專利名稱：生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物傳感器，更具體地，涉及一種包含微孔膜載體，第一電極系統(tǒng)，第二電極系統(tǒng)，和一對絕緣膜的生物傳感器，其中第一電極系統(tǒng)在微孔膜載體的表面形成并且第二電極系統(tǒng)在微孔膜載體的反面形成。
發(fā)明技術(shù)生物傳感器是指一種設(shè)備，探針，或電極，其當與適當?shù)臉悠方佑|時，在存在目的分析物的條件下產(chǎn)生電信號。通常通過固定與合適的轉(zhuǎn)換系統(tǒng)緊密接觸的生物敏感物質(zhì)以將分析物的濃度轉(zhuǎn)化成可定量的信號來構(gòu)建生物傳感器。
盡管幾個優(yōu)點，當前可用的生物傳感器全部有很多有待解決的問題化學干擾，環(huán)境影響，長期穩(wěn)定性，信噪比和傳感器包裝系統(tǒng)的設(shè)計。
在生物傳感器的發(fā)展中可看出下列趨勢a)小型化b)用組合多于一種敏感元件的陣列傳感器系統(tǒng)測定幾種試劑c)開發(fā)可大規(guī)模生產(chǎn)的任意使用的(disposable)傳感器d)使用可植入生物芯片體內(nèi)分析e)處理來自具有人工智能系統(tǒng)的陣列傳感器系統(tǒng)的輸出同時，一個長期目標是開發(fā)一種迅速，簡單，免分離的檢測蛋白的方法。已經(jīng)使用顯色和發(fā)熒光的半乳糖苷-葡聚糖底物來設(shè)計針對C-活性蛋白(C-reactive protein)，鐵蛋白和免疫球蛋白的均相酶免疫測定(EIAs)(Gibbons等，“Homogeneous Enzyme Immunoassay for Proteins Employingβ-Galactosidase，”Analytical Biochemistry 102/167-170，1980；和Armenta等，“Improved Sensitivity in Homogeneous Enzyme Immunoassays Using aFluorogenic Macromolecular SubstrateAn Assay for Serum Ferritin，”Analytical Biochemistry 146/211-219，1985)。然而，在該均相方案中酶活性的低程度調(diào)節(jié)已使該方法對于現(xiàn)實應(yīng)用而言不切實際。
此外，已報道一種針對大分子的免分離的雙固相EIA，其依賴于一種酶偶聯(lián)物(生物素-葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-抗體)在結(jié)合了聚苯乙烯膠乳的抗生物素蛋白和結(jié)合了聚苯乙烯膠乳的分析物的兩種固體相之間的分配(Schray等，“Separation-Free Dual Solid Phase Enzyme Immunoassay forMacromolecules，”Analytical Chemistry，60/353-56，1988)。然而，該測定方案需要24小時來酶促產(chǎn)生可檢測的產(chǎn)物。
早就認識到將電化學檢測與EIAs結(jié)合將是有利的。電極對檢測樣品的顏色或濁度不敏感，因此可用來開發(fā)可直接應(yīng)用于全血樣的方法。然而，許多關(guān)于使用電化學檢測來設(shè)計EIAs或“免疫傳感器”的報道的大多數(shù)已依賴于使用這樣的傳感器如多相測定設(shè)備中的固相，其中將抗體固定在給定電極的表面。在樣品與其它試劑溫育后，在加入測量束縛酶(bound enzyme)活性所需的底物之前必須洗滌電極表面。
作為一個具體實例，在1991年11月5日頒發(fā)的美國專利No.5,063,081中，Cozzette等公開了一種用于檢測特定分析物種類如抗原的基于配體/配體受體的生物傳感器。這里，一種基底傳感器(base sensor)，其包含一種使用貴后過渡金屬(noble late transition metal)如銥，金，鉑或銀的催化指示電極，并被一種由例如銀和氯化銀制成的組合參比和對電極(柱25-26)包圍。一種抗體固定在基底傳感器上。然后將得到的生物傳感器與含有樣品和標記的第二種分析物特異性抗體的混合物接觸(柱45-46)。還可將選擇透性硅烷層用作針對干擾物的篩子。然而，優(yōu)選通過使用洗滌溶液或通過使用含有酶底物作為洗滌物的溶液從傳感器去除未結(jié)合物質(zhì)和干擾電活化粒種(柱47-49)。
作為另一個具體實例，在1998年11月3日頒發(fā)的美國專利No.5,830,680中，Meyerhoff等公開了一種適合在任何本底信號上檢測分析信號的酶夾層免疫測定盒，所述本底信號是源自與所述盒接觸的本體溶液(bulksolution)。這里，所述盒包含一種微孔膜載體，其一側(cè)已經(jīng)用一種導電金屬層涂布，和至少一個第一捕捉抗體層，其被固定在微孔膜載體的至少一個第一空間獨特區(qū)域中的導電金屬層上。參考

