專利名稱：蛋白質(zhì)原位檢測(cè)試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的蛋白質(zhì)和/或氨基酸檢測(cè)組合物，該組合物可用作一種原位檢測(cè)試劑，例如，在表面原位檢測(cè)。本發(fā)明還涉及用于使用上述組合物和包含此組合物的試劑盒來檢測(cè)表面上的蛋白質(zhì)和/或氨基酸的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)的檢測(cè)，比如，對(duì)自然完整的蛋白質(zhì)和/或它們的亞組氨基酸和肽的檢測(cè)，尤其是微量檢測(cè)，是在實(shí)驗(yàn)室、臨床、和法醫(yī)環(huán)境中重要的分析和生物技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)過程。通常，蛋白質(zhì)和/或氨基酸的檢測(cè)是使用現(xiàn)有試劑、結(jié)合已經(jīng)驗(yàn)證過的不同技術(shù)以及儀器而完成的。現(xiàn)有方法傾向于依賴試劑和肽的自由氨基酸、末端氨基酸殘基反應(yīng)，或者和溶液中蛋白的末端氨基酸殘基、側(cè)鏈官能團(tuán)反應(yīng)，通過產(chǎn)生可見的顏色、或者可探測(cè)的熒光產(chǎn)物，以定性和定量方式輔助確定分析物的存在。研究表明，在醫(yī)院滅菌與消毒裝置(Hospital SteriIisation&DisinfectionUnits)(也稱為Sterile Service Departments (SSD)(消毒服務(wù)部門))中，標(biāo)準(zhǔn)滅菌程序在對(duì)可回收利用的醫(yī)療器械進(jìn)行凈化時(shí)，是沒有效率的(Baxter R.L et al J HospitalInfection.2006, 63，439-44)。這些研究顯示，醫(yī)療器械上的殘留蛋白可以通過外科手術(shù)、尤其是神經(jīng)手術(shù)過程，直接導(dǎo)致潛在疾病的威脅，包括vCJD (變異型庫賈氏癥)的轉(zhuǎn)移。因此，檢測(cè)醫(yī)療儀器表面的非常低數(shù)量(納克或者皮克)的殘留蛋白很重要，而且亟待解決。茚三酮(2，2_ 二羥基-1，3-茚二酮)是用于檢測(cè)一級(jí)和二級(jí)胺的化合物。茚三酮和氨基酸的alpha氨基殘基反應(yīng)。在茚三酮和胺反應(yīng)的時(shí)候，在合適的溫度環(huán)境下，會(huì)產(chǎn)生顏色深的藍(lán)/紫色發(fā)色團(tuán)，即羅曼紫(2-[ (3-羥基-1 -氧茚-2-基)亞氨]-1，3-茚二酮)。茚三酮的顯色性質(zhì)可以視覺檢測(cè)和定量分析氨基酸。在生物化學(xué)分析上，茚三酮被用于在各種分離技術(shù)、如色譜法、高效液相色譜(HPLC)或者固體多肽合成完成時(shí)，確定存在的氨基酸的濃度。無菌服務(wù)部門(SSD department)使用市場(chǎng)上可以購買到的試劑盒的卻三酮,用于定性檢測(cè)可回收使用的外科和/或牙醫(yī)設(shè)備的凈化和/或滅菌程序的效率。高壓蒸汽處理、加熱和清洗過的儀器的表面，用棉簽擦拭，然后用試劑盒里面的茚三酮濕潤。一旦在棉簽上有顏色產(chǎn)生(通過和胺的反應(yīng))，通過視覺對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)精氨酸棉簽評(píng)估，判斷是否有殘余蛋白質(zhì)。茚三酮依賴于自由可得的氨基酸來優(yōu)選產(chǎn)生有色產(chǎn)物。在自由氨基酸存在的條件下，如氨基酸殘基自由暴露，試劑是最有效的。但是，在儀器被洗滌或者高壓蒸汽處理時(shí)，自由氨基酸，或蛋白質(zhì)降解的氨基酸都被洗去。茚三酮可以檢測(cè)精氨酸的閾值大約是5微克/毫升，而牛血清蛋白的檢測(cè)閾值是實(shí)際很高的檢測(cè)閾值，只有500微克/毫升。也因?yàn)椴潦眉夹g(shù)在將蛋白質(zhì)從它們結(jié)合的位置吸收下來的效率很低，因此造成檢測(cè)靈敏度降低。由于對(duì)殘留蛋白質(zhì)不敏感，而且產(chǎn)生假陰性的風(fēng)險(xiǎn)高，因此，茚三酮的靈敏度和特異性都很低?？偟膩碚f，作為試劑的茚三酮和茚三酮的試劑盒不能為凈化程序的蛋白質(zhì)檢測(cè)提供足夠的靈敏度。
