(chǎn)生，而被感染一到兩周后病人已經(jīng)表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，這使得使用該種原理制成的非典型肺炎診斷試劑盒失去了意義；3.有相當(dāng)多的非典型肺炎病人在被引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒并未產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的特異性抗體，這使得使用該種原理制成的非典型肺炎診斷試劑盒完全不能鑒別出非典型肺炎患者。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種診斷非典型肺炎試劑盒的制備方法，制備簡(jiǎn)便，方法易行，早期診斷，準(zhǔn)確診斷，該試劑盒可檢測(cè)全血中引非典型肺炎傳染病的SARS冠狀病毒顆粒及其抗原。
為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施本發(fā)明涉及SARS冠狀病毒S蛋白和其部分多肽以及免疫哺乳動(dòng)物所制得的單克隆抗體或多克隆抗體，涉及含有用于所述目的的基因疫苗中的SARS冠狀病毒S蛋白的全長(zhǎng)或部分基因片段，涉及以SARS冠狀病毒S蛋白和其部分多肽以及免疫哺乳動(dòng)物所制得的單克隆抗體或多克隆抗體為材料制成非典型肺炎診斷試劑盒的制備方法。本發(fā)明中，構(gòu)建了若干重組質(zhì)粒，以便包括編碼SARS冠狀病毒S蛋白的核苷酸序列。
編碼SARS冠狀病毒S蛋白的核苷酸序列見(jiàn)序列表，本發(fā)明涉及SARS冠狀病毒S蛋白的核苷酸序列包括序列表所示的完整序列(見(jiàn)表1)和其片段(見(jiàn)表2)。
本發(fā)明的實(shí)施步驟為1.以基因合成方法或RT-PCR從病人血清擴(kuò)增的方法得到編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段；2.將1所得到的編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段克隆到原核表達(dá)載體上；3.將2所得到的帶有編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的重組原核表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；4.將3所得到的編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白通過(guò)蛋白質(zhì)純化的方法如硫酸氨法或親和層析法得到提純的編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白；5.將4所得到的蛋白以單獨(dú)形式或與佐劑混合的方式免疫哺乳動(dòng)物，如小鼠，兔，馬，牛，豬等；
6.收集5所免疫的哺乳動(dòng)物的血清；7.將6所得到的血清，參照Harlow等人描述的ELISA方法包被到以塑料為材料的96孔板上；并用牛奶或牛血清白蛋白封閉處理。
8.將5所得到的血清，參照Harlow等人描述的ELISA方法標(biāo)記上同底物反應(yīng)后能顯色的酶，如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶，或者標(biāo)記上熒光基團(tuán)。
9.將7所得到的包被有抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體的96孔板和經(jīng)過(guò)8所標(biāo)記的抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體及其現(xiàn)色底物和反應(yīng)終止液，組成非典型肺炎診斷試劑盒。
本發(fā)明所得到的非典型肺炎診斷試劑盒的各組分1.包被有抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體的96孔板。
2.標(biāo)記有顯色的酶，如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶的抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體溶液。
3.20％雙氧水。
4.四氯萘酚本發(fā)明所得到的非典型肺炎診斷試劑盒的使用方法如下1.取待測(cè)者全血150微升，加入到包被有抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體的96孔板中，溫育30分鐘；2.棄加入的待測(cè)者全血，用200微升PBS或PBST洗滌五次，并拍干；3.加入標(biāo)記上同底物反應(yīng)后能顯色的酶，如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶，或者標(biāo)記上熒光基團(tuán)的抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體，溫育30分鐘；4.棄3所加入的液體，用200微升PBS或PBST洗滌五次，并拍干；5.如3所加入的是標(biāo)記上同底物反應(yīng)后能顯色的酶，如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶，則加入其對(duì)應(yīng)底物，現(xiàn)色15分鐘；用硫酸終止反應(yīng)；6.測(cè)量反應(yīng)后反應(yīng)孔的吸光值或熒光強(qiáng)度。如果測(cè)量值大于2.1倍陰性對(duì)照值，則本次測(cè)量結(jié)果為陽(yáng)性，待測(cè)者為非典型肺炎患者；如果測(cè)量值小于2.1倍陰性對(duì)照值，則本次測(cè)量結(jié)果為陰性，待測(cè)者為不是非典型肺炎患者。