圖1，其是擴散電池設(shè)備的圖解，可以看到該盒需要另外的輔助電極和/或參比電極，因此未實現(xiàn)小型化和現(xiàn)場檢測(point-of-care testing)。
因此，盡管該領(lǐng)域中所有過去和當前的研究活動，長期以來期望一種可以避免上述缺點的新型生物傳感器。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供一種生物傳感器，其包含微孔膜載體，其上固定生物活性物質(zhì)的第一電極系統(tǒng)，第二電極系統(tǒng)和一對絕緣膠片，其中第一電極系統(tǒng)在微孔膜載體的表面形成并且第二電極系統(tǒng)在微孔膜載體的反面形成。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種生物傳感器，其包含微孔膜載體，其上固定生物活性物質(zhì)的第一電極系統(tǒng)，第二電極系統(tǒng)和一對絕緣膜，一個墊板和一對帶孔的蓋子，其中第一電極系統(tǒng)在微孔膜載體的表面形成并且第二電極系統(tǒng)在微孔膜載體的反面形成，并且將一種酶-分析物偶聯(lián)物或一種酶-抗體偶聯(lián)體固定在墊板上。
附圖簡述參考附圖可最好的理解本發(fā)明最優(yōu)實施方案的應(yīng)用，附圖中相同的參考號用于相同和對應(yīng)的部分，其中圖1是現(xiàn)有技術(shù)擴散電池設(shè)備的示意圖，其中在微孔膜載體上只形成一個電極系統(tǒng)；a分析物溶液b底物溶液圖2a為依照本發(fā)明實施方案1在整個條帶上形成的基于對稱微孔電極的生物傳感器的分解透視圖；圖2b是本發(fā)明實施方案1的生物傳感器的透視圖；圖2c是基于對稱微孔電極的生物傳感器的分解透視圖，其中依照本發(fā)明實施方案1使用分別在兩個絕緣基片上形成的電連接器改裝生物傳感器；
圖2d是2c生物傳感器的透視圖，其中依照本發(fā)明實施方案1改裝生物傳感器；圖2e是基于不對稱微孔電極的生物傳感器的分解透視圖，其中依照本發(fā)明實施方案1使用分別在兩個絕緣基片上形成的電連接器改裝生物傳感器；圖2f是2e生物傳感器的透視圖，其中依照本發(fā)明實施方案1改裝生物傳感器；圖3是依照本發(fā)明實施方案1說明生物傳感器應(yīng)用實例的圖解；圖4a是依照本發(fā)明實施方案2的生物傳感器的分解透視圖；圖4b是依照本發(fā)明實施方案2的生物傳感器的透視圖；圖5是說明依照本發(fā)明實施方案2將生物傳感器應(yīng)用于樣品溶液的實例的圖解；圖6a和圖6b是依照本發(fā)明實施方案2裝備了改良進樣毛細管的生物傳感器的截面圖；圖7a是依照本發(fā)明實施方案3的生物傳感器的分解透視圖；(關(guān)于圖7b-7e我推薦使用單獨的圖號)圖7b-7e顯示依照本發(fā)明實施方案3生物傳感器的各種改裝；圖8顯示提及的免分離免疫測定步驟的原理和順序的圖解；圖9是本發(fā)明擴散電池設(shè)備的示意圖；圖10是生物傳感器的環(huán)狀伏安圖，該生物傳感器是實施例1中基于不對稱微孔電極的生物傳感器，其中將鐵氰化鉀用作電極的氧化還原劑；圖11是實施例1生物傳感器的典型校正曲線，其中將葡糖氧化酶物理固定在用于葡萄糖分析的工作電極上；圖12是實施例2生物傳感器的動態(tài)響應(yīng)曲線，其中將葡糖氧化酶和鐵氰化鉀物理固定在工作電極上；圖13是實施例3生物傳感器的校正曲線，其中將葡糖氧化酶-生物素偶聯(lián)物用作酶-分析物偶聯(lián)物并且將抗生物素蛋白用作抗體；圖14是實施例3生物傳感器的動態(tài)響應(yīng)曲線和圖15是實施例4 CRP生物傳感器的校正曲線；使用固定在前面微孔電極的CRP抗體，在上墊板中干燥的堿性磷酸酶-CRP偶聯(lián)物和通過底板浸泡的對-氨基苯磷酸鹽來獲取信號。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種生物傳感器，其包含微孔膜載體，第一電極系統(tǒng)，第二電極系統(tǒng)和一對絕緣膜(或一對帶有電連接器的絕緣基片)，其中第一電極系統(tǒng)在微孔膜載體的表面形成并且第二電極系統(tǒng)在微孔膜載體的反面形成。依照本發(fā)明的生物傳感器不需要任何附加電極。
參考圖2a和2b，依照本發(fā)明的生物傳感器使用的電化學電池(100)包含一個微孔膜載體(101)，第一電極系統(tǒng)(102)，第二電極系統(tǒng)(103)。第一電極系統(tǒng)(102)由其上固定生物活性物質(zhì)的工作電極(104)，第一電極連接器(105)和第一引線出口(106)組成。第二電極系統(tǒng)由一個對電極(107)，第二電極連接器(108)和第二引線出口組成(109)。第一電極系統(tǒng)和第二電極系統(tǒng)(102，103)通過電極連接器(105，108)經(jīng)由例如鱷魚夾或焊劑的連接被電連接。
