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一種含海藻寡糖重金屬生物修復(fù)劑及其制備方法

文檔序號:9480722閱讀:803來源:國知局
一種含海藻寡糖重金屬生物修復(fù)劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重金屬生物修復(fù)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域,尤其是涉及一種含海藻寡糖重金屬生 物修復(fù)劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國重金屬污染問題日益嚴峻,2014年的全國土地污染情況調(diào)查報告指出,部分 土壤污染嚴重,耕地土壤環(huán)境質(zhì)量堪憂,工礦業(yè)廢棄地土壤環(huán)境問題突出,污染以無機型為 主,無機污染物鎘(Cd)、汞(Hg)、銅(Cu)、鉛(Pb)、鉻(Cr)、鋅(Zn)、鎳(Ni)等8種重金屬 污染程度最嚴重,其中重金屬Cd點位超標率達到了 7. 0 %,是重金屬污染物中點位超標率 最高的。中科院院士趙其國教授在"2015重金屬污染治理峰會"上指出,我國受重金屬污 染的耕地約有1000萬公頃,占18億耕地的8%以上,每年直接減少的糧食產(chǎn)量約100億公 斤。由于重金屬污染具有隱蔽性、滯后性,形態(tài)多樣性,且在物質(zhì)循環(huán)和能量循環(huán)中難以分 解,容易蓄積在土壤中,導(dǎo)致作物減產(chǎn),并通過植物的根系吸收進入植物體內(nèi),再經(jīng)過食物 鏈的傳遞和富集而危害人體健康。因此土壤重金屬污染已成為全球面臨的一個嚴重環(huán)境問 題(邢艷帥等,2014)。
[0003] 目前,土壤重金屬污染的治理方法主要有兩種方式:一是降低土壤中重金屬的生 物有效性,減少植物對重金屬的吸收;二是通過工程或生物技術(shù)方法降低土壤中重金屬的 含量。后者因工程量大、成本高,不適合大面積的土壤重金屬修復(fù)。改變土壤中重金屬存在 形態(tài),降低土壤有效態(tài)重金屬的含量是土壤重金屬修復(fù)的主要方法。重金屬污染修復(fù)方法 有物理修復(fù)法(電動修復(fù)法、電熱修復(fù)法)、化學(xué)修復(fù)法(土壤淋洗法、化學(xué)固定技術(shù))和生 物修復(fù)法(植物修復(fù)法、動物修復(fù)法和微生物修復(fù)法)(梁家妮等,2009)。物理修復(fù)法和化 學(xué)修復(fù)法修復(fù)效果好,但是成本高,且易造成二次污染,不適于大面積土壤重金屬修復(fù)。微 生物修復(fù)法是利用微生物對土壤中的重金屬污染物的吸收、沉淀、氧化還原等作用降低土 壤重金屬含量,或使污染物無害化的過程。微生物修復(fù)法具有成本低、污染少等優(yōu)點,再加 上國家政策傾斜,使其成為了重金屬污染土壤修復(fù)的重要方向(喬志香等,2004)。中國專 利CN102240670A提供一種重金屬污染土壤的微生物修復(fù)方法,該球形紅細菌微生修復(fù)劑 能一定程度上降低植物體內(nèi)重金屬積累,但施用時將發(fā)酵液直接隨水漫溉重金屬土壤,保 質(zhì)期較短,存在著應(yīng)用效果穩(wěn)定性差等問題;同時施用量為50~200mL/kg 土壤,換算成畝 施用量為7500~30000L (-畝地耕層土壤質(zhì)量約為150000kg),用量大,成本較高。中國專 利CN103275728A提供一種土壤重金屬生物固定劑,在有機肥中添加納豆芽孢桿菌、膠質(zhì)芽 孢桿菌、巨大芽孢桿菌和康氏木霉菌四種菌,制備方法復(fù)雜,成本較高;而且采用的菌株雖 然對重金屬有吸附效果,但據(jù)相關(guān)報道指出,巨大芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌因代謝過程中產(chǎn) 生有機酸,對土壤重金屬起到溶解活化作用,能提高土壤有效態(tài)重金屬含量,促進植物吸收 重金屬(楊卓等,2009 ;王小敏等,2013 ;楊榕等,2015);對重金屬作用效果不一樣的菌株 復(fù)配,造成修復(fù)效率的下降,成本提高。
[0004] 海藻寡糖是由海藻多糖降解得到的聚合度在2~10的直鏈或支鏈化合物,以瓊膠 寡糖(agaro-oligosaccharide,AOS)和褐藻寡糖(alginate-derived oligosaccharide, ADO)等為代表。海藻寡糖具有抗氧化、調(diào)節(jié)植物生長,提高植物抗逆性,減少植物病蟲害發(fā) 病率的作用(Kang et al.,2014 ;Zhang et al.,2013),作為新型綠色環(huán)保生物肥在農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)中起到重要作用。此外,海藻寡糖分子中含有大量的羧基、羥基,帶有電負性,能夠通過離 子交換和絡(luò)合作用吸附重金屬,因此在土壤重金屬污染的治理方面顯現(xiàn)出一定的潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題,提供不僅制備方法簡單,環(huán)境 污染小,而且能有效降低土壤中有效態(tài)重金屬含量,阻止植物對根系周圍重金屬離子的吸 收,同時能改良土壤,促進植物生長的一種含海藻寡糖重金屬生物修復(fù)劑及其制備方法。
[0006] 所述含海藻寡糖重金屬生物修復(fù)劑各組分的質(zhì)量百分比為:海藻寡糖5%~ 15%、枯草芽孢桿菌發(fā)酵液10%~20%、淡紫擬青霉固態(tài)發(fā)酵物65%~85%;其中,有效活 菌數(shù)彡2億CFU/g。
[0007] 所述含海藻寡糖重金屬生物修復(fù)劑的制備方法,包括以下步驟:
[0008] 1)制備枯草芽孢桿菌發(fā)酵液
