專利名稱：Ret寡核苷酸微芯片及其用于檢測遺傳性癌癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測RET基因突變熱點(diǎn)區(qū)中突變的RET寡核苷酸微芯片，其生產(chǎn)方法及其用于檢測遺傳性癌癥的方法。
為了檢驗高風(fēng)險家族成員的種系突變，研制出一種寡核苷酸微芯片(下文稱為“寡芯片(寡芯片)”)。它被用于檢驗高風(fēng)險家族成員中是否存在種系突變，早期檢測遺傳性癌癥，并為種系突變成員提供一種正規(guī)的醫(yī)學(xué)治療方法。該檢驗的結(jié)果還緩解了無種系突變家族成員對癌癥的恐懼心理。
通常，該技術(shù)涉及實(shí)驗寡核苷酸與固定在固體基質(zhì)，即玻璃片或凝膠表面的寡核苷酸雜交。該寡核苷酸涂布的固體基質(zhì)可以用以下兩種方法制備直接在固體基質(zhì)表面合成寡核苷酸，或者在固體基質(zhì)表面固定預(yù)先合成的寡核苷酸。前者應(yīng)用一種光刻寡核苷酸合成技術(shù)承載光保護(hù)羥基的表面通過光刻掩蔽照射，在光脫保護(hù)區(qū)產(chǎn)生游離羥基，然后，該羥基與脫氧核糖核苷氨基亞磷酸酯偶聯(lián)(Pease，A.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915022～5026，1994)。
在后面的方法中，將攜帶均聚物尾巴的寡核苷酸和末端脫氧核糖核苷酰轉(zhuǎn)移酶點(diǎn)到尼龍膜上，通過UV照射共價結(jié)合(Saiki，R.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866230～6234，1989)。還報道了一種改進(jìn)方法，其在膜的羧基和結(jié)合到寡核苷酸5′端的氨基接頭之間形成酰胺鍵，以避免當(dāng)應(yīng)用加熱或紫外照射時導(dǎo)致的非特異性固定(Zhang，Y.等，Nucleic Acids Res.193929～3933，1991)。
放射性標(biāo)記或無標(biāo)記的目的DNA與上述制備的DNA芯片的雜交方法已經(jīng)成功用于檢測RAS點(diǎn)突變、囊性纖維化刪除和各種點(diǎn)突變，以及DNA測序(Cantor，C.R.等，Genomics 131378～383，1992)。它還曾被用于檢測基因突變和研究基因多態(tài)型(Lipshutz，R.J.等，Biotechniques19442～447，1995)。而且，該技術(shù)期望對有效確定腫瘤形成和HLA基因型以及診斷遺傳性疾病提供一種有力的工具(Saiki，R.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866230～6234，1989)。
然而，用于檢測基因突變的寡芯片不容易生產(chǎn)，因此，僅有很少一部分寡芯片商業(yè)化，例如Affymetrix(Santa Clara，CA 95051)，并且它們的應(yīng)用僅限于檢測很少幾個基因的突變，例如p53、ATM和BRCA1。Affymetrix銷售的寡芯片應(yīng)用光刻法直接將寡核苷酸合成到固體基質(zhì)表面生產(chǎn)。然而，該寡芯片存在一些問題，例如其生產(chǎn)成本較高；需要應(yīng)用昂貴的設(shè)備；不可能在固體基質(zhì)表面固定純化的高質(zhì)量寡核苷酸；固體基質(zhì)表面產(chǎn)生的雜交產(chǎn)物的量不足以定量分析。
另一方面，2型多發(fā)性內(nèi)分泌瘤(MEN2)綜合癥以常染色體顯性方式遺傳，并具有高度滲透性。它還有三種亞型，即MEN2A、MEN2B和FMTC(家族性甲狀腺髓樣癌)，RET基因的突變在MEN2綜合癥中發(fā)揮重要作用在95％以上的MEN2病例中，觀察到RET基因的9個密碼子(密碼子609、611、618、620、630、634、768、804和918)之一發(fā)生錯義突變。為了考察RET基因的這些突變熱點(diǎn)區(qū)是否存在突變，應(yīng)用了一些工具例如SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)型)、PTT(蛋白質(zhì)截斷實(shí)驗)、以及基于凝膠的測序。然而，這些工具相對費(fèi)時費(fèi)力，因此有必要研究一種改進(jìn)的方法。
因此本發(fā)明試圖研究以符合上述需要，研制了一種RET寡芯片，它通過用自動微點(diǎn)陣儀將寡核苷酸固定到固體基質(zhì)表面生產(chǎn)，該寡核苷酸被設(shè)計用于檢測RET基因的突變熱點(diǎn)區(qū)的錯義突變。本發(fā)明的RET寡芯片還能夠用于研究與RET基因有關(guān)的信號傳導(dǎo)基質(zhì)和腫瘤發(fā)生。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種RET寡芯片，其可以用作檢測RET基因突變和遺傳性癌癥的快速可靠的遺傳診斷設(shè)備。
按照本發(fā)明的一方面，提供了一種用于檢測RET突變的RET寡核苷酸微芯片，其包括固定在固體基質(zhì)表面的多種寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被設(shè)計用于檢測RET基因突變熱點(diǎn)區(qū)的錯義突變。
按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種應(yīng)用所述微芯片檢測遺傳性癌癥的方法。


