專利名稱：真菌細(xì)胞壁合成基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼參與真菌細(xì)胞壁合成的蛋白質(zhì)的DNA，由該DNA編碼的蛋白質(zhì)，檢查某些化合物是否對(duì)GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)中所涉及的轉(zhuǎn)運(yùn)過程產(chǎn)生影響的方法，以及對(duì)GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)中所涉及的轉(zhuǎn)運(yùn)過程產(chǎn)生影響的抗真菌劑。
背景技術(shù)：
近年來，由于老人以及因高強(qiáng)度化療等而導(dǎo)致的免疫受損患者的數(shù)目的增加，機(jī)會(huì)感染的管理變得比以往更重要。由假絲酵母(Candida)、曲霉菌(Aspergillus)、隱球菌(Cryptococcus)等導(dǎo)致的深部真菌感染占這種機(jī)會(huì)感染的一部分，其比例正年復(fù)一年地增加。由眾多無毒細(xì)菌導(dǎo)致的機(jī)會(huì)感染接連發(fā)生的事實(shí)表明，只要存在降低病人免疫功能的疾病，傳染性疾病就不會(huì)終止。盡管在即將到來的老齡社會(huì)中傳染病控制的策略(包括細(xì)菌耐藥性的問題)將是至關(guān)緊要的問題之一，但是目前存在的有效治療藥物還相當(dāng)少。
到目前為止，治療真菌感染的藥物的開發(fā)主要基于下列策略，即通過化學(xué)方法修飾已知的結(jié)構(gòu)來制備新的化合物。但是，由于耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn)等問題，所以迫切需要開發(fā)基于新機(jī)理的新藥物。
考慮到這種狀況，本發(fā)明人瞄準(zhǔn)了治療藥物種類不充分的抗真菌劑領(lǐng)域中的一種新途徑。換言之，本發(fā)明人的工作集中在通過阻止病原體發(fā)揮致病性來影響感染的發(fā)作、發(fā)展和持續(xù)。為了避免感染的建立和發(fā)展，本發(fā)明人認(rèn)為最有效的途徑是抑制對(duì)宿主的粘附(這是感染建立的第一步)，以及隨后的定居。另外，還實(shí)施了一種嶄新的方法，即抑制粘附因子本身的表達(dá)。
為了抑制粘附因子的表達(dá)，本發(fā)明人將其注意力指向如下假設(shè)細(xì)胞壁糖蛋白如粘附因子首先通過GPI(糖基磷脂酰肌醇)-錨定在細(xì)胞膜上，然后再轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞壁上(圖1)。迄今，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)30或更多的細(xì)胞壁糖蛋白(包括粘附配體)是通過GPI-錨定轉(zhuǎn)運(yùn)的(稱之為GPI-錨定蛋白質(zhì))。因此，發(fā)明人想到，如果該轉(zhuǎn)運(yùn)步驟受到抑制，則極有可能抑制粘附因子和構(gòu)成細(xì)胞壁的主要蛋白質(zhì)在細(xì)胞壁上的表達(dá)(Hamada K et al，Mol.Gen.Genet.，25853-59，1998)。已經(jīng)報(bào)道過，GPI-錨定蛋白質(zhì)存在于假絲酵母中，其為一種致病性的真菌(Kapteyn JC et al，Eur.J.Cell Biol.，65402-407，1994)。
本發(fā)明人開始了他們的研究，同時(shí)確信，抑制細(xì)胞壁合成的新抗真菌劑可以通過抑制真菌細(xì)胞膜中存在的GPI-錨定蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞壁的過程來制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是開發(fā)抗真菌劑，該抗真菌劑通過抑制細(xì)胞壁糖蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞壁的裝配及與細(xì)胞的粘附，以及阻止病原體表現(xiàn)出致病性，而體現(xiàn)出抵抗感染發(fā)作、發(fā)展和持續(xù)的作用。
為了篩選抑制GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁之轉(zhuǎn)運(yùn)過程的化合物，本發(fā)明人制備了采用融合蛋白的報(bào)告系統(tǒng)，該融合蛋白包括報(bào)告酶和存在于CWP2(GPI-錨定蛋白質(zhì)之一)的C-末端的轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)(Van Der Vaat JM et al，J.Bacteriol.，1773104-3110，1995)。
構(gòu)建包含分泌信號(hào)基因+報(bào)告酶基因+CWP2 C-末端基因(存在或缺失)的DNA，并在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達(dá)融合蛋白，經(jīng)證實(shí)，當(dāng)CWP2C-末端存在時(shí)，可在細(xì)胞壁中檢測到報(bào)告酶的活性；當(dāng)CWP2C-末端不存在時(shí)，可在培養(yǎng)物上清液中檢測到報(bào)告酶的活性。因此，可以預(yù)言，如果GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程受到試樣的抑制，報(bào)告酶在細(xì)胞壁中的活性將會(huì)減少，或者報(bào)告酶的活性將會(huì)在培養(yǎng)物上清液中發(fā)現(xiàn)。因而，抑制GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程的化合物的篩選是利用該報(bào)告系統(tǒng)開始的。
從采用該報(bào)告系統(tǒng)的篩選中發(fā)現(xiàn)了若干抑制GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程的化合物。有代表性的實(shí)例如式(Ia)所示的化合物。
前述式(Ia)所示的化合物(下文中稱之為“化合物(Ia)”)抑制釀酒酵母和白色假絲酵母(Candida albicans)的生長，而且在前述化合物(Ia)存在下培養(yǎng)的白色假絲酵母表現(xiàn)出弱的粘附到細(xì)胞上的活性。這樣，可以確定前述的化合物(Ia)適于本發(fā)明的最初目的，即基于對(duì)GPI-錨定蛋白質(zhì)向細(xì)胞壁轉(zhuǎn)運(yùn)的系統(tǒng)的抑制，發(fā)現(xiàn)一種因?yàn)橐种普婢掣剿氐谋磉_(dá)而抑制真菌粘附的化合物。此外，通過透射電子顯微鏡觀察可以證實(shí)，在前述化合物(Ia)的存在下培養(yǎng)的白色假絲酵母在其細(xì)胞壁合成中有異常。
本發(fā)明人證實(shí)，采用前述的化合物(Ia)可以制備基于抑制GPI-錨定蛋白質(zhì)向細(xì)胞壁轉(zhuǎn)運(yùn)過程的機(jī)制的抗真菌劑。
此外，為了確定前述化合物(Ia)所作用的目標(biāo)蛋白，本發(fā)明人檢索了賦予前述化合物(Ia)以抗性的基因。
將釀酒酵母基因的質(zhì)粒庫引入釀酒酵母中，并通過過表達(dá)收集對(duì)前述化合物(Ia)表現(xiàn)出抗性的質(zhì)粒。然后克隆抗性基因，測定核苷酸序列，并將該基因命名為GWT1(SEQ ID NO1)。在過表達(dá)GWT1基因產(chǎn)物的釀酒酵母中，具有GPI-錨定蛋白質(zhì)之C-末端的前述報(bào)告酶轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞壁上，即使在前述化合物(Ia)存在時(shí)也是如此。此外，通過透射電鏡觀察證實(shí)，即使存在前述的化合物(Ia)，細(xì)胞壁也是正常的。
而且，當(dāng)將點(diǎn)突變隨機(jī)地引入釀酒酵母染色體組的DNA上，并分離出對(duì)前述化合物(Ia)表現(xiàn)出特異抗性的突變菌株R1和R5時(shí)，在R1突變菌株中發(fā)現(xiàn)涉及GWT1基因第405號(hào)密碼子自GTC變?yōu)锳TC的點(diǎn)突變，以及在R5突變菌株中發(fā)現(xiàn)第140號(hào)密碼子自GGG變?yōu)锳GG的點(diǎn)突變。由于在這些突變的GWT1基因引入GWT1基因已被破壞的菌株時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)前述化合物(Ia)的抗性，所以可以單獨(dú)用GWT1基因來解釋對(duì)該化合物的抗性。因此，這暗示前述化合物(Ia)直接作用于GWT1基因產(chǎn)物，以抑制GWT1蛋白的功能。
通過類似的方法，克隆白色假絲酵母的抗性基因(SEQ ID NO3和5)，測定核苷酸序列，并將該基因命名為CaGWT1。
此外，利用GWT1進(jìn)行數(shù)據(jù)庫同源檢索，揭示了粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的同源物(SEQ ID NO27)。再者，基于釀酒酵母、粟酒裂殖唐酵母和白色假絲酵母的GWT1基因編碼的蛋白質(zhì)中高度保守區(qū)的序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR產(chǎn)生煙曲霉(Aspergillus fumigatus)中的同源物(SEQ ID NO39和41)。而且，基于對(duì)GWT1的數(shù)據(jù)庫同源檢索發(fā)現(xiàn)的序列進(jìn)行PCR，發(fā)現(xiàn)了新形隱球酵母(Cryptococcus neoformans)中的同源物(SEQ ID NO54和58)。
更具體地，本發(fā)明涉及下列內(nèi)容。
1.一種編碼蛋白質(zhì)的DNA，當(dāng)該DNA過量表達(dá)在真菌中時(shí)，所述蛋白質(zhì)具有賦予真菌耐受式(Ia)所示化合物的活性，其中該DNA選自(a)編碼包含SEQ ID NO2，4，6，28，40或59氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，(b)包含SEQ ID NO1，3，5，27，39，41，54或58核苷酸序列的DNA，(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含SEQ ID NO1，3，5，27，39，41，54或58核苷酸序列的DNA雜交的DNA，(d)編碼包含SEQ ID NO2，4，6，28，40或59氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，所述氨基酸序列中，增加、缺失、取代和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸，及(e)利用SEQ ID NO29和31或者SEQ ID NO29和30為引物擴(kuò)增的DNA 2.一種編碼蛋白質(zhì)的DNA，該蛋白質(zhì)因?yàn)樵揇NA的功能缺陷而具有降低真菌細(xì)胞壁中GPI-錨定蛋白質(zhì)的量的活性，其中該DNA選自(a)編碼包含SEQ ID NO2，4，6，28，40或59氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，(b)包含SEQ ID NO1，3，5，27，39，41，54或58核苷酸序列的DNA，(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含SEQ ID NO1，3，5，27，39，41，54或58核苷酸序列的DNA雜交的DNA，
(d)編碼包含SEQ ID NO2，4，6，28，40或59氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，所述氨基酸序列中，增加、缺失、取代和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸，及(e)利用SEQ ID NO29和31或者SEQ ID NO29和30為引物擴(kuò)增的DNA，其中，“嚴(yán)謹(jǐn)條件”是指，例如，在65℃下于4×SSC中進(jìn)行雜交，然后在65℃下于0.1×SSC中洗滌1小時(shí)；或者在另一方法中，“嚴(yán)謹(jǐn)條件”為42℃下于50％甲酰胺中的4×SSC；或者，在65℃下于PerfectHybTM(TOYOBO)溶液中雜交2.5小時(shí)，然后(i)在25℃下于2×SSC，0.05％SDS溶液中洗滌5分鐘，(ii)在25℃下于2×SSC，0.05％SDS溶液中洗滌15分鐘，及(iii)在50℃下于0.1×SSC，0.1％SDS溶液中洗滌20分鐘；“DNA功能缺陷”可以發(fā)生在DNA的功能基因產(chǎn)物未表達(dá)時(shí)或者表達(dá)減少時(shí)，例如利用同源重組技術(shù)嵌入與DNA編碼區(qū)無關(guān)的DNA如選擇標(biāo)記；以及單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用下列任一方法定量源于真菌細(xì)胞壁中GPI-錨定蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的減少(i)反映GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程的報(bào)告系統(tǒng)，(ii)定量細(xì)胞壁中GPI-錨定蛋白質(zhì)的ELISA，(iii)GPI-錨定蛋白質(zhì)活性如附著動(dòng)物細(xì)胞的活性的測量，或者(iv)通過透射電鏡觀察真菌細(xì)胞最外層的絮狀纖維結(jié)構(gòu)。
3.通過項(xiàng)1或2的DNA編碼的蛋白質(zhì)。
4.其中插入了項(xiàng)1或2的DNA的載體。
5.包含項(xiàng)1或2的DNA或者項(xiàng)4的載體的轉(zhuǎn)化體。
6.項(xiàng)5的轉(zhuǎn)化體，其為過量表達(dá)項(xiàng)3的蛋白質(zhì)的真菌。
7.一種真菌，其中項(xiàng)3的蛋白質(zhì)的功能有缺陷。
8.一種制備項(xiàng)3的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括培養(yǎng)項(xiàng)5的轉(zhuǎn)化體，并由該轉(zhuǎn)化體或其培養(yǎng)上清液收集所表達(dá)的蛋白質(zhì)的步驟。
9.一種與項(xiàng)3的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。
10.一種篩選具有抗真菌作用的化合物的方法，其中該方法包括以下步驟(a)使試樣與項(xiàng)3的蛋白質(zhì)接觸；(b)檢測該蛋白質(zhì)與試樣之間的結(jié)合活性；及(c)選取具有與該蛋白質(zhì)結(jié)合活性的化合物。
11.一種篩選具有抗真菌作用的化合物的方法，其中該方法包括以下步驟(a)使試樣與過量表達(dá)項(xiàng)3的蛋白質(zhì)的真菌接觸；(b)檢測GPI-錨定蛋白質(zhì)到真菌細(xì)胞壁上的轉(zhuǎn)運(yùn)量；及(c)選出下述化合物，其使得步驟(b)中所檢測的GPI-錨定蛋白質(zhì)到真菌細(xì)胞壁上的轉(zhuǎn)運(yùn)量比試樣與未過量表達(dá)項(xiàng)3的蛋白質(zhì)接觸時(shí)所檢測到的轉(zhuǎn)運(yùn)量減少，其中，通過檢測細(xì)胞生長速度的降低、膨脹或溫度敏感性，或者通過檢測源于細(xì)胞壁中GPI-錨定蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的減少，優(yōu)選通過檢測源于細(xì)胞壁上GPI-錨定蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的減少，可以檢測因?yàn)樵嚇佣鴮?dǎo)致的轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞壁上的GPI-錨定蛋白質(zhì)的量的降低；而且，利用下列任一方法或其組合，可定量源于真菌細(xì)胞壁中GPI-錨定蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的減少(i)反映GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程的報(bào)告系統(tǒng)，(ii)定量細(xì)胞壁中一類GPI-錨定蛋白質(zhì)的ELISA，(iii)測量GPI-錨定蛋白質(zhì)活性如附著動(dòng)物細(xì)胞的活性，或者(iv)通過透射電子顯微鏡觀察真菌細(xì)胞最外層的絮狀纖維結(jié)構(gòu)。
12.一種具有抗真菌作用的化合物，其是通過項(xiàng)10或11的篩選方法分離的。
13.一種抗真菌劑，其包含抑制GPI-錨定蛋白到真菌細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)的化合物作為活性成分。
14.一種抗真菌劑，其包含項(xiàng)9的抗體或者項(xiàng)12的化合物作為活性成分。
15.項(xiàng)13的抗真菌劑，其包含下列通式(I)所示的化合物或其鹽或其水合物作為活性成分，在式(I)中 [R1a和R2a彼此相同或相異并且單獨(dú)代表氫原子，鹵原子，羥基，硝基，氰基，三氟甲基，三氟甲氧基，取代或未取代的C1-6烷基，C2-6鏈烯基，C2-6炔基，取代或未取代的C1-6烷氧基，或者下式所示的基團(tuán)
(其中X1代表單鍵，羰基，或者式-S(O)2-所示的基團(tuán)；R5a和R6a彼此相同或相異并且代表氫原子或者取代或未取代的C1-6烷基)。而且，R1a和R2a可以一起形成選自下列的稠環(huán)取代或未取代的苯環(huán)，取代或未取代的吡啶環(huán)，取代或未取代的吡咯環(huán)，取代或未取代的噻吩環(huán)，取代或未取代的呋喃環(huán)，取代或未取代的噠嗪環(huán)，取代或未取代的嘧啶環(huán)，取代或未取代的吡嗪環(huán)，取代或未取代的咪唑環(huán)，取代或未取代的唑環(huán)，取代或未取代的噻唑環(huán)，取代或未取代的吡唑環(huán)，取代或未取代的異唑環(huán)，取代或未取代的異噻唑環(huán)，取代或未取代的環(huán)己烷環(huán)，及取代或未取代的環(huán)戊烷環(huán)；R3a和R4a彼此相同或相異并且單獨(dú)代表氫原子，鹵原子，羥基，硝基，氰基，羧基，甲?；?，肟基，三氟甲基，三氟甲氧基，C1-6烷基，C1-6烷氧基，C2-6鏈烯基，C2-6炔基，式-C(O)NR7aR7b(其中R7a和R7b彼此相同或相異并且單獨(dú)代表氫原子，或者C1-6烷基)，式-CO2R7a(其中R7a的定義同上)，式-S(O)nR7a(其中n代表0～2的整數(shù)，R7a的定義同上)，式-S(O)2NR7aR7b(其中R7a和R7b的定義同上)所示的基團(tuán)，下式的基團(tuán) (其中X2代表單鍵，羰基，或者式-S(O)2-所示的基團(tuán)；R5b和R6b彼此相同或相異，并且代表氫原子，取代或未取代的C1-6烷基，或者取代或未取代的C6-14芳基)，或者下式的基團(tuán)-Z1-Z2(其中Z1代表單鍵，氧原子，1，2-亞乙烯基或者亞乙炔基；Z2代表單鍵，或者被0～4個(gè)取代基取代或未取代的C1-6烷基)。R3a和R4a可以共同代表亞甲二氧基，或者1，2-亞乙二氧基，作為選擇，R3a和R4a可以一起形成選自下列的稠環(huán)取代或未取代的苯環(huán)，取代或未取代的吡啶環(huán)，取代或未取代的吡咯環(huán)，取代或未取代的噻吩環(huán)，取代或未取代的呋喃環(huán)，取代或未取代的噠嗪環(huán)，取代或未取代的嘧啶環(huán)，取代或未取代的吡嗪環(huán)，取代或未取代的咪唑環(huán)，取代或未取代的唑環(huán)，取代或未取代的噻唑環(huán)，取代或未取代的吡唑環(huán)，取代或未取代的異唑環(huán)，取代或未取代的異噻唑環(huán)，取代或未取代的環(huán)己烷環(huán)，及取代或未取代的環(huán)戊烷環(huán)，但是R1a和R2a均代表氫原子的情況除外]。
16.項(xiàng)13所述的抗真菌劑，其包含下式的化合物(Ia)作為活性成分 17.通式(II)所示的化合物，或者它的鹽或水合物，在式(II)中， [Ar代表選自式(IIIa)至(IIIf)的取代基 (其中K代表硫原子，氧原子，或者式-NH-所示的基團(tuán)；R1b和R2b彼此相同或相異，并且單獨(dú)代表氫原子，鹵原子，羥基，硝基，氰基，三氟甲基，三氟甲氧基，下式所示的基團(tuán) (其中X3代表單鍵，羰基，或者式-S(O)2-所示的基團(tuán)；R5c和6c彼此相同或相異，并且代表氫原子，或者取代或未取代的C1-6烷基)，或者式-X4-R8a(其中X4代表單鍵，氧原子，或硫原子；R8a代表C1-6烷基，C2-6鏈烯基，C2-6炔基，C3-8環(huán)烷基，或者C3-8環(huán)烯基)所示的基團(tuán)。作為選擇，R1b和R2b可以一起形成亞甲二氧基，或者1，2-亞乙二氧基)；R3b和R4b彼此相同或相異并且單獨(dú)代表氫原子，鹵原子，羥基，硝基，氰基，羧基，甲?；炕?，三氟甲基，三氟甲氧基，C1-6烷基，C1-6烷氧基，C2-6鏈烯基，C2-6炔基，或者下式所示的基團(tuán)-Z1b-Z2b(其中Z1b代表單鍵，1，2-亞乙烯基或亞乙炔基；Z2b代表單鍵，或者被0～4個(gè)取代基取代或未取代的C1-6烷基)；下列情況除外(1)Ar代表前述的式(IIId)，其中R1b和R2b均為氫原子，(2)至少一個(gè)R3b或R4b代表氫原子，而另一個(gè)為氫原子，甲氧基，羥基，甲基，芐氧基，或者鹵原子，及Ar代表前述的式(IIIc)，其中R1b和R2b兩個(gè)均代表氫原子或甲氧基，(3)至少一個(gè)R3b或R4b代表氫原子，而另一個(gè)為氫原子，羥基，甲氧基，或芐氧基，及Ar代表前述的式(IIIc)，其中R1b和R2b兩個(gè)均代表羥基或芐氧基，或者(4)Ar代表前述的式(IIId)，其中R1b為氫原子，且R2b為甲?；u甲基，或者甲氧基羰基]。
18.項(xiàng)17的化合物，或者它的鹽或水合物，其中Ar代表下式 (其中R1c代表氫原子，取代或未取代的C1-6烷基，或芐基)，并且排除R3b代表氫原子時(shí)的情形。