[0009] 配制營養(yǎng)瓊脂平板,將枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)三炬-07接種在 營養(yǎng)瓊脂平板上進行劃線培養(yǎng),從營養(yǎng)瓊脂平板上將活化好的枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)三炬-07用無菌生理鹽水洗滌,制成菌懸液,將菌懸液接種至種子培養(yǎng)基中培 養(yǎng),得種子液,再將種子液接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)基中發(fā)酵,得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液;
[0010] 2)制備淡紫擬青霉固態(tài)發(fā)酵物
[0011] 配制PDA培養(yǎng)基,將淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)三炬03號種孢 子液,涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng),再用無菌生理鹽水將營養(yǎng)瓊脂平板上的淡紫擬青霉 (Paecilomyces lilacinus)三炬03號種的孢子洗滌,制成孢子懸液;將孢子懸液接入種子 培養(yǎng)基中培養(yǎng)得種子液;將種子液接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,于28~32°C下培養(yǎng)1~2d后 翻盤一次,前3d保持濕度為70%~80%,后4d保持自然濕度,發(fā)酵7d后,孢子成熟,固體 發(fā)酵結(jié)束,固體發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)常溫干燥后粉碎,制得淡紫擬青霉固態(tài)發(fā)酵物;
[0012] 3)制備含海藻寡糖重金屬生物修復(fù)劑
[0013] 將海藻寡糖、步驟1)所得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液、步驟2)所得淡紫擬青霉固態(tài)發(fā)酵 物混合,即得含海藻寡糖重金屬生物修復(fù)劑。
[0014] 在步驟1)中,所述營養(yǎng)瓊脂平板的組成可為牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉 5g/L、瓊脂20g/L,滅前pH值為7. 3 ;所述枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)三炬-07,已 于2014年12月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,地址:北京 市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所,郵編:100101,保藏中心登記入冊 編號:CGMCC No. 10248 ;所述劃線培養(yǎng)的條件可于28~32°C條件下培養(yǎng)24~48h ;
[0015] 所述種子培養(yǎng)基的組成可為牛肉膏3g/L,蛋白胨10g/L,氯化鈉5g/L,滅菌前pH值 為7. 0 ;所述菌懸液接種的接種量按體積百分比可為菌懸液的5%,菌懸液0D_= 0. 84 ;所 述種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的條件可于30~35°C,150~200rpm條件下培養(yǎng)24~36h ;
[0016] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可為淀粉20. 0~30. 0g/L,蔗糖5. 0~10. 0g/L,豆柏粉 10~20g/L,磷酸氫二鉀2. 0~3. 0g/L,硫酸錳0. 1~0. 5g/L,酵母膏1. 0~2. 0g/L ;所述 種子液接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)基中發(fā)酵的接種量按體積百分比可為種子液的10% ;所述發(fā)酵的 條件可為:轉(zhuǎn)速控制在200~300rpm,通氣量控制在為lvvm,保持溶解氧10%以上,罐溫控 制在28~30°C,罐壓保持在0. 05~0. 06MPa,pH值通過10%氨水和10%鹽酸控制在6. 5, 發(fā)酵時間為36~72h。
[0017] 在步驟2)中,所述PDA培養(yǎng)基的組成可為:去皮馬鈴薯200g/L,葡萄糖20g/L,瓊 脂15g/L,自然口!1值;所述淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)三炬03號種,已于2010 年6月30日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,地址:中國.武漢.武漢大學(xué),郵編:430072, 保藏編號為CCTCC NO :M 2010165 ;所述涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)的條件可于28~32°C 條件下培養(yǎng)3~5d ;所述種子培養(yǎng)基的組成可為:蔗糖15g/L,大豆粉10g/L,磷酸二氫鉀 lg/L,硫酸鋅0. lg/L,滅菌前pH值為6. 0 ;所述將孢子懸液接入種子培養(yǎng)基的接種量按體積 百分比可為8%~15%,稀釋至0D_為0. 2 ;所述將孢子懸液接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的條件 可于28~32°C,150~200rpm下培養(yǎng)3~4d ;所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可為:麩皮、秸 桿粉末、玉米粉、硫酸銨,麩皮、秸桿粉末、玉米粉、硫酸銨按質(zhì)量比可為(70~80) : (15~ 20) : (10~15) : (0.5~1.0);所述將種子液接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量可將種子 液以100mL/kg的比例接種至固體培養(yǎng)基中。
[0018] 在步驟3)中,所述海藻寡糖是利用微生物直接降解龍須菜、馬尾藻、褐藻等藻類 植物中至少一種
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