圖1本發(fā)明RET寡芯片的外觀；圖2本發(fā)明RET寡芯片的一個實(shí)施例，它在一個3.7cm×7.6cm的玻璃表面印刻了總共268個寡核苷酸點(diǎn)；圖3用于通過分析雜交反應(yīng)后來自各寡核苷酸點(diǎn)的信號強(qiáng)度確定極限值的Sigma曲線(SigmaPlot)，其中實(shí)線表示極限值，虛線表示背景的平均值；圖4應(yīng)用本發(fā)明的RET寡芯片檢測各密碼子中是否存在RET基因突變，a在外顯子10(密碼子609、611、618、和620)和外顯子11(密碼子630和634)上的雜交b在外顯子13(密碼子768)和外顯子14(密碼子804)上的雜交發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種用于檢測RET突變的RET寡核苷酸微芯片，它包括用自動微點(diǎn)陣儀固定到固體基質(zhì)表面的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能夠檢測RET基因突變熱點(diǎn)區(qū)上的錯義突變。
首先，寡核苷酸被設(shè)計用于檢測8個密碼子(密碼子609、611、618、630、634、768、和804)上可產(chǎn)生的錯義突變型和一個密碼子918上的錯義突變型。
如上所述，RET基因是形成REN2綜合癥的原因，REN2綜合癥以常染色體顯性方式遺傳并具有高度滲透性和多種臨床表征。主要的RET突變限于9個密碼子(密碼子609、611、618、620、630、634、768、804和918)的錯義突變。MEN2綜合癥具有3個亞型2A型多發(fā)性內(nèi)分泌瘤(MEN2A)、MEN2B、和家族性甲狀腺髓樣癌(FMTC)。已經(jīng)鑒定在MEN2A家族中外顯子10(密碼子609、611、618、和620)和外顯子11(密碼子630和634)有98％的錯義突變，在FMTC家族中有85％的錯義突變。已知密碼子768和804的錯義突變是5～10％ FMTC病例的病因。另外，外顯子16(密碼子918)的錯義突變在95％的MEN2B病例中發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明提供了各種能夠用于檢測上述RET基因突變熱點(diǎn)區(qū)錯義突變的寡核苷酸，這些錯義突變在所有檢查病例中的發(fā)生幾率超過了95％。因此，本發(fā)明的RET寡芯片以大于95％的可信度檢測突變是可能的。另外，因為本發(fā)明的RET寡芯片中使用的寡核苷酸被設(shè)計用來檢測8個密碼子上的所有可能錯義突變，因此檢測這些密碼子上尚未發(fā)現(xiàn)的任何錯義突變也是可能的。在密碼子918，發(fā)生的主要突變是Met→Thr型突變，因此，本發(fā)明使用的寡核苷酸被設(shè)計用來檢測這種類型突變。也就是說，本發(fā)明人將基因特征考慮在內(nèi)特別設(shè)計了用于檢測RET基因熱點(diǎn)區(qū)突變的寡核苷酸，本發(fā)明的RET寡芯片在檢測RET基因突變時具有更高的準(zhǔn)確性和效率。
按照本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的RET寡芯片具有67種點(diǎn)樣并固定到固體基質(zhì)表面的上的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能夠檢測RET基因9個熱點(diǎn)上的各種錯義突變。每個寡核苷酸水平點(diǎn)樣4次，以增加測量信號的準(zhǔn)確性，結(jié)果如表1、圖1和圖2所示。首先點(diǎn)1和50位，然后點(diǎn)26到50位，最后點(diǎn)51到67位。1和50位分別是外顯子10和11的陽性對照。其它寡核苷酸為2-33是外顯子10(密碼子609、611、618、和、620)；34-49是外顯子11(密碼子630和634)；51-58是外顯子13(密碼子768)；59-65是外顯子14(密碼子804)；和66-67是外顯子16(密碼子918)。
具體地說，對于密碼子609、611、618、620、630、634、和768，點(diǎn)了具有7種錯義突變的寡核苷酸(M)和一種野生型寡核苷酸(W)；對于密碼子804，點(diǎn)了具有6種錯義突變的寡核苷酸(M)和一種野生型寡核苷酸(W)；對于密碼子918，點(diǎn)了具有主要突變類型的寡核苷酸(M)和一種野生型寡核苷酸(W)。為了說明得更具體，用于密碼子609、611、618、620、630、和634的是7種如下取代得到的寡核苷酸分別用CGC(精氨酸)、AGC(絲氨酸)、GGC(甘氨酸)、TTC(苯丙氨酸)、TAC(酪氨酸)、TCC(絲氨酸)和TGG(色氨酸)取代TGC(半胱氨酸)。用于密碼子768的是7種如下取代得到的寡核苷酸分別用CAG(谷氨酰胺)、AAG(賴氨酸)、GCG(丙氨酸)、GGG(甘氨酸)、GTG(纈氨酸)、GAC(天冬氨酸)和GAT(天冬氨酸)取代GAG(谷氨酸)。對于密碼子804，使用6種突變的寡核苷酸分別用CTG(亮氨酸)、ATG(蛋氨酸)、TTG(亮氨酸)、GAG(谷氨酸)、GCG(丙氨酸)和GGG(甘氨酸)取代GTG(纈氨酸)。密碼子918的突變體是用ACC(蘇氨酸)取代ATG(蛋氨酸)得到的寡核苷酸。
為各個密碼子都設(shè)計了一種野生型寡核苷酸(W)，用于直接與突變型比較。例如，對于密碼子618，點(diǎn)了8個寡核苷酸，一個用于檢測正常堿基序列，其余的檢測突變的堿基序列?？偣矠?個熱點(diǎn)密碼子上的56種錯義突變型設(shè)計了56個突變寡核苷酸和用于野生型和陽性對照的11個寡核苷酸(參見表1a和1b)。設(shè)計的陽性對照是針對大多數(shù)突變已經(jīng)被鑒定出來的外顯子10和11的。