19.通式(IIIc2)所示的化合物，或者它的鹽或水合物，在式(IIIc2)中， [R1b和R2b的定義同上，但下列情況除外(1)R1b代表式R1c-O-(其中R1c的定義同上)所示的基團(tuán)，R2b為氫原子，且R3b代表氫原子，(2)至少一個(gè)R3b或R4b代表氫原子，而另一個(gè)為氫原子，甲氧基，羥基，甲基，芐氧基，或鹵原子，且R1b和R2b兩個(gè)均代表氫原子或甲氧基，或者(3)至少一個(gè)R3b或R4b代表氫原子，而另一個(gè)為氫原子，羥基，甲氧基，或芐氧基，且R1b和R2b兩個(gè)均代表羥基或芐氧基]。
20.項(xiàng)17的抗真菌劑，其具有抗真菌作用。
21.項(xiàng)15的抗真菌劑，其中R3a和R4a至少一個(gè)代表下列各式所示的基團(tuán)式-C(O)NR7aR7b(其中R7a和R7b的定義同上)，式-CO2R7a(其中R7a的定義同上)，式-S(O)nR7a(其中n代表0～2的整數(shù)，R7a定義同上)，式-S(O)2NR7aR7b(其中R7a和R7b的定義同上)，下式 (其中X2，R5b，及R6b的定義同上)，或者被1～4個(gè)取代基取代或未取代的C1-6烷氧基，或者R3a和R4a共同代表亞甲二氧基或1，2-亞乙二氧基。
22.項(xiàng)15所述的抗真菌劑，其中該具有抗真菌作用的化合物為(1)1-芐基異喹啉，(2)1-(4-溴芐基)異喹啉，(3)1-(4-氯芐基)異喹啉，(4)1-(4-氟芐基)異喹啉，(5)1-(4-碘芐基)異喹啉，(6)1-(3-甲基芐基)異喹啉，(7)1-(4-甲基芐基)異喹啉，(8)1-(3，4-二甲基芐基)異喹啉，(9)1-(3-甲氧基芐基)異喹啉，(10)1-(4-甲氧基芐基)異喹啉，(11)1-(3，4-亞甲二氧基芐基)異喹啉，(12)1-(4-芐氧基芐基)異喹啉，(13)1-(4-氰基芐基)異喹啉，(14)1-(4-硝基芐基)異喹啉，(15)1-(4-氨基芐基)異喹啉，(16)1-(4-甲氧基芐基)-6，7-二氯-異喹啉，(17)1-(4-甲氧基-2-硝基-芐基)-異喹啉，(18)1-(4-甲氧基芐基)-6，7-亞甲二氧基-異喹啉，(19)1-(2-氨基4-甲氧基-芐基)異喹啉，(20)1-(4-甲氧基芐基)-7-羥基-6-甲氧基-異喹啉，(21)1-(4-芐氧基芐基)-6，7-二甲氧基-異喹啉，(22)1-(4-甲氧基芐基)6，7-二甲氧基-異喹啉，(23)1(4-甲氧基-2-硝基-芐基)-異喹啉，(24)3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯氧基]丁腈，(25)1-[4-(2，2，3，3-四氟丙氧基)芐基]異喹啉，(26)1-[4-(2-哌啶子基乙氧基)芐基]異喹啉，(27)4-(1-異喹啉基甲基)苯基(2-嗎啉基乙基)醚，(28)1-[4-(2-甲氧基乙氧基)芐基]異喹啉，(29)N-{2-[4-(1-異喹啉基甲基)苯氧基]乙基}-N，N-二甲胺，(30)1-[4-(苯乙氧基)芐基]異喹啉，(31)1-{4-[(2-甲基烯丙基)氧基]芐基}異喹啉，(32)1-(4-異丁氧基芐基)異喹啉，(33)1-[4-(2-苯氧基乙氧基)芐基]異喹啉，(34)2-[4-(1-異喹啉基甲基)苯氧基]乙酸甲酯，(35)2-[4-(1-異喹啉基甲基)苯氧基]-1-乙醇，(36)N-{2-[4-(1-異喹啉基甲基)苯氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯，(37)1-{4-[3-(四氫-2H-2-吡喃氧基)丙氧基]芐基}異喹啉，(38)2-[4-(1-異喹啉基甲基)苯氧基]-1-乙胺，(39)1-[4-(3-哌啶子基丙氧基)芐基]異喹啉，(40)3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯氧基]-1-丙醇，(41)1-[4-(2-乙基丁氧基)芐基]異喹啉，(42)4-[4-(1-異喹啉基甲基)苯氧基]丁酸，(43)1-(4-{3-[(4-芐基哌啶子基)磺?；鵠丙氧基}芐基)異喹啉，(44)1-(4-{3-[4-(4-氯苯基)哌啶子基]丙氧基}芐基)異喹啉，(45)4-(1-異喹啉基甲基)苯胺，(46)N-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]丁酰胺，(47)N-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]丙酰胺，(48)N-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-1-乙磺酰胺，(49)N-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-N-甲基-乙磺酰胺，(50)N-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-N-甲胺，(51)N-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-N-丙胺，或者(52)N-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-N-甲基-N-丙胺。
23.一種治療真菌感染的方法，包括將治療有效量的項(xiàng)13～22中任一項(xiàng)的抗真菌劑給藥于哺乳動(dòng)物。
下面將通過解釋本說明書中所提到的術(shù)語、符號(hào)等的意義，更詳細(xì)地說明本發(fā)明。
在本說明書中，為了方便，化合物的結(jié)構(gòu)式可以代表某些異構(gòu)體，但是，本發(fā)明包括所有的幾何異構(gòu)體，基于不對(duì)稱碳原子的光學(xué)異構(gòu)體，立體異構(gòu)體，源于化合物結(jié)構(gòu)的互變異構(gòu)體，以及各種異構(gòu)體的混合物，本發(fā)明不受為了方便而構(gòu)建的化學(xué)式的代表物的限制，而且可以為各種異構(gòu)體中的任意一種或其混合物。因此，可能存在光活性物質(zhì)和分子中具有不對(duì)稱碳原子的外消旋物質(zhì)，但是在本發(fā)明中沒有特別的限制，并且包括它們中的任何一種。此外，可能存在多晶形現(xiàn)象，對(duì)此同樣沒有任何限制，晶形可以是任何晶形之一或者其混合物，而且可以是無水物或水合物。
此外，本發(fā)明的化合物包括在體內(nèi)代謝之后如在氧化之后，還原之后，水解之后，或者偶聯(lián)之后具有抗真菌作用的化合物。再者，本發(fā)明還包括那些在體內(nèi)代謝之后如氧化之后，還原之后，以及水解之后產(chǎn)生本發(fā)明的化合物的化合物。
本說明書中的“C1-6烷基”是指直鏈或支鏈的烷基，其中碳的數(shù)目為1～6，具體實(shí)例包括甲基，乙基，異丙基，正丙基，正丁基，異丁基，叔丁基，正戊基，異戊基，新戊基，正己基，1-甲基丙基，1，2-二甲基丙基，2-乙基丙基，1-甲基-2-乙基丙基，1-乙基-2-甲基丙基，1，1，2-三甲基丙基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，1，1-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，2-乙基丁基，1，3-二甲基丁基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，等等。
本說明書中的“C2-6鏈烯基”是指直鏈或支鏈的鏈烯基，其中碳的數(shù)目為2～6，具體實(shí)例包括乙烯基，烯丙基，1-丙烯基，異丙烯基，1-丁烯-1-基，1-丁烯-2-基，1-丁烯-3-基，2-丁烯-1-基，2-丁烯-2-基，等等。
本說明書中的“C2-6炔基”是指直鏈或支鏈的炔基，其中碳的數(shù)目為2～6，其具體實(shí)例包括乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，丁炔基，戊炔基，己炔基，等等。
本說明書中的“C1-6烷氧基”是指連接在上面所定義的“C1-6烷基”上的氧基，其具體實(shí)例包括甲氧基，乙氧基，正丙氧基，異丙氧基，正丁氧基，異丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，正戊氧基，異戊氧基，仲戊氧基，叔戊氧基，新戊氧基，1-甲基丁氧基，2-甲基丁氧基，1，1-二甲基丙氧基，1，2-二甲基丙氧基，正己氧基，異己氧基，1-甲基戊氧基，2-甲基戊氧基，3-甲基戊氧基，1，1-二甲基丁氧基，1，2-二甲基丁氧基，2，2-二甲基丁氧基，1，3-二甲基丁氧基，2，3-二甲基丁氧基，3，3-二甲基丁氧基，1-乙基丁氧基，2-乙基丁氧基，1，1，2-三甲基丙氧基，1，2，2-三甲基丙氧基，1-乙基-1-甲基丙氧基，1-乙基-2-甲基丙氧基，等等。
本說明書中的“C6-14芳基”是指芳環(huán)基團(tuán)，其中碳的數(shù)目為6～14，其具體實(shí)例包括苯基，1-萘基，2-萘基，as-indacenyl group，s-indacenyl group，二氫苊基，等等。
本說明書中的“鹵原子”是指氟原子，氯原子，溴原子，及碘原子。
本說明書中的“取代或未取代的”是指“可取代的位置上可以具有一個(gè)或多個(gè)取代基的任意組合”，具體的取代基的實(shí)例包括氫原子，鹵素，硝基，氰基，羥基，巰基，羥烷基，羧基，C1-6烷氧基羰基，C2-7酰氨基，C1-6烷氨基，吡啶基，C1-6烷基亞磺酰基，C1-6烷基磺?；?，C1-6烷基氨磺?；?，C1-6烷基氨亞磺酰基，C1-6烷基氨次磺酰基(sulfenamoyl)，四氫吡喃基，C1-6烷基氨甲?；?，或者式-X4-R8a(其中X4代表單鍵，氧原子或硫原子；R8a代表C1-6烷基，C2-6鏈烯基，C2-6炔基，C6-14芳基，C3-8環(huán)烷基或C3-8環(huán)烯基)，等等。
“可以被0～4個(gè)取代基所取代”與“可取代的位置上可以具有1～4個(gè)取代基的任意組合”的意義相同，且取代基的定義同上。
本發(fā)明中的“鹽”是指藥學(xué)上可接受的鹽，并且沒有任何特殊的限制，只要該鹽是與本發(fā)明的化合物形成的加成鹽，且其優(yōu)選實(shí)例為鹵族酸鹽如氫氟化物，氫氯化物，氫溴化物，及氫碘化物；無機(jī)酸鹽如硫酸鹽，硝酸鹽，高氯酸鹽，磷酸鹽，碳酸鹽，及碳酸氫鹽；有機(jī)羧酸鹽如乙酸鹽，草酸鹽，馬來酸鹽，酒石酸鹽，及富馬酸鹽；有機(jī)磺酸鹽如甲磺酸鹽，三氟甲磺酸鹽，乙磺酸鹽，苯磺酸鹽，甲苯磺酸鹽，及樟腦磺酸鹽；氨基酸鹽如天門冬氨酸鹽，及谷氨酸鹽；胺鹽如三甲胺鹽，三乙胺鹽，普魯卡因鹽，吡啶鹽，及苯乙基苯甲基胺鹽；堿金屬鹽如鈉鹽，及鉀鹽；堿土金屬鹽如鎂鹽和鈣鹽；等等。
在下文中將要描述1.獲得參與細(xì)胞壁合成的蛋白質(zhì)的編碼DNA的方法，2.檢查試樣是否影響GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程的方法，以及3.獲得本發(fā)明的前述化合物(Ia)的方法。
1.獲得參與細(xì)胞壁合成的蛋白質(zhì)的編碼DNA的方法下文中將描述(1)獲得編碼蛋白質(zhì)的DNA的方法，所述蛋白質(zhì)通過在真菌中過表達(dá)而賦予對(duì)前述化合物(Ia)的抗性；(2)獲得在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的DNA雜交的DNA的方法；(3)基于同源檢索獲得編碼參與真菌細(xì)胞壁合成的蛋白質(zhì)的DNA的方法；及(4)獲得過表達(dá)或者缺乏賦予對(duì)前述化合物(Ia)的抗性所需的蛋白的真菌的方法。
(1)獲得編碼蛋白質(zhì)的DNA的方法，所述蛋白質(zhì)通過在真菌中過表達(dá)而賦予對(duì)前述化合物(Ia)的抗性這里，“真菌”是指屬于接合菌門(Zygomycota)，子囊菌門(Ascomycota)，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)及半知菌門(Deuteromycota)的真菌。優(yōu)選的真菌為致病性真菌，毛霉菌(Mucor)，糖酵母屬(Saccharomyces)，假絲酵母屬(Candida)，隱球酵母屬(Cryptococcus)，絲孢酵母屬(Trichosposon)，鱗斑霉屬(Malassezia)，曲霉屬(Aspergillus)，發(fā)癬菌屬(Trichophyton)，小孢子菌屬(Microsporum)，孢子絲菌屬(Sporothrix)，芽生菌屬(Blastmyces)，球孢菌屬(Coccidioides)，副球孢子菌屬(Paracoccidioides)，青霉屬(Penicillinium)或鐮孢屬(Fusarium)，更優(yōu)選的真菌為白色假絲酵母，C.glabrata，新形隱球酵母或煙曲霉。便于進(jìn)行遺傳分析的釀酒酵母和粟酒裂殖唐酵母，也是優(yōu)選的菌株。
將真菌基因的質(zhì)粒庫引入真菌中?？梢杂葾TCC(ATCC的信息編號(hào)為37323)得到釀酒酵母和粟酒裂殖唐酵母的質(zhì)粒庫，而白色假絲酵母的質(zhì)粒庫則可以根據(jù)Navaro-Garcia，F(xiàn).et al，Mol.Cell.Biol.，152197-2206，1995的方法來制備。將所得的質(zhì)粒庫通過Gietz，D.et al，Nucl.Acids Res.201425，1992的方法引入真菌中。作為選擇，可以使用例如YEASTMAKERTM酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(Clontech)等試劑盒。
在前述化合物(Ia)的存在下培養(yǎng)其中引入了質(zhì)粒庫的真菌。具體地，在包含濃度為1.56～25μg/ml，優(yōu)選為1.56～6.25μg/ml，更優(yōu)選為3.125μg/ml的前述化合物(Ia)的瓊脂培養(yǎng)基中接種已經(jīng)引入了質(zhì)粒庫的真菌，培養(yǎng)適當(dāng)長的時(shí)間，即在30～42℃培養(yǎng)2～5天，或優(yōu)選在37℃培養(yǎng)3天。在包含前述化合物(Ia)的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)通過增殖形成的菌落，并由增殖的真菌細(xì)胞中提純質(zhì)粒。質(zhì)粒的提純可以根據(jù)例如METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.194169-182(1991)的方法來進(jìn)行。
優(yōu)選直接測定所得質(zhì)粒的核苷酸序列，但是如果需要，可以克隆至適于核苷酸序列測定的載體例如pBluescript II及pUC19中，然后再完成核苷酸序列的測定。核苷酸序列可以根據(jù)例如ABI177系統(tǒng)(PE applied Biosystems)手冊的方法進(jìn)行測定。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，全部27個(gè)獨(dú)立獲得的釀酒酵母菌落，以及30個(gè)白色假絲酵母菌落中的28個(gè)菌落均包含本發(fā)明的DNA。只有一個(gè)賦予對(duì)前述化合物(Ia)的抗性的基因存在于這些真菌中，而且該基因可以通過前述的方法而得到。
(2)獲得在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的DNA雜交的DNA的方法根據(jù)本發(fā)明，獲得編碼參與真菌細(xì)胞壁合成的蛋白質(zhì)的DNA的方法包括以釀酒酵母染色體組的DNA為模板，由SEQ ID NO1的核苷酸序列的信息設(shè)計(jì)引物，或者以白色假絲酵母染色體組的DNA為模板，由SEQ IDNO3或SEQ ID NO5的核苷酸序列的信息設(shè)計(jì)引物，然后進(jìn)行PCR，并將擴(kuò)增的DNA克隆到適宜的載體如pBlueScript中。按照將要擴(kuò)增的區(qū)域的需要設(shè)計(jì)引物，優(yōu)選長度為15個(gè)或更多個(gè)堿基對(duì)(bp)，更優(yōu)選為20個(gè)或更多個(gè)堿基對(duì)，且某些情況下，可以增加后續(xù)DNA構(gòu)建所必需的序列(如限制酶位點(diǎn))。PCR的條件可以根據(jù)引物長度、將要擴(kuò)增的區(qū)域的長度及將要使用的DNA模板的量等因素而適當(dāng)?shù)卮_定。例如，編碼真菌中參與細(xì)胞壁合成的蛋白的DNA可以采用200ng的白色假絲酵母染色體組DNA為模板，采用SEQ ID NO21和SEQ ID NO22為引物，在94℃4分鐘→(94℃30秒→68℃5分鐘)×35循環(huán)→72℃4分鐘的條件下得到。
通過PCR得到的DNA可以用作獲得其它類型真菌DNA的探針，該其它類型的真菌DNA與編碼參與細(xì)胞壁之合成的蛋白的DNA具有同源性。具體地，例如，為了獲得編碼參與釀酒酵母細(xì)胞壁合成的蛋白質(zhì)的白色假絲酵母的同源基因，可以采用釀酒酵母的染色體組DNA為模板，并以通過PCR得到的DNA為探針，由白色假絲酵母的基因組文庫或eDNA文庫克隆出在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的DNA。這里，嚴(yán)謹(jǐn)條件是指例如在65℃于4×SSC中雜交，然后在0.1×SSC中于65℃洗滌1小時(shí)。此外，另一嚴(yán)謹(jǐn)條件是指42℃于50％甲酰胺中的4×SSC。作為選擇，下列條件也是允許的，例如在65℃于PerfectHybTM(TOYOBO)溶液中雜交2.5小時(shí)，然后1)在25℃于2×SSC，0.05％SDS溶液中洗滌5分鐘，2)在25℃于2×SSC，0.05％SDS溶液中洗滌15分鐘，及3)在50℃于0.1×SSC，0.1％SDS溶液中洗滌20分鐘。
通過Southern印跡分析，本發(fā)明的實(shí)施例證實(shí)，白色假絲酵母中僅有一種基因與SEQ ID NO1的DNA雜交，并且示出了對(duì)該基因的克隆。從上述方法，可以得到與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3雜交的DNA。
(3)基于同源檢索獲得編碼參與真菌細(xì)胞壁合成的蛋白質(zhì)的DNA的方法本發(fā)明揭示了釀酒酵母，白色假絲酵母，粟酒裂殖唐酵母，煙曲霉，及新形隱球酵母的GWT1同源物。據(jù)認(rèn)為，這些基因中的保守區(qū)對(duì)于GWT1基因產(chǎn)物展示其功能是重要的，并且可以在其它真菌中也是保守的。
因此，編碼參與真菌細(xì)胞壁合成的蛋白質(zhì)的DNA可以根據(jù)下列方法得到基于保守區(qū)的氨基酸序列構(gòu)建探針再實(shí)施雜交，或者根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物再實(shí)施PCR。PCR引物可以具有任何序列，只要將其設(shè)計(jì)成編碼保守區(qū)即可，但是優(yōu)選SEQ ID NO29和31或者優(yōu)選SEQ ID NO29和30。
此外，作為另一種方法，編碼參與真菌細(xì)胞壁合成的蛋白質(zhì)的DNA可以通過下列方法得到在登記于數(shù)據(jù)庫中的基因片段中找出與GWT1同源的核苷酸序列，然后根據(jù)該核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，采用cDNA或染色體組DNA進(jìn)行PCR。
根據(jù)所得序列獲得全長基因的PCR方法的實(shí)例包括如3′-RACE，5′-RACE，以及反向PCR等技術(shù)，也可以通過雜交選擇包含鄰接序列的克隆。全長基因可以通過組合這些技術(shù)而得到。
(4)獲得過表達(dá)或者缺乏賦予對(duì)前述化合物(Ia)的抗性所需的蛋白的真菌的方法過量表達(dá)賦予對(duì)本發(fā)明前述化合物(Ia)的抗性的蛋白質(zhì)的真菌，優(yōu)選釀酒酵母，可以通過將表達(dá)該蛋白的表達(dá)載體插入真菌染色體的特定位置上的方法而得到，例如其中SEQ ID NO1的DNA與啟動(dòng)子的下游相連的表達(dá)載體，該啟動(dòng)子可以強(qiáng)制地將蛋白質(zhì)表達(dá)在真菌中，優(yōu)選芽殖酵母烯醇酶基因(ENO1)的啟動(dòng)子。插入法可以通過如下步驟進(jìn)行例如將所需的序列插到pRS304(Sikorski RS et al，Genetics.122(1)19-27，1989)的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建用于整合的載體，并將該載體引入真菌中。詳見METHODS INENZYMOLOGY Vol.194281-301(1991)。
此外，過量表達(dá)的白色假絲酵母菌株可以通過將SEQ ID NO3或SEQID NO5的基因引入白色假絲酵母的表達(dá)載體如pCARS1和pRM1(Pla J etal，Yeast 121677-1702，1996)中，然后轉(zhuǎn)化白色假絲酵母(Sanglard D et al，Antimicrobiol.Agents Chemother.402300-2305，1996)而得到。
本發(fā)明的缺乏賦予對(duì)前述化合物(Ia)的抗性的基因的真菌，優(yōu)選釀酒酵母，可以通過下列方法得到，但并不僅限于下列方法。
利用標(biāo)記基因(優(yōu)選粟酒裂殖唐酵母的his5基因)作模板，采用引物來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物被設(shè)計(jì)成使得PCR產(chǎn)物包含將要缺失的基因(在釀酒酵母的情況中，為SEQ ID NO1的基因序列)兩端30個(gè)堿基對(duì)或更多，優(yōu)選40個(gè)堿基對(duì)或更多。PCR產(chǎn)物可以提純并引入到真菌中，然后在對(duì)應(yīng)于標(biāo)記基因的選擇培養(yǎng)基(如對(duì)應(yīng)于his5的his-)中培養(yǎng)，得到缺失菌株。
此外，通過慣常方法，基于SEQ ID NO3或SEQ ID NO5的核苷酸序列信息，用hisG-URA3-hisG表達(dá)盒(Fonzi WA et al，Genetics 134717-728，1993)得到白色假絲酵母的缺失菌株。
2.檢查試樣是否影響GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程的方法通過下列方法可以確定試樣是否抑制GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，或者試樣是否抑制GPI-錨定蛋白質(zhì)在真菌表面的表達(dá)(1)一種利用了報(bào)告酶的方法，(2)一種利用了與真菌細(xì)胞壁表面糖蛋白反應(yīng)的抗體的方法，(3)檢查對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的粘附活性的方法，及(4)采用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡觀察真菌的方法。