參考圖2b至2f，其中改裝2a的生物傳感器，按照本發(fā)明的生物傳感器中使用的電化學電池(100)包含微孔膜載體(101)，第一電極系統(tǒng)(102)，和第二對稱(2b)或不對稱(2c)電極系統(tǒng)(103)。第一電極系統(tǒng)(102)由其上固定生物活性物質(zhì)的工作電極(104)，在頂部絕緣膜的下側(cè)形成的第一電極連接器(105)和第一引線出口(106)組成。第二電極系統(tǒng)由一個對電極(107)，底部絕緣膜的上表面形成的第二電極連接器(108)和第二引線出口(109)組成。將第一、第二引線出口(106和109)緊壓與第一、第二電極連接器(105和108)連接，并且還將在頂部絕緣膜下側(cè)形成的分段的第一連接器(105’)和在底部絕緣膜的表面形成的105緊壓連接以在底部基片上以面朝上的方向安裝兩個連接器(105’和105)。通過將它們插入插座中連接電極連接器(105，108)電連接第一和第二電極系統(tǒng)(102，103)。
通常通過化學氣相淀積或物理蒸氣淀積噴鍍導電材料或通過絲漏印刷導電材料形成第一和第二電極系統(tǒng)(102，103)。能夠用來形成第一和第二電極系統(tǒng)(102，103)的導電材料的實例包括但不限于導電聚合物，碳，和導電金屬如金，鉑，銀，銠，銥，釕，鈀，鋨或銅。導電材料通常形成厚度為大約150至大約1000的層。更優(yōu)選地，導電層厚200-800，最優(yōu)選導電層厚300-600。
可用來形成微孔膜載體(101)的材料應(yīng)與經(jīng)常用于將生物活性物質(zhì)如酶，電子傳遞介質(zhì)和抗體固定在電極系統(tǒng)上的有機溶劑相容，并且應(yīng)顯示足夠高的拉伸強度以抵抗在操作過程中多孔結(jié)構(gòu)的撕裂和/或其它扭變。可用來形成微孔膜載體(101)的材料的實例包括有機聚合物(例如尼龍，硝化纖維，聚偏二氟乙烯，聚砜，聚酯或聚碳酸酯)和無機材料如多孔陶瓷或吸附陶瓷。優(yōu)選微孔尼龍網(wǎng)，因為它是天然親水的而且可以以基本上不含濕潤劑的形式商購。
即使在用導電層涂布膜之后，它也仍可以是微孔性的，具有約0.01微米至約10微米的通常范圍內(nèi)的孔徑。甚至理論上更大的孔徑也是可能的，其只被用于部分封閉(occlude)孔的附加導電材料的費用所限制。優(yōu)選的平均孔徑為約0.2μm至約0.45μm。該孔徑允許具有不超過5000Da分子量的分析物以及底物通過孔。
電化學電池(100)的表面，除了工作電極(104)，第一電極連接器(105)，對電極(107)和第二電極連接器(108)的區(qū)域以外，都用絕緣膜(110，111)覆蓋?？梢杂脕硇纬山^緣膜(110，111)的材料包括但不限于聚氯乙烯(PVC)或它的共聚物如聚氯乙烯-二(2-乙基己基)癸二酸酯，聚乙烯，聚氨基甲酸酯，聚碳酸酯，聚酯等。還可通過將絕緣聚合物糊絲漏印刷在尼龍膜上，接著熱處理來形成絕緣膜(110，111)。絕緣膜(110，111)應(yīng)該僅限制底物通過微孔膜區(qū)域的擴散并且應(yīng)該最小化生物傳感器的扭變。如果微孔電極和尼龍膜的尺寸與圖2c-2f中所示相同，可以將電連接分別印刷在絕緣膜上，并且可以緊壓以連接電極和組裝生物傳感器系統(tǒng)。
該形式的生物傳感器(2c-2f)在大規(guī)模制造方面有優(yōu)勢；可以分別制備印在絕緣蓋上沉積金的微孔電極和連接電極并且在將生物材料固定在工作電極上后一步組裝為一個整體。如果采用等離子沉積的方法，非對稱的雙面電極(2e和2f)可能比對稱的雙面電極(2c和2d)更容易制備；非對稱雙面電極，需要在絲漏印刷的對電極反面電極沉積一次即可，而對稱的雙面電極需要在破壞真空后電極沉積兩次。
按照本發(fā)明的生物傳感器可以迅速，簡單，免分離的電化學免疫測定和選擇性檢測分析物。另外，該生物傳感器不需要任何附加電極因此可以實現(xiàn)小型化，現(xiàn)場檢測和任意使用。
如圖3所示，按照本發(fā)明的生物傳感器可直接應(yīng)用于人體來檢測各種樣品，包括生物材料。待測的生物材料包括代謝物，例如葡萄糖，膽固醇，乳酸，肌酸酐，蛋白質(zhì)，過氧化氫，醇，氨基酸，谷氨酸丙酮酸酯和谷氨酸草酰乙酯。例如，使用膽固醇氧化酶，乳酸氧化酶，谷氨酸氧化酶，辣根過氧化物酶或醇氧化酶可分別定量分析膽固醇，乳酸，谷氨酸，過氧化氫和乙醇。為工作電極提供的電子傳送介質(zhì)可使用二茂鐵或它的衍生物，醌或它的衍生物，有機導電鹽類或viologen。電子傳送介質(zhì)可固定在與酶結(jié)合的工作電極上，并且優(yōu)選是一種能形成氧化還原對的混合價化合物。優(yōu)選的化合物包括六胺基氯化釕(III)，鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀，二甲基二茂鐵，二茂鐵，一元羧酸二茂鐵，7，7，8，8-四氰基對醌二甲烷，四硫富瓦烯，二茂鎳，N-methylacidinium，四硫并四苯(tetrathiatetracene)，N-甲基吩嗪鎓(N-methylphenazinium)，氫醌，3-二甲氨基安息香酸，3-methyl-2-benzothiozolinone hydrazone，2-甲氧基-4-烯丙基苯酚，4-氨基安替比林(4-aminoantipyrin)，二甲替苯胺，4-氨基安替比林(4-aminoantipyrene)，4-甲氧基萘酚，3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺，2，2-連氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸鹽(酯)](2，2-azino-d-[3-ethylbenzthiazolinesulfonate]，鄰聯(lián)(二)茴香胺，鄰甲苯胺，2，4-二氯苯酚，4-氨基非那宗，聯(lián)苯胺和普魯士藍。
