專利名稱：一種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)劑技術(shù)領(lǐng)域和其應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域。
本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)劑的應(yīng)用。
本發(fā)明解決上述首要技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為該種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)劑，其特征在于為具有下式結(jié)構(gòu)的海藻低聚寡糖， 其中n＝1-10。
上述的海藻低聚寡糖是來(lái)自于紅藻瓊膠的降解寡聚糖，以5個(gè)瓊二糖或新瓊二糖的聚合單位以下的寡糖為主，即1≤n≤5。
本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是將上述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)劑在預(yù)防紫外線造成皮膚損傷的護(hù)膚化妝品應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、采用天然的海藻原料，原料廣泛；2、制備工藝簡(jiǎn)單，無(wú)需基因工程方法或者昂貴的蛋白質(zhì)純化方法；；3、單純的小分子碳水化合物，不是蛋白質(zhì)，不會(huì)變性，更適合在護(hù)扶的化妝品上使用，安全可靠有效；4、成本經(jīng)濟(jì)，適合其推廣使用。總之，海藻寡糖來(lái)自于純天然海藻原料，制備工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品安全無(wú)毒，具有明顯的成纖維細(xì)胞保護(hù)作用。根據(jù)本發(fā)明，可以將海藻寡糖作為特效生物活性成分添加到各類化妝、護(hù)膚品中，可以祛除防止紫外線輻射引起的皮膚損傷與皺紋，使皮膚彈性增強(qiáng)、有光澤并富于生氣。
實(shí)施例之一1.瓊膠寡糖的降解制備將瓊膠樣品配置成1.5％溶液，在50℃恒溫水浴中加入鹽酸至終濃度0.37mol/L，攪拌條件下反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后以NaOH中和，加入4倍體積的乙醇，靜置過(guò)夜，減壓過(guò)濾，濾液減壓濃縮至近干。降解產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G-10柱脫鹽，脫鹽后的產(chǎn)物冷凍干燥，得率為35％。
2.瓊膠寡糖的組成分析(薄層色譜法)樣品溶解于50％乙醇中，在硅膠板上點(diǎn)樣，展開(kāi)劑采用正丁醇/乙醇/水(3∶1∶1)，顯色劑采用百里酚-硫酸，噴霧后100℃顯色5min，出現(xiàn)粉紅色斑點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)寡糖樣品包括半乳糖、3，6-內(nèi)醚半乳糖、新瓊二糖、新瓊四糖、新瓊六糖。斑點(diǎn)主要集中在新瓊二糖、新瓊四糖、新瓊六糖以及更高分子量的寡糖斑點(diǎn)。
3.瓊膠寡糖對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性測(cè)定本實(shí)驗(yàn)在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行。
(1)成纖維細(xì)胞第10代體外培養(yǎng)的人體成纖維細(xì)胞。
(2)膠寡糖樣品將0.5g樣品溶解于2.5ml蒸餾水中，經(jīng)過(guò)0.2μm濾膜過(guò)濾，4℃保存。
(3)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上接種細(xì)胞，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，在37℃，5％CO2，飽和濕度條件下培育20h后，加入樣品溶液，然后在同樣條件下培育60min，培育結(jié)束后，在每個(gè)孔內(nèi)加入5mg/ml MTT(Sigma產(chǎn)品)200μl，同樣條件下再培育4h，棄去上清夜，每孔加入DMSO 800μl，混合均勻，以1∶3轉(zhuǎn)移到96孔板(每孔100μl)，采用酶標(biāo)儀在550nm讀取吸光度，共進(jìn)行9組平行樣品測(cè)定。
(4)對(duì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)作用按照下式計(jì)算生長(zhǎng)促進(jìn)率(％)＝[(A-A0)/A0]×100％]其中，A為樣品組的吸光度；A0為空白對(duì)照組的吸光度。結(jié)果見(jiàn)表1，可以證明，瓊膠寡糖對(duì)人體成纖維細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)促進(jìn)作用。
表1瓊膠寡糖對(duì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)作用