利用下述(1)～(4)的方法，優(yōu)選利用(1)～(4)的方法的組合來判斷試樣是否抑制GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程或者GPI-錨定蛋白質(zhì)在真菌表面的表達(dá)。此外，當(dāng)由本發(fā)明的DNA編碼的蛋白質(zhì)過量表達(dá)于真菌中時(shí)，在抑制程度減小或不再能觀察到抑制的情況下，可以判定試樣影響GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。
下面將描述方法(1)～(4)。
(1)采用報(bào)告酶進(jìn)行的方法GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程可通過示蹤實(shí)驗(yàn)定量如用放射性同位素標(biāo)記GPI-錨定蛋白質(zhì)，然后對(duì)真菌細(xì)胞壁級(jí)分進(jìn)行分離，與GPI-錨定蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。也可以用另一種方法更簡便的定量表達(dá)由各種GPI-錨定蛋白質(zhì)中常見的、被認(rèn)為起轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)作用的C-末端序列與便于測量的酶(報(bào)告酶)形成的融合蛋白，對(duì)真菌細(xì)胞壁級(jí)分進(jìn)行分離，然后采用報(bào)告系統(tǒng)測量每一級(jí)分的酶活性(Van Berkel MAA et al，F(xiàn)EBS Letters，349135-138，1994)。在下文中，將要解釋一種采用報(bào)告酶進(jìn)行的方法，但是本發(fā)明并不僅限于此。
首先，構(gòu)建報(bào)告基因并將其引入真菌中。報(bào)告基因是這樣構(gòu)建的連接能在真菌中起作用的啟動(dòng)子序列，然后依次連接編碼信號(hào)序列、報(bào)告酶和GPI-錨定蛋白質(zhì)C-末端序列的DNA，使得讀框匹配。啟動(dòng)子序列的實(shí)例包括如GAL10及ENO1等啟動(dòng)子的那些序列。信號(hào)序列的實(shí)例包括如α-因子，轉(zhuǎn)化酶，溶菌酶等的序列。報(bào)告酶的實(shí)例是β-內(nèi)酰胺酶，溶菌酶，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶等?？梢允褂靡子跈z出的綠色熒光蛋白(GFP)，即便它不具有酶活性。GPI-錨定蛋白質(zhì)C-末端序列的實(shí)例是α-凝集素C-末端序列，CWP2 C-末端序列等。此外，優(yōu)選將適宜的選擇標(biāo)記物如LEU2和URA3插到包含所構(gòu)建的報(bào)告基因的載體中。
將所構(gòu)建的報(bào)告基因通過適宜的方法插到真菌中，如乙酸鋰方法(GietzD et al，Nucl.Acids Res.201425，1992)，并且在需要時(shí)通過適于選擇標(biāo)記物的方法(如適于LEU2的Leu-培養(yǎng)基，以及適于URA3的Ura-培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)，然后挑選其中引入了DNA的真菌。
通過下列方法檢查試樣是否影響GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。
在試樣存在時(shí)，于適宜的條件下(如30℃48小時(shí))培養(yǎng)引入了報(bào)告基因的真菌。培養(yǎng)之后，離心分離培養(yǎng)物上清液，并測量培養(yǎng)物上清液級(jí)分的報(bào)告酶活性。洗滌剩余的細(xì)胞級(jí)分，然后通過適當(dāng)?shù)姆椒ǚ蛛x細(xì)胞壁成分，例如用葡聚糖酶降解細(xì)胞壁的葡聚糖，然后測量細(xì)胞壁級(jí)分和細(xì)胞質(zhì)級(jí)分的報(bào)告酶活性。該試驗(yàn)可以如下簡單地進(jìn)行通過離心分離，然后在不洗滌細(xì)胞的情況下按比例計(jì)算來源于培養(yǎng)物上清液級(jí)分但殘留在細(xì)胞級(jí)分中的報(bào)告酶的量，從細(xì)胞級(jí)分的報(bào)告酶的量中減去此量，從而確定細(xì)胞級(jí)分中報(bào)告酶的量。
如果證實(shí)試樣具有增加培養(yǎng)物上清液級(jí)分中報(bào)告酶活性的活性(活性/細(xì)胞)，或者具有降低細(xì)胞壁級(jí)分中報(bào)告酶活性的活性(活性/細(xì)胞)，那么就可以判定試樣對(duì)GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程有影響。
(2)采用與真菌細(xì)胞壁表面糖蛋白反應(yīng)的抗體進(jìn)行的方法對(duì)于試樣是否影響GPI-錨定蛋白質(zhì)在真菌表面層的表達(dá)，可以通過采用與所述蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體定量真菌細(xì)胞壁中的GPI-錨定蛋白質(zhì)來檢測。
例如，可以由GPI-錨定蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測抗體的抗原決定簇，所述GPI-錨定蛋白質(zhì)的實(shí)例如α-凝集素，Cwp2p及Als1p(Chen MH et al，J.Biol.Chem.，27026168-26177，1995；Van Der Vaat JM et al，J.Bacteriol.，1773104-3110，1995；Hoyer LL et al，Mol.Microbiol.，1539-54，1995)，合成該區(qū)的肽，將其與具有抗原性的物質(zhì)如載體蛋白結(jié)合，然后可以通過免疫兔子等得到多克隆抗體，也可以通過免疫小鼠等得到單克隆抗體。更優(yōu)選家兔的針對(duì)Als1p肽的多克隆抗體。
在可供選擇的方法中，可以通過用真菌(優(yōu)選過量表達(dá)如α-凝集素，Cwp2p及Als1p等GPI-錨定蛋白質(zhì)的真菌)免疫小鼠等獲得抗GPI-錨定蛋白質(zhì)的單克隆抗體，在某些情況下，可以用部分純化GPI-錨定蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫，并通過ELISA，Western印跡分析等選擇經(jīng)融合產(chǎn)生的克隆。
通過下列方法可以檢查試樣是否影響GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，以及試樣是否減少來源于細(xì)胞壁中GPI-錨定蛋白質(zhì)的蛋白量。
在試樣存在時(shí)，于適宜的條件下(如30℃48小時(shí))培養(yǎng)真菌。通過離心法收集所培養(yǎng)的真菌并將細(xì)胞破碎，優(yōu)選采用玻璃珠。優(yōu)選用SDS離心提取洗滌過的破碎細(xì)胞，然后洗滌沉淀物。提取之后，用降解葡聚糖的酶，優(yōu)選葡聚糖酶處理破碎的細(xì)胞，其經(jīng)過離心處理的上清液即為GPI-錨定蛋白質(zhì)樣品。
將抗-Als1p肽的抗體通過4℃培養(yǎng)過夜而包被在96-孔板上。用洗滌溶液，優(yōu)選含0.05％Tween 20的PBS(PBST)，洗滌之后，用封閉96-孔板非特異性吸附位點(diǎn)的試劑，優(yōu)選BSA和明膠等蛋白質(zhì)，更優(yōu)選BlockAce進(jìn)行封閉。用洗滌溶液，優(yōu)選PBST，再次洗滌之后，有時(shí)在加入適當(dāng)稀釋的GPI-錨定蛋白質(zhì)樣品之后，在室溫進(jìn)行適當(dāng)長時(shí)間如2小時(shí)的反應(yīng)。用洗滌溶液，優(yōu)選PBST，洗滌之后，使對(duì)抗酶標(biāo)記的白色假絲酵母的抗體，優(yōu)選HRP-標(biāo)記的抗-假絲酵母抗體，在室溫反應(yīng)適當(dāng)長的時(shí)間如2小時(shí)。標(biāo)記方法可以是酶標(biāo)記法或放射性同位素標(biāo)記法。用洗滌溶液，優(yōu)選PBST，洗滌之后，通過適于標(biāo)記類型即酶標(biāo)記的方法計(jì)算GPI-錨定蛋白質(zhì)樣品中Als1p的量，加入底物溶液，然后終止反應(yīng)，測量在490nm處的吸光度。
(3)檢查對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的粘附活性的方法通過測量真菌細(xì)胞壁中GPI-錨定蛋白質(zhì)的活性，優(yōu)選通過測量真菌對(duì)動(dòng)物細(xì)胞等的粘附活性，可以檢查試樣是否影響GPI-錨定蛋白質(zhì)在真菌表面的表達(dá)。除了參與粘附動(dòng)物細(xì)胞的Als1p，Hwp1p等之外，參與交配的α-凝集素，參與酵母聚集的Flo1p等也稱作GPI-錨定蛋白質(zhì)。在下文中，將詳細(xì)解釋采用真菌對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的粘附活性進(jìn)行檢測的方法，但是本發(fā)明并不僅限于此。
真菌選用對(duì)細(xì)胞具有粘附活性的真菌，優(yōu)選的真菌為白色假絲酵母。哺乳動(dòng)物細(xì)胞采用粘附真菌的細(xì)胞，優(yōu)選小腸上皮細(xì)胞。培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞并通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ缫掖脊潭ǚ▽⑵涔潭?。接種試樣和已經(jīng)培養(yǎng)適當(dāng)長時(shí)間(如30℃培養(yǎng)48小時(shí))的真菌，培養(yǎng)一定長的時(shí)間(如在30℃培養(yǎng)1小時(shí))之后，移出培養(yǎng)物上清液，用緩沖液洗滌，加載至瓊脂培養(yǎng)基，如SabouraudDextrose Agar培養(yǎng)基(Difco)。在30℃培養(yǎng)過夜之后，計(jì)數(shù)菌落的數(shù)目，并計(jì)算粘附率。
如果觀察到一種試樣使真菌粘附細(xì)胞而形成的菌落數(shù)目與未經(jīng)該試樣處理的真菌相比降低，則可以判定該試樣已經(jīng)影響了GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。
(4)采用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡觀察真菌的方法可以通過用電子顯微鏡觀察真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)來檢查試樣是否影響GPI-錨定蛋白質(zhì)在真菌表面的表達(dá)。
在試樣存在的條件下，將真菌如白色假絲酵母培養(yǎng)一定長的時(shí)間，例如30℃培養(yǎng)48小時(shí)，用透射電子顯微鏡觀察超精細(xì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。這里，采用透射電子顯微鏡進(jìn)行的觀察可以通過例如根據(jù)Electron Microscope ChartManual(Medical Publishing Center)的方法來進(jìn)行。據(jù)認(rèn)為，具有高電子密度且通過透射電子顯微鏡顯像可以觀察到的真菌細(xì)胞最外層絮狀纖維結(jié)構(gòu)是具有GPI-錨定蛋白質(zhì)作為其構(gòu)成成分的表面糖蛋白層，它不受其它現(xiàn)有抗真菌劑的影響。與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，當(dāng)真菌細(xì)胞最外層的這種絮狀纖維結(jié)構(gòu)(其具有高電子密度)消失，留下具有高電子密度的微層時(shí)，可以判定所述試樣已經(jīng)影響GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。
當(dāng)在透射電子顯微鏡以及光學(xué)顯微鏡下觀察到真菌細(xì)胞大量溶脹且出芽(分裂)受到抑制的圖像時(shí)，可以判定試樣對(duì)細(xì)胞壁有影響。
下面式(I)所示的本發(fā)明的化合物 (其中各符號(hào)的定義同上)可以采用目前已知的常規(guī)有機(jī)化學(xué)反應(yīng)來合成。例如，它可以通過下列方法來合成。
制備方法(1) 在上面各式中，X為離去基團(tuán)如鹵素基團(tuán)和?；?。R3c的定義與R3a相同。式中其它符號(hào)的定義同上。
步驟A1制備Reissert化合物(V)的方法。該化合物可以根據(jù)文獻(xiàn)中的反應(yīng)條件來制備，如Org.Synth.，VI，115(1988)；Heterocycles，36(11)，2489(1993)；J.Chem.Soc.(C)，666(1969)；或者J.Heterocycl.Chem.，29(5)，1165(1992)。具體地，反應(yīng)物為例如苯甲酰氯與氰化鉀的組合。
步驟A2烷基化步驟?；衔?VI)可以通過化合物(V)與取代的苯甲基鹵衍生物，取代的甲磺酸芐酯衍生物等在堿的存在下進(jìn)行反應(yīng)而制備。所述堿的具體實(shí)例包括氫化鈉，氫氧化鈉。
步驟A3水解反應(yīng)步驟?；衔?I)可以通過在堿的存在下水解化合物(VI)來制備。
方法A是通過步驟A1，步驟A2，及步驟A3制備化合物(I)的方法。
步驟B1將化合物(V)轉(zhuǎn)化成化合物(VII)的步驟。化合物(VII)可以通過化合物(V)與取代的苯甲醛在堿和相轉(zhuǎn)移催化劑的存在下反應(yīng)來制備。所述堿的實(shí)例包括氫氧化鈉和氫氧化鉀。所述相轉(zhuǎn)移催化劑的實(shí)例包括三乙基芐基氯化銨。
步驟B2將醇氧化成酮的步驟。酮衍生物(VIII)可以采用醇到酮的氧化反應(yīng)中常用的氧化劑和反應(yīng)條件來制備。具體地，氧化劑為例如二氧化錳，二氧化鉻，或者苯醌。
步驟B3將酮還原成亞甲基的步驟。亞甲基衍生物(I)可以采用酮衍生物(VIII)到亞甲基衍生物(I)的還原反應(yīng)中常用的還原劑組合來制備。所述還原劑組合的實(shí)例包括水合肼與氫氧化鈉或氫氧化鉀，和三乙基硅烷與三氟化硼，或三氟甲磺酸。
方法B是通過步驟A1，步驟B1，步驟B2，及步驟B3制備化合物(I)的方法。
步驟C1羥基鹵化或?；牟襟E?；衔?IX)可以通過鹵化劑或酰化劑與化合物(VII)的反應(yīng)來制備。鹵化劑的實(shí)例包括亞硫酰氯，濃鹽酸，及三溴化磷。此外，?；瘎┑膶?shí)例包括酰鹵如乙酰氯和酸酐如乙酸酐。
步驟C2
鹵素基團(tuán)或?；倪€原性消除反應(yīng)步驟?；衔?I)可以通過例如采用催化劑進(jìn)行化合物(IX)的氫消除反應(yīng)來制備。
所述催化劑的實(shí)例包括鈀-碳。
方法C是通過步驟A1，步驟B1，步驟C1，及步驟C2制備化合物(I)的方法。
制備方法(2)式(I)所示的本發(fā)明的化合物還可以通過下面的方法來合成。
式中，X為離去基團(tuán)如鹵素基團(tuán)和?；Ｆ渌?hào)的定義同上。
步驟D1進(jìn)行Grignard反應(yīng)及隨后的酸水解反應(yīng)的步驟。化合物(VIII)可以通過化合物(X)與取代或未取代的苯基Grignard試劑反應(yīng)，然后在酸存在下水解來制備。
步驟D2亞甲基衍生物(I)可以由酮衍生物(VIII)按類似于步驟B3的條件來制備。
方法D是通過步驟D1和步驟D2制備化合物(I)的方法。
步驟E1酮到醇的還原反應(yīng)步驟?；衔?VII)可以從化合物(VIII)開始，采用酮到醇的還原反應(yīng)中常用的還原劑和反應(yīng)條件來制備。所述還原劑的具體實(shí)例包括硼氫化鈉和氫化鋁鋰。
步驟E2在類似于步驟C1的條件下，鹵化或酰化的衍生物(IX)可以由醇衍生物(VII)來制備。
步驟E3在類似于步驟C2的還原性消除反應(yīng)的條件下，化合物(I)可以由化合物(IX)來制備。
方法E是通過步驟D1，步驟E1，步驟E2，及步驟E3制備化合物(I)的方法。
制備方法(3)式(I)所示的本發(fā)明的化合物還可以通過下面的方法來合成。
式中各符號(hào)的定義同上。
步驟F1氯化反應(yīng)步驟?；衔?XII)可以通過化合物(XI)與氯化試劑反應(yīng)來制備。氯化試劑的實(shí)例包括三氯氧磷和亞硫酰氯。
步驟F2與Grignard試劑偶聯(lián)反應(yīng)的步驟?；衔?I)可以通過化合物(XII)與取代或未取代的芐基Grignard試劑在催化劑存在下反應(yīng)來制備，反應(yīng)條件依據(jù)文獻(xiàn)如Arch.Pharm，314，156(1981)。所述催化劑的實(shí)例包括[1，1′-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯合鎳(II)。
方法F是通過步驟F1和步驟F2制備化合物(I)的方法。
制備方法(4)式(I)所示的本發(fā)明的化合物可以通過下列方法來合成，該化合物中的R1a和R2a一起形成如苯環(huán)，吡啶環(huán)，吡咯環(huán)，噻吩環(huán)，呋喃環(huán)，環(huán)己烷環(huán)或者環(huán)戊烷環(huán)等稠環(huán)的。
式中各符號(hào)的定義同上。
其中形成異喹啉環(huán)的制備方法示例如下。
步驟G1進(jìn)行縮合反應(yīng)及隨后的還原反應(yīng)的步驟。化合物(XIV)可以通過取代或未取代的苯甲醛衍生物(XIII)與硝基甲烷之間的縮合反應(yīng)，以及隨后的硝基還原反應(yīng)來制備。還原硝基所使用的試劑的實(shí)例包括鈀-碳與甲酸銨的組合，以及氫化鋁鋰。
步驟G2形成酰胺鍵的反應(yīng)。化合物(XV)可以利用酰胺鍵形成反應(yīng)的偶聯(lián)試劑通過化合物(XIV)與取代或未取代的苯乙酰氯反應(yīng)而制備。所述偶聯(lián)試劑的實(shí)例包括N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的組合，N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺與N-羥基苯并三唑的組合，以及1，1′-羰基二咪唑。
步驟G3環(huán)化反應(yīng)步驟?；衔?XV)可以根據(jù)文獻(xiàn)中的反應(yīng)條件來制備，所述文獻(xiàn)如Organic Reaction，6，74(1951)；J.Hetetocyclic Chem.，30，1581(1993)。該反應(yīng)的試劑的實(shí)例包括三氯氧磷和多聚磷酸。
方法G是通過步驟G1，步驟G2，及步驟G3制備化合物(I)的方法。
制備方法(5-1)替換通過前述制備方法合成的化合物(I)的取代基R3a或R4a(5-1)用氨基，酰胺基，磺酰胺基等替換所述取代基。
式中各符號(hào)的定義同上。
步驟H1硝基的還原反應(yīng)?；衔?XVII)可以利用還原硝基常用的方法，通過還原化合物(XVI)來制備。所述還原方法的實(shí)例為鈀-碳或氫氧化鈀催化的氫化還原，以及通過鐵-氯化銨、鐵-鹽酸、鐵-乙酸等進(jìn)行的還原。
步驟H2進(jìn)行?；蚧酋；磻?yīng)的步驟?；衔?XVIII)可以通過用酰氯或酸酐處理化合物(XVII)來制備。
方法H是通過步驟H1和步驟H2制備化合物(XVIII)的方法。
式中各符號(hào)的定義同上。
步驟I1還原氨化反應(yīng)步驟?；衔?XX)可以根據(jù)文獻(xiàn)中的反應(yīng)條件由化合物(XIX)與取代或未取代的醛來制備，所述的文獻(xiàn)如J.Am.Chem.Soc.，93，2897(1971)；Comprehensive Organic Synthese，8，25(1991)；Tetrahedron，40，1783(1984)；及Tetrahedron，41，5307(1985)。所述還原氨化試劑的實(shí)例包括三乙酰氧基硼氫化鈉，氰基三硼氫化鈉，硼烷-吡啶復(fù)合物，以及鈀-碳/氫。
步驟I2進(jìn)行?；⒒酋；蜻€原氨化反應(yīng)的步驟。化合物(XXIa)或者化合物(XXIb)可以采用酰氯或酸酐由化合物(XX)制備?；衔?XXIc)可以通過進(jìn)行類似于步驟I1的還原氨化反應(yīng)來制備。
方法I是通過步驟I1和步驟I2制備化合物(XXIa)，化合物(XXIb)，或者化合物(XXIc)的方法。
制備方法(5-2)替換通過前述制備方法合成的化合物(I)的取代基R3a或R4a(5-2)用羥基，烷氧基等替換所述取代基。
式中各符號(hào)的定義同上。
步驟J1化合物(XXIII)可以根據(jù)文獻(xiàn)中的反應(yīng)條件通過去甲基化反應(yīng)由化合物(XXII)來制備，所述文獻(xiàn)如Bull.Chem.Soc.Jpn.，44，1986(1971)；Org.Synth.，Collect.Vol.V，412(1073)；J.Am.Chem.Soc.，78，1380(1956)；或者J.Org.Chem.，42，2761(1977)。在去甲基化反應(yīng)中使用的試劑的實(shí)例包括47％的氫溴酸水溶液，三溴化硼，鹽酸吡啶，以及碘代三甲基硅烷。
步驟J2烷基化反應(yīng)步驟?；衔?XXIV)可以通過化合物(XXIII)與取代或未取代的烷基鹵化物，取代或未取代的甲磺酸烷基酯等在堿存在下的反應(yīng)來制備。
方法J是通過步驟J1和步驟J2制備化合物(XXIV)的方法。
制備方法(5-3)替換通過前述制備方法合成的化合物(I)的取代基R3a或R4a(5-3)用1，2-亞乙烯基，亞乙炔基，烷基等替換所述取代基。
式中各符號(hào)的定義同上。
步驟K1三氟甲磺酰化(triflation)反應(yīng)的步驟。化合物(XXV)可以通過化合物(XXIII)與三氟甲磺酸酐在堿存在下的反應(yīng)來制備。
步驟K2與炔偶聯(lián)反應(yīng)的步驟?；衔?XXVI)可以通過化合物(XXV)與炔衍生物在鈀膦復(fù)合物，碘化銅和堿的存在下的偶聯(lián)來制備。制備該反應(yīng)體系中鈀膦復(fù)合物的試劑的實(shí)例包括鈀-碳與三苯基膦的組合，四(三苯基膦)合鈀(O)與三苯基膦，二氯三苯基膦合鈀(II)，乙酸鈀(II)與三(鄰甲基苯基)膦，以及乙酸鈀(II)與1，1′-雙(二苯基膦)二茂鐵。所述堿的實(shí)例包括三乙胺，哌啶，吡啶，及碳酸鉀。根據(jù)反應(yīng)，還可以使用氯化鋰。
步驟K3進(jìn)行不飽和烴之還原反應(yīng)的步驟?；衔?XXVIIa)或者化合物(XXVIIb)可以通過例如采用催化劑的催化氫化反應(yīng)由化合物(XXVI)來制備。所述催化劑的實(shí)例包括鈀-碳，氫氧化鈀，氧化鈀，及鈀-碳-碳酸鈣。
X denotes a leaving group.such as a halogen group and trifluorosulfonate.