SEQ ID Nos.4、20、和44中分別描述的三種寡核苷酸被設(shè)計具有16個堿基的較短長度而不是20個堿基。初步實(shí)驗表明當(dāng)使用20個堿基的寡核苷酸時，常發(fā)生某些G-A錯配(4、20、和44位)，從而表現(xiàn)出非特異性信號。例如，在SEQ ID Nos.4(-GGC-)和8(-TGC-)中描述的寡核苷酸情況下，樣品DNA中的互補(bǔ)序列(-ACG)原則上僅與SEQ ID No.8的寡核苷酸雜交。然而，也可能與表現(xiàn)G-A錯配恒定結(jié)合親合力水平的SEQ ID No.4的寡核苷酸非特異性雜交。據(jù)報道，G-T和G-A錯配略微使雙鏈不穩(wěn)定，而A-A、T-T、C-T、和C-A錯配導(dǎo)致顯著不穩(wěn)定(IkutaS.等，Nucleic Acids Res.15797-811，1987)。還報道提高清洗溫度能夠清晰分辨精確匹配雙鏈與錯配雙鏈(Ikuta S.等，Nucleic Acids Res.15797-811，1987)，當(dāng)室溫為約60℃時，則不可能充分分辨特異性信號與非特異性信號。因此，為了減少本發(fā)明中由于非特異性雜交導(dǎo)致的實(shí)驗誤差，寡核苷酸的長度在三個情況下(4、20、和44位)從20個堿基減少到16個堿基，以便降低G-A錯配導(dǎo)致的不穩(wěn)定作用。這些16個堿基的寡核苷酸用精確匹配寡核苷酸分析。
可以利用包括以下步驟的方法，用自動微點(diǎn)陣儀將多達(dá)67個寡核苷酸固定到固體基質(zhì)表面生產(chǎn)本發(fā)明的RET寡芯片1)在微量點(diǎn)樣溶液中混合每一種寡核苷酸，然后分配到平板的孔中；2)用微點(diǎn)陣儀將寡核苷酸點(diǎn)到固體基質(zhì)表面；3)將寡核苷酸固定到固體基質(zhì)表面，并清洗；4)將固體基質(zhì)浸泡到95℃水中，使固定的寡核苷酸變性，然后用硼氫化鈉溶液處理固體基質(zhì)；和5)清洗并干燥固體基質(zhì)。
步驟(1)中使用的每種寡核苷酸優(yōu)選具有功能基團(tuán)，該基團(tuán)可以用于與固體基質(zhì)表面形成穩(wěn)定的結(jié)合。例如，各寡核苷酸可以連接有含5’氨基功能的12碳間隔區(qū)，例如H2N-(CH2)12-寡核苷酸。該氨基可與固體基質(zhì)表面的醛基發(fā)生Schiff堿反應(yīng)，在其間形成牢固結(jié)合。12碳間隔區(qū)通過促進(jìn)寡核苷酸和熒光標(biāo)記的目的DNA之間接觸，而增強(qiáng)雜交速率。
步驟(1)中使用的微量點(diǎn)樣溶液可以含有適當(dāng)?shù)柠}和聚合物，以便有利于將寡核苷酸點(diǎn)到固體基質(zhì)上。
步驟(2)中使用的固體基質(zhì)可以用玻璃、改良硅膠、塑料盒、或聚合物例如聚碳酸酯或其凝膠制得。固體基質(zhì)表面可以涂布化合物，其有助于寡核苷酸與基質(zhì)底物結(jié)合。可以用于涂布的優(yōu)選化合物具有例如醛基或氨基這樣的功能基團(tuán)。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明使用了一個用乙醛涂布的玻璃片。
按照步驟(1)和(2)的一個實(shí)施方式，將總共268種寡核苷酸用自動針式微點(diǎn)陣儀以指定方式排列到固體基質(zhì)上。各寡核苷酸點(diǎn)優(yōu)選為直徑100到500μm的圓形。固體基質(zhì)的優(yōu)選實(shí)施例是尺寸約為3.7cm×7.6cm的玻璃片，該玻璃片可以容納約100到10000個點(diǎn)。優(yōu)選地，可以將總共268種寡核苷酸點(diǎn)，直徑各自為130μm，以300μm的間隔排列成多列和多排(參見圖2)。
在步驟(3)中，通過在寡核苷酸的氨基和固體基質(zhì)的醛基之間經(jīng)Schiff堿反應(yīng)形成共價鍵的方式，將寡核苷酸固定到固體基質(zhì)表面。游離未反應(yīng)的寡核苷酸用SDS、SSC、SSPE等從固體基質(zhì)上清洗除去。
在步驟(4)中，將固定的寡核苷酸變性，通過硼氫化鈉處理減少和滅活保留在固體基質(zhì)上的未反應(yīng)醛基。
通過上述方法生產(chǎn)的本發(fā)明的RET寡芯片可以有利地檢測基因突變，本發(fā)明的方法比任何常規(guī)基因突變檢測方法更簡單、更經(jīng)濟(jì)用這些常規(guī)方法例如SSCP(單鏈和構(gòu)象多態(tài)型)、PTT(蛋白質(zhì)截斷實(shí)驗)、RFLP(限制性片段長度多態(tài)型)、克隆、直接測序等檢查是否存在基因突變平均須花費(fèi)幾天到數(shù)月。然而，當(dāng)使用本發(fā)明的RET寡芯片分析RET基因突變的DNA樣品僅花費(fèi)不到9小時。另外，本發(fā)明的RET寡芯片可以以比常規(guī)芯片更少的生產(chǎn)成本更簡單地生產(chǎn)。一旦合成所需的寡核苷酸后，可以大量生產(chǎn)本發(fā)明的玻璃片。使用本發(fā)明的RET寡芯片所需的試劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于任何常規(guī)方法中所需的試劑量本發(fā)明的RET寡芯片用針式微點(diǎn)陣儀可容易地生產(chǎn)，而現(xiàn)有的Affymetrix寡芯片必須用復(fù)雜和昂貴的光刻技術(shù)制備。
另外，用本發(fā)明的RET寡芯片純化和修飾寡核苷酸是可能的，相比較而言，通過在固體基質(zhì)表面直接合成寡核苷酸制備的Affymetrix寡芯片不可能純化或修飾寡核苷酸。因此，本發(fā)明的RET寡芯片能夠提供比以前可能得到的更好的實(shí)驗準(zhǔn)確度。
本發(fā)明提供了一種用RET寡芯片檢測遺傳性癌癥的方法，包括以下步驟1)從受試患者的血液制備熒光標(biāo)記的DNA樣品；2)使標(biāo)記的DNA樣品與RET寡芯片上的寡核苷酸點(diǎn)反應(yīng)；3)清洗反應(yīng)后的寡芯片，除去未結(jié)合的樣品DNA；4)用熒光讀數(shù)儀檢測特定寡核苷酸點(diǎn)的雜交模式；和
5)檢查是否存在基因突變。
在步驟(1)中，通過將熒光染料加入到從受試患者得到的血液DNA樣品中制備DNA樣品。可以應(yīng)用適當(dāng)軟件用熒光讀數(shù)儀分析熒光染料標(biāo)記的DNA與寡芯片上某寡核苷酸點(diǎn)的雜交。優(yōu)選的熒光染料包括，但不限于Cy5和Cy3。