實(shí)施之二1.從食品級(jí)瓊膠降解制備瓊膠寡糖采用食品級(jí)市售瓊膠配置成1％溶液，加入2216E固體培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)瓊膠降解微生物降解2d，過(guò)濾后，在降解產(chǎn)物中加入3倍乙醇，離心后將溶液旋轉(zhuǎn)濃縮，冷凍干燥。
2.瓊膠寡糖的分離制備將上述降解產(chǎn)物120mg，加入0.02％疊氮化鈉抗菌劑，上Sephadex G-25凝膠柱(900×26mm)，室溫下用恒流泵以40ml/h流速含有0.02％疊氮化鈉的水溶液洗脫，以部分收集器收集流分，每次收集6ml，用硫酸苯酚法檢測(cè)各試管中的糖濃度，結(jié)合薄層色譜檢測(cè)，得到二糖寡聚度為1-5的組分，合并洗脫液，旋轉(zhuǎn)濃縮后冷凍干燥。
3.瓊膠寡糖對(duì)成纖維細(xì)胞紫外輻射氧化損傷的保護(hù)活性測(cè)定采用與實(shí)施例1基本相同的檢測(cè)方法同樣測(cè)定，在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上接種細(xì)胞，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，在37℃，5％CO2，飽和濕度條件下培育20h后，加入樣品溶液，然后在同樣條件下培育30min，然后用UVA輻射5s，輻射強(qiáng)度為1.91×10-3J/cm2，另外一組則用UVB輻射20s，輻射強(qiáng)度為1.176×10-4J/cm2，輻射結(jié)束后，再培育30min，然后在每個(gè)孔內(nèi)加入5mg/ml MTT(Sigma產(chǎn)品)200μl，同樣條件下再培育4h，棄去上清夜，每孔加入DMSO 800μl，混合均勻，以1∶3轉(zhuǎn)移到96孔板，每孔100μl，采用酶標(biāo)儀在550nm讀取吸光度，共進(jìn)行9組平行樣品測(cè)定。采用與實(shí)施例1一樣的數(shù)據(jù)處理方式計(jì)算成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)率。
結(jié)果見(jiàn)表2，通過(guò)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可以得出結(jié)論UVA短時(shí)間照射5s，對(duì)成纖維細(xì)胞不僅沒(méi)有抑制作用，而且具有一定的生長(zhǎng)促進(jìn)作用，但是UVB確實(shí)能夠造成對(duì)成纖維細(xì)胞的損傷作用，而瓊膠寡糖樣品確實(shí)對(duì)紫外線造成的人體成纖維細(xì)胞的氧化性損傷具有明顯的保護(hù)作用，而且這種保護(hù)作用成顯著的量效關(guān)系。
表2瓊膠寡糖對(duì)紫外輻射損傷的成纖維細(xì)胞的保護(hù)與生長(zhǎng)促進(jìn)作用

作為本實(shí)施例的變更1.瓊膠的來(lái)源可以是石花菜、江蘺、紫菜等紅藻。按照藻類資源的不同，在提取瓊膠的工藝上有所不同。
2.瓊膠寡糖的制備可以采用酸水解法，也可以采用酶水解法。精制瓊膠寡糖的方法可以采用Sephadex G-25凝膠色譜，也可以采用乙醇沉淀除去多糖后再脫鹽制備，或者采用分子截留值為3000的膜超濾方法制備。
權(quán)利要求
1.一種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)劑，其特征在于為具有下式結(jié)構(gòu)的海藻低聚寡糖， 其中n＝1-10。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞促進(jìn)劑，其特征在于所述的海藻低聚寡糖是來(lái)自于紅藻瓊膠的降解寡聚糖，以5個(gè)瓊二糖或新瓊二糖的聚合單位以下的寡糖為主，即1≤n≤5。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)劑，其特征在于在預(yù)防紫外線造成皮膚損傷的護(hù)膚化妝品方面應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及下式的海藻低聚寡糖作為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)劑,它具有作為紫外線氧化損傷保護(hù)劑的新用途,具有下式結(jié)構(gòu)的低聚寡糖,來(lái)自于紅藻瓊膠的降解產(chǎn)物,可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為作為具有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用及紫外線氧化損傷保護(hù)作用的護(hù)膚化妝品,其中n=1－10。
文檔編號(hào)A61P17/16GK1387857SQ02111990
公開(kāi)日2003年1月1日 申請(qǐng)日期2002年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月6日
發(fā)明者嚴(yán)小軍, 周成旭, 范曉 申請(qǐng)人:嚴(yán)小軍