Method L式中各符號(hào)的定義同上。
步驟L1與烯烴之偶聯(lián)反應(yīng)(Heck反應(yīng))的步驟?；衔?XXVIIa)可以根據(jù)文獻(xiàn)反應(yīng)條件利用催化劑(如，鈀絡(luò)合物及其配位體)由化合物(XXVIII)來制備，所述文獻(xiàn)如J.Org.Chem.，37，2320(1972)；Org.Reactions.，27，345(1982)；Comprehensive Organic Synthesis，Vol.4，833(1991)；鈀Reagents andCatalysts，125(1995)；Chem.Commun.，1287(1984)；Tetrahedron Lett，26，2667(1985)；及Tetrahedron Lett，31，2463(1990)。該反應(yīng)所使用的催化劑組合(鈀絡(luò)合物及其配位體)的實(shí)例包括乙酸鈀(II)與1，1′-雙(二苯基膦)二茂鐵，以及乙酸鈀(II)與三(鄰甲基苯基)膦。三級(jí)堿的實(shí)例包括三乙胺，二異丙基乙胺，以及1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]-7-十一碳烯?；衔?XXVIII)中的X代表離去基團(tuán)，如鹵素基團(tuán)和三氟甲磺酰氧基。
步驟L2化合物(XXVIIb)可以根據(jù)類似于步驟K3的不飽和烴還原反應(yīng)的條件由化合物(XXVIIa)來制備。
方法L是通過步驟L1制備化合物(XXVIIa)，然后通過步驟L2制備化合物(XXVIIb)的方法。
式(I)所示的本發(fā)明的化合物的各種異構(gòu)體可以利用普通的分離技術(shù)(例如重結(jié)晶，色譜法等)進(jìn)行純化與分離。
本發(fā)明的化合物或其鹽或其水合物可以直接給藥于哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)。它們還可以通過常規(guī)方法配制成片劑，粉劑，細(xì)粒劑，顆粒劑，包衣片劑，膠囊，糖槳，錠劑，吸入劑，栓劑，注射劑，軟膏劑，眼膏，滴眼劑，滴鼻劑，滴耳劑，泥罨劑，洗劑等，然后給藥。對(duì)于藥物制劑，可以使用藥物制劑常用的助劑(例如，填充劑，粘結(jié)劑，潤滑劑，著色劑，調(diào)味劑，以及需要時(shí)的穩(wěn)定劑，乳化劑，吸收促進(jìn)劑，表面活性劑，pH調(diào)節(jié)劑，防腐劑，抗氧劑等)。藥物制劑可以用常規(guī)方法，通過將通常用作藥劑成分的各組份混合來制備。例如，經(jīng)口的制劑可以如此制備將本發(fā)明的化合物或其藥用鹽與填充劑以及需要時(shí)的粘結(jié)劑，崩解劑，潤滑劑，著色劑，調(diào)味劑等混合，并通過普通方法將該混合物配制成粉劑，細(xì)粒劑，顆粒劑，片劑，包衣片劑，膠囊等。這些組分的實(shí)例包括動(dòng)物脂肪和植物油，如大豆油，牛脂，以及合成甘油酯；烴，如液體石蠟，角鯊烯，以及固體石蠟；酯油，如肉豆蔻酸辛基十二醇酯和肉豆蔻酸異丙酯；高級(jí)醇，如十六醇十八醇混合物以及二十二醇；硅氧烷樹脂；硅油；表面活性劑，如聚氧乙烯脂肪酸酯，山梨聚糖脂肪酸酯，甘油脂肪酸酯，聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，聚氧乙烯硬化的蓖麻油，以及聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物；水溶性大分子，如羥乙基纖維素，聚丙烯酸，羧基乙烯基聚合物，聚乙二醇，聚乙烯基吡咯烷酮，以及甲基纖維素；低級(jí)醇，如乙醇和異丙醇；多元醇，如甘油，丙二醇，二丙二醇，以及山梨醇；糖，如葡萄糖和蔗糖；無機(jī)粉末，如硅酸酐，硅酸鋁鎂，以及硅酸鋁；純水等。填充劑的實(shí)例包括乳糖，玉米淀粉，精制白糖，葡萄糖，甘露醇，山梨醇，結(jié)晶纖維素，以及二氧化硅。粘結(jié)劑的實(shí)例包括聚乙烯醇，聚乙烯醚，甲基纖維素，乙基纖維素，阿拉伯樹膠，黃芪膠，明膠，蟲膠，羥丙基甲基纖維素，羥丙基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙二醇聚氧乙烯嵌段聚合物，以及葡甲胺。崩解劑的實(shí)例包括淀粉，瓊脂，粉狀明膠，結(jié)晶纖維素，碳酸鈣，碳酸氫鈉，檸檬酸鈣，糊精，果膠，以及羧甲基纖維素鈣。潤滑劑的實(shí)例包括硬脂酸鎂，滑石，聚乙二醇，二氧化硅，以及硬化的植物油。著色劑的實(shí)例為那些允許加入藥物中的著色劑。調(diào)味劑的實(shí)例包括可可粉，l-薄荷醇，芳香分散劑，薄荷油，冰片，以及肉桂粉。對(duì)于這些片劑和顆粒劑當(dāng)然可以使用糖衣，必要時(shí)還可使用其它適宜的包衣。此外，液體制劑如糖漿和注射劑可以采用常規(guī)方法通過將pH調(diào)節(jié)劑，穩(wěn)定劑，等滲劑等，以及需要時(shí)的增溶助劑，穩(wěn)定劑等加到本發(fā)明的化合物或其藥用鹽中來制備。制備外用制劑的方法沒有限制，而且可以通過常規(guī)方法來制備。也就是說，用于制劑的基礎(chǔ)材料可以選自藥物、準(zhǔn)藥物、化妝品等常用的各種材料。具體地，可使用的基礎(chǔ)材料的實(shí)例為動(dòng)物脂肪和植物油，礦物油，酯油，蠟，高級(jí)醇，脂肪酸，硅油，表面活性劑，磷脂，醇，多元醇，水溶性大分子，粘土礦，以及純化水。需要時(shí)，可以添加pH調(diào)節(jié)劑，抗氧化劑，螯合劑，防腐劑和抗真菌劑，著色物質(zhì)，香味劑等，但是，本發(fā)明的外用制劑的基礎(chǔ)材料并不僅限于此。再者，如果需要，還可以混入具有不同誘導(dǎo)作用的組分，血流促進(jìn)劑，殺真菌劑，消炎劑，細(xì)胞活化劑，維生素，氨基酸，保濕劑，以及角質(zhì)裂解劑。上述基礎(chǔ)材料按外用制劑常用濃度的量加入。
施用本發(fā)明的化合物或其鹽或其水合物時(shí)，對(duì)其形式?jīng)]有特別的限制，它們可以根據(jù)常用的方法經(jīng)口或經(jīng)非胃腸道途徑給藥。它們可以配制成如片劑，粉劑，細(xì)粒劑，膠囊，糖漿，錠劑，吸入劑，栓劑，注射劑，軟膏劑，眼膏，滴眼劑，滴鼻劑，滴耳劑，泥罨劑，以及洗劑等劑型。本發(fā)明的藥物組合物的劑量可以根據(jù)癥狀輕重、年齡、性別、體重、劑型、鹽的類型、疾病的具體類型等適當(dāng)?shù)剡x擇。
將治愈有效量的本發(fā)明的抗真菌劑給藥于患者。這里，“治療有效量”是指產(chǎn)生所需藥理效果并且有效地恢復(fù)或緩解所要治療的患者之癥狀的藥物量。視患者的體重、疾病類型、癥狀輕重、患者的年齡、性別、對(duì)藥物的敏感性等，上述劑量可以顯著地不同。通常，成人的日劑量為大約0.03～1000mg，優(yōu)選0.1～500mg，更優(yōu)選0.1～100mg，并且每日給藥一次或幾次，或者每若干天給藥一次或幾次。注射劑量一般為約1～3000μg/kg，優(yōu)選為約3～1000μg/kg。


圖1是GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程的示意圖。GPI(糖基磷脂酰肌醇)-錨定蛋白質(zhì)首先錨定在GPI上，然后再轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞壁。
圖2圖示前述化合物(Ia)在釀酒酵母報(bào)告系統(tǒng)中的活性。當(dāng)前述化合物(Ia)以0.39～1.56μg/ml的濃度存在時(shí)，培養(yǎng)物上清液級(jí)分中的頭孢菌素酶活性增加而細(xì)胞壁級(jí)分的此酶活性中降低，當(dāng)濃度為3.13μg/ml或更高時(shí)，則觀察到生長抑制。
圖3圖示前述化合物(Ia)對(duì)白色假絲酵母與動(dòng)物細(xì)胞的粘附的影響。即使在未能觀察到生長抑制的1.56μg/ml濃度下，白色假絲酵母到動(dòng)物細(xì)胞的粘附也有大約一半受到了抑制。
圖4是前述化合物(Ia)對(duì)白色假絲酵母的Als1p抗原量的影響。當(dāng)前述化合物(Ia)以0.1～0.39μg/ml的濃度存在時(shí)，培養(yǎng)物上清液級(jí)分中Als1p抗原量增加而細(xì)胞壁級(jí)分中該抗原量減少。
圖5是用GWT1基因作為探針對(duì)白色假絲酵母基因進(jìn)行Southern印跡分析的照片。經(jīng)EcoRI處理后在6.5kb處，經(jīng)HindIII處理后在4.0kb處，經(jīng)EcoRI-HindIII后處理在2.0kb處，經(jīng)EcoRI-PstI處理后在2.5kb處，都分別觀察到單一泳帶，預(yù)期白色假絲酵母中抗前述化合物(Ia)的抗性基因的同源物以單個(gè)基因的形式存在。
圖6示過量表達(dá)GWT1基因產(chǎn)物的釀酒酵母中，前述化合物(Ia)的活性。在釀酒酵母CW63菌株(圖中的“W/T”)中，即使前述化合物(Ia)在導(dǎo)致培養(yǎng)物上清液級(jí)分中頭孢菌素酶活性增加而細(xì)胞壁級(jí)分中該酶活性降低的濃度下(0.39～1.56μg/ml)，也未在釀酒酵母CW63/GWT1菌株，及釀酒酵母CW63菌株中觀察到這種效果，甚至在導(dǎo)致生長受到抑制的前述濃度(＞3.13μg/ml)下，也未在釀酒酵母CW63/GWT1菌株(圖中的“O/E”)中觀察到生長抑制。
圖7是釀酒酵母，粟酒裂殖唐酵母，及白色假絲酵母的GWT1基因編碼的蛋白質(zhì)中高度保守區(qū)的圖譜。
具體實(shí)施例方式下面將參照實(shí)施例詳細(xì)地說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例A1構(gòu)建報(bào)告基因并將其引入釀酒酵母(1)構(gòu)建溶菌酶為報(bào)告酶的報(bào)告基因用包含ENO1啟動(dòng)子+分泌信號(hào)+溶菌酶基因的pESH質(zhì)粒(IchikawaK et al，Biosci.Biotech.Biochem.，57(10)，1686-1690，1993)作為模板，以SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的寡核苷酸為引物，通過PCR擴(kuò)增包含啟動(dòng)子序列的溶菌酶基因，并將其亞克隆到pCR-Script SK(+)的SalI-EcoRI位點(diǎn)中(a)。此外，用釀酒酵母染色體DNA作模板，以SEQ ID NO10和SEQID NO11的寡核苷酸為引物，通過PCR擴(kuò)增CWP2基因，并將其亞克隆到pUC19的EcoRI-HindIII位點(diǎn)中(b)。類似地，用pYES2(INVITROGEN)作模板，以SEQ ID NO12和SEQ ID NO13的寡核苷酸為引物，通過PCR擴(kuò)增CYC1終止子，并將其亞克隆到pUC19的新引入的NotI-KpnI位點(diǎn)中(c)。
下一步，將用SalI-EcoRI切除的溶菌酶基因(a)，以及用EcoRI-HindIII切除的CWP2基因(b)插到pESH的SalI-HindIII切割位點(diǎn)。最后，通過下述步驟制備pRLW63T用BamHI-HindIII切割包含ENO1啟動(dòng)子+分泌信號(hào)+溶菌酶基因+CWP2基因的基因，將其插入pRS306整合載體(Sikorski RS etal，Genetics.122(1)19-27，1989)，然后將HindIII-KpnI切割的CYC1終止子(c)插到HindIII-KpnI切割位點(diǎn)中。
(2)構(gòu)建頭孢菌素酶為報(bào)告酶的報(bào)告基因用前述pESH作模板，用ENO1啟動(dòng)子C-末端+分泌信號(hào)部分(d)作模板，以SEQ ID NO14和SEQ ID NO15的寡核苷酸為引物，通過PCR擴(kuò)增包含啟動(dòng)子序列和分泌信號(hào)部分的DNA，并將其亞克隆到新引入pUC19中的BamHI-NotI位點(diǎn)中(d)。此外，用弗勞地氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)染色體DNA作模板，以SEQ ID NO16和SEQ ID NO17的寡核苷酸為引物，通過PCR擴(kuò)增頭孢菌素酶基因，并將其亞克隆到新引入pUC19中的NspV-XbaI位點(diǎn)中(e)。類似地，用釀酒酵母染色體DNA作模板，以SEQ IDNO18和SEQ ID NO19的寡核苷酸為引物，通過PCR擴(kuò)增CWP2基因，并將其亞克隆到pUC19的XbaI-HindIII位點(diǎn)中(f)。
通過將pESH的BamHI-SalI片段插到其中已經(jīng)插入了(d)的質(zhì)粒的BamHI-SalI切割位點(diǎn)，制得全長的ENO1啟動(dòng)子+分泌信號(hào)部分之后，用NspV-XbaI切割頭孢菌素酶基因，用XbaI-HindIII切割CWP2基因，將這兩種基因插到NspV-HindIII切割位點(diǎn)中。之后，通過下列步驟制備pRCW63T用EcoRI-HindIII切割，將該片段插到前述pRS306中，然后將CYC1終止子插入HindIII-KpnI切割位點(diǎn)。
(3)將報(bào)告基因引入釀酒酵母中在10ml YPD培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)釀酒酵母G2-10菌株，在對(duì)數(shù)生長晚期收集細(xì)胞(2～5×107細(xì)胞/ml)。用無菌水洗滌之后，通過乙酸鋰方法引入上述的pRLW63T和pRCW63T，所述乙酸鋰方法采用YEASTMAKERTM酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(Clontech)(參照YEASTMAKERTM酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)用戶手冊)。采用pRLW63T和pRCW63T，其中的URA3基因分別用EcoRV和ApaI切割。在SD(Ura-)培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)3天，所得菌落在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
當(dāng)確認(rèn)溶菌酶和頭孢菌素酶活性的定位時(shí)，二者的活性主要定位于細(xì)胞壁中，并且確認(rèn)CWP2的C-末端序列的作用是作為向細(xì)胞壁轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)。
實(shí)施例A2通過釀酒酵母報(bào)告系統(tǒng)篩選藥物由于使用頭孢菌素酶的酶反應(yīng)的靈敏性優(yōu)于使用溶菌酶的酶反應(yīng)的靈敏性，所以采用引入了pRCW63T的釀酒酵母(釀酒酵母CW63菌株)篩選化合物。
在YPD液體培養(yǎng)基中30℃靜止培養(yǎng)48小時(shí)之后，將酵母細(xì)胞培養(yǎng)物用YPD液體培養(yǎng)基稀釋100倍(3～5×105細(xì)胞/ml)，并將其以75μl/孔的等分試樣接種在V-形底的96-孔板(含有25μl/孔的稀釋試樣)中，30℃靜止培養(yǎng)48小時(shí)。將該板離心之后，取樣25μl的上清液，并置于平底的96-孔板中，以此作為培養(yǎng)物上清液級(jí)分。
使沉淀的細(xì)胞懸浮，并按75μl/孔的等份加入用2.4M山梨醇制備的酶解酶(Seikagaku Corporation)溶液，30℃反應(yīng)1小時(shí)。將該板離心之后，取樣10μl的上清液，并置于平底的96-孔板中，加入15μl的磷酸鹽緩沖液，將其用作細(xì)胞壁級(jí)分。
通過下列方法測量培養(yǎng)基和細(xì)胞壁級(jí)分中的頭孢菌素酶活性將200μMnitrocefin溶液加到已集中的樣品中，經(jīng)過一定時(shí)間之后，用檸檬酸緩沖液中止反應(yīng)，然后測量在490nm處的吸光度。
此外，通過目測法測定試樣存在下的真菌生長。
圖2表明，當(dāng)前述化合物(Ia)以0.39～1.56μg/ml的濃度存在時(shí)，培養(yǎng)物上清液級(jí)分中的頭孢菌素酶活性增加，而細(xì)胞壁級(jí)分中的該酶活性降低。依照這種方式，將增加在培養(yǎng)物上清液級(jí)分中頭孢菌素酶活性又降低細(xì)胞壁級(jí)分中頭孢菌素酶活性的化合物視為抑制GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程的化合物。
實(shí)施例A3利用假絲酵母與動(dòng)物細(xì)胞的粘附篩選藥物將IEC-18細(xì)胞(1×105細(xì)胞/ml于包含10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的D-MEM培養(yǎng)基(Nissui Pharmaceutical)中)的3毫升等分試樣置于6-孔板的每個(gè)孔中。將該板在二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)3天，取出培養(yǎng)物上清液，并進(jìn)行乙醇固定。
將在包含各種濃度的試樣的Sabouraud葡萄糖液體培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)48小時(shí)的白色假絲酵母調(diào)整到4×102細(xì)胞/ml，并將1ml接種到平板的每個(gè)孔中，所述孔中已培養(yǎng)了固相IEC-18細(xì)胞。30℃培養(yǎng)1小時(shí)之后，取出培養(yǎng)物上清液，用PBS洗滌，然后在上層覆蓋2ml的Sabouraud葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Difco)。30℃培養(yǎng)過夜之后，計(jì)數(shù)成熟菌落(CFU)并計(jì)算粘附率。
圖3表明，即使前述化合物(Ia)的濃度為1.56μg/ml，且其中未能觀察到生長抑制，白色假絲酵母對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的粘附也有大約一半受到抑制。與未經(jīng)處理的白色假絲酵母相比，將減少細(xì)胞粘附型CFU的試樣視為抑制白色假絲酵母與動(dòng)物細(xì)胞的粘附的化合物。
實(shí)施例A4利用通過ELISA定量的GPI-錨定蛋白質(zhì)的量篩選藥物(1)抗-Als1p肽抗體的制備用與KLH偶聯(lián)的合成肽SEQ ID NO20使家兔免疫。將所得抗血清進(jìn)行親和純化，用IgG級(jí)分作為抗-Als1p肽抗體。
(2)通過ELISA利用抗-Als1p肽抗體篩選藥物將白色假絲酵母在包含各種濃度的試樣的Sabouraud葡萄糖液體培養(yǎng)基(5ml)中30℃培養(yǎng)48小時(shí)，離心收集細(xì)胞，洗滌，然后懸浮于300μl的Tris-HCl緩沖液中。將懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裝有玻璃珠的微型試管中，并通過將攪拌1分鐘且冰上冷卻1分鐘的循環(huán)重復(fù)10項(xiàng)進(jìn)行破碎。破碎的細(xì)胞洗滌后，用2％的SDS在95℃抽提10分鐘，離心，然后用磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀物5次。向該沉淀物中加入0.5ml 5μg/ml的酶解酶溶液，37℃反應(yīng)1小時(shí)，用離心所得上清液作為GPI-錨定蛋白質(zhì)樣品。
用50μl抗-Als1p肽抗體(40μg/ml)包被96-孔板并于4℃過夜。待用包含0.05％Tween 20的PBS(PBST)洗滌5次之后，用25％的BlockAce在室溫封閉2小時(shí)。用PBST洗滌3次之后，使50μl 2-倍系列稀釋的GPI-錨定蛋白樣品在室溫反應(yīng)2小時(shí)。用PBST洗滌5次之后，使100μl稀釋1000倍的HRP-標(biāo)記的抗-假絲酵母抗體(ViroStat)室溫反應(yīng)2小時(shí)，然后在用PBST洗滌5次之后，立即加入75μl底物溶液。中止反應(yīng)之后，測量490nm的吸光度。
圖4表明，當(dāng)前述化合物(Ia)以0.1～0.39μg/ml的濃度存在時(shí)，Als1p抗原的量在培養(yǎng)物上清液級(jí)分中增加，且在細(xì)胞壁級(jí)分中減少。按照這種方式，將增加培養(yǎng)物上清液中Als1p量或者降低細(xì)胞壁級(jí)分中Als1p量(與未經(jīng)所述化合物處理的白色假絲酵母中的Als1p量相比，其通過ELISA測量)的化合物視為抑制白色假絲酵母中GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程的化合物。
實(shí)施例A5通過電子顯微鏡觀察在試樣存在下培養(yǎng)的白色假絲酵母的細(xì)胞壁將白色假絲酵母在包含各種濃度的試樣的Sabouraud葡萄糖液體培養(yǎng)基(5ml)中30℃培養(yǎng)48小時(shí)，然后離心并收集，通過高錳酸鉀固定法將其固定，觀測其透射電子顯微鏡圖像。
在細(xì)胞的最外層觀察到具有高電子密度的絮狀纖維結(jié)構(gòu)，并認(rèn)為它是具有GPI-錨定蛋白質(zhì)為其構(gòu)成成分的表層糖蛋白層。該絮狀纖維結(jié)構(gòu)不受其它現(xiàn)有的抗真菌劑的影響。
與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，在前述化合物(Ia)存在下培養(yǎng)的白色假絲酵母中，細(xì)胞的最外層具有高電子密度的絮狀纖維結(jié)構(gòu)消失，留下少量具有高電子密度的層。照此，當(dāng)真菌細(xì)胞最外層具有高電子密度的絮狀纖維結(jié)構(gòu)消失時(shí)，則將試樣視為影響GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程的化合物。
實(shí)施例A6篩選釀酒酵母的抗前述化合物(Ia)的抗性基因由ATCC得到釀酒酵母基因的質(zhì)粒文庫(ATCC編號(hào)37323)。
在10ml的YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)釀酒酵母G2-10菌株30℃振蕩，在對(duì)數(shù)生長晚期收獲細(xì)胞(1～2×107細(xì)胞/ml)。用無菌水洗滌細(xì)胞之后，通過乙酸鋰方法引入釀酒酵母基因的質(zhì)粒文庫，所述乙酸鋰方法采用YEASTMAKERTM酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(Clontech)(參照YEASTMAKERTM酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)用戶手冊)，將所得細(xì)胞涂布在SD(Leu-)板上，得到大約80,000個(gè)菌落。收集和稀釋菌落，并將其涂布在包含濃度為1.56μg/ml和3.125μg/ml的前述化合物(Ia)的SD(Leu-)板上，致使每個(gè)板上有570,000個(gè)菌落。隨后，通過在37℃培養(yǎng)72小時(shí)，得到抗性克隆。
挑選27個(gè)克隆，通過METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.194169-182(1991)的方法收集質(zhì)粒，分析插入子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有27個(gè)克隆均包含相同的片段。
采用ABI377系統(tǒng)(PE Applied Biosystems)測定核苷酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO1所示DNA就是賦予對(duì)前述化合物(Ia)的抗性的DNA，將其命名為GWT1。
實(shí)施例A7釀酒酵母GWT1基因的白色假絲酵母同源物的Southern印跡分析樣品如下制備用EcoRI(TaKaRa)，HindIII(TaKaRa)，BamHI(TOYOBO)，或者PstI(New England Biolabs)(包括2種酶的組合)處理25μg的白色假絲酵母染色體組DNA 16小時(shí)，然后通過乙醇沉淀法濃縮，并溶解于25μl的無菌水中。將25微克用所述限制性內(nèi)切酶消化的染色體組DNA通過0.75％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，并將其轉(zhuǎn)移至尼龍膜(GeneScreenPLUS/NEN)。
通過隨機(jī)引物法，用α-33P-dCTP標(biāo)記20ng大約1.5kb的SEQ ID NO1的DNA片段，由此制得探針，并用GeneQuant柱(Amersham-Pharmacia)進(jìn)行純化。
按下列方法進(jìn)行雜交將膜浸泡在10ml PerfectHybTM(TOYOBO)溶液中，在65℃預(yù)培養(yǎng)1小時(shí)，然后加入上述標(biāo)記過的探針，并于65℃培養(yǎng)2.5小時(shí)。按下列進(jìn)行洗滌1)2×SSC，0.05％SDS溶液，于25℃洗滌5分鐘，2)2×SSC，0.05％SDS溶液，于25℃洗滌15分鐘，及3)0.1×SSC，0.1％SDS溶液，于50℃洗滌20分鐘。將經(jīng)洗滌的膜用Saran Wrap包裹起來，并與成像底片(FUJI)在室溫接觸12小時(shí)，用BAS2000(FUJI)捕集轉(zhuǎn)移到成像底片的圖像，且對(duì)圖像進(jìn)行分析。
結(jié)果，經(jīng)EcoRI處理后在6.5kb處，經(jīng)HindIII處理后在4.0kb處，經(jīng)EcoRI-HindIII后處理在2.0kb處，經(jīng)EcoRI-PstI處理后在2.5kb處，都分別觀察到單一泳帶(圖5)，而且預(yù)期白色假絲酵母中抗前述化合物(Ia)的抗性基因的同源物以單個(gè)基因的形式存在。
實(shí)施例A8篩選白色假絲酵母的抗前述化合物(Ia)的抗性基因根據(jù)Navaro-Garcia F et al，Mol.Cell.Biol.，152197-2206，1995的方法制備白色假絲酵母的染色體組文庫。具體地，用Sau3AI部分地消化白色假絲酵母的染色體組DNA，然后收集大約3～5個(gè)DNA片段，并將其插到Y(jié)Ep352穿梭載體的BamHI位點(diǎn)中。
在30℃，于10ml的YPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)釀酒酵母G2-10菌株，并在對(duì)數(shù)生長晚期收集細(xì)胞(2～5×107細(xì)胞/ml)。用無菌水洗滌細(xì)胞之后，通過乙酸鋰方法引入白色假絲酵母的染色體組文庫，所述乙酸鋰方法采用YEASTMAKERTM酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(Clontech)(參照YEASTMAKERTM酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)用戶手冊)，將所得細(xì)胞涂布在SD(Ura-)板上，得到大約25,000個(gè)菌落。收集和稀釋菌落，并將其涂布在包含濃度為1.56μg/ml的前述化合物(Ia)的SD板上，致使每個(gè)板上有500,000個(gè)菌落。其后，通過在30℃培養(yǎng)6小時(shí)，然后將其轉(zhuǎn)移到37℃并培養(yǎng)66小時(shí)，得到抗性克隆。
挑選30個(gè)克隆并通過METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.194169-182(1991)的方法收集質(zhì)粒，分析插入片段，結(jié)果發(fā)出30個(gè)克隆中有28個(gè)克隆包含相同的片段。
采用ABI377系統(tǒng)(PE Applied Biosystems)測定核苷酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO3所示DNA就是賦予對(duì)前述化合物(Ia)的抗性的DNA。
實(shí)施例A9由白色假絲酵母的臨床分離物克隆前述化合物(Ia)的抗性基因的同源物進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用由本發(fā)明人保存的白色假絲酵母的臨床分離物純化制得的染色體組DNA作為模板，并以SEQ ID NO21和SEQ ID NO22為引物。由全部三個(gè)獨(dú)立的PCR樣品擴(kuò)增大約1.6kb的DNA片段，純化已擴(kuò)增的片段，將其亞克隆到pT7-Blue載體(Novagen)中，并測定核苷酸序列，由此發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO5的DNA序列。該序列在三個(gè)位置不同于實(shí)施例A7的DNA序列(SEQ ID NO3)。
此外，在斯坦福大學(xué)序列中心(Stanford University Sequence Center(http//sequence-www.stanford.edu/))測定的白色假絲酵母基因的核苷酸序列中，發(fā)現(xiàn)實(shí)施例A7的DNA的同源物(SEQ ID NO7)，該序列在四個(gè)位置不同于實(shí)施例A7的DNA序列(SEQ ID NO3)。
實(shí)施例A10構(gòu)建過量表達(dá)GWT1基因產(chǎn)物的釀酒酵母進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用由實(shí)施例A6所得抗前述化合物(Ia)的抗性克隆純化制得的質(zhì)粒作為模板，并以SEQ ID NO23和SEQ ID NO24為引物。將用PvuII切割的PCR產(chǎn)物插到得自實(shí)施例A1的pRLW63T的SalI-HindIII切割位點(diǎn)中。將完整插入物用BamHI-KpnI切割，并插到pRS304的MCS(多克隆位點(diǎn))中(Sikorski RS et al，Genetics.122(1)19-27，1989)，制得用于整合的載體。
根據(jù)實(shí)施例A1的方法培養(yǎng)釀酒酵母CW63菌株，該菌株具有頭孢菌素酶基因作為報(bào)告基因，用EcoRV切割整合載體的TRP1，然后通過實(shí)施例A1的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。過量表達(dá)GWT1的菌株(釀酒酵母CW63/GWT1菌株)通過在SD(Trp-)培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)3天而得到。
除了對(duì)前述化合物(Ia)表現(xiàn)出抗性之外，過量表達(dá)GWT1的菌株與野生型菌株沒有什么不同，而且對(duì)其它抗真菌劑，放線菌酮，苯菌靈，及兩性霉素B敏感。
實(shí)施例A11構(gòu)建缺少GWT1基因的釀酒酵母突變體通過PCR擴(kuò)增兩端均包含GWT1序列的His5盒，所用模板為粟酒裂殖唐酵母的his5基因(Longtine MS et al，Yeast，14953-961，1998)，以SEQ IDNO25和SEQ ID NO26為引物。
培養(yǎng)釀酒酵母G2-10并根據(jù)實(shí)施例A1的方法收集細(xì)胞，且根據(jù)實(shí)施例A1的方法轉(zhuǎn)化前述的PCR產(chǎn)物。通過在SD(His-)培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)5-7天，得到缺乏GWT1的菌株。
盡管缺乏GWT1的菌株表現(xiàn)出生長非常緩慢，但卻暗示其生長不受前述化合物(Ia)的影響，且該GWT1基因產(chǎn)物即為所述化合物的靶。此外，缺乏GWT1的菌株具有如下特征其不能在高溫下生長；細(xì)胞是溶脹的；以及通過透射電子顯微鏡觀察時(shí)，具有高電子密度的真菌細(xì)胞最外層的絮狀纖維結(jié)構(gòu)已經(jīng)消失。