在步驟(2)中，將步驟(1)中制備的熒光染料標(biāo)記的DNA樣品與雜交溶液混合，然后轉(zhuǎn)移到各種寡核苷酸點(diǎn)中。在45～60℃、水蒸汽飽和的保溫箱中進(jìn)行雜交反應(yīng)3-9小時。然后清洗寡芯片，除去未結(jié)合的樣品DNA，并干燥(步驟3)，應(yīng)用合適的軟件用熒光讀數(shù)儀分析產(chǎn)生的熒光(步驟4)。在步驟(5)中，在99％可靠范圍內(nèi)設(shè)置一個最大值作為極限值，認(rèn)為熒光值高于極限值的任何信號對于突變的存在是陽性的。
本發(fā)明的RET寡芯片可以有效地用于診斷諸如MEN2A、MEN2B、FMTC等的遺傳性癌癥。因為RET基因?qū)儆谑荏w酪氨酸激酶家族，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起作用，因此本發(fā)明的RET寡芯片可以用作研究癌癥細(xì)胞的有效診斷工具。
下述實(shí)施例和實(shí)驗例僅為說明的目的提供，并不是想限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1用RET寡芯片檢查RET突變(步驟1) RET寡芯片的生產(chǎn)如下生產(chǎn)67種寡核苷酸，設(shè)計用于檢測RET基因的9個突變熱點(diǎn)密碼子上的共56種錯義突變(表1a和1b)。SEQ ID Nos.1和50中描述的寡核苷酸10-PC和11-PC為陽性對照，SEQ ID Nos.9、17、25、33、41、49、58、65、和67中描述的寡核苷酸為野生型。其它寡核苷酸各自在一個熱點(diǎn)密碼子上存在SEQ ID Nos.2到8描述的寡核苷酸在密碼子609上有錯義突變；SEQ ID Nos.10到16描述的寡核苷酸在密碼子611上有錯義突變；SEQ ID Nos.18到24描述的寡核苷酸在密碼子618上有錯義突變；SEQ ID Nos.26到32描述的寡核苷酸在密碼子620上有錯義突變；SEQ ID Nos.34到40描述的寡核苷酸在密碼子630上有錯義突變；SEQ ID Nos.42到48描述的寡核苷酸在密碼子634上有錯義突變；SEQ ID Nos.51到57描述的寡核苷酸在密碼子768上有錯義突變；SEQID Nos.59到64描述的寡核苷酸在密碼子804上有錯義突變；和SEQ IDNo.66描述的寡核苷酸在密碼子918上有錯義突變。<表1a>
<表1b>
a陽性對照；b突變的；c氨基酸；d野生型所有67個寡核苷酸，各自具有一個5’-末端用可與醛基發(fā)生Schiff堿反應(yīng)的氨基殘基修飾的12碳間隔區(qū)，從MWG-Biotech(Ebrsberg，德國)得到，然后固定到玻璃片上。每種寡核苷酸各20pmole/μl，與微量點(diǎn)樣溶液(TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)混合，混合比例為1∶1，得到的寡核苷酸10pmol/μl的終體積，將每種寡核苷酸各40μl轉(zhuǎn)移到96孔平板上。當(dāng)將該96孔平板置于針式微點(diǎn)陣儀(Microsys 5100 Cartesian，Cartesian Technologies Inc，Irvine，CA)后，將各寡核苷酸印跡到醛基涂布的玻璃片上(26×76×1mm，CEL Associates Inc，Houston，TX)。每點(diǎn)直徑130μm，以300μm的間隔多列多排排列。點(diǎn)印寡核苷酸的玻璃片用0.2％ SDS清洗兩次，然后用蒸餾水清洗一次。將玻璃片浸泡到熱水(95℃)中，使寡核苷酸變性，然后放入硼氫化鈉溶液5分鐘，使未反應(yīng)的醛基失活。然后，用0.2％ SDS清洗玻璃片2次，用蒸餾水洗一次，離心，干燥。(步驟2)DNA樣品的制備從與5個MEN2A家族有關(guān)的23位個體采集學(xué)樣(表2)。23位中22位(SNU-MEN1A-I，II，III，IV)經(jīng)常規(guī)方法確認(rèn)為MEN2A患者，剩余的一位(SNU-MEN2A-V)是未知受試者。<表2>
在表2中，術(shù)語“受影響成員”指表現(xiàn)MEN2A臨床癥狀的MEN2A患者，術(shù)語“基因攜帶者”指未表現(xiàn)MEN2A臨床癥狀的突變RET基因攜帶者。
用Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia-biotech Ltd，Uppsala，Sweden)和TRI試劑(Molecular Research Center，Cincinati，OH)，按照生產(chǎn)商的說明，提取各血樣中的總基因組DNA。為了產(chǎn)生熒光標(biāo)記的DNA樣品，用提取出的DNA作為模版和SEQ ID Nos.68到77中描述的5對引物(MWG-Biotech，Ebersberg，Germany)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表3)。按照Takiguchi-Shirahama，S.等，Hum.Genet.95187-190，1995的描述使用外顯子10和11的PCR引物，按照Shuffenecker I.等，Am.J.Hum.Genet.62233-237，1997的描述使用外顯子14的PCR引物，按照Karaga，H.J.等，Eur.J.Endocrinol.139410-415，1998的描述使用外顯子13和16的PCR引物。PCR反應(yīng)液的組成為100ng基因組DNA、10pmol各種引物、40μM dCTP、20μM熒光染料Cy5-dCTP(MEN)或Cy3-dCTP(Amersham-biotech Ltd.，Buckinghamshire，UK)，體積為25μl。在程序化熱循環(huán)儀(Perkin Elmer Cetus 9600；Roche Molecular Systems，Inc.，NJ)中，94℃變性5分鐘開始反應(yīng)。PCR條件為94℃30秒、60℃30秒、和72℃1分鐘，循環(huán)35次，最后在72℃延長7分鐘。每種外顯子單獨(dú)擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增后，用純化試劑盒(Qiagen Inc，Valencia，CA)純化Cy5-或Cy3-標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，然后用0.25 U DNase I(Takara，Shiga，Japan)在25℃消化10分鐘。剩余的酶在95℃滅活10分鐘，并通過上述純化程序除去，收集Cy5-或Cy3-標(biāo)記的DNA樣品。<表3>