按照本發(fā)明的生物傳感器的另一個優(yōu)選實施方案如圖4a和4b所示，其中生物傳感器包含一個微孔膜載體(101)；第一電極系統(tǒng)(102)，其由一個其上固定生物活性物質(zhì)的工作電極(104)組成，第一電極連接器(105)和第一引線出口組成(106)；第二電極系統(tǒng)(103)，其由一個對電極(107)組成，第二電極連接器(108)和第二引線出口組成(109)；一對絕緣膜(110，111)；一個吸收墊板(112)；和一個多孔材料(113)制成的薄膜，通過毛細管作用分析物透過其導入。
參照圖4a，4b，和5，更詳細地描述生物傳感器的工作原理。透過與微孔電極后的吸收墊板(112)結(jié)合的薄多孔材料(113)，通過毛細管作用導入含有分析物的樣品溶液(2)。在該過程中，通過尺寸和電荷排阻，極性磷脂和混合控制，可以消除干擾如人血中含有的固體粒子(血細胞比容)使得只有血漿接觸到固定在工作電極(104)上的生物活性物質(zhì)。在生物活性物質(zhì)的催化作用下，分析物是產(chǎn)生容易氧化或還原種類的電化學活性種類。該氧化還原種類在電極傳遞或接受電子而產(chǎn)生與分析物濃度成比例的電信號，因此可以實現(xiàn)定量測量。另外，在由微孔膜載體(101)，吸收墊板(112)和薄多孔材料(113)作用產(chǎn)生的化學勢的調(diào)節(jié)下，可將樣品溶液的流量調(diào)整在合適的范圍。
同時，導入生物傳感器內(nèi)部的樣品溶液以及通過酶反應(yīng)產(chǎn)生的種類被吸收到吸收墊板(112)中，這樣可以保證大約30分鐘至大約20小時的連續(xù)測量。該類型的生物傳感器可稱為自動進樣和流動生物傳感器。維持樣品的連續(xù)流動不需要機械組件如蠕動泵和復(fù)雜的流體通道。此外，由于可以連續(xù)測量，如圖3所示，該生物傳感器除了血液外還可以適用于體液。
圖6a和6b顯示本發(fā)明另外的實施方案。在圖6a中，生物傳感器另外包括第一和第二微孔膜載體(101a，101b)和粘合層(130)；在圖6b中，生物傳感器另外包括第二微孔膜載體(101b)，粘附層(130)和塑料基片(140)。
按照本發(fā)明的生物傳感器還可用作通過EIA檢測分析物蛋白質(zhì)的免分離固相免疫傳感器。
圖7a顯示了按照本發(fā)明生物傳感器的一個優(yōu)選實施方案。參照圖7a，用于EIA的生物傳感器包含一個微孔膜載體(101)；第一電極系統(tǒng)(102)，其由一個其上固定生物活性物質(zhì)(抗體)的工作電極組成，第一電極連接器(105)和第一引線出口(106)組成；第二電極系統(tǒng)(103)，其由一個對電極(107)組成，第二電極連接器(108)和第二引線出口(109)組成；一對絕緣膜(110，111)；一個其上吸收和干燥酶-分析物偶聯(lián)物的墊板(114a)；和一對分別帶孔(117，118)的蓋子(115，116)。
參照圖7a和圖8，更充分描述提及的免分離免疫測定步驟的原理和順序。通過頂蓋(115)上形成的孔(117)將含有分析物的樣品溶液(例如血液)導入生物傳感器。導入的溶液與吸收了預(yù)定量的酶-分析物偶聯(lián)物的墊板(114a)(例如硝化纖維膜，紙和玻璃纖維)接觸。然后，分析物蛋白質(zhì)和溶解在溶液中的酶-分析物偶聯(lián)物形成與固定在工作電極(104)上的生物活性物質(zhì)(抗體)的競爭性結(jié)合。在已經(jīng)形成充分結(jié)合后，通過在底蓋(116)上形成的孔(118)導入對綴合酶特異的底物。該底物穿過孔，與結(jié)合的酶-分析物偶聯(lián)物接觸，并引發(fā)酶反應(yīng)。通過該反應(yīng)，將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，并且傳遞到電極的電子產(chǎn)生電信號。該電信號傳至電極系統(tǒng)(102)表面并通過適當?shù)脑O(shè)備檢測。通過底物與未結(jié)合的酶-分析物偶聯(lián)物的反應(yīng)也可產(chǎn)生電信號。然而，未結(jié)合的酶-分析物偶聯(lián)物離電極表面足夠遠結(jié)果酶-底物反應(yīng)產(chǎn)生的電子不能到達電極。由此，可以省略洗滌步驟和分離步驟。
電信號與捕獲的酶-分析物偶聯(lián)體的量成比例，因此從校正曲線評估可以定量分析物蛋白質(zhì)的量。此外，由于對電極系統(tǒng)(103)是在微孔膜載體(101)的反面形成，不需要另外的電極系統(tǒng)。因此可以實現(xiàn)一種小型化，免分離的固相免疫傳感器。
