一種含海藻寡糖重金屬生物修復(fù)劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重金屬生物修復(fù)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種含海藻寡糖重金屬生 物修復(fù)劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國重金屬污染問題日益嚴峻，2014年的全國土地污染情況調(diào)查報告指出，部分 土壤污染嚴重，耕地土壤環(huán)境質(zhì)量堪憂，工礦業(yè)廢棄地土壤環(huán)境問題突出，污染以無機型為 主，無機污染物鎘（Cd)、汞（Hg)、銅（Cu)、鉛（Pb)、鉻（Cr)、鋅（Zn)、鎳（Ni)等8種重金屬 污染程度最嚴重，其中重金屬Cd點位超標率達到了 7. 0 %，是重金屬污染物中點位超標率 最高的。中科院院士趙其國教授在"2015重金屬污染治理峰會"上指出，我國受重金屬污 染的耕地約有1000萬公頃，占18億耕地的8%以上，每年直接減少的糧食產(chǎn)量約100億公 斤。由于重金屬污染具有隱蔽性、滯后性，形態(tài)多樣性，且在物質(zhì)循環(huán)和能量循環(huán)中難以分 解，容易蓄積在土壤中，導(dǎo)致作物減產(chǎn)，并通過植物的根系吸收進入植物體內(nèi)，再經(jīng)過食物 鏈的傳遞和富集而危害人體健康。因此土壤重金屬污染已成為全球面臨的一個嚴重環(huán)境問 題（邢艷帥等，2014)。
[0003] 目前，土壤重金屬污染的治理方法主要有兩種方式：一是降低土壤中重金屬的生 物有效性，減少植物對重金屬的吸收；二是通過工程或生物技術(shù)方法降低土壤中重金屬的 含量。后者因工程量大、成本高，不適合大面積的土壤重金屬修復(fù)。改變土壤中重金屬存在 形態(tài)，降低土壤有效態(tài)重金屬的含量是土壤重金屬修復(fù)的主要方法。重金屬污染修復(fù)方法 有物理修復(fù)法（電動修復(fù)法、電熱修復(fù)法）、化學(xué)修復(fù)法（土壤淋洗法、化學(xué)固定技術(shù)）和生 物修復(fù)法（植物修復(fù)法、動物修復(fù)法和微生物修復(fù)法）（梁家妮等，2009)。物理修復(fù)法和化 學(xué)修復(fù)法修復(fù)效果好，但是成本高，且易造成二次污染，不適于大面積土壤重金屬修復(fù)。微 生物修復(fù)法是利用微生物對土壤中的重金屬污染物的吸收、沉淀、氧化還原等作用降低土 壤重金屬含量，或使污染物無害化的過程。微生物修復(fù)法具有成本低、污染少等優(yōu)點，再加 上國家政策傾斜，使其成為了重金屬污染土壤修復(fù)的重要方向（喬志香等，2004)。中國專 利CN102240670A提供一種重金屬污染土壤的微生物修復(fù)方法，該球形紅細菌微生修復(fù)劑 能一定程度上降低植物體內(nèi)重金屬積累，但施用時將發(fā)酵液直接隨水漫溉重金屬土壤，保 質(zhì)期較短，存在著應(yīng)用效果穩(wěn)定性差等問題；同時施用量為50~200mL/kg 土壤，換算成畝 施用量為7500~30000L (-畝地耕層土壤質(zhì)量約為150000kg)，用量大，成本較高。中國專 利CN103275728A提供一種土壤重金屬生物固定劑，在有機肥中添加納豆芽孢桿菌、膠質(zhì)芽 孢桿菌、巨大芽孢桿菌和康氏木霉菌四種菌，制備方法復(fù)雜，成本較高；而且采用的菌株雖 然對重金屬有吸附效果，但據(jù)相關(guān)報道指出，巨大芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌因代謝過程中產(chǎn) 生有機酸，對土壤重金屬起到溶解活化作用，能提高土壤有效態(tài)重金屬含量，促進植物吸收 重金屬（楊卓等，2009 ;王小敏等，2013 ;楊榕等，2015);對重金屬作用效果不一樣的菌株 復(fù)配，造成修復(fù)效率的下降，成本提高。
[0004] 海藻寡糖是由海藻多糖降解得到的聚合度在2~10的直鏈或支鏈化合物，以瓊膠 寡糖（agaro-oligosaccharide，AOS)和褐藻寡糖（alginate-derived oligosaccharide， ADO)等為代表。海藻寡糖具有抗氧化、調(diào)節(jié)植物生長，提高植物抗逆性，減少植物病蟲害發(fā) 病率的作用（Kang et al.，2014 ;Zhang et al.，2013)，作為新型綠色環(huán)保生物肥在農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)中起到重要作用。此外，海藻寡糖分子中含有大量的羧基、羥基，帶有電負性，能夠通過離 子交換和絡(luò)合作用吸附重金屬，因此在土壤重金屬污染的治理方面顯現(xiàn)出一定的潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，提供不僅制備方法簡單，環(huán)境 污染小，而且能有效降低土壤中有效態(tài)重金屬含量，阻止植物對根系周圍重金屬離子的吸 收，同時能改良土壤，促進植物生長的一種含海藻寡糖重金屬生物修復(fù)劑及其制備方法。
[0006] 所述含海藻寡糖重金屬生物修復(fù)劑各組分的質(zhì)量百分比為：海藻寡糖5%~ 15%、枯草芽孢桿菌發(fā)酵液10%~20%、淡紫擬青霉固態(tài)發(fā)酵物65%~85%;其中，有效活 菌數(shù)彡2億CFU/g。
[0007] 所述含海藻寡糖重金屬生物修復(fù)劑的制備方法，包括以下步驟：
[0008] 1)制備枯草芽孢桿菌發(fā)酵液
[0009] 配制營養(yǎng)瓊脂平板，將枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis)三炬-07接種在 營養(yǎng)瓊脂平板上進行劃線培養(yǎng)，從營養(yǎng)瓊脂平板上將活化好的枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis)三炬-07用無菌生理鹽水洗滌，制成菌懸液，將菌懸液接種至種子培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，得種子液，再將種子液接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)基中發(fā)酵，得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；