鄰苯二甲醛(OPA)也是一種在化學(xué)和生物研究中用于氨基酸檢測(cè)的試劑。因?yàn)槠涓叩撵`敏度而被用于氨基酸檢測(cè)。鄰苯二甲醛/硫醇的溶液，在氨基酸分析中是茚三酮的替代試劑(Stobaugh et al.(1983)分析生物化學(xué)135，頁495-504)。鄰苯二甲醛和一級(jí)胺在硫醇(如巰基乙醇，乙硫醇，或者(2R)-2-乙酰胺基-3-磺酰基丙酸、即通常所說的乙酰半胱氨酸(NAC))存在下反應(yīng),產(chǎn)生具有明亮突光的異Π引哚衍生物(Garcia Alvarez-Coqueet al.(1989)，分析生物化學(xué)180，頁172-176)，在Ex/Em=350/450納米下監(jiān)測(cè)該衍生物。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)和/或氨基酸檢測(cè)組合物，該組合物包括: (a)苯二甲醛，(b)C3-C6 硫醇， (c)pH值在約7.5到約10范圍內(nèi)的緩沖溶液，和 (d)表面活性劑， 其中所述組合物進(jìn)一步包括: Ce)硫醇還原化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)和/或氨基酸檢測(cè)組合物，其特征在于，該組合物由下列物質(zhì)組合制備: Ca)約0.1毫摩爾/升至約10毫摩爾/升的鄰苯二甲醛， (b)約I毫摩爾/升至約20毫摩爾/升的C3-C6硫醇(c)約10毫摩爾/升至約100毫摩爾/升的、pH值在7.5到10之間的緩沖溶液， Cd)約0.01% (v/v,體積比)至約2% (v/v,體積比)的表面活性劑，和 (e)約0.05毫摩爾/升至約5毫摩爾/升硫醇還原化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于，所述C3-C6硫醇是乙酰半胱氨酸、2-巰基乙醇或者二硫代蘇糖醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述緩沖溶液的pH值在pH9到pH9.5之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述表面活性劑是非離子表面活性劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述硫醇還原化合物包括有二硫蘇糖醇或者三(2-羧乙基)膦。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物進(jìn)一步包括螯合劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述螯合劑的濃度在約0.05毫摩爾/暈升至約5暈?zāi)?暈升之間。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物進(jìn)一步包括有機(jī)溶劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述溶劑選自于乙醇、甲醇、丙酮或者乙腈。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的組合物，其特征在于，所述溶劑是甲醇。
12.用于制備權(quán)利要求1-11所述的組合物的方法，該方法通過將成分(a)、(b)、(d)和Ce)混合到緩沖溶液(c)中而進(jìn)行。
13.檢測(cè)蛋白質(zhì)和/或氨基酸的方法，包括: a)施用權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的組合物至表面和/或底物上，和 b)檢測(cè)熒光。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，使用能探測(cè)熒光的任何裝置或儀器來檢測(cè)熒光。
15.用于檢測(cè)蛋白質(zhì)和/或氨基酸的試劑盒，包括:a)如權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的組合物,和b)使用說明。
16.用于檢測(cè)蛋白質(zhì)和/或氨基酸的試劑盒，包括:a)如權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的組合物,和b)用于將所述組合物施用到表面和/或底物上的裝置，和c)使用 說明。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)和/或氨基酸的穩(wěn)定的檢測(cè)組合物，該組合物可用于作為一種原位檢測(cè)試劑，例如，在表面原位檢測(cè)。本發(fā)明還涉及用于使用上述組合物和包含此組合物的試劑盒來檢測(cè)表面上的蛋白質(zhì)和/或氨基酸的方法。
文檔編號(hào)G01N33/50GK103201626SQ201180051047
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2011年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者大衛(wèi)·佩雷特, 索萊達(dá)·塞西莉亞·瑞茲·安拓麗, 南達(dá)·琪朔·巴布·南羽尼 申請(qǐng)人:倫敦大學(xué)瑪麗皇后西域?qū)W院