圖7b，7c，7d，和7e各自顯示其它使用改進的按照本發(fā)明生物傳感器的優(yōu)選實施方案。如圖7b和7d所示，可以加入吸附有底物的墊板(114b)，其使得分析物蛋白質(zhì)的檢測更簡單。如圖7c和7d所示，可以加入過濾墊(114c)，這樣通過例如尺寸排阻，電荷排阻，極性磷脂和混合控制，可以預(yù)先消除干擾如人血中含有的固體粒子(血細胞比容)。此外，過濾墊(114c)上可吸收蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑和/或緩沖溶液以實現(xiàn)改善的分析物蛋白質(zhì)檢測。如圖7e所示，通過其加入樣品溶液的孔和經(jīng)由毛細管與底物槽(reservoir)連接、通過其加入底物溶液的孔可以在相同一側(cè)形成，這樣可以實現(xiàn)更簡單的樣品和底物溶液供應(yīng)。通過在底部基片(116)上沖孔或模壓圖案可以形成連接毛細管(119)與底物槽(118’)的孔(118)。如果將底部基片(116)模壓以形成連接毛細管(119)與槽(118’)的孔(118)，第二底板是不必要的。
如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，可以將酶-抗體偶聯(lián)物而不是酶-分析物偶聯(lián)物吸收于墊板中(114a)。此外，選擇合適的酶-底物對也是眾所周知的。例如，尿酸酶-尿酸對，肌氨酸氧化酶-肌氨酸對，膽固醇氧化酶-膽固醇對，3-磷酸甘油氧化酶-3-磷酸甘油對，丙酮酸氧化酶-丙酮酸對，硫辛酰胺脫氫酶-NADH對，過氧化氫酶-H2O2對，L-谷氨酸氧化酶-L-谷氨酸對，膽紅素氧化酶-膽紅素對，堿性磷酸化酶-對-氨基苯酚磷酸鹽對，和葡糖氧化酶-葡萄糖對都是合適的酶-底物對(見美國專利No.5,830,680)。
也可以非干燥的形式使用依照本發(fā)明的生物傳感器。
如圖9所示，非干燥的生物傳感器包含一個微孔膜載體(101)；其上固定抗體的第一電極系統(tǒng)(102)；第二電極系統(tǒng)(103)；和一對絕緣膜，其中第一電極系統(tǒng)(102)在微孔膜載體(101)的表面形成而第二電極系統(tǒng)(103)在微孔膜載體(101)的反面形成。將分析物和酶-偶聯(lián)物(酶-分析物偶聯(lián)物或酶-抗體偶聯(lián)物)放在第一個隔室(200)中，將酶的底物放在第二個隔室(300)中。
如圖9所示，因為第一電極系統(tǒng)(102)和第二電極系統(tǒng)(103)一起在微孔膜載體(101)的兩個表面形成，不需要另外的電極。
本發(fā)明的生物傳感器可以適用于任何能夠?qū)е驴贵w產(chǎn)生的分析物，例如，C-活性蛋白，hCG，PSA，肌氨酸磷酸激酶(同工酶MB，BB和MM)，肌鈣蛋白，肌紅蛋白，肌球蛋白輕鏈，血纖蛋白原，促甲狀腺激素，F(xiàn)SH，肝炎抗原，糖基化蛋白(glycated proteins)(如Hb A1c和果糖胺)和與各種各樣的特異性病毒如馬鈴薯病毒相關(guān)的各種蛋白質(zhì)。
所用的底物取決于使用的酶。技術(shù)人員將容易實現(xiàn)酶-底物對的合適選擇。例如，當將葡糖氧化酶用作酶時，優(yōu)選底物為葡萄糖。通過葡糖氧化酶的催化作用葡萄糖氧化為葡萄糖酸并產(chǎn)生H2O2。H2O2在大約+700mV的電壓下(相對于Ag/AgCl)產(chǎn)生電信號。
另一方面，當使用堿性磷酸化酶時，優(yōu)選對-氨基苯磷酸鹽。對-氨基苯基磷酸鹽通過堿性磷酸酶的作用產(chǎn)生電活性物質(zhì)對-氨基苯酚，其進一步被氧化而在+190mV的外加電壓下(相對于Ag/AgCl)產(chǎn)生最優(yōu)電信號。
同時，辣根過氧化物酶利用H2O2作為底物，其中用作電子傳移介質(zhì)的Fe(II)氧化為Fe(III)。通過施加-100mV的還原電壓可以檢測由Fe(III)還原所產(chǎn)生的電流。
物理吸附或化學成鍵可以實現(xiàn)將生物活性物質(zhì)固定在工作電極上，如酶，電極傳遞介質(zhì)或抗體。物理吸附是通過將生物活性物質(zhì)溶液滴在工作電極上，然后培養(yǎng)而實現(xiàn)的。該方法利用生物活性物質(zhì)和電極形成材料之間的親和力?；瘜W成鍵利用在工作電極表面形成的活化自組裝單層。通過各種方法使用活性化合物如烷基硫醇，胺和羧酸實現(xiàn)工作電極表面的修飾。形成生物活性物質(zhì)與自組裝單層的共價結(jié)合(Meyerhoff等，Mikrochim.Acta.117/195-206，1995)。
按照下列實施例可以獲得本發(fā)明的更好理解，所述實施例是提出來說明本發(fā)明而不可解釋為來限制本發(fā)明。