實(shí)施例A12前述化合物(Ia)在過量表達(dá)GWT1基因產(chǎn)物的釀酒酵母中的活性利用釀酒酵母CW63菌株和引入了GWT1基因的釀酒酵母CW63/GWT1，通過實(shí)施例A2中所述的方法檢測前述化合物(Ia)的活性。
結(jié)果，即使前述化合物(Ia)的濃度(0.39～1.56μg/ml)使得在釀酒酵母CW63菌株中頭孢菌素酶在培養(yǎng)物上清液級(jí)分中的活性增加，在細(xì)胞壁級(jí)分中的活性減小，也未在釀酒酵母CW63/GWT1菌株中觀察到任何影響，甚至在前述化合物(Ia)的濃度(＞3.13μg/ml)使得釀酒酵母CW63菌株的生長受到抑制時(shí)，仍未觀察到釀酒酵母CW63/GWT1菌株的生長抑制(圖6)。
實(shí)施例A13(4-丁基苯基)(1-異喹啉基)酮的合成在氮?dú)夥障拢瑢?-溴-4-丁基苯(2.29ml，13.0mmol)加到鎂(338mg，13.9mmol)與四氫呋喃(6.5ml)的混合溶液中，并加入催化劑量的1，2-二溴乙烷作為引發(fā)劑，回流攪拌10分鐘。將該溶液冷卻至0℃，加入1-異喹啉腈(1.0g，6.49mmol)的四氫呋喃溶液，并于室溫下再攪拌1小時(shí)，且于70℃下攪拌3小時(shí)。其后，再次將溶液冷卻至0℃，加入濃鹽酸(2.56ml)和甲醇(11ml)，然后回流2小時(shí)。將濃縮的剩余物溶解于5N氫氧化鈉和甲苯，并通過硅藻土(celite)進(jìn)行過濾。分出濾液的甲苯層，用水洗滌，用硫酸鎂干燥，并濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化得到1.72g的標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.93(3H，t)，1.32-1.43(2H，m)，1.58-1.66(2H，m)，2.68(2H，t)，7.28(2H，d)，7.61(1H，td)，7.74(1H，td)，7.80(1H，d)，7.87(2H，d)，7.92(1H，d)，8.20(1H，d)，8.60(1H，d)實(shí)施例A14前述式(Ia)的化合物{1-(4-丁基芐基)異喹啉}的合成將實(shí)施例A13的化合物(1.72g，5.95mmol)，一水合肼(836mg，16.7mmol)，及氫氧化鉀(769mg，13.7mmol)加到二乙二醇(8.5ml)中，并在80℃下攪拌1小時(shí)，在160℃下攪拌3.5小時(shí)，在200℃下攪拌1小時(shí)。冷卻至室溫，加冰水并用乙酸乙酯萃取。將其用水洗滌，然后用硫酸鎂干燥，并濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化得到914mg前述式(Ia)的化合物。
1H-MR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.26-1.36(2H，m)，1.50-1.59(2H，m)，2.53(2H，t)，4.64(2H，s)，7.06(2H，d)，7.19(2H，d)，7.53(1H，td)，7.56(1H，d)，7.64(1H，td)，7.81(1H，d)，8.18(1H，dd，)，8.50(1H，d)實(shí)施例A15制備前述式(Ia)的化合物{1-(4-丁基芐基)異喹啉}的另一種方法在氮?dú)夥蘸?16℃下，向60％氫化鈉(16mg，0.40mmol)的二甲基甲酰胺(1.8ml)溶液中滴加根據(jù)文獻(xiàn)Org.Synth.，VI，115(1988)合成的1-氰基-2-苯甲酰基-1，2-二氫異喹啉(100mg，0.38mmol)的二甲基甲酰胺(3.6ml)溶液和4-正丁基芐基氯化物(70mg，0.38mmol)，并在室溫下進(jìn)一步攪拌30分鐘。加水，將其濃縮，并向該剩余物中加入甲苯和水。用水洗滌甲苯層，通過碳酸鉀干燥，并濃縮。向剩余物的乙醇(1.6ml)溶液中加入50％的氫氧化鈉水溶液(0.63ml)，并將其回流2小時(shí)。濃縮之后，加入甲苯和水。用水洗滌甲苯層，用碳酸鈣干燥，然后濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化得到18mg前述式(Ia)的化合物。
實(shí)施例A16克隆釀酒酵母GWT1基因的白色假絲酵母同源物通過0.75％瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)HindIII(TaKaRa)處理16小時(shí)的白色假絲酵母染色體組DNA(25μg)，從凝膠中回收大小約3.5～4.5kb的DNA片段。將回收的DNA片段插到pKF3載體(TaKaRa)的HindIII位點(diǎn)中，制備假絲酵母基因組文庫。
利用所制備的文庫，大約10,000個(gè)菌落出現(xiàn)在LB/氨芐青霉素板上，采用Colony/Plaque Screen(NEN)膜進(jìn)行菌落轉(zhuǎn)移，然后進(jìn)行雜交。通過隨機(jī)引物法，用α-33P-dCTP標(biāo)記20ngSEQ ID NO1的大約1.5kb的DNA片段，制備探針，采用GeneQuant柱(Amersham-Pharmacia)進(jìn)行純化。
按下列步驟進(jìn)行雜交將所述的膜在PerfectHybTM(TOYOBO)溶液中于65℃培養(yǎng)1小時(shí)，然后加入上述標(biāo)記過的探針，并于65℃進(jìn)一步培養(yǎng)2.5小時(shí)。進(jìn)行下面的洗滌(i)2×SSC，0.05％SDS溶液，在25℃洗滌5分鐘，(ii)2×SSC，0.05％SDS溶液，在25℃洗滌15分鐘，及(iii)0.1×SSC，0.1％SDS溶液，在50℃洗滌20分鐘。將洗滌過的膜用Saran Wrap包裹，在室溫下與X-射線膠片(KONICA)接觸24小時(shí)，然后顯影。將對(duì)應(yīng)于曝光點(diǎn)的大腸桿菌菌落分離出來，并進(jìn)行二次篩選。每個(gè)LB/Ampicillin板上將出現(xiàn)約200個(gè)分離的菌落，按類似于一次篩選時(shí)的方式進(jìn)行菌落轉(zhuǎn)移，然后進(jìn)行雜交。雜交的條件與第一次篩選時(shí)的條件相同。
結(jié)果，分離出與探針強(qiáng)烈反應(yīng)的大腸桿菌單菌落。由該菌落收集質(zhì)粒，測定其所包含的序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了與在實(shí)施例A9中揭示的序列(SEQ ID NO5)相同的序列(假絲酵母GWT1的序列)，推測其為白色假絲酵母同源物。
實(shí)施例A17釀酒酵母GWT1基因的粟酒裂殖唐酵母同源物通過數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)了與釀酒酵母GWT1基因具有同源性的粟酒裂殖唐酵母基因(SEQ ID NO27，其基因產(chǎn)物的氨基酸序列為SEQ ID NO28)，并將其視為GWT1的粟酒裂殖唐酵母同源物。
實(shí)施例A18克隆釀酒酵母GWT1基因的煙曲霉同源物通過遺傳序列分析，本發(fā)明人在釀酒酵母，粟酒裂殖唐酵母，及白色假絲酵母的GWT1基因編碼的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)高度保守區(qū)(圖7)。根據(jù)假定的編碼該保守區(qū)氨基酸序列的DNA，設(shè)計(jì)引物SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，及SEQ ID NO31。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用1μl購自STRATAGENE的文庫(煙曲霉cDNA文庫#937053)作為模板，并采用SEQ ID NO29和SEQ IDNO31為引物。此外，采用1μg該擴(kuò)增的樣品作模板且采用SEQ ID NO29和SEQ ID NO30引物進(jìn)行嵌套式-PCR，結(jié)果證實(shí)了大約250kb的單個(gè)片段的擴(kuò)增。測定該片段的序列，獲得與釀酒酵母的GWT1基因具有同源性的新序列(示于SEQ ID NO32中)，并假定其為煙曲霉的同源物。
為了獲得全長cDNA，根據(jù)擴(kuò)增片段的序列設(shè)計(jì)引物SEQ ID NO33和SEQ ID NO34。此外，還設(shè)計(jì)了該文庫的基因插入位點(diǎn)以外的引物，即SEQ ID NO35和SEQ ID NO36。采用煙曲霉cDNA文庫為模板，并采用SEQ ID NO33和SEQ ID NO35引物組或SEQ ID NO34和SEQ ID NO36引物組進(jìn)行PCR，結(jié)果證實(shí)擴(kuò)增了大約1kb的DNA片段(兩個(gè)引物組都是如此)。測量這些片段的核苷酸序列，得到與釀酒酵母的GWT1基因高度同源的新序列(示于SEQ ID NO1中)。由于該序列的完整基因與釀酒酵母，粟酒裂殖唐酵母，及白色假絲酵母的GWT1基因高度同源，所以強(qiáng)烈暗示該序列為煙曲霉的同源物。
為了克隆煙曲霉的完整同源物，根據(jù)所得的序列重新設(shè)計(jì)下列引物對(duì)應(yīng)于起始密碼子上游序列的引物SEQ ID NO37，以及對(duì)應(yīng)于終止密碼子下游序列的引物SEQ ID NO38。用煙曲霉cDNA文庫(STRATAGENE)和煙曲霉染色體組文庫(STRATAGENE)為模板，并采用SEQ ID NO37和SEQ IDNO38為引物進(jìn)行35輪PCR，結(jié)果使用兩個(gè)模板都檢測出大約1.6kb的單個(gè)擴(kuò)增片段。直接測序該片段的核苷酸序列，從cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了示于SEQ ID NO39中的核苷酸序列，并認(rèn)為該核苷酸序列編碼包含501個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，如SEQ ID NO40中所示。此外，從染色體組文庫中發(fā)現(xiàn)核苷酸序列SEQ ID NO41，并發(fā)現(xiàn)其具有在同一位置上包含77個(gè)堿基對(duì)的內(nèi)含子。
實(shí)施例A19克隆釀酒酵母GWT1基因的隱球菌同源物1)數(shù)據(jù)庫檢索在數(shù)據(jù)庫中搜索與釀酒酵母GWT1基因具有同源性的基因，結(jié)果從斯坦福大學(xué)的基因組中心的服務(wù)器(http//baggage.stanford.edu/cgi-misc/cneoformans/)上發(fā)現(xiàn)了序列502042C05.x1。此外，還從美國俄克拉荷馬大學(xué)(Oklahoma University)的服務(wù)器(http//www.genome.ou.edu/cneo_blast.html)上發(fā)現(xiàn)了序列b6e06cn.f1。
2)采用染色體組DNA為模板進(jìn)行的PCR根據(jù)序列502042C05.x1構(gòu)建引物SEQ ID NO42，并根據(jù)序列b6e06cn.f1構(gòu)建引物SEQ ID NO43。當(dāng)采用隱球菌(新形隱球酵母)的染色體組DNA為模板，利用引物SEQ ID NO42及引物SEQ ID NO43進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，檢測到大約2kb的擴(kuò)增片段。當(dāng)檢測該片段的核苷酸序列時(shí)，得到與釀酒酵母的GWT1基因同源的新序列，如SEQ ID NO44中所示。
為了獲得隱球菌GWT1基因起始密碼子上游的序列，根據(jù)序列502042C05.x1構(gòu)建引物SEQ ID NO45，并根據(jù)序列SEQ ID NO44構(gòu)建引物SEQ ID NO46。當(dāng)采用隱球菌的染色體組DNA為模板，利用引物SEQID NO45及引物SEQ ID NO46進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，檢測到大約500bp的擴(kuò)增片段。當(dāng)檢測該片段的核苷酸序列時(shí)，得到SEQ ID NO47的序列，并且發(fā)現(xiàn)該序列與SEQ ID NO44重疊。
3)3′-RACE為了得到隱球菌GWT1基因的3′-末端序列，進(jìn)行3′-RACE。用銜接了-引物SEQ ID NO48(基于16μg從隱球菌中提取的總RNA)引發(fā)，并采用SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO/BRL)來進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并制備隨后將成為RT-PCR模板的單鏈cDNA。采用該單鏈cDNA為模板，并利用引物SEQ IDNO49和SEQ ID NO50進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR，結(jié)果檢測到大約1.2kb的擴(kuò)增片段。當(dāng)采用直接測序法分析該片段的核苷酸序列時(shí)，得到示于SEQID NO51中與釀酒酵母GWT1基因同源的新序列。
4)全長染色體組DNA的PCR利用根據(jù)SEQ ID NO47設(shè)計(jì)的引物SEQ ID NO52，以及根據(jù)SEQID NO51設(shè)計(jì)的引物SEQ ID NO53，以隱球菌的染色體組DNA為模板，對(duì)三個(gè)獨(dú)立的制劑進(jìn)行35個(gè)PCR循環(huán)。結(jié)果，從全部三個(gè)獨(dú)立的試管中檢測到大約2kb的擴(kuò)增片段，因此，將它們中的每一個(gè)單獨(dú)地進(jìn)行直接測序，并測定它們的全部核苷酸序列。結(jié)果，三個(gè)獨(dú)立的序列完全匹配，得到包含SEQ ID NO54所示的隱球菌全長GWT1基因同源物的序列。
5)cDNA序列的測定將來源于SEQ ID NO54中所示的基因組的隱球菌GWT1基因的序列，與通過3′-RACE得到的cDNA序列51進(jìn)行比較，結(jié)果表明在兩個(gè)位置存在內(nèi)含子。此外，由于ATG起始密碼子之后的開放式讀框不連續(xù)，所以暗示存在另一個(gè)內(nèi)含子。因此，從假定的氨基酸序列和剪接供體/受體序列預(yù)言cDNA結(jié)構(gòu)，并將引物SEQ ID NO55和SEQ ID NO56設(shè)計(jì)在預(yù)期的外顯子連接處。利用上述引物，并以來源于隱球菌的單鏈cDNA為模板，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR，結(jié)果證實(shí)擴(kuò)增了大約1.4kb的片段。在采用直接測序法測定該片段的核苷酸序列時(shí)，得到序列SEQ ID NO57，并與SEQ ID NO54進(jìn)行比較，暗示隱球菌GWT1基因的cDNA序列具有SEQ ID NO58的結(jié)構(gòu)。由于該序列在某些區(qū)域顯示出與釀酒酵母，粟酒裂殖唐酵母，白色假絲酵母，及煙曲霉的GWT1基因的高度同源性，所以強(qiáng)烈暗示該序列為隱球菌的同源物。
實(shí)施例A20賦予對(duì)前述式(Ia)所示化合物的抗性的遺傳突變用甲磺酸乙酯處理因引入pRLW63T而以溶菌酶基因?yàn)閳?bào)告基因的釀酒酵母LW63菌株，然后在前述式(Ia)化合物的濃度為1.56，3.13，及6.25μg/ml的SD培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)3天，得到5個(gè)抗性突變菌株(R1～R5)。在它們當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)R1突變菌株和R5突變菌株因?yàn)閱蝹€(gè)基因的突變而獲得了針對(duì)前述式(Ia)化合物的特異性抗性。為了確認(rèn)這兩種突變菌株在GWT1基因上是否具有突變，從兩種突變菌株中提取染色體組DNA，并測定GWT1基因部分的核苷酸序列。結(jié)果，在R1突變菌株中，1213位的鳥嘌呤已變異為腺嘌呤。此外，在R5突變菌株中，418位的鳥嘌呤已變異為腺嘌呤。因此，這表明，在R1突變菌株中，第405個(gè)氨基酸(異亮氨酸)已經(jīng)變成纈氨酸，而在R5突變菌株中，第140個(gè)氨基酸(甘氨酸)已經(jīng)變成精氨酸。
下一步，為了確認(rèn)這些突變是否獲得對(duì)前述式(Ia)化合物的特異抗性的原因，采用來源于這兩種突變菌株的染色體組DNA作為模板，并采用引物SEQ ID NO60和61分離突變的GWT1基因(R1或R5)。同時(shí)，分離GWT1啟動(dòng)子區(qū)(SEQ ID NO62)和終止子區(qū)(SEQ ID NO63)，將GWT1基因啟動(dòng)子，突變的GWT1基因ORF，以及GWT1基因終止子插到pRS316載體中，并構(gòu)建表達(dá)突變的GWT1基因的單個(gè)拷貝的質(zhì)粒(pRS316GWT1-R1，pRS316GWT1-R5)。將其引入僅僅單個(gè)GWT1基因拷貝被破壞的二倍體菌株(WDG1)中。通過在孢子形成培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落，形成孢子，并通過進(jìn)行四分體分析，得到其中染色體上的GWT1基因已被破壞而且攜帶前述質(zhì)粒的克隆。當(dāng)將其在包含前述式(Ia)化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，觀察到了對(duì)前述式(Ia)化合物的抗性，類似于原始的R1突變菌株和R5突變菌株。綜上所述說明，通過發(fā)生在GWT1基因上的伴隨氨基酸突變的點(diǎn)突變，賦予了對(duì)前述式(Ia)化合物的特異性抗性，并且強(qiáng)烈暗示該化合物通過直接與GWT1蛋白質(zhì)的結(jié)合而抑制GWT1蛋白的功能。
本發(fā)明的化合物可以通過例如下列方法來制備。但是，這些實(shí)施例僅用于說明，任何情況下，本發(fā)明的化合物都不僅限于在下述具體實(shí)例中制備的那些化合物。
實(shí)施例B11-(氯甲基)-4-正丁基苯 將亞硫酰氯(2.5ml，34mmol)加到4-正丁基芐基醇(2.0g，12mmol)的乙醚(25ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。濃縮該混合物之后，通過用苯共沸蒸餾除去過量的亞硫酰氯得到標(biāo)題化合物(2.3g)。該化合物無需純化即可用于下列反應(yīng)。
實(shí)施例B21-(4-丁基芐基)異喹啉 在氮?dú)夥蘸?16℃下，將根據(jù)Org.Synth.，VI，115(1988)合成的1-氰基-2-苯甲?；?1，2-二氫異喹啉(100mg，0.38mmol)與4-正丁基芐基氯(70mg，0.38mmol)的二甲基甲酰胺(3.6ml)溶液滴加到60％氫化鈉(16mg，0.40mmol)的二甲基甲酰胺(1.8ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌30分鐘。加水，將該混合物在減壓下濃縮，向剩余物中加入甲苯和水。用水洗滌甲苯層，用碳酸鉀干燥，然后減壓濃縮。將50％氫氧化鈉水溶液(0.63ml)加到剩余物的乙醇(1.6ml)溶液中。將該混合物加熱回流2小時(shí)并濃縮，然后加入甲苯和水。用水洗滌甲苯層，用碳酸鈣干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化得到標(biāo)題化合物(18mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.26-1.36(2H，m)，1.50-1.59(2H，m)，2.53(2H，t)，4.64(2H，s)，7.06(2H，d)，7.19(2H，d)，7.53(1H，td)，7.56(1H，d)，7.64(1H，td)，7.81(1H，d)，8.18(1H，dd)，8.50(1H，d)實(shí)施例B3(4-丁基苯基)(1-異喹啉基)酮 在氮?dú)夥障拢瑢?-溴-4-丁基苯(2.29ml，13mmol)和作為引發(fā)劑的催化劑量的1，2-二溴乙烷加到鎂(338mg，14mmol)與四氫呋喃(6.5ml)的混合溶液中，并將該混合物回流攪拌10分鐘。將該混合物冷卻至0℃，加入1-異喹啉腈(1.0g，6.5mmol)的四氫呋喃溶液，并將該混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后在70℃下攪拌3小時(shí)。其后，將該混合物再次冷卻至0℃，加入濃鹽酸(2.6ml)和甲醇(11ml)，并將該混合物加熱回流2小時(shí)。將該混合物濃縮之后，將剩余物溶解于5N氫氧化鈉和甲苯，并通過硅藻土過濾。分出濾液的甲苯層，用水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化得到標(biāo)題化合物(1.7g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.93(3H，t)，1.32-1.43(2H，m)，1.58-1.66(2H，m)，2.68(2H，t)，7.28(2H，d)，7.61(1H，td)，7.74(1H，td)，7.80(1H，d)，7.87(2H，d)，7.92(1H，d)，8.20(1H，d)，8.60(1H，d)實(shí)施例B4可供選擇的制備1-(4-丁基芐基)異喹啉的方法將實(shí)施例B3的化合物(1.7g，6.0mmol)，一水合肼(836mg，17mmol)，及氫氧化鉀(769mg，14mmol)加到二乙二醇(8.5ml)中，并將該混合物在80℃下攪拌1小時(shí)，在160℃下攪拌3.5小時(shí)，然后在200℃下攪拌1小時(shí)。將該混合物冷卻至室溫，加入冰水，并用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。萃取物用水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，并減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化得到標(biāo)題化合物(914mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.26-1.36(2H，m)，1.50-1.59(2H，m)，2.53(2H，t)，4.64(2H，s)，7.06(2H，d)，7.19(2H，d)，7.53(1H，td)，7.56(1H，d)，7.64(1H，td)，7.81(1H，d)，8.18(1H，dd)，8.50(1H，d)實(shí)施例B51-(4-乙基芐基)異喹啉 利用對(duì)乙基芐基氯，按與實(shí)施例B2相同的方式得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.18(3H，t)，2.57(2H，q)，4.64(2H，s)，7.08(2H，d)，7.20(2H，d)，7.50-7.55(2H，m)，7.61-7.65(1H，m)，7.80(1H，d)，8.16-8.18(1H，m)，8.49(1H，d)實(shí)施例B6(4-丙基苯基)甲醇 將硼氫化鈉(2.9g，76mmol)與濃硫酸的乙醚溶液(通過將2.0ml濃硫酸加到4.0ml的乙醚中而制備)滴加到已經(jīng)冷卻至0℃的對(duì)正丙基苯甲酸(5.0g，32mmol)的四氫呋喃(20ml)溶液中，同時(shí)保持反應(yīng)體系的溫度低于20℃，然后將該混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。待混合物在冰上冷卻之后，加入甲醇和1N氫氧化鈉，并用乙酸乙酯萃取該混合物。乙酸乙酯層用飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物(4.33g)。該化合物無需純化即可用于下列反應(yīng)。
實(shí)施例B71-(氯甲基)-4-丙基苯 按與實(shí)施例B1相同的方式，通過處理實(shí)施例B6的化合物，得到標(biāo)題化合物。該化合物無需純化即可用于下列反應(yīng)。
實(shí)施例B81-(4-丙基芐基)異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B7的化合物得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.55-1.61(2H，m)，2.51(2H，t)，4.64(2H，s)，7.06(2H，d)，7.19(2H，d)，7.51-7.55(2H，m)，7.61-7.65(1H，m)，7.81(1H，d)，8.17(1H，dd)，8.49(1H，d)實(shí)施例B9(4-戊基苯基)甲醇 按與實(shí)施例B6相同的方式，通過還原4-正戊基苯甲酸，得到標(biāo)題化合物。
實(shí)施例B101-(氯甲基)-4-戊基苯 按與實(shí)施例B1相同的方式，通過處理實(shí)施例B9的化合物，得到標(biāo)題化合物。該化合物無需純化即可用于下列反應(yīng)。
實(shí)施例B111-(4-戊基芐基)異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過實(shí)施例B10的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.86(3H，t)，1.26-1.33(4H，m)，1.52-1.59(2H，m)，2.52(2H，t)，4.64(2H，s)，7.06(2H，d)，7.18(2H，d)，7.50-7.55(2H，m)，7.61-7.65(1H，m)，7.80(1H，d)，8.17(1H，dd)，8.49(1H，d)實(shí)施例B12(4-己基苯基)甲醇 按與實(shí)施例B6相同的方式，通過還原4-正己基苯甲酸，得到標(biāo)題化合物。該化合物無需純化即可用于下列反應(yīng)。
實(shí)施例B131-(氯甲基)-4-己基苯 按與實(shí)施例B1相同的方式，通過處理實(shí)施例B12的化合物，得到標(biāo)題化合物。該化合物無需純化即可用于下列反應(yīng)。
實(shí)施例B141-(4-己基芐基)異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理的實(shí)施例B13化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.86(3H，t)，1.26-1.31(6H，m)，1.51-1.58(2H，m)，2.52(2H，t)，4.63(2H，s)，7.06(2H，d)，7.18(2H，d)，7.50-7.55(2H，m)，7.61-7.65(1H，m)，7.80(1H，d)，8.17(1H，dd)，8.49(1H，d)實(shí)施例B151-(4-異丙基芐基)異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理對(duì)異丙基芐基氯，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.19(6H，d)，2.80-2.87(1H，m)，4.64(2H，s)，7.11(2H，d)，7.21(2H，d)，7.51-7.56(2H，m)，7.61-7.65(1H，m)，7.81(1H，d)，8.19(1H，dd)，8.50(1H，d)實(shí)施例B161-[4-(叔丁基)芐基]異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理4-叔丁基芐基氯，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.26(9H，s)，4.64(2H，s)，7.22(2H，d)，7.27(2H，d)，7.52-7.56(2H，m)，7.62-7.66(1H，m)，7.81(1H，d)，8.19(1H，dd)，8.50(1H，d)實(shí)施例B17(4-異丁基苯基)甲醇 按與實(shí)施例B6相同的方式，通過還原4-異丁基苯甲酸，得到標(biāo)題化合物。該化合物無需進(jìn)一步純化即可用于下列反應(yīng)。
實(shí)施例B18
1-(氯甲基)-4-異丁基苯 按與實(shí)施例B1相同的方式，通過處理實(shí)施例B17的化合物，得到標(biāo)題化合物。該化合物無需進(jìn)一步純化即可用于下列反應(yīng)。
實(shí)施例B191-(4-異丁基芐基)異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B18的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.86(6H，d)，1.75-1.83(1H，m)，2.39(2H，d)，4.66(2H，s)，7.02(2H，d)，7.18(2H，d)，7.52-7.58(2H，m)，7.63-7.67(1H，m)，7.82(1H，d)，8.18(1H，d)，8.50(1H，d)實(shí)施例B201-(氯甲基)-4-(三氟甲基)苯 按與實(shí)施例B1相同的方式，通過處理4-三氟甲基芐基醇，得到標(biāo)題化合物。該化合物無需進(jìn)一步純化即可用于下列反應(yīng)。
實(shí)施例B211-[4-(三氟甲基)芐基]異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B20的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.73(2H，s)，7.39(2H，d)，7.51(2H，d)，7.54-7.60(2H，m)，7.65-7.69(1H，m)，7.84(1H，d)，8.09-8.10(1H，m)，8.51(1H，d)實(shí)施例B221-(氯甲基)-4-(三氟甲氧基)苯 按與實(shí)施例B1相同的方式，通過處理4-三氟甲氧基芐基醇，得到標(biāo)題化合物。該化合物無需進(jìn)一步純化即可用于下列反應(yīng)。
實(shí)施例B231-[4-(三氟甲氧基)芐基]異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B22的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.67(2H，s)，7.10(2H，d)，7.27(2H，d)，7.54-7.59(2H，m)，7.64-7.68(1H，m)，7.84(1H，d)，8.11(1H，dd)，8.50(1H，d)實(shí)施例B241-(氯甲基)-2-碘苯 將甲磺酰氯(2.0ml，29mmol)和三乙胺(3.6ml，26mmol)加到冷卻至0℃的鄰碘芐基醇(5.0g，21mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液中，并將混合物在該溫度下攪拌19小時(shí)。加入5％的碳酸氫鈉水溶液，并用二氯甲烷萃取所得的混合物。將二氯甲烷層用無水硫酸鎂干燥并減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物(5.34g)。
實(shí)施例B251-(2-碘芐基)異喹啉
按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B24的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.74(2H，s)，6.81-6.84(1H，m)，6.87-6.92(1H，m)，7.11-7.15(1H，m)，7.55-7.57(1H，m)，7.60(1H，d)，7.64-7.68(1H，m)，7.83-7.86(1H，m)，7.89-7.91(1H，m)，8.00-8.02(1H，m)，8.50(1H，d)實(shí)施例B261-[2-(2-苯基-1-乙炔基)芐基]異喹啉 在氮?dú)夥障?，將?三苯基膦)合鈀(58mg，0.05mmol)與乙炔基苯(204mg，2.0mmol)的吡咯烷(1.5ml)溶液加到實(shí)施例B25的化合物(345mg，1.07mmol)的吡咯烷(1.5ml)溶液中，并將該混合物在80℃下攪拌3小時(shí)。將該混合物冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋，用飽和的氯化銨水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(280mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.95(2H，s)，6.98-7.06(2H，m)，7.10-7.21(2H，m)，7.31-7.35(3H，m)，7.48-7.51(3H，m)，7.57-7.65(2H，m)，7.82(1H，d)，8.25(1H，d)，8.52(1H，d)實(shí)施例B271-(2-苯基乙基芐基)異喹啉