與上述現(xiàn)有原理制備非典型肺炎診斷試劑盒相比，本發(fā)明使用另一策略來(lái)制備非典型肺炎診斷試劑盒，即以引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒的抗體為包被物，檢測(cè)人全血中的引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒的抗原。一旦引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒入侵人體，就會(huì)在機(jī)體中存在著引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒的抗原，這包含著兩層含義1.可以早期診斷，只要引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒入侵人體，使用本發(fā)明所涉及的非典型肺炎診斷試劑盒就能檢測(cè)出來(lái)；2.可以準(zhǔn)確診斷，機(jī)體中是否存在著引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒的抗原與病人是否患有非典型肺炎存在著必然的聯(lián)系a.使用本發(fā)明所涉及的非典型肺炎診斷試劑盒檢測(cè)出引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒的抗原，則該被檢測(cè)者必然患有非典型肺炎；b.使用本發(fā)明所涉及的非典型肺炎診斷試劑盒不能檢測(cè)出引起非典型肺炎的SARS冠狀病毒的抗原，則該被檢測(cè)者必然沒(méi)有患非典型肺炎。
SARS冠狀病毒S蛋白是介導(dǎo)SARS冠狀病毒識(shí)別宿主細(xì)胞以及入侵過(guò)程中的膜融合過(guò)程的關(guān)鍵蛋白，與SARS冠狀病毒入侵人體的致病過(guò)程密切相關(guān)。SARS冠狀病毒S蛋白位于病毒囊膜表面，在病毒入侵時(shí)介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜表面受體的相互作用，并留在細(xì)胞表面，成為受病毒感染細(xì)胞的表面標(biāo)志。因此SARS冠狀病毒S蛋白存在SARS冠狀病毒囊膜表面和受病毒感染細(xì)胞的表面，這成為機(jī)體是否被感染的重要的判斷標(biāo)準(zhǔn)。


圖1為一種診斷非典型肺炎試劑盒的制備方法原理圖。
具體實(shí)施例方式
1.構(gòu)建含SARS冠狀病毒S蛋白S2亞基基因片段的811bp-1221bp的核苷酸序列的真核表達(dá)載體合成SARS冠狀病毒S蛋白S2亞基基因片段的811bp-1221bp的核苷酸序列，然后通過(guò)PCR法以引物對(duì)5’ggggaattcgacatggaatcacttacaacaacatcaactgc 3’5’cccggatcctactaagcttgctcctgggatggcacatacg 3’為引物，合成SARS冠狀病毒S蛋白S2亞基基因片段的811bp-1221bp的核苷酸序列為模板，擴(kuò)增得到兩端分別加上EcoRI和HindIII限制性酶切位點(diǎn)的在該段核苷酸序列的兩端分別加上EcoRI和HindIII限制性酶切位點(diǎn)的SARS冠狀病毒S蛋白S2亞基基因片段的811bp-1221bp的核苷酸序列。PCR反應(yīng)總體積為50μl，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3分鐘；PCR循環(huán)參數(shù)94℃60秒，48℃30秒，72℃20秒，最后一次循環(huán)在72℃延伸7分鐘。
然后用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII將該P(yáng)CR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pET28a進(jìn)行雙酶切，使兩者兩端成為粘端。其后于16℃在T4 DNA連接酶的作用下將兩個(gè)片段連接起來(lái)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化處于感受態(tài)的大腸桿菌DH5α。從轉(zhuǎn)化平皿上挑取單菌落，接種于5mL含100μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜。次日按Sambrook等人描述的小量堿法提取質(zhì)粒[Sambrook J，et al，1989]。用限制性內(nèi)切酶EcoRI作酶切鑒定，選出含有片段較大的重組質(zhì)粒，然后用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII作酶切鑒定，挑出其中能切出SARS S2的重組質(zhì)粒。按照前述給片段兩端加上EcoRI和HindII]位點(diǎn)的PCR方法進(jìn)行PCR，對(duì)含有SARS S2片段的重組質(zhì)粒進(jìn)一步鑒定，將能夠擴(kuò)增出SARS S2的重組質(zhì)粒定名為pET-S2。
2.接種BL21(DE3)/pET-S2于5mL含100μg/mLAmp的LB液體培養(yǎng)基，在37℃下250rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日將過(guò)夜培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)種于50mL含100μg/mLAmp的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600＝1.0，加入10％乳糖使其終濃度為1％，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)后，收集菌體，按5mL/g(濕重)重懸于含1mmol/LEDTA，0.5mmol/L PMSF的PBS(pH8.0)。超聲破菌后，4000rpm離心10分鐘，除去菌體殘?jiān)?。上清?℃下，12000rpm離心15分鐘。上清和沉淀分別上樣進(jìn)行12％的SDS-PAGE電泳檢測(cè)。