試劑使用材料和試劑的來源如下葡糖氧化酶(GOx；EC 1.1.3.4，VII-S類型，245-900單位/g，來源于Aspergillus Niger；2-[N-嗎啉代]乙磺酸(MES)，1-乙基-3，3-二甲氨基丙基碳二亞胺(EDAC)，N-羥磺基琥珀酰亞胺(NHS)，鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)，β-D(+)-葡萄糖，2-巰基乙胺和DL-6，8-硫辛酰胺，來源于Sigma(St.Louis，Missouri，美國)；1，2-二硫戊環(huán)-3-戊酸，3-巰基丙酸，11-巰基十一酸，16-巰基十六酸(MHDA/C16)，和乙酸二茂鐵(Fc-COOH)，來源于Aldrich(Milwaukee，Wisconsin，美國)；磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉，來源于Kanto Chemical(東京，日本)；Nytran中性微孔尼龍膜(孔徑0.2μm)，來源于Schleicher和Schuell ofKeene，New Hampshire；硝化纖維素(NC)膜來源于Whatman International(Maidstone，英國)。所有其它使用的化學藥品為分析級。
在磷酸緩沖鹽水(PBS，140mM NaCl)中制備樣品和標準溶液。所有水溶液用去離子水制備(18MΩcm)。堿性磷酸酶(AKP)，對-硝基苯磷酸鹽，抗生物素蛋白(來自于雞蛋白)，生物素(維生素H)和明膠以及牛血清清蛋白(BSA)購自St.Louis，Missouri Sigma。對氨基苯磷酸鹽是由對-硝基苯磷酸鹽合成。制備緩沖液所用的去離子水是YamatoMillipore WQ 500(電阻18MΩ)。
實施例11-1)對稱雙面微孔金電極的制作將微孔尼龍膜(15×30mm2)置于直徑為6mm的合適的面罩和13mm寬的輸出條(outlet strip)(用于電連接目的)下面。采用物理蒸氣淀積技術(shù)將膜兩面都鍍上金；噴鍍時間300s，壓力75m托，等離子體電流25-30mA，電壓350-500V。這樣在膜的中心形成圓盤狀的金電極，外徑為4mm，厚度大約為300。在中心圓盤電極周圍，包括在狹窄的金引線出口上澆鑄溶解在四氫呋喃(THF)中(1∶6w/v)的PVC層(33％PVC和67％二(2-乙基己基)癸二酸酯(均為w/w％))。這留下6mm的中心未觸動的圓盤狀金電極。電極形狀如圖2a所示。在另一個實施方案中，在無面罩的尼龍膜(6×6cm2)的兩面都鍍上金，并剪成如圖2a中所示的形狀。然后，將鍍金的電極片放置在兩個帶有絲網(wǎng)印刷的電極連接器的絕緣膜之間，并壓緊以組裝為對稱的雙面微孔電極。
1-2)非對稱雙面微孔金電極的制作使用碳糊(或任何導電糊如銀/氯化銀)將對電極絲網(wǎng)印刷在尼龍膜的一面，所述對電極是模仿工作電極的輪廓線而內(nèi)部中空。在膜的反面，用實施例1-1中描述的物理沉積方法形成金電極。將電極剪成圖2e中所示的形狀，并擠壓于兩個帶有絲網(wǎng)印刷的電極連接器的絕緣膜之間。使用環(huán)狀伏安圖(掃描速率60mV/min)在含F(xiàn)e(III)/Fe(II)的緩沖液中檢驗非對稱雙面微孔電極的電化學特性；如圖10所示，電極提供可逆響應(yīng)而在沉積金和絲網(wǎng)印刷的碳之間并未出現(xiàn)短路。
1-3)生物活性物質(zhì)的固定用MES緩沖液漂洗電極并立刻置于攪拌的10μl含有10mg/ml GOx和140mM NaCl，pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中一小時，使得Gox物理吸附于金電極表面，其后用磷酸鹽緩沖液漂洗它們。
1-4)葡萄糖傳感器的制造圖4a和4b中所示的自動進樣和流動的葡萄糖傳感器是通過把微孔金帶狀(strip)電極夾入多孔的硝化纖維(NC)帶和作為吸收墊板的玻璃纖維中間制成的。
1-5)葡萄糖傳感器的分析性能為了檢測葡萄糖傳感器的分析性能，使用標準葡萄糖溶液，通過一種測量電流技術(shù)測量對葡萄糖的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)。圖11顯示在0.8V電壓下生物傳感器的典型校正曲線，其表明葡萄糖傳感器能夠?qū)ζ咸烟琼憫?yīng)大約30分鐘。在0mg/dL至200mg/dL葡萄糖范圍內(nèi)觀測到線性響應(yīng)。斜率為2.60×10-3nA/(mg/dL)并且相關(guān)系數(shù)為0.988。從這些結(jié)果，證實使用本發(fā)明的生物傳感器可以連續(xù)自動進樣及檢測。
實施例22-1)金電極的制造以與實施例1-1中描述相同的方法獲得金電極。
2-2)生物活性物質(zhì)的固定用MES緩沖液漂洗電極并立刻置于攪拌的10μl含有10mg/ml Gox，200mM鐵氰化鉀和140mM NaCl，pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中一小時，其后用磷酸鹽緩沖液漂洗它們。
2-3)葡萄糖傳感器的制造自動進樣和流動的葡萄糖傳感器是通過把微孔金帶電極夾入多孔的NC帶和作為吸收墊板的玻璃纖維中間制成的。