(步驟3)雜交反應(yīng)和分析將步驟(2)中制備的各外顯子的Cy5-或Cy3-標(biāo)記的DNA樣品單獨(dú)混合，然后重懸浮于預(yù)熱的1×UniHyb溶液(TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)中，至體積為2～4μl。將2μl混合的DNA樣品滴到步驟(1)制備的玻璃片上，然后用一塊蓋玻片覆蓋這塊玻璃片。將這塊玻璃片在飽和蒸汽試管中于60℃保溫3小時進(jìn)行雜交反應(yīng)。將該雜交后的玻璃片置于2×SSC+0.2％ SDS緩沖液中室溫下漂洗10～30分鐘，然后，在蒸餾水中漂洗5分鐘，隨后離心和干燥。用ScanArray Lite(ParkardInstrument Co，Meriden，CT)掃描玻璃片，用定量微點(diǎn)陣分析軟件(QuantArray，version 2.0)分析。為了確定極限值，所有數(shù)據(jù)用Sigma Plot(SPSS Inc.，San Rafael，CA)進(jìn)行分析，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
將99％可信度范圍的最大值設(shè)置為極限值，分析存在RET各密碼子突變的陽性信號(圖3和4)。圖4(a)顯示外顯子10(密碼子609、611、618、和620)和外顯子11(密碼子630和634)上發(fā)生的雜交的范圍。據(jù)報道超過95％的MEN2A突變發(fā)生在外顯子10和外顯子11。Fig.4(b)表明外顯子13(密碼子768)和14(密碼子804)上的雜交。經(jīng)鑒定大多數(shù)FMTC突變發(fā)生在外顯子13和外顯子14上；而觀察到大多數(shù)MEN2B突變發(fā)生在外顯子16(密碼子918)上。
22個樣品(SNU-MEN2A-I，II，III，IV)的雜交結(jié)果與之前的測序數(shù)據(jù)一致。至于未知的SNU-MEN2A-V樣品，應(yīng)用本發(fā)明的RET寡芯片的雜交實(shí)驗表明密碼子634發(fā)生了從TGC(半胱氨酸)到TGG(色氨酸)的突變，而不是之前用常規(guī)方法確定的野生型序列。為了確定該突變在密碼子634位上，進(jìn)行克隆和直接測序。將外顯子11的PCR產(chǎn)物連接到PCR-TOPO載體上，用TA克隆系統(tǒng)(Invitrogen，Caelsbad，CA)進(jìn)行亞克隆。用Taq雙脫氧末端循環(huán)測序試劑盒和ABI 377 DNA序列儀(Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City，CA)進(jìn)行雙向測序。結(jié)果證實(shí)SNU-MEN2A-V樣品在密碼子634上有一個突變(48C634W，TGC→TGG，外顯子11)。也就是說，本發(fā)明的RET寡芯片能夠檢測到直接測序辨認(rèn)錯誤的RET基因突變。
雖然描述和說明了本發(fā)明的實(shí)施方式，顯然在不偏離僅由所附權(quán)利要求范圍限定的本發(fā)明實(shí)質(zhì)的情況下，可以進(jìn)行各種改變和修飾。
序列表<110>國立癌中心<120>RET寡核苷酸微芯片及其用于檢測遺傳性癌癥的方法<130>PCA11254/PJG<160>67<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>10-PC<400>1ggggattaaa gctggctatg g 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(R)<400>2ctatggcacc cgcaactgct t 21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(S)<400>3ctatggcacc agcaactgct t 21<210>4<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(G)<400>4tggcaccggc aactgc 16<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(F)<400>5ctatggcacc ttcaactgct tc 22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(Y)<400>6ctatggcacc tacaactgct tc 22<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(S)<400>7tatggcacct ccaactgctt c 21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(W)<400>8tatggcacct ggaactgctt c 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(C)<400>9tatggcacct gcaactgctt c 21<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>611M-(R)<400>10acctgcaacc