3.將表達(dá)帶6-His標(biāo)記的S2蛋白的大腸桿菌離心收集菌體，置冰上15分鐘。以每克菌體2-5ml裂解緩沖液的比例重懸菌體于裂解緩沖液中。加溶菌酶置終濃度1mg/ml，置于冰上30分鐘。在冰上用超聲波破碎菌體。4℃4000g離心10分鐘以去處細(xì)胞碎片，保留上清于-20℃。
往4ml大腸桿菌裂解液中加入1ml 50％Ni-NTA漿液，4℃緩慢搖動(dòng)。將上述混合液倒入底部有蓋子的柱子中。去掉柱子底部的蓋子讓混合液流出。用4ml洗雜液洗柱兩次。用0.5ml洗脫液洗脫四次。
4.將提純后蛋白S2經(jīng)SDS-PAGE分離，切下目的帶后，在無(wú)菌的瓷研缽中破碎使之能夠通過(guò)4.5號(hào)注射器針頭。取五只昆明系小鼠，按照每只小鼠每次50微克蛋白質(zhì)的用量皮下免疫小鼠。每?jī)尚瞧诩訌?qiáng)免疫一次，第二次加強(qiáng)免疫一周后采血。
最后一次免疫后采用小鼠眼眶取血法采全血。采血前小鼠應(yīng)禁食6小時(shí)。血樣收集在無(wú)菌的離心管中，放于37℃30～60分鐘使之凝聚。用無(wú)菌的槍頭將凝塊與管壁分離，4℃放置過(guò)夜。次日從離心管中吸出血清，4℃下離心(1000g，10分鐘)去除不溶物。
5.以戊二醛法將4所得到的抗體標(biāo)記上辣根過(guò)氧化物酶。
6.參照Harlow等人描述的ELISA方法將4所得到的血清用包被緩沖液稀釋至1ng/μL，往酶標(biāo)板每孔加入200μL，4℃包被過(guò)夜。次日，洗滌液洗滌一次，用封閉液于37℃封閉2小時(shí)。洗滌液洗滌，共重復(fù)5次，倒置于37℃烘干。
7.將5和6所得到的產(chǎn)品與四氯萘酚和雙氧水組成非典型肺炎診斷試劑盒按照前述本非典型肺炎診斷試劑盒的使用雙盲法檢測(cè)83例血清，準(zhǔn)確率為96.39％，其中陽(yáng)性符合率為97.62％；陰性符合率為95.12％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前市面上所用的產(chǎn)品。
SEQUENCE LISTING表1 SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因序列表<110>武漢大學(xué)<120>一種診斷非典型性肺炎試劑盒的制備方法<130>一種診斷非典型性肺炎試劑盒的制備方法<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3768<212>DNA<213>SARS coronavirus<300><301>Marra，M.A.，Jones，S.J.，Astell，C.R.，Holt，R.A.，Brooks-Wilson，A.，<302>The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronavirus<303>Science<304>2003<305>0<306>13<307>2003-05-01<308>GI29836496<309>2003-05-22<313>(1)..(3768)<400>1atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt300tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag 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coronavirus<300><301>Marra，M.A.，Jones，S.J.，Astell，C.R.，Holt，R.A.，Brooks-Wilson，A.，<302>The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronavirus<303>Science<304>2003<305>0<306>13<307>2003-05-01<308>GI29836496<309>2003-05-22<313>(1)..(411)<400>1gaatcactta caacaacatc aactgcattg ggcaagctgc aagacgttgt taaccagaat 60gctcaagcat taaacacact tgttaaacaa cttagctcta attttggtgc aatttcaagt120gtgctaaatg atatcctttc gcgacttgat aaagtcgagg cggaggtaca aattgacagg180ttaattacag gcagacttca aagccttcaa acctatgtaa cacaacaact aatcagggct240gctgaaatca gggcttctgc taatcttgct gctactaaaa tgtctgagtg tgttcttgga300caatcaaaaa gagttgactt ttgtggaaag ggctaccacc ttatgtcctt cccacaagca360gccccgcatg gtgttgtctt cctacatgtc acgtatgtgc catcccagga g 41權(quán)利要求