2-4)葡萄糖傳感器的分析性能為了檢驗葡萄糖傳感器的分析性能，通過測量電流技術(shù)測量對葡萄糖的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)。圖12顯示在0.38V電壓下生物傳感器的動態(tài)響應(yīng)，其表明葡萄糖傳感器能夠?qū)γ糠N葡萄糖溶液(50mg/dL，100mg/dL和200mg/dL)響應(yīng)一個小時。圖12顯示葡萄糖分析的典型動態(tài)響應(yīng)曲線。在0mg/dL至200mg/dL葡萄糖范圍內(nèi)觀測到線性響應(yīng)。斜率為85.8nA/(mg/dL)并且相關(guān)系數(shù)為0.998。這些結(jié)果顯示即使在0.38V的低電壓下也可獲得對葡萄糖更敏感的響應(yīng)。從這些結(jié)果，證實使用本發(fā)明的生物傳感器可以連續(xù)自動進樣及檢測。
實施例3制備如圖7a所說明的免分離，固相免疫傳感器。
3-1)金電極的制造以與實施例1-1中描述相同的方法獲得金電極。
3-2)生物傳感器的制造用MES緩沖液漂洗電極。將10μl含有0.05mg/ml抗生物素蛋白和0.05M碳酸鈉，pH值為9.6的磷酸鹽緩沖液滴至工作電極上。然后，將電極4℃溫育16小時。使用其上吸附50μl葡糖氧化酶-生物素偶聯(lián)物(2.5μg/ml)的玻璃纖維膜(Whatman International of Maidstone，英國)作為墊板(114a)。
3-3)校正使用從實施例3-2獲得的免疫傳感器進行校正將標準生物素溶液稀釋到10-5M至10-14M的濃度。通過頂蓋(115)上形成的孔(117)將每種標準溶液加至免疫傳感器。在+800mV的外加電壓下實現(xiàn)抗生物素蛋白與生物素或酶偶聯(lián)物之間穩(wěn)定的競爭性結(jié)合。然后，通過底蓋(116)上形成的孔(118)加入底物(葡萄糖)。可以檢測通過酶反應(yīng)產(chǎn)生的電流。圖13顯示電流變化依賴于生物素濃度的校正曲線。在10-7M(1.0μA)至10-10M(0.5μA)生物素之間發(fā)現(xiàn)有顯著的信號差異。
3-4)信號變化的測量使用從實施例3-2中獲得的免疫傳感器獲得動態(tài)響應(yīng)曲線分別將10-12M生物素緩沖液和10-4M不含生物素的緩沖液加入免疫傳感器。傳感器達到穩(wěn)定后，通過孔(118)將10μl的葡萄糖溶液加至傳感器的后部。通過測量電流技術(shù)測量免疫傳感器的動態(tài)響應(yīng)，其結(jié)果見圖14。
圖14顯示對于10-12M生物素緩沖液的電流變化為1μA，對于10-4M生物素緩沖液的電流變化為0.4μA。對于不含生物素的緩沖溶液的電流變化為大約0.05μA。從這些結(jié)果，證實為了檢測合適的抗原-抗體反應(yīng)可以改進該模式免疫傳感器。
實施例4以如圖7e所示的形式制備一種免分離的固相C-活性蛋白(CRP)免疫傳感器，并且與如在實施例3-1和3-2中描述相似的生物材料固定方法；通過物理吸附將抗-CRP(0.0125mg/mL)固定在金電極上，將堿性磷酸酶(ALP)而不是實施例3-1中的葡糖氧化酶-生物素用作與CRP連接酶(ALP-CRP；0.2mg/mL)，并且使用對-氨基苯磷酸鹽(5mg/mL)而不是實施例3-2中的葡萄糖。通過將已知量的CRP溶解于再生血清(reconstituted serum)中制備標準CRP溶液并加入到如圖7e所示生物傳感器的孔(117)中。將底物對-氨基苯酚加至孔118，其通過毛細管119擴散至槽118’，并且通過電極系統(tǒng)100(圖7e)的微孔擴散而產(chǎn)生電化學信號。在+150mV的外加電壓下通過測量電流技術(shù)測量免疫傳感器的電流響應(yīng)，其結(jié)果總結(jié)在圖15中。
如圖15所示，對于10-6mg/mL CRP/血清溶液的電流變化為0.75μA，并且對于10-4mg/mL CRP/血清溶液的電流變化為0.6μA。從這些結(jié)果，證實該免疫傳感器可以有效用于高敏感檢測CRP。
權(quán)利要求
1.一種生物傳感器，其包含一種微孔膜載體；第一電極系統(tǒng)，其由其上固定生物活性物質(zhì)的工作電極，第一電極連接器和第一引線出口組成；第二電極系統(tǒng)，其由對電極，第二電極連接器和第二引線出口組成；和一對絕緣膜，其覆蓋除了所述工作電極，第一電極連接器，對電極和第二電極連接器區(qū)域以外的所述第一和第二電極系統(tǒng)的表面，其中，所述第一電極系統(tǒng)在所述微孔膜載體的表面形成并且所述第二電極系統(tǒng)在所述微孔膜載體的反面形成。
2.如權(quán)利要求1中闡明的生物傳感器，其中所述第一和第二電極系統(tǒng)是由導電材料對稱制成。
3.如權(quán)利要求1中闡明的生物傳感器，其中所述第一和第二電極系統(tǒng)是由導電材料不對稱制成。
4.如權(quán)利要求1中闡明的生物傳感器，其中所述第一和第二引線出口和連接器分開在所述絕緣膜上安裝。
5.如權(quán)利要求2中闡明的生物傳感器，其中所述第一和第二絕緣膜包括分開形成的電連接器，并且其中將所述對稱或不對稱雙面電極插入所述絕緣膜之間并與絕緣膜的所述連接器連接。
6.如權(quán)利要求2中闡明的生物傳感器，其中所述導電材料選自金，鉑，銀，氯化銀，銠，銥，釕，鈀，鋨，碳，銅及其混合物。
7.如權(quán)利要求1中闡明的生物傳感器，所述微孔膜載體是由選自有機聚合物，無機聚合物，天然織物或合成纖維，紙和陶瓷中的一員制成。