gcttccctga 20<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>611M-(S)<400>11cacctgcaac agcttccctg a 21<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>611M-(G)<400>12acctgcaacg gcttccctga 20<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>611M-(F)<400>13acctgcaact tcttccctga g 21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>611M-(Y)<400>14acctgcaact acttccctga g 21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>611M-(S)<400>15acctgcaact ccttccctga g 21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>611M-(W)<400>16acctgcaact ggttccctga g 21<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>611W-(C)<400>17acctgcaact gcttccctga g 21<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>618M-(R)<400>18aggagaagcg cttctgcgag 20<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>618M-(S)<400>19gaggagaaga gcttctgcga g 21<210>20<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>618M-(G)<400>20gagaagggct tctgcg 16<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>618M-(F)<400>21aggagaagtt cttctgcgag 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>618M-(Y)<400>22aggagaagta cttctgcgag 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>618M-(S)<400>23aggagaagtc cttctgcgag 20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>618M-(W)<400>24aggagaagtg gttctgcgag 20<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>618W-(C)<400>25gaggagaagt gcttctgcga g 21<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620M-(R)<400>26aagtgcttcc gcgagcccga 20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620M-(S)<400>27aagtgcttca gcgagcccga 20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620M-(G)<400>28aagtgcttcg gcgagcccga 20<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620M-(F)<400>29aagtgcttct tcgagcccga 20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620M-(Y)<400>30aagtgcttct acgagcccga 20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620M-(S)<400>31aagtgcttct ccgagcccga 20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620M-(W)<400>32aagtgcttct gggagcccga 20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620W-(C)<400>33aagtgcttct gcgagcccga 20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630M-(M)<400>34gatccactgc gcgacgagct 20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630M-(S)<400>35gatccactga gcgacgagct 20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630M-(G)<400>36gatccactgg gcgacgagct 20<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630M-(F)<400>37gatccactgt tcgacgagct 20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630M-(Y)<400>38gatccactgt