1.一種診斷非典型肺炎試劑盒的制備方法，包括下列步驟A、以基因合成方法或RT-PCR方法得到編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段；B、將A所得到的編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段克隆到原核表達(dá)載體上；C、將B所得到的帶有編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的重組原核表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；D、將C所得到的編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白通過(guò)蛋白質(zhì)純化的方法得到提純的編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白；E、將D所得到的蛋白以單獨(dú)形式或與佐劑混合的方式免疫哺乳動(dòng)物；F、收集E所免疫的哺乳動(dòng)物的血清；G、將F所得到的血清，按Harlow描述的ELISA方法包被到以塑料為材料的96孔板上，并用牛奶或牛血清白蛋白封閉處理；H、將E所得到的血清，按Harlow描述的ELISA方法標(biāo)記上同底物反應(yīng)后能顯色的酶；I、將G所得到的包被有抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體的96孔板和經(jīng)過(guò)H所標(biāo)記的抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體及其現(xiàn)色底物和反應(yīng)終止液，組成非典型肺炎診斷試劑盒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種診斷非典型肺炎試劑盒的制備方法，其特征在于SARS冠狀病毒S蛋白的全長(zhǎng)基因序列是atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt300tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa540cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat600caacctatag atgtagttcg tgatctacct tctggtttta acactttgaa acctattttt660aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat tttagagcca ttcttacagc cttttcacct720gctcaagaca tttggggcac gtcagctgca gcctattttg ttggctattt aaagccaact780acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa840aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt aagagctttg agattgacaa aggaatttac900cagacctcta atttcagggt tgttccctca ggagatgttg tgagattccc taatattaca960aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg 1020gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt 1080ttttcaacct ttaagtgcta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc 1140aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga 1200caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc 1260cttgcttgga atactaggaa cattgatgct acttcaactg gtaattataa ttataaatat 1320aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc tttgagagag acatatctaa tgtgcctttc 1380tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct gctcttaatt gttattggcc attaaatgat 1440tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct 1500tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt 1560aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct1620tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat1680tccgttcgag atcctaaaac atctgaaata ttagacattt caccttgcgc ttttgggggt1740gtaagtgtaa ttacacctgg aacaaatgct tcatctgaag ttgctgttct atatcaagat1800gttaactgca ctgatgtttc tacagcaatt catgcagatc aactcacacc agcttggcgc1860atatattcta ctggaaacaa tgtattccag actcaagcag gctgtcttat aggagctgag1920catgtcgaca cttcttatga gtgcgacatt cctattggag ctggcatttg tgctagttac1980catacagttt ctttattacg tagtactagc caaaaatcta ttgtggctta tactatgtct2040ttaggtgctg atagttcaat tgcttactct