8.如權(quán)利要求1中闡明的生物傳感器，其中所述微孔膜載體是微孔尼龍網(wǎng)。
9.如權(quán)利要求1中闡明的生物傳感器，其另外包含由多孔材料制成的薄膜和一種去除導入樣品的吸收墊板，待測樣品通過所述薄膜被導入所述生物傳感器。
10.如權(quán)利要求1中闡明的生物傳感器，其中所述生物活性物質(zhì)是一種酶。
11.如權(quán)利要求10中闡明的生物傳感器，其中所述酶選自葡糖氧化酶，葡糖脫氫酶，乳酸氧化酶，膽固醇氧化酶，谷氨酸氧化酶，辣根過氧化物酶，醇氧化酶，谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶。
12.如權(quán)利要求10中闡明的生物傳感器，其中所述生物活性物質(zhì)是酶與電子傳遞介質(zhì)的組合。
13.如權(quán)利要求12中闡明的生物傳感器，其中所述電子傳遞介質(zhì)選自六胺基氯化釕(III)，鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀，二甲基二茂鐵，二茂鐵，一元羧酸二茂鐵，7，7，8，8-四氰基對醌二甲烷，四硫富瓦烯，二茂鎳，N-methylacidinium，四硫并四苯，N-甲基吩嗪鎓，氫醌，3-二甲氨基安息香酸，3-methyl-2-benzothjozolinone hydrazone，2-甲氧基-4-烯丙基苯酚，4-氨基安替比林，二甲替苯胺，4-氨基安替比林，4-甲氧基萘酚，3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺，2，2-連氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸鹽(酯)]，鄰聯(lián)(二)茴香胺，鄰甲苯胺，2，4-二氯苯酚，4-氨基非那宗，聯(lián)苯胺和普魯士藍。
14.如權(quán)利要求1中所闡述的生物傳感器，其另外包含在所述工作電極頂部包含酶-分析物偶聯(lián)物或酶-抗體偶聯(lián)物(含有或不含有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑和緩沖鹽)的墊板；在所述對電極下空白或含有所述底物(具有或不具有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑和緩沖鹽)的墊板；和在所述墊板頂部帶孔的一對蓋子。
15.如權(quán)利要求2中所闡述的生物傳感器，其另外包含在所述工作電極頂部包含酶-分析物偶聯(lián)物或酶-抗體偶聯(lián)物(含有或不含有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑和緩沖鹽)的墊板；在所述對電極下空白或含有所述底物(含有或不含有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑和緩沖鹽)的墊板；和在所述墊板頂部帶孔的一對蓋子。
16.如權(quán)利要求2中所闡述的生物傳感器，其另外包含在所述工作電極頂部包含酶-分析物偶聯(lián)物或酶-抗體偶聯(lián)物(含有或不含有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑和緩沖鹽)的墊板；在所述對電極下空白或含有所述底物(含有或不含有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑和緩沖鹽)的墊板；和在所述含生物材料的墊板頂部帶孔的上蓋和帶有底物導入孔的下蓋和通過所述對電極下的毛細管連接的儲槽。
17.如權(quán)利要求14中闡明的生物傳感器，其中所述生物活性物質(zhì)是對所選抗原特異的抗體。
18.如權(quán)利要求14中闡明的生物傳感器，綴合酶選自任何還原酶或氧化酶。
19.如權(quán)利要求10中闡明的生物傳感器，其中將所述生物活性物質(zhì)物理或化學固定在所述工作電極上。
20.如權(quán)利要求1中闡明的生物傳感器，其另外包含第一隔室，其中放置酶-分析物偶聯(lián)物或酶-抗體偶聯(lián)物和分析物；和第二隔室，其中放置所述酶的底物；其中將所述微孔膜放置于所述第一和第二隔室間，所述膜上形成第一和第二電極。
全文摘要
一種用來測定分析物的生物傳感器，其包括微孔膜載體，第一電極系統(tǒng)，第二電極系統(tǒng)，和一對絕緣膜。第一電極系統(tǒng)在微孔膜載體的表面形成，第二電極系統(tǒng)在微孔膜載體的反面形成。該生物傳感器能夠?qū)Ψ治鑫镞M行迅速，簡單，免分離和選擇性的檢測。該生物傳感器不需要任何龐大的附加電極，因此可以實現(xiàn)小型化，現(xiàn)場檢測和任意使用。
文檔編號G01N27/416GK1531650SQ02810955
公開日2004年9月22日 申請日期2002年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月30日
發(fā)明者崔文姬, 崔剛, 俞在炫, 曹浩哲, 金玟先, 張峰花, 南學鉉, 車根植 申請人:愛-森斯株式會社