acgacgagct 20<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630M-(S)<400>39gatccactgt ccgacgagct 20<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630M-(W)<400>40gatccactgt gggacgagct 20<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630W-(C)<400>41gatccactgt gcgacgagct 20<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>634M-(R)<400>42gacgagctgc gccgcacggt 20<210>43<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>634M-(S)<400>43gacgagctga gccgcacggt 20<210>44<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>634M-(G)<400>44cgagctgggc cgcacg 16<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>634M-(F)<400>45gacgagctgt tccgcacggt 20<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>634M-(Y)<400>46gacgagctgt accgcacggt 20<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>634M-(S)<400>47gacgagctgt cccgcacggt 20<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>634M-(W)<400>48gacgagctgt ggcgcacggt 20<210>49<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>634W-(C)<400>49gacgagctgt gccgcacggt 20<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>11PC<400>50ccgctgtcct cttctccttc 20<210>51<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>768M-(Q)<400>51tccccgagtc agcttcgaga 20<210>52<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>768M-(K)<400>52ctccccgagt aagcttcgag a 21<210>53<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>768M-(A)<400>53tccccgagtg cgcttcgaga 20<210>54<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>768M-(G)<400>54tccccgagtg ggcttcgaga 20<210>55<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>768M-(V)<400>55tccccgagtg tgcttcgaga 20<210>56<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>768M-(D)<400>56tccccgagtg accttcgaga 20<210>57<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>768M-(D)<400>57tccccgagtg atcttcgaga c 21<210>58<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>768W-(E)<400>58tccccgagtg agcttcgaga 20<210>59<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>804M-(L)<400>59ctcctcatcc tggagtacgc 20<210>60<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>804M-(M)<400>60cctcctcatc atggagtacg c 21<210>61<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>804M-(L)<400>61cctcctcatc ttggagtacg c 21<210>62<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>804M-(E)<400>62ctcctcatcg aggagtacgc 20<210>63<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>804M-(A)<400>63ctcctcatcg cggagtacgc 20<210>64<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>804M-(G)<400>64ctcctcatcg gggagtacgc 