aataacacca ttgctatacc tactaacttt2100tcaattagca ttactacaga agtaatgcct gtttctatgg ctaaaacctc cgtagattgt2160aatatgtaca tctgcggaga ttctactgaa tgtgctaatt tgcttctcca atatggtagc2220ttttgcacac aactaaatcg tgcactctca ggtattgctg ctgaacagga tcgcaacaca2280cgtgaagtgt tcgctcaagt caaacaaatg tacaaaaccc caactttgaa atattttggt2340ggttttaatt tttcacaaat attacctgac cctctaaagc caactaagag gtcttttatt2400gaggacttgc tctttaataa ggtgacactc gctgatgctg gcttcatgaa gcaatatggc2460gaatgcctag gtgatattaa tgctagagat ctcatttgtg cgcagaagtt caatggactt2520acagtgttgc cacctctgct cactgatgat atgattgctg cctacactgc tgctctagtt2580agtggtactg ccactgctgg atggacattt ggtgctggcg ctgctcttca aatacctttt2640gctatgcaaa tggcatatag gttcaatggc attggagtta cccaaaatgt tctctatgag2700aaccaaaaac aaatcgccaa ccaatttaac aaggcgatta gtcaaattca agaatcactt2760acaacaacat caactgcatt gggcaagctg caagacgttg ttaaccagaa tgctcaagca2820ttaaacacac ttgttaaaca acttagctct aattttggtg caatttcaag tgtgctaaat2880gatatccttt cgcgacttga taaagtcgag gcggaggtac aaattgacag gttaattaca2940ggcagacttc aaagccttca aacctatgta acacaacaac taatcagggc tgctgaaatc3000agggcttctg ctaatcttgc tgctactaaa atgtctgagt gtgttcttgg acaatcaaaa3060agagttgact tttgtggaaa gggctaccac cttatgtcct tcccacaagc agccccgcat3120ggtgttgtct tcctacatgt cacgtatgtg ccatcccagg agaggaactt caccacagcg3180ccagcaattt gtcatgaagg caaagcatac ttccctcgtg aaggtgtttt tgtgtttaat3240ggcacttctt ggtttattac acagaggaac ttcttttctc cacaaataat tactacagac3300aatacatttg tctcaggaaa ttgtgatgtc gttattggca tcattaacaa cacagtttat3360gatcctctgc aacctgagct tgactcattc aaagaagagc tggacaagta cttcaaaaat3420catacatcac cagatgttga tcttggcgac atttcaggca ttaacgcttc tgtcgtcaac3480attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gtcgctaaaa atttaaatga atcactcatt3540gaccttcaag aattgggaaa atatgagcaa tatattaaat ggccttggta tgtttggctc3600ggcttcattg ctggactaat tgccatcgtc atggttacaa tcttgctttg ttgcatgact3660agttgttgca gttgcctcaa gggtgcatgc tcttgtggtt cttgctgcaa gtttgatgag3720gatgactctg agccagttct caagggtgtc aaattacatt acacataa 3768
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種診斷非典型肺炎試劑盒的制備方法，其步驟是提供一種早期診斷非典型性肺炎的診斷試劑盒，為早期診斷患有由SARS冠狀病毒所引起的非典型性肺炎傳染病的病人提供了一種快速，準(zhǔn)確的診斷試劑盒。該診斷試劑盒由包被有抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體的96孔板和標(biāo)記有顯色的酶，如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶的抗編碼SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因或其片段的蛋白的抗體溶液。以及顯色液所組成。該診斷試劑盒可檢測(cè)全血中引起非典型性肺炎傳染病的SARS冠狀病毒顆粒及其抗原。
文檔編號(hào)G01N33/563GK1482461SQ0312825
公開(kāi)日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2003年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月1日
發(fā)明者葉凱, 丁虹, 葉 凱 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)