將鈀-碳(10％，230mg)加到實(shí)施例B26的化合物(280mg，0.88mmol)的四氫呋喃(30ml)溶液中，并在氫氣氛(1atm)下將該混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。濾除催化劑并減壓濃縮所得濾液。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(162mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.90-2.94(2H，m)，3.07-3.10(2H，m)，4.67(2H，s)，6.80(1H，d)，7.02-7.06(1H，m)，7.15-7.30(7H，m)，7.49-7.53(1H，m)，7.58(1H，d)，7.64-7.68(1H，m)，7.84(1H，d)，7.95(1H，d)，8.50(1H，d)實(shí)施例B281-{2-[4-(四氫-2H-2-吡喃氧基)-1-丁炔基]芐基}-異喹啉 在氮?dú)夥障?，將?三苯基膦)合鈀(58mg，0.05mmol)與2-(3-丁炔氧基)-四氫-2H-吡喃(208mg，2.0mmol)的吡咯烷(1.5ml)溶液加到實(shí)施例B25的化合物(345mg，1.07mmol)的吡咯烷(1.5ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌4天，且于80℃下攪拌30分鐘。將該混合物冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋，用飽和的氯化銨水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(277mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.42-1.60(4H，m)，1.64-1.68(1H，m)，1.75-1.81(1H，m)，2.76-2.80(2H，m)，3.46-3.51(1H，m)，3.60-3.66(1H，m)，3.85-3.95(2H，m)，4.64-4.66(1H，m)，4.85(2H，s)，6.95-6.98(1H，m)，7.05-7.13(2H，m)，7.44-7.46(1H，m)，7.49-7.53(1H，m)，7.56(1H，d)，7.60-7.65(1H，m)，7.80-7.82(1H，m)，8.15-8.18(1H，m)，8.49-8.51(1H，m)實(shí)施例B294-[2-(1-異喹啉基甲基)苯基]-3-丁炔-1-醇 待將實(shí)施例B28的化合物(200mg，0.54mmol)冷卻至0℃之后，加入鹽酸-甲醇溶液(10％，5ml)，并將該混合物攪拌15分鐘。加入飽和的碳酸氫鈉水溶液，并用乙酸乙酯萃取該混合物。乙酸乙酯層用無水硫酸鎂干燥并減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(86mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.72(2H，t)，3.53-3.60(1H，brs)，3.85(2H，t)，4.85(2H，s)，7.12-7.15(2H，m)，7.22-7.24(1H，m)，7.42-7.44(1H，m)，7.55-7.59(2H，m)，7.63-7.67(1H，m)，7.81(1H，d)，8.30(1H，m)，8.46(1H，m)實(shí)施例B304-[2-(1-異喹啉基甲基)苯基]-1-丁醇 將鈀-碳(10％，10mg)加到實(shí)施例B29的化合物(44mg，0.15mmol)的四氫呋喃(5ml)溶液中，并在氫氣氛下(1atm)將該混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。濾除催化劑之后，將濾液減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(18mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.61-1.75(4H，m)，2.33(1H，brs)，2.77(2H，t)，3.67(2H，t)，4.70(2H，s)，6.91(1H，d)，7.02-7.06(1H，m)，7.12-7.16(1H，m)，7.19-7.21(1H，m)，7.50-7.55(1H，m)，7.57(1H，d)，7.63-7.67(1H，d)，7.83(1H，d)，8.09(1H，d)，8.47(1H，d)實(shí)施例311-溴-2-(氯甲基)苯 按與實(shí)施例B1相同的方式，通過處理溴芐基醇，得到標(biāo)題化合物。
實(shí)施例B321-(4-溴芐基)異喹啉
按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B31的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.61(2H，s)，7.14-7.16(2H，m)，7.35-7.39(2H，m)，7.52-7.58(2H，m)，7.63-7.67(1H，m)，7.82(1H，d)，8.07-8.10(1H，m)，8.49(1H，d)實(shí)施例B33(E)-3-[4-(異喹啉基甲基)苯基]-2-丙酸乙酯 在氮?dú)夥障?，將?2-甲基苯基)膦(20mg，0.067mmol)，乙酸鈀(II)(7.5mg，0.034mmol)，及三乙胺(70μl，0.50mmol)加到實(shí)施例B32的化合物(100mg，0.34mmol)與丙酸乙烯酯(73μl，0.67mmol)的二甲基甲酰胺(1.0ml)溶液中，并將該混合物在100℃下攪拌4小時(shí)。待將該混合物冷卻至室溫之后，加水，并用乙酸乙酯萃取該混合物。有機(jī)層用水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(74mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.32(3H，t)，4.24(2H，q)，4.69(2H，s)，6.36(1H，d)，7.29(2H，d)，7.42(2H，d)，7.53-7.67(4H，m)，7.83(1H，d)，8.11-8.13(1H，m)，8.50(1H，d)實(shí)施例B343-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]丙酸乙酯 將鈀-碳(10％，20mg)加到實(shí)施例B33的化合物(71mg，0.22mmol)的甲醇(5.0ml)溶液中，并在大氣壓大小的氫氣氛下，將該反應(yīng)混合物于室溫?cái)嚢?.5小時(shí)。從反應(yīng)混合物中濾除催化劑之后，將濾液減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(52mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.20(3H，t)，2.56(2H，t)，2.88(2H，t)，4.09(2H，q)，4.64(2H，s)，7.09(2H，d)，7.20(2H，d)，7.51-7.57(2H，m)，7.62-7.66(1H，m)，7.82(1H，d)，8.15(1H，dd)，8.50(1H，d)實(shí)施例B353-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-1-丙醇 在氮?dú)夥障?，將氫化鋁鋰(6mg，0.16mmol)加到冷卻至0℃的四氫呋喃(1.0ml)中。進(jìn)一步加入實(shí)施例B34的化合物(46mg，0.14mmol)的四氫呋喃(1.0ml)溶液，并將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌3小時(shí)。向反應(yīng)混合物中加入甲醇與水(9∶1，1.0ml)的混合溶液，進(jìn)一步加入飽和的氯化銨水溶液，然后用氯仿萃取該混合物。有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥并減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(22mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.30-1.35(1H，brs)，1.81-1.88(2H，m)，2.64(2H，t)，3.62-3.65(2H，m)，4.64(2H，s)，7.09(2H，d)，7.20(2H，d)，7.51-7.57(2H，m)，7.62-7.66(1H，m)，7.81(1H，d)，8.16-8.18(1H，m)，8.49(1H，d)實(shí)施例361-異喹啉基(4-甲氧基苯基)酮 在氮?dú)夥障?，?-溴苯甲醚(15.3ml，122mmol)和催化劑量的1，2-溴乙烷(引發(fā)劑)加到鎂(3059mg，125.8mmol)與四氫呋喃(20ml)的混合溶液中，并在加熱回流下攪拌反應(yīng)混合物45分鐘。將該混合物冷卻至0℃，并向其中滴加1-異喹啉腈(10.78g，69.9mmol)的四氫呋喃(30ml)溶液，且將該混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物在冰上冷卻，加入濃鹽酸(24ml)和甲醇(120ml)，并將該混合物加熱回流1.5小時(shí)。在冰上冷卻之后，通過加入氫氧化鈉水溶液將混合物的pH調(diào)整至8，用乙醚萃取，用飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(15.87g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.88(3H，s)，6.95(2H，d)，7.61(1H，dd)，7.74(1H，dd)，7.76(1H，d)，7.85(2H，d)，8.17(1H，dd)，8.60(1H，d)。
實(shí)施例B371-異喹啉基(4-甲氧基苯基)甲醇 將硼氫化鈉(1855mg)加到冰冷卻的實(shí)施例B36的化合物(8608mg)的乙醇(170ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌35分鐘。進(jìn)一步加入硼氫化鈉(957mg)，并將反應(yīng)混合物在40℃下攪拌40分鐘。將反應(yīng)混合物減壓濃縮，加水，并用乙醚萃取該混合物。有機(jī)層用水和飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。所得標(biāo)題化合物(7881mg)無需進(jìn)一步純化即可用于下面的反應(yīng)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)3.66(3H，s)，6.30-6.32(1H，brs)，6.81(2H，d)，7.28(2H，d)，7.54(1H，dd)，7.68(1H，dd)，7.76(1H，d)，7.94(1H，d)，8.37(1H，d)，8.47(1H，d)。
在NMR光譜中未觀察到羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例B381-異喹啉基(4-甲氧基苯基)乙酸甲酯 將乙酸酐(20ml)加到實(shí)施例B37的化合物(7881mg)的吡啶(100ml)溶液中，并將反應(yīng)混合物在50℃下攪拌4小時(shí)。將反應(yīng)混合物減壓濃縮，并用甲苯共沸蒸餾。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(8.79g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.22(3H，s)，3.76(3H，s)，6.84(2H，d)，7.39(2H，d)，7.54(1H，dd)，7.56(1H，s)，7.60(1H，d)，7.64(1H，dd)，7,82(1H，d)，8.19(1H，d)，8.57(1H，d)。
實(shí)施例B391-(4-甲氧基芐基)異喹啉
將鈀-碳(10％，4.0g)加到實(shí)施例B38的化合物(8.79g)的甲醇(150ml)溶液中，并在大氣壓大小的氫氣氛下，將該混合物在室溫下攪拌5.5小時(shí)。通過硅藻土濾除催化劑，并將濾液減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(4.48g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.74(3H，s)，4.61(2H，s)，6.79(2H，d)，7.21(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.80(1H，d)，8.16(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B404-(1-異喹啉基甲基)苯酚 將氫溴酸水溶液(47％，40ml)加到實(shí)施例B39的化合物(2185mg)中，并將該反應(yīng)混合物加熱回流14小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，進(jìn)一步在冰上冷卻，用50％的氫氧化鈉水溶液中和，并用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯層用水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。所得粉末經(jīng)石油醚洗滌之后，得到標(biāo)題化合物(1822mg)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)4.48(2H，s)，6.61(2H，d)，7.07(2H，d)，7.60(1H，dd)，7.68(1H，d)，7.71(1H，dd)，7.92(1H，d)，8.27(1H，d)，8.41(1H，d)，9.19(1H，brs)。
實(shí)施例B414-(1-異喹啉基甲基)三氟甲磺酸苯酯 將三氟甲磺酸酐(0.55ml)滴加到冰冷的實(shí)施例B40的化合物(513mg)的吡啶(10ml)溶液中，并將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌45分鐘。加冰之后，用乙醚萃取反應(yīng)混合物。有機(jī)層用水和飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(546mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.69(2H，s)，7.16(2H，d)，7.35(2H，d)，7.57(1H，dd)，7,60(1H，d)，7.68(1H，dd)，7.85(1H，d)，8.09(1H，d)，8.50(1H，d)。
實(shí)施例B421-[4-(2-苯基-1-乙炔基)芐基]異喹啉 將苯乙炔(53μl)，乙酸鈀(9mg)，1，1′-二(二苯基膦)二茂鐵(67mg)，碘化銅(I)(3mg)，氯化鋰(20mg)，及三乙胺(50μl)加到已經(jīng)脫氣并置于氮?dú)庵械膶?shí)施例B41的化合物(88mg)的N，N-二甲基甲酰胺(2.0ml)溶液中，將該混合物在80℃下攪拌8小時(shí)。待混合物冷卻至室溫之后，加水，并用乙酸乙酯萃取該混合物。有機(jī)層用水和飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(53mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.69(2H，s)，7.12-7.32(3H，m)，7.25(2H，d)，7.42(2H，d)，7.43-7.52(2H，m)，7.54(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.10(1H，d)，8.51(1H，d)。
實(shí)施例B431-(4-苯乙基芐基)異喹啉 將鈀-碳催化劑(10％，20mg)加到實(shí)施例B42的化合物(45mg)的四氫呋喃(2ml)溶液中，并在大氣壓大小的氫氣氛下，將該混合物于室溫下攪拌2小時(shí)。通過硅藻土濾除催化劑，并將濾液減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(23mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.78-2.90(4H，m)，4.64(2H，s)，7.07(2H，d)，7.10-7.20(5H，m)，7.22(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.80(1H，d)，8.15(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B441[4-(4-苯基-1-丁炔基)芐基]異喹啉 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物和4-苯基-1-丁炔，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.65(2H，t)，2.88(2H，t)，4.68(2H，s)，7.12-7.40(9H，m)，7.50-7.70(3H，m)，7.80-7.88(1H，m)，8.00-8.10(1H，m)，8.48-8.51(1H，m)。
實(shí)施例B451-[4-(4-苯基-1-丁基)芐基]異喹啉 按與實(shí)施例B43相同的方式，通過處理實(shí)施例B44的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.55-1.80(4H，m)，2.50-2.65(4H，m)，4.68(2H，s)，7.00-7.30(9H，m)，7.52(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.15(1H，d)，8.50(1H，d)。
實(shí)施例461-{4-[4-(四氫-2H-2-吡喃氧基)-1-丁炔基]芐基}-異喹啉
按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物和2-(3-丁炔氧基)四氫-2H-吡喃，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.48-1.90(6H，m)，2.67(2H，t)，3.49-3.55(1H，m)，3.60(1H，dd)，3.65-3.94(2H，m)，4.66(2H，s)，4.65-4.70(1H，m)，7.14-7.20(2H，m)，7.23-7.30(2H，m)，7.53(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.10(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B474-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-3-丁炔-1-醇 將實(shí)施例B46的化合物(1048mg)溶解于10％的鹽酸-甲醇溶液(50ml)，并將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1.5小時(shí)。將反應(yīng)混合物在冰上冷卻，加入飽和的碳酸氫鈉水溶液，并用乙酸乙酯萃取所得的混合物。有機(jī)層用水和飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(666mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.65(2H，t)，3.77(2H，t)，4.65(2H，s)，7.18(2H，d)，7.29(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.07(1H，d)，8.49(1H，d)。
在NMR光譜中未觀察到羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例B484-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-1-丁醇
按與實(shí)施例B43相同的方式，通過處理實(shí)施例B47的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.50-1.70(4H，m)，2.57(2H，t)，3.62(2H，t)，4.64(2H，s)，7.06(2H，d)，7.18(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.80(1H，d)，8.16(1H，d)，8.49(1H，d)。
在NMR光譜中未觀察到羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例491-[4-(3-環(huán)戊基-1-丙炔基)芐基]異喹啉 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與3-環(huán)戊基-1-丙炔，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.25-1.35(2H，m)，1.45-1.70(6H，m)，1.75-1.85(2H，m)，2.05-2.13(1H，m)，4.65(2H，s)，7.17(2H，d)，7.27(2H，d)，7.51(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.08(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B501-[4-(3-環(huán)戊基丙基)芐基]異喹啉 按與實(shí)施例B43相同的方式，通過處理實(shí)施例B49的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.25-1.74(13H，m)，2.49-2.54(2H，m)，4.64(2H，s)，7.06(2H，d)，7.18(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.80(1H，d)，8.17(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B514-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-甲基-3-丁炔-2-醇
按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與2-甲基-3-丁炔-2-醇，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)1.35(1H，s)，1.40(6H，s)，4.62(2H，s)，7.20-7.30(4H，m)，7.61(1H，dd)，7.71(1H，d)，7.69-7.76(1H，m)，7.95(1H，d)，8.26(1H，d)，8.42(1H，d)。
實(shí)施例B524-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-甲基-2-丁醇 按與實(shí)施例B43相同的方式，通過處理實(shí)施例B51的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.25(6H，s)，1.70-1.77(2H，m)，2.60-2.67(2H，m)，4.64(2H，s)，7.08(2H，d)，7.19(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.80(1H，d)，8.16(1H，d)，8.49(1H，d)。
在NMR光譜中未觀察到羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例B531-[4-(3-甲氧基-1-丙炔基)芐基]異喹啉 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與甲基丙炔基醚，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.42(3H，s)，4.29(2H，s)，4.66(2H，s)，7.21(2H，d)，7.34(2H，d)，7.54(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)7.82(1H，d)，8.10(1H，d)8.49(1H，d)。
實(shí)施例B541-[4-(3-甲氧基丙基)芐基]異喹啉 按與實(shí)施例B43相同的方式，通過處理實(shí)施例B53的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.78-1.87(2H，m)，2.06(2H，t)，3.31(3H，s)，3.35(2H，t)，4.64(2H，s)，7.07(2H，d)，7.22(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.17(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B551-{4-[2-(2-吡啶基)-1-乙炔基]芐基}異喹啉 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與2-乙炔基吡啶，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.71(2H，s)，7.20-7.25(2H，m)，7.29(2H，d)，7.48-7.53(1H，m)，7.51(2H，d)，7.57(1H，dd)，7.61(1H，d)，7.67(1H，dd)，7.85(1H，d)，8.13(1H，d)，8.53(1H，d)，8.59-8.63(1H，m)。
實(shí)施例B561-{4-[2-(2-吡啶基)乙基]芐基}異喹啉
按與實(shí)施例B43相同的方式，通過處理實(shí)施例B55的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.94-3.06(4H，m)，4.64(2H，s)，7.04(1H，d)，7.09(1H，dd)，7.09(2H，d)，7.18(2H，d)，7.53(1H，ddd)，7.54(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.64(1H，d)，7.81(1H，d)，8.15(1H，d)，8.49(1H，d)，8.53(1H，dd)。
實(shí)施例B571-{4-[2-(3-吡啶基)-1-乙炔基]芐基}異喹啉 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與3-乙炔基吡啶，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.69(2H，s)，7.27(2H，d)，7.31(1H，dd)，7.43(2H，d)，7.55(1H，dd)，7.59(1H，d)，7.66(1H，dd)，7.82(1H，ddd)，7.83(1H，d)，8.10(1H，d)，8.51(1H，d)，8.60(1H，dd)，8.77(1H，d)。
實(shí)施例B581-{4-[2-(3-吡啶基)乙基]芐基}異喹啉 按與實(shí)施例B43相同的方式，通過處理實(shí)施例B57的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.80-2.90(4H，m)，4.65(2H，s)，7.04(2H，d)，7.15(1H，dd)，7.19(2H，d)，7.39(1H，dd)，7.54(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.15(1H，d)，8.40(1H，d)，8.42(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B59N-(2-丙炔基)乙酰胺
將吡啶(16.3ml)和乙酸酐(10.4ml)加到冰冷卻的丙炔基胺(3023mg)的二氯甲烷(30ml)溶液中，并將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。將反應(yīng)混合物倒在冰上，用乙酸乙酯萃取，依次用1N鹽酸，飽和的碳酸氫鈉水溶液，及飽和的鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后通過硅膠進(jìn)行過濾。將濾液減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物(743mg)。所得化合物無需進(jìn)一步純化即可用于下面的反應(yīng)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)1.79(3H，s)，3.07(1H，t)，3.81(2H，d)，8.25(1H，brs)。
實(shí)施例B60N-{3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔基}乙酰胺 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與實(shí)施例B59的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)1.79(3H，s)，4.04(2H，s)，4.61(2H，s)，7.45-7.68(4H，m)，7.68-7.75(2H，m)，7.90-8.00(1H，m)，8.25-8.38(2H，m)，8.40-8.45(1H，m)。
實(shí)施例B61N-{3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]丙基}乙酰胺 按與實(shí)施例B43相同的方式，通過處理實(shí)施例B60的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.95(3H，s)，1.74-1.84(2H，m)，2.55(2H，t)，3.25(2H，dt)，4.68(2H，s)，7.10(2H，d)，7.18(2H，d)，7.20-7.28(1H，m)，7.50-7.58(2H，m)，7.60-7.68(1H，m)，7.75-7.85(1H，m)，8.10-8.16(1H，m)，8.45-8.50(1H，m)。
實(shí)施例B62N-(2-丙炔基)甲磺酰胺 將三乙胺(9.77ml)加到冰冷卻的丙炔基胺(3023mg)的二氯甲烷(30ml)溶液中。滴加甲磺酰氯(5.19ml)之后，將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌3小時(shí)，溫暖至室溫，進(jìn)一步攪拌2小時(shí)。將冰架的反應(yīng)混合物中，所的混合物用乙酸乙酯萃取，用飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，并減壓濃縮。將剩余物溶解于甲醇(120ml)，加入碳酸鉀(11.7g)，并將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。將反應(yīng)混合物減壓濃縮，在冰冷卻下用稀鹽酸中和，然后用乙酸乙酯萃取。萃取液用飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(6.67g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.39(1H，t)，3.10(3H，s)，3.99(2H，dd)，4.60(1H，brs)。