20<210>65<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>804W-(V)<400>65ctcctcatcg tggagtacgc 20<210>66<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>918M-(T)<400>66cagttaaatg gacggcaatt gaat24<210>67<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>918W-(M)<400>67cagttaaatg gatggcaatt gaat24<210>68<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-10F<400>68gtaggaattc gacacgagcc tggggagc28<210>69<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-10R<400>69catcgaattc ttgttggacc tcagatgtgc 30<210>70<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-11F<400>70gtaggaattc gcagcctgta cccagtggtg 30<210>71<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-11R<400>71catcgaattc accggaagag gagtagctg 29<210>72<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-13F<400>72taatacgact cactataggg cttccaggag cgatcgttt39<210>73<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-13R<400>73atttaggtga cactatagca ccctgcagct ggcctt 36<210>74<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-14F<400>74tggctcctgg aagacccaa 19<210>75<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-14R<400>75tgcacgcacc ttcatctcg 19<210>76<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-16F<400>76taatacgact cactataggg agagttagag taacttcaat gtc 43<210>77<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-16R<400>77atttaggtga cactatagta acctccaccc caagaga 3權(quán)利要求
1.一種用于檢測RET突變的RET寡核苷酸微芯片，包括固定在固體基質(zhì)表面的多種寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被設(shè)計用來檢測RET基因突變熱點(diǎn)的錯義突變型。
2.權(quán)利要求1的RET寡核苷酸微芯片，其中熱點(diǎn)是密碼子609、611、618、620、630、634、768、804和918。
3.權(quán)利要求1的RET寡核苷酸微芯片，其中寡核苷酸被設(shè)計用來檢測密碼子609、611、618、620、630、634、和768上的7種錯義突變，密碼子804上的6種錯義突變，密碼子918上的一種錯義突變，9種各密碼子的野生型，和2種外顯子10和11的陽性對照。
4.權(quán)利要求3的RET寡核苷酸微芯片，其中密碼子609的錯義突變的寡核苷酸為SEQ ID Nos.2到8描述的那些，密碼子611的錯義突變?yōu)镾EQ ID Nos.10到16，密碼子618的錯義突變?yōu)镾EQ ID Nos.18到24，密碼子620的錯義突變?yōu)镾EQ ID Nos.26到32，密碼子630的錯義突變?yōu)镾EQ ID Nos.34到40，密碼子634的錯義突變?yōu)镾EQ ID Nos.42到48，密碼子768的錯義突變?yōu)镾EQ ID Nos.51到57，密碼子804的錯義突變?yōu)镾EQ ID Nos.59到64，和密碼子918的錯義突變?yōu)镾EQ ID No.66。
5.權(quán)利要求1至4中任何一個的RET寡核苷酸微芯片的生產(chǎn)方法，包括1)將各種寡核苷酸混合到微量點(diǎn)樣溶液中，然后分配到平板的孔中；2)用微量點(diǎn)陣儀將寡核苷酸點(diǎn)到固體基質(zhì)的表面；3)將寡核苷酸固定到固體基質(zhì)表面，并清洗；4)將固體基質(zhì)浸泡到95℃水中，使固定的寡核苷酸變性，然后用硼氫化鈉溶液處理固體基質(zhì)；和5)清洗和干燥固體基質(zhì)。
6.權(quán)利要求5的生產(chǎn)方法，其中步驟(1)中使用的每種寡核苷酸具有一個5’氨基修飾的12碳間隔區(qū)。
全文摘要
本發(fā)明設(shè)計一種用于檢測RET基因突變熱點(diǎn)區(qū)突變的RET寡核苷酸微芯片,其生產(chǎn)方法及其用于檢測遺傳性癌癥的方法,其中有選擇地設(shè)計了特定寡核苷酸,用來檢測RET基因突變熱點(diǎn)上的各種錯義突變。
文檔編號G01N33/53GK1422963SQ0210530
公開日2003年6月11日 申請日期2002年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月19日
發(fā)明者樸在甲, 金日鎮(zhèn), 姜曉貞, 樸在賢 申請人:國立癌中心