[0010] 2)制備淡紫擬青霉固態(tài)發(fā)酵物
[0011] 配制PDA培養(yǎng)基，將淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus)三炬03號種孢 子液，涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)，再用無菌生理鹽水將營養(yǎng)瓊脂平板上的淡紫擬青霉 (Paecilomyces lilacinus)三炬03號種的孢子洗滌，制成孢子懸液；將孢子懸液接入種子 培養(yǎng)基中培養(yǎng)得種子液；將種子液接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28~32°C下培養(yǎng)1~2d后 翻盤一次，前3d保持濕度為70%~80%，后4d保持自然濕度，發(fā)酵7d后，孢子成熟，固體 發(fā)酵結(jié)束，固體發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)常溫干燥后粉碎，制得淡紫擬青霉固態(tài)發(fā)酵物；
[0012] 3)制備含海藻寡糖重金屬生物修復(fù)劑
[0013] 將海藻寡糖、步驟1)所得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液、步驟2)所得淡紫擬青霉固態(tài)發(fā)酵 物混合，即得含海藻寡糖重金屬生物修復(fù)劑。
[0014] 在步驟1)中，所述營養(yǎng)瓊脂平板的組成可為牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉 5g/L、瓊脂20g/L，滅前pH值為7. 3 ;所述枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis)三炬-07,已 于2014年12月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京 市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101，保藏中心登記入冊 編號：CGMCC No. 10248 ;所述劃線培養(yǎng)的條件可于28~32°C條件下培養(yǎng)24~48h ;
[0015] 所述種子培養(yǎng)基的組成可為牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，滅菌前pH值 為7. 0 ;所述菌懸液接種的接種量按體積百分比可為菌懸液的5%，菌懸液0D_= 0. 84 ;所 述種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的條件可于30~35°C，150~200rpm條件下培養(yǎng)24~36h ;
[0016] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可為淀粉20. 0~30. 0g/L，蔗糖5. 0~10. 0g/L，豆柏粉 10~20g/L，磷酸氫二鉀2. 0~3. 0g/L，硫酸錳0. 1~0. 5g/L，酵母膏1. 0~2. 0g/L ;所述 種子液接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)基中發(fā)酵的接種量按體積百分比可為種子液的10% ;所述發(fā)酵的 條件可為：轉(zhuǎn)速控制在200~300rpm，通氣量控制在為lvvm，保持溶解氧10%以上，罐溫控 制在28~30°C，罐壓保持在0. 05~0. 06MPa，pH值通過10%氨水和10%鹽酸控制在6. 5， 發(fā)酵時間為36~72h。
[0017] 在步驟2)中，所述PDA培養(yǎng)基的組成可為：去皮馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊 脂15g/L，自然口!1值；所述淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus)三炬03號種，已于2010 年6月30日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編：430072， 保藏編號為CCTCC NO :M 2010165 ;所述涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)的條件可于28~32°C 條件下培養(yǎng)3~5d ;所述種子培養(yǎng)基的組成可為：蔗糖15g/L，大豆粉10g/L，磷酸二氫鉀 lg/L，硫酸鋅0. lg/L，滅菌前pH值為6. 0 ;所述將孢子懸液接入種子培養(yǎng)基的接種量按體積 百分比可為8%~15%，稀釋至0D_為0. 2 ;所述將孢子懸液接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的條件 可于28~32°C，150~200rpm下培養(yǎng)3~4d ;所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可為：麩皮、秸 桿粉末、玉米粉、硫酸銨，麩皮、秸桿粉末、玉米粉、硫酸銨按質(zhì)量比可為（70~80) : (15~ 20) : (10~15) : (0.5~1.0);所述將種子液接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量可將種子 液以100mL/kg的比例接種至固體培養(yǎng)基中。
[0018] 在步驟3)中，所述海藻寡糖是利用微生物直接降解龍須菜、馬尾藻、褐藻等藻類 植物中至少一種