實(shí)施例B63N-{3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔基}-甲磺酰胺 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與實(shí)施例B62的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)2.97(3H，s)，4.00(2H，d)，4.63(2H，s)，7.25-7.37(4H，m)，7.57(1H，t)，7.62(1H，dd)，7.71(1H，d)，7.73(1H，dd)，7.94(1H，d)，8.28(1H，d)，8.42(1H，d)。
實(shí)施例B64N-{3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]丙基}甲磺酰胺
按與實(shí)施例B43相同的方式，通過處理實(shí)施例B63的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.80-1.90(2H，m)，2.62(2H，t)，2.89(3H，s)，3.11(2H，dt)，4.25(1H，brs)，4.64(2H，s)，7.05(2H，d)，7.20(2H，d)，7.50(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.15(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B651-{4-[3-(乙基磺酰基)-1-丙炔基]芐基}異喹啉 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與丙炔基乙基硫化物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.30(3H，t)，2.73(2H，q)，3.47(2H，s)，4.67(2H，s)，7.20-7.32(4H，m)，7.52(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.08(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B66N-(2-丙炔基)氨基甲酸叔丁酯 將焦碳酸二叔丁酯(di-t-butyl-dicarbonate)(10.84g)的四氫呋喃(20ml)溶液滴加到冰冷卻的丙炔基胺(3040mg)的四氫呋喃(20ml)溶液中，將混合物的溫度逐步升高至室溫，并將反應(yīng)混合物攪拌20小時(shí)。加水之后，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯萃取，用飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮得到標(biāo)題化合物(9.34g)。所得化合物無需進(jìn)一步純化即可用于下面的反應(yīng)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)1.36(9H，s)，3.04(1H，t)，3.62-3.70(2H，m)，7.20-7.30(1H，m)
實(shí)施例B67N-{3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔基}-氨基甲酸叔丁酯 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與實(shí)施例B66的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.45(9H，s)，4.06-4.13(2H，m)，4.66(2H，s)，7.19(2H，d)，7.20-7.28(1H，m)，7.29(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.08(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B68N-{3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]丙基}氨基甲酸叔丁酯 按與實(shí)施例B43相同的方式，通過處理實(shí)施例B67的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.43(9H，s)，1.70-1.81(2H，m)，2.54-2.60(2H，m)，3.01-3.20(2H，m)，4.47-4.57(1H，m)，4.65(2H，s)，7.07(2H，d)，7.21(2H，d)，7.55(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.18(1H，d)，8.51(1H，d)。
實(shí)施例B693-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔-1-胺 將三氟乙酸(0.3ml)加到冰冷卻的實(shí)施例B67的化合物(4mg)的二氯甲烷(0.6ml)溶液中，并將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌1小時(shí)。加入飽和的碳酸氫鈉水溶液之后，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯萃取，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(4mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.60-3.68(2H，m)，4.66(2H，s)，7.19(2H，d)，7.29(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.10(1H，d)，8.49(1H，d)。
在NMR光譜中未觀察到胺質(zhì)子。
實(shí)施例B703-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-1-丙胺 按與實(shí)施例B69相同的方式，通過處理實(shí)施例B68的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.20-1.30(2H，m)，1.78-1.88(2H，m)，2.45-2.52(2H，m)，2.73-2.81(2H，m)，4.55(2H，s)，6.94(2H，d)，7.08(2H，d)，7.50(1H，dd)，7.51(1H，d)，7.61(1H，dd)，7.76(1H，d)，8.10(1H，d)，8.38(1H，d)。
實(shí)施例B71N-甲基-N-(2-丙炔基)乙酰胺 按與實(shí)施例B59相同的方式，通過處理N-甲基-N-(2-丙炔基)胺，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.11(2.1H，s)，2.17(0.9H，s)，2.21(0.7H，t)，2.31(0.3H，t)，3.00(0.9H，s)，3.08(2.1H，s)，4.04(0.6H，d)，4.23(1.4H，d)。
所得化合物包含該酰胺的幾何異構(gòu)體的7∶3混合物。
實(shí)施例B72N-{3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔基}-N-甲基-乙酰胺
按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與實(shí)施例B71的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.10(1.8H，s)，2.11(1.2H，s)，3.01(1.2H，s)，3.10(1.8H，s)，4.21(1.2H，s)，4.41(0.8H，s)，4.67(2H，s)，7.18-7.23(2H，m)，7.29-7.32(2H，m)，7.53(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.09(1H，d)，8.49(1H，d)。
所得化合物包含該酰胺的幾何異構(gòu)體的3∶2混合物。
實(shí)施例B73N-{3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]丙基}-N1-甲基乙酰胺 按與實(shí)施例B43相同的方式，通過處理實(shí)施例B72的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.70-1.90(2H，m)，1.89(1.5H，s)，2.03(1.5H，s)，2.50-2.59(2H，m)，2.88(1.5H，s)，2.91(1.5H，s)，3.20-3.25(1H，m)，3.36-3.40(1H，m)，4.66(2H，s)，7.03-7.10(2H，m)，7.18-7.30(2H，m)，7.53(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.66(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.17(1H，d)，8.50(1H，d)。
所得化合物包含該酰胺的幾何異構(gòu)體的1∶1混合物。
實(shí)施例B74N-甲基-N-(2-丙炔基)甲磺酰胺 將三乙胺(6.55ml)加到冰冷卻的N-甲基-N-(2-丙炔基)胺(2603mg)的二氯甲烷(25ml)溶液中。進(jìn)一步滴加甲磺酰氯(3.50ml)，將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌1小時(shí)，然后在室溫性愛進(jìn)一步攪拌2小時(shí)。加冰之后，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯萃取，依次用1N鹽酸，飽和的碳酸氫鈉水溶液，及飽和的鹽水，用無水硫酸鎂干燥，然后通過硅膠進(jìn)行過濾。將濾液減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物(4522mg)。所得化合物無需進(jìn)一步純化即可用于下面的反應(yīng)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.41(1H，t)，2.93(3H，s)，2.96(3H，s)，4.09(2H，d)。
實(shí)施例B75N-{3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔基}-N-甲基甲磺酰胺 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與實(shí)施例B74的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.95(3H，s)，2.97(3H，s)，4.26(2H，s)，4.68(2H，s)，7.24(2H，d)，7.31(2H，d)，7.55(1H，dd)，7.59(1H，d)，7.66(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.10(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B76N-{3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]丙基}-N-甲基甲磺酰胺 按與實(shí)施例B43相同的方式，處理實(shí)施例B75的化合物，所得剩余物通過LC-MS[洗脫劑含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液∶含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分鐘循環(huán)，流速20ml/分鐘，柱子YMC CombiprepODS-AM，Φ20mm×50mm(長)]純化與分離，得到標(biāo)題化合物。
MS m/z(ESIMH+)369.2實(shí)施例B775-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-4-戊炔-2-醇
按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與4-戊炔-2-醇，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.27(3H，t)，2.38-2.62(2H，m)，3.95-4.03(1H，m)，4.65(2H，s)，7.19(2H，d)，7.29(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.08(1H，d)，8.48(1H，d)。
在NMR光譜中未觀察到羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例B785-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-戊醇 按與實(shí)施例B43相同的方式處理實(shí)施例B77的化合物，所得剩余物通過LC-MS[洗脫劑含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液∶含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分鐘循環(huán)，流速20ml/分鐘，柱子YMC Combiprep ODS-AM，Φ20mm×50mm(長)]純化與分離，得到標(biāo)題化合物。
MS m/z(ESIMH+)306.2實(shí)施例B793-丁基苯酚 按與實(shí)施例B40相同的方式，通過處理1-丁基-3-甲氧基苯，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.94(3H，t)，1.30-1.55(2H，m)，1.55-1.62(2H，m)，2.56(2H，t)，4.76(1H，brs)，6.63(1H，dd)，6.66(1H，d)，6.75(1H，d)，7.12(1H，dd)。
實(shí)施例B80
1-丁基-3-(甲氧基甲氧基)苯 將60％分散于礦物油(102mg)中的氫化鈉溶液加到冰冷卻的實(shí)施例B79的化合物(318mg)的二甲基甲酰胺(5ml)溶液中，并將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌30分鐘。再次將混合物在冰上冷卻，加入氯甲基甲基醚(0.18ml)，并將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌12小時(shí)。加水之后，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯萃取，用飽和的碳酸氫鈉水溶液及飽和的鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后通過硅膠進(jìn)行過濾。將濾液減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物(341mg)。所得化合物無需進(jìn)一步純化即可用于下面的反應(yīng)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.94(3H，t)，1.30-1.42(2H，m)，1.55-2.04(2H，m)，2.58(2H，t)，3.49(3H，s)，5.17(2H，s)，6.80-6.87(3H，m)，7.18(1H，dd)。
實(shí)施例B814-丁基-2-(甲氧基甲氧基)苯甲醛 將叔丁基鋰的戊烷溶液(1.51M，10.6ml)滴加到冷卻至-20℃的實(shí)施例B80的化合物(2396mg)的石油醚溶液中，將該反應(yīng)混合物在-10℃～0℃的溫度下攪拌1.5小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至-70℃，加入無水乙醚(17ml)和二甲基甲酰胺(1.91ml)，并將所得混合物在該溫度下攪拌3小時(shí)，然后再在室溫下攪拌1小時(shí)。將反應(yīng)混合物在冰上冷卻，加入飽和的氯化銨水溶液，并將該混合物用乙酸乙酯萃取。萃取液用飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化得到標(biāo)題化合物(1821mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.94(3H，t)，1.32-1.42(2H，m)，1.57-1.65(2H，m)，2.64(2H，t)，3.54(3H，s)，5.29(2H，s)，6.91(1H，d)，7.01(1H，s)，7.76(1H，d)，10.44(1H，s)。
實(shí)施例B82 (1-異喹啉基)甲醇 將氫氧化鈉水溶液(50％，1.4ml)加到1-氰基-苯甲?；?1，2-二氫異喹啉(815mg)(根據(jù)Org.Synth.，IV，155(1988)合成的)，實(shí)施例B81的化合物(869mg)，以及三乙基芐基氯化銨(7mg)的二氯甲烷(1.6ml)溶液中，使反應(yīng)混合物在水浴中進(jìn)行10分鐘的超聲波處理。加入二氯甲烷(8.3ml)和乙醇(4.4ml)之后，將反應(yīng)混合物再在水浴中進(jìn)行85分鐘的超聲波處理。加水并用二氯甲烷萃取所得反應(yīng)混合物。萃取液用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(1144mg)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)0.86(3H，t)，1.22-1.31(2H，m)，1.44-1.52(2H，m)，2.44-2.51(2H，m)，3.16(3H，s)，5.10(1H，d)，5.12(1H，d)，6.72(1H，s)，6.75(1H，d)，6.84(1H，s)，7.21(1H，d)，7.61(1H，dd)，7.72(1H，dd)，7.74(1H，d)，7.95(1H，d)，8.31(1H，d)，8.42(1H，d)。
在NMR光譜中未觀察到羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例B83[4-丁基-2-(甲氧基甲氧基)苯基](1-異喹啉基)乙酸甲酯 按與實(shí)施例B38相同的方式，通過處理實(shí)施例B82的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.28-1.40(2H，m)，1.50-1.60(2H，m)，2.22(3H，s)，2.54(2H，t)，3.41(3H，s)，5.22(1H，d)，5.26(1H，d)，6.77(1H，d)，6.94(1H，s)，7.29(1H，d)，7.55(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.70(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.05(1H，s)，8.35(1H，d)，8.55(1H，d)。
實(shí)施例B841-[4-丁基-2-(甲氧基甲氧基)芐基]異喹啉
按與實(shí)施例B39相同的方式，通過處理實(shí)施例B83的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.28-1.37(2H，m)，1.50-1.58(2H，m)，2.53(2H，t)，3.46(3H，s)，4.65(2H，s)，5.24(2H，s)，6.66(1H，dd)，6.89(1H，d)，6.92(1H，d)，7.51(1H，dd)，7.53(1H，d)，7.62(1H，dd)，7.79(1H，d)，8.23(1H，d)，8.47(1H，d)。
實(shí)施例B855-丁基-2-(1-異喹啉基甲基)苯酚 將5N鹽酸(1.0ml)加到實(shí)施例B84的化合物(88mg)的甲醇(1.5ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌14小時(shí)。將反應(yīng)混合物用5N的氫氧化鈉水溶液中和，用磷酸鹽緩沖液將pH調(diào)整至6.8，并用乙酸乙酯萃取。萃取液用無水硫酸鎂干燥并減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物(44mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.23-1.37(2H，m)，1.48-1.60(2H，m)，2.51(2H，t)，4.56(2H，s)，6.65(1H，dd)，6.82(1H，d)，7.21(1H，d)，7.55(1H，d)，7.68(1H，dd)，7.72(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.35(1H，d)，8.44(1H，d)。
在NMR光譜中未觀察到羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例B86N-{3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔基}-N，N-二甲基胺 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與1-二甲基氨基-2-丙炔，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.04(3H，s)，2.34(3H，s)，3.47(2H，s)，4.66(2H，s)，7.20(2H，d)，7.32(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.10(1H，d)，8.50(1H，d)。
實(shí)施例B871-{4-[3-(四氫-2H-2-吡喃氧基)-1-丙炔基]芐基}異喹啉 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與四氫-2-(2-丙炔氧基)-2H-吡喃，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.45-1.85(6H，m)，3.50-3.60(1H，m)，3.84-3.90(1H，m)，4.42(1H，d)，4.48(1H，d)，4.66(2H，8)，4.87(1H，dd)，7.15-7.21(2H，m)，7.33-7.36(2H，m)，7.50-7.70(3H，m)，7.81-7.86(1H，m)，8.07-8.10(1H，m)，8.48-8.51(1H，m)。
實(shí)施例B883-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-丙炔-1-醇 按與實(shí)施例B47相同的方式，通過處理實(shí)施例B87的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.20-1.30(1H，m)，4.46(2H，s)，4.67(2H，s)，7.23(2H，d)，7.31(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.09(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B89N，N-二甲基-4-戊炔酰胺
將二甲胺(2M的四氫呋喃溶液，8.53ml)，三乙胺(2.59ml)，及1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(3221mg)加到4-戊炔酸(552mg)的二氯甲烷(150ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。反應(yīng)混合物依次用1N鹽酸，飽和的碳酸氫鈉水溶液，水，及飽和的鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物(129mg)。所得化合物無需進(jìn)一步純化即可用于下面的反應(yīng)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.96-1.99(1H，m)，2.50-2.60(4H，m)，2.96(3H，s)，3.02(3H，s)。
實(shí)施例B90N，N-二甲基-5-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-4-戊炔酰胺 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與實(shí)施例B89的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.59-2.64(2H，m)，2.71-2.75(2H，m)，2.96(3H，s)，3.03(3H，s)，4.66(2H，s)，7.18(2H，d)，7.28(2H，d)，7.43-7.70(3H，m)，7.90(1H，d)，8.09(1H，d)，8.50(1H，d)。
實(shí)施例B911-甲基-2-丙炔基四氫-2H-2-吡喃基醚 將3，4-二氫-2H-吡喃(7.15ml)和對(duì)甲苯磺酸吡啶鹽(2187mg)加到3-丁炔-2-醇(3051mg)的二氯甲烷(150ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌29小時(shí)。反應(yīng)混合物依次用飽和的碳酸氫鈉水溶液，水，及飽和的鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(4698mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.45(1.05H，d)，1.48(1.95H，d)，1.50-1.90(6H，m)，2.37(0.65H，d)，2.43(0.35H，d)，3.50-3.60(1.3H，m)，3.80-3.86(0.7H，m)，4.4-3-4.50(0.35H，m)，4.52-4.60(0.65H，m)，4.77(0.35H，t)，4.94(0.65H，t)。
實(shí)施例B921-{4-[3-(四氫-2H-2-吡喃氧基)-1-丁炔基]芐基}異喹啉 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與實(shí)施例B91的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.40-1.80(6H，m)，1.49(1.05H，d)，1.52(1.95H，d)，3.49-3.60(1H，m)，3.80-3.88(0.65H，m)，3.99-4.06(0.35H，m)，4.65(2H，s)，4.74(1H，q)，4.83(0.35H，t)，4.97(0.65H，t)，7.18-7.22(2H，m)，7.32(2H，d)，7.54(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.08(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B934-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-3-丁炔-2-醇 按與實(shí)施例B47相同的方式，通過處理實(shí)施例B92的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.53(3H，d)，2.15(1H，brs)，4.68(2H，s)，4.72(1H，q)，7.21(2H，d)，7.31(2H，d)，7.54(1H，dd)，7.59(1H，d)，7.66(1H，dd)，7.84(1H，d)，8.10(1H，d)，8.51(1H，d)。
實(shí)施例B94
4-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-丁醇 按與實(shí)施例B43相同的方式處理實(shí)施例B93的化合物，所得剩余物通過LC-MS[洗脫劑含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液∶含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分鐘循環(huán)，流速20ml/分鐘，柱子YMC Combiprep ODS-AM，Φ20mm×50mm(長)]純化與分離，得到標(biāo)題化合物。
MS m/z(ESIMH+)292.2實(shí)施例B952-甲基-4-戊炔-2-醇 將乙炔化鋰-乙二胺復(fù)合物逐步加到冷卻至0℃的1，1-二甲基環(huán)氧乙烷(1889mg)于四氫呋喃(13ml)和二甲亞砜(20ml)的混合溶液中，將該反應(yīng)混合物在0℃下攪拌5小時(shí)。加水之后，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯萃取，用飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后通過硅膠進(jìn)行過濾。將濾液減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物(3316mg)。該化合物無需進(jìn)一步純化即可用于下列反應(yīng)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.33(6H，s)，2.09(1H，t)，2.38(2H，t)。
在MR光譜中未觀察到羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例B965-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-甲基-4-戊炔-2-醇 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與實(shí)施例B95的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)1.18(6H，s)，2.28(1H，s)，2.42(2H，s)，4.62(2H，s)，7.10-7.30(4H，m)，7.62(1H，dd)，7.71(1H，d)，7.72(1H，dd)，7.94(1H，d)，8.27(1H，d)，8.42(1H，d)。
實(shí)施例B975-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-甲基-2-戊醇 按與實(shí)施例B43相同的方式，處理實(shí)施例B96的化合物，所得剩余物通過LC-MS[洗脫劑含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液∶含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分鐘循環(huán)，流速20ml/分鐘，柱子YMC CombiprepODS-AM，Φ20mm×50mm(長)]純化與分離，得到標(biāo)題化合物。
MS m/z(ESIMH+)320.2實(shí)施例B984-芐氧基-2-(甲氧基甲氧基)苯甲醛 將N，N-二異丙基乙基胺(1.98ml)和氯甲基甲基醚(0.76ml)加到4-芐氧基-2-羥基苯甲醛(2071mg)的四氫呋喃(30ml)溶液中，并在加熱回流下將該反應(yīng)混合物攪拌19小時(shí)。進(jìn)一步加入N，N-二異丙基乙基胺(2.7ml)和氯甲基甲基醚(1.04ml)，并再次將所的混合物化熱回流攪拌10小時(shí)。加水之后，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯萃取，用飽和的氯化銨水溶液及飽和的鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后通過硅膠和氧化鋁過濾。將濾液減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物(2470mg)。該化合物無需純化即可用于下列反應(yīng)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.52(3H，s)，5.12(2H，s)，5.27(2H，s)，6.68(1H，dd)，6.80(1H，d)，7.33-7.45(5H，m)，7.82(1H，d)，10.33(1H，s)。
實(shí)施例B99[4-(芐氧基)-2-(甲氧基甲氧基)苯基](1-異喹啉基)甲醇
按與實(shí)施例B82相同的方式，通過處理實(shí)施例B98的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)3.16(3H，s)，5.01(2H，s)，5.11(1H，d)，5.14(1H，d)，6.59(1H，dd)，6.66-6.70(2H，m)，7.18(1H，d)，7.31(1H，d)，7.34-7.42(4H，m)，7.61(1H，dd)，7.71(1H，d)，7.75(1H，d)，7.95(1H，d)，8.28(1H，d)，8.43(1H，d)。
在NMR光譜中未觀察到羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例B100[4-(芐氧基)-2-(甲氧基甲氧基)苯基](1-異喹啉基)乙酸甲酯 按與實(shí)施例B38相同的方式，通過處理實(shí)施例B99的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.21(3H，s)，3.42(3H，s)，4.98(1H，d)，5.00(1H，d)，5.21-5.27(2H，m)，6.54(1H，dd)，6.81(1H，d)，7.25(1H，d)，7.30-7.41(5H，m)，7.53(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.80(1H，d)，8.00(1H，s)，8.29(1H，d)，8.55(1H，d)。
實(shí)施例B1014-(1-異喹啉基甲基)-3-(甲氧基甲氧基)苯酚 按與實(shí)施例B39相同的方式，通過處理實(shí)施例B100的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)3.36(3H，s)，4.44(2H，s)，5.17(2H，s)，6.22(1H，d)，6.52(1H，s)，6.67(1H，d)，7.57-7.76(3H，m)，7.92(1H，d)，8.22(1H，d)，8.37(1H，d)，9.24(1H，brs)。
實(shí)施例B1024-(1-異喹啉基甲基)-3-(甲氧基甲氧基)苯基三氟甲磺酸酯 按與實(shí)施例B41相同的方式，通過處理實(shí)施例B101的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.43(3H，s)，4.65(2H，s)，5.24(2H，s)，6.77(1H，dd)，7.04(1H，d)，7.07(1H，d)，7.54-7.61(2H，m)，7.67(1H，dd)，7.84(1H，d)，8.16(1H，d)，8.47(1H，d)。
實(shí)施例B1031-{2-(甲氧基甲氧基)-[4-(四氫-2H-2-吡喃氧基)-1-丁炔基]芐基}異喹啉 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B102的化合物與2-(3-丁炔氧基)四氫-2H-吡喃，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.51-1.90(6H，m)，2.68(2H，t)，3.50(3H，s)，3.49-3.55(1H，m)，3.58-3.65(1H，m)，3.84-3.94(2H，m)，4.63-4.68(1H，m)，4.65(2H，s)，5.23(2H，s)，6.76(1H，dd)，7.04(1H，d)，7.07(1H，d)，7.49-7.69(3H，m)，7.81(1H，d)，8.14(1H，d)，8.47(1H，d)。
實(shí)施例B1045-(4-羥基-1-丁炔基)-2-(1-異喹啉基甲基)苯酚
按與實(shí)施例B85相同的方式，通過處理實(shí)施例B103的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.80(1H，brs)，2.66(2H，t)，3.73-3.82(2H，m)，4.58(2H，s)，6.87(1H，d)，7.04(1H，s)，7.23(1H，d)，7.60(1H，d)，7.69-7.78(2H，m)，7.86(1H，d)，8.37(1H，d)，8.42(1H，d)。
在NMR光譜中未發(fā)現(xiàn)酚羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例B1051-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基{4-[4-(1-異喹啉基甲基)-苯基]-2-甲基-3-丁炔基}醚 將三苯基膦(18.37g)加到冰冷卻的四溴化碳(11.19g)的二氯甲烷(60ml)溶液中，并將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌1小時(shí)。滴加3-{[1-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基]氧基}-2-甲基丙醇(根據(jù)Tetrahedron Lett.，4347(1979)制備)的二氯甲烷(14ml)溶液，并將所得反應(yīng)混合物進(jìn)一步攪拌1小時(shí)。將反應(yīng)混合物用二氯甲烷稀釋，依次用飽和的碳酸氫鈉水溶液，飽和的氯化銨水溶液及飽和的鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。向剩余物中加入乙醚，濾除不溶物，并將濾液減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到叔丁基[(4，4-二溴-2-甲基-3-丁烯基)氧基]-二甲基硅烷(2385mg)。
下一步，將2.47M的正丁基鋰己烷溶液(3.15ml)滴加到冷卻至-70℃的叔丁基[(4，4-二溴-2-甲基-3-丁烯基)氧基]二甲基硅烷(1326mg)的四氫呋喃(10ml)溶液中，并將混合物在該溫度下攪拌1小時(shí)。進(jìn)一步加入飽和的氯化銨水溶液，并將所得的混合物溫暖至室溫。加水之后，用乙醚萃取反應(yīng)混合物。乙醚層用飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后通過硅膠進(jìn)行過濾。將濾液減壓濃縮。按與實(shí)施例B42相同的方式，處理所得剩余物和實(shí)施例B41的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.07(6H，s)，0.90(9H，s)，1.18(3H，d)，2.70-2.80(1H，m)，3.47(1H，dd)，3.70(1H，dd)，4.65(2H，s)，7.16(2H，d)，7.27(2H，d)，7.51(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.07(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B1064-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-甲基-3-丁炔-1-醇 按與實(shí)施例B47相同的方式，通過處理實(shí)施例B105的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)1.11(3H，d)，2.60-2.70(1H，m)，3.28(1H，d)，3.44(1H，d)，4.58(2H，s)，4.85-4.90(1H，m)，7.23(4H，s)，7.61(1H，dd)，7.70(1H，d)，7.71(1H，dd)，7.93(1H，d)，8.25(1H，d)，8.42(1H，d)。
實(shí)施例B1071-{[1-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基]氧基}-3-丁炔-2-醇 在氮?dú)夥障拢瑢⒁胰不寤V的四氫呋喃溶液(0.5M，90ml)加到冷卻至-78℃的無水四氫呋喃(20ml)中。滴加叔丁基二甲基甲硅烷氧基乙醛(6000mg)的四氫呋喃(30ml)溶液，并將所得的混合物在-78℃下攪拌45分鐘，溫暖至室溫，攪拌1小時(shí)40分鐘，然后在冰上冷卻。加入飽和的氯化銨水溶液之后，用乙醚萃取反應(yīng)混合物，用水及飽和的鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后通過硅膠進(jìn)行過濾。將濾液減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物(8.55g)。該化合物無需純化即可用于下列反應(yīng)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.08(6H，s)，0.91(9H，s)，2.43(1H，d)，2.60-2.66(1H，m)，3.65-3.70(1H，m)，3.73-3.81(1H，m)，4.38-4.42(1H，m)。
實(shí)施例B1081-{[1-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基]氧基}甲基)-2-丙炔基乙酸酯 按與實(shí)施例B38相同的方式，通過處理實(shí)施例B107的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.08(6H，s)，0.90(9H，s)，2.11(3H，s)，2.44(1H，d)，3.80-3.88(2H，m)，5.41-5.55(1H，m)。
實(shí)施例B1094-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-3-丁炔-1，2-二醇 按與實(shí)施例B42相同的方式，處理實(shí)施例B41的化合物和實(shí)施例B108的化合物，得到偶聯(lián)產(chǎn)物。按與實(shí)施例B47相同的方式，通過去除偶聯(lián)產(chǎn)物的羥基保護(hù)基，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)3.40-3.45(1H，m)，3.70-3.82(1H，m)，4.30-4.35(1H，m)，4.63(2H，s)，4.90(1H，t)，5.46(1H，d)，7.25-7.30(4H，m)，7.62(1H，dd)，7.71(1H，d)，7.73(1H，dd)，7.94(1H，d)，8.28(1H，d)，8.43(1H，d)。
實(shí)施例B1101-{4-[2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)-1-乙炔基]芐基}-異喹啉 將2，2-二甲氧基丙烷(0.36ml)，10-樟腦磺酸(43mg)，及分子篩(4)加到實(shí)施例B109的化合物(34mg)的二甲基甲酰胺(2ml)溶液中，并將該反應(yīng)混合物在75℃下攪拌9小時(shí)。加入飽和的碳酸鈉水溶液之后，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯萃取，用水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(14mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.40(3H，s)，1.50(3H，s)，3.97(1H，dd)，4.21(1H，dd)，4.66(2H，s)，4.91(1H，dd)，7.19(2H，d)，7.32(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.65-7.78(2H，m)，8.08(1H，d)，8.09(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B111叔丁基{[2-(1-乙氧基乙氧基)-3-丁炔基]氧基}二甲基硅烷 將乙基乙烯基醚(1.21ml)and對(duì)甲苯磺酸吡啶鹽(317mg)加到1-{[1-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基]氧基}-3-丁炔-2-醇(1687mg)的二氯甲烷(90ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。二氯甲烷層用飽和的碳酸氫鈉水溶液及飽和的鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物(1962mg)。該化合物無需純化即可用于下列反應(yīng)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)0.00(6H，s)，0.81(9H，s)，1.01-1.07(3H，m)，1.10-1.20(1H，m)，1.18(3H，d)，3.35-3.63(4H，m)，4.18-4.27(1H，m)，4.74(0.5H，q)，4.81(0.5H，q)。
實(shí)施例B1121-{4-[4-{[1-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基]氧基}-3-(1-乙氧基乙氧基)-1-丁炔基]芐基}異喹啉 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與實(shí)施例B111的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)0.00(6H，s)，0.80(9H，s)，1.01-1.05(3H，m)，1.19(3H，d)，3.39-3.70(4H，m)，4.41(0.5H，t)，4.48(0.5H，t)，4.59(2H，s)，4.79(0.5H，q)，4.87(0.5H，q)，7.20-7.30(4H，m)，7.58(1H，dd)，7.68(1H，d)，7.69(1H，dd)，7.91(1H，d)，8.24(1H，d)，8.38(1H，d)。
實(shí)施例B1131-{[1-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基]氧基}4-[4-(1-異喹啉基-甲基)苯基]-3-丁炔-2-醇 將對(duì)甲苯磺酸吡啶鹽(486mg)加到實(shí)施例B112的化合物(474mg)的甲醇(15ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。加入乙酸乙酯之后，將反應(yīng)混合物用飽和的碳酸氫鈉水溶液及飽和的鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(265mg)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)0.01(6H，s)，0.82(9H，s)，3.55-3.62(2H，m)，4.30-4.39(1H，m)，4.61(2H，s)，5.51(1H，d)，7.20-7.27(4H，m)，7.50-7.63(1H，m)，7.67-7.74(2H，m)，7.92(1H，d)，8.27(1H，d)，8.41(1H，d)。
實(shí)施例B1141-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基{2-氟-4-[4-(1-異喹啉基-甲基)苯基]-3-丁炔基}醚 在氮?dú)夥障?，將?shí)施例B113的化合物(116mg)的二氯甲烷(2ml)溶液滴加到冷卻至-78℃的(二乙基氨基)三氟化硫(44μl)的二氯甲烷(2ml)溶液中。攪拌15分鐘之后，將反應(yīng)混合物在室溫下再攪拌8小時(shí)。加入飽和的碳酸氫鈉水溶液，所得的反應(yīng)混合物用二氯甲烷萃取。二氯甲烷層用水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(42mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.10(6H，s)，0.91(9H，s)，3.83-4.00(2H，m)，4.67(2H，s)，5.17(1H，ddd)，7.22(2H，d)，7.34(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.08(1H，d)，8.50(1H，d)。
實(shí)施例B1152-氟-4-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-3-丁炔-1-醇 按與實(shí)施例B47相同的方式，通過處理實(shí)施例B114的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.31(1H，brs)，3.77-3.95(2H，m)，4.67(2H，s)，5.35(1H，ddd)，7.22(2H，d)，7.35(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.07(1H，d)，8.50(1H，d)。
實(shí)施例B1161-(叔丁基)-1，1-二甲基甲硅烷基{6-[4-(1-異喹啉基甲基)-苯基]-5-己炔基}醚 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與叔丁基(5-己炔基氧基)二甲基硅烷，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.04(6H，s)，0.88(9H，s)，1.55-1.70(4H，m)，2.39(2H，t)，3.64(2H，t)，4.65(2H，s)，7.17(2H，d)，7.27(2H，d)，7.51(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.08(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B1176-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-5-己炔-1-醇
按與實(shí)施例B47相同的方式，通過處理實(shí)施例B116的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.60-1.80(4H，m)，2.42(2H，t)，3.69(2H，t)，4.65(2H，s)，7.17(2H，d)，7.27(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.08(1H，d)，8.49(1H，d)。
在NMR光譜中未觀察到羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例B1186-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-1-己醇 按與實(shí)施例B43相同的方式處理實(shí)施例B117的化合物，所得剩余物通過LC-MS[洗脫劑含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液∶含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分鐘循環(huán)，流速20ml/分鐘，柱子YMC Combiprep ODS-AM，Φ20mm×50mm(長)]純化與分離，得到標(biāo)題化合物。
MS m/z(ESIMH+)320.2實(shí)施例B1192-(4-戊炔氧基)四氫-2H-吡喃 按與實(shí)施例B91相同的方式，通過處理4-戊炔-1-醇，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.50-1.90(8H，m)，1.95(1H，t)，2.30-2.35(2H，m)，3.46-3.54(2H，m)，3.80-3.90(2H，m)，4.60(1H，dd)。
實(shí)施例B1201-{4-[5-(四氫-2H-2-吡喃氧基)-1-戊炔基]芐基}-異喹啉
按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與實(shí)施例B119的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.49-1.90(8H，m)，2.49(2H，t)，3.47-3.54(2H，m)，3.82-3.90(2H，m)，4.60(1H，dd)，4.65(2H，s)，7.17(2H，d)，7.27(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.09(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B1215-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-4-戊炔-1-醇 按與實(shí)施例B47相同的方式，通過處理實(shí)施例B120的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.80-1.88(2H，m)，2.51(2H，t)，3.80(2H，t)，4.65(2H，s)，7.18(2H，d)，7.29(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.09(1H，d)，8.49(1H，d)。
在NMR光譜中未觀察到羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例B1225-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-4-戊炔基氰化物 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與5-氰基-1-戊炔，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.85-1.98(2H，m)，2.40-2.60(4H，m)，4.66(2H，s)，7.20(2H，d)，7.28(2H，d)，7.53(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.65(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.09(1H，d)，8.50(1H，d)。
實(shí)施例B1231-[4-(3-甲基-1-丁炔基)芐基]異喹啉 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與3-甲基-1-丁炔，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.23(6H，d)，2.70-2.78(1H，m)，4.65(2H，s)，7.18(2H，d)，7.28(2H，d)，7.51(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.08(1H，d)，8.50(1H，d)。
實(shí)施例B1241-[4-(5-甲基-1-己炔基)芐基]異喹啉 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與5-甲基-1-己炔，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(6H，d)，1.47(2H，dt)，1.68-1.77(1H，m)，2.37(2H，t)，4.65(2H，s)，7.17(2H，d)，7.28(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.09(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B1254-戊炔酰胺 將1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二氫喹啉(6775mg)和碳酸氫銨(5905mg)加到4-戊炔酸(2446mg)的氯仿(75ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌17.5小時(shí)。將反應(yīng)混合物用硅藻土過濾并減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(249mg)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)2.21(2H，t)，2.29-2.33(2H，m)，2.73(1H，t)，6.78-6.88(1H，m)，7.28-7.38(1H，m)。
實(shí)施例B1265-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-4-戊炔酸酰胺 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與實(shí)施例B125的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)2.51(2H，t)，2.85(2H，t)，3.70(2H，brs)，4.59(2H，s)，7.05(2H，d)，7.23(2H，d)，7.61(1H，dd)，7.70(1H，d)，7.72(1H，dd)，7.94(1H，d)，8.30(1H，d)，8.43(1H，d)。
實(shí)施例B1274-戊炔酸叔丁酯 將芐基三乙基氯化銨(5.92g)，碳酸鉀(93.4g)，及叔丁基溴(143ml)加到4-戊炔酸(2550mg)的N，N-二甲基乙酰胺(230ml)溶液中，并將該反應(yīng)混合物在55℃下攪拌24小時(shí)。加水之后，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯萃取，用水洗滌，用無水氯化鎂干燥，然后通過硅膠進(jìn)行過濾。將濾液減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物(2.10g)。該化合物無需純化即可用于下列反應(yīng)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.46(9H，s)，1.96-1.97(1H，m)，2.45-2.47(4H，m)。
實(shí)施例B1285-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-4-戊炔酸叔丁酯
按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B41的化合物與實(shí)施例B127的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.45(9H，s)，2.49(2H，t)，2.64(2H，t)，4.64(2H，s)，7.21(2H，d)，7.26(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.57(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.09(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B1295-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-4-戊炔酸 按與實(shí)施例B69相同的方式，處理實(shí)施例B128的化合物，所得剩余物通過LC-MS[洗脫劑含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液∶含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分鐘循環(huán)，流速20ml/分鐘，柱子YMC CombiprepODS-AM，Φ20mm×50mm(長)]純化與分離，得到標(biāo)題化合物。
MS m/z(ESIMH+)316.1下列的化合物合成如下。即根據(jù)實(shí)施例B33，用下述各種反應(yīng)物處理實(shí)施例B41的化合物，得到標(biāo)題化合物。該各種反應(yīng)物為丙烯酰胺，N，N-二甲基丙烯酰胺，丙烯酸叔丁酯，及甲基乙烯基砜。此外，將按此方式得到的偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)施例B39的還原或者實(shí)施例B40的叔丁酯去保護(hù)，或者二者均進(jìn)行。所得產(chǎn)物通過硅膠柱色譜或通過LC-MS[洗脫劑含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液∶含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分鐘循環(huán)，流速20ml/分鐘，色譜柱YMC Combiprep ODS-AM，20mm(Φ)×50mm(長)]進(jìn)行純化。
實(shí)施例B130
(E)-3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-丙烯酰胺 MS m/z(ESIMH+)289.3實(shí)施例B1313-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-丙酰胺 MS m/z(ESIMH+)291.2實(shí)施例B132N，N二甲基-(E)-3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-丙烯酰胺 MS m/z(ESIMH+)317.3實(shí)施例B133N，N-二甲基-3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]丙酰胺 MS m/z(ESIMH+)319.1實(shí)施例B134(E)-3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-丙烯酸叔丁酯
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.51(9H，s)，4.68(2H，s)，6.28(1H，d)，7.27(2H，d)，7.39(2H，d)，7.49-7.60(3H，m)，7.65(1H，dd)，7.82(1H，d)，8.11(1H，d)，8.50(1H，d)。
實(shí)施例B135(E)-3-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-2-丙烯酸 MS m/z(ESIMH+)290.2實(shí)施例B1363-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]丙酸叔丁酯 1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.37(9H，s)，2.47(2H，t)，2.83(2H，t)，4.64(2H，s)，7.07(2H，d)，7.19(2H，d)，7.52(1H，dd)，7.56(1H，d)，7.63(1H，dd)，7.81(1H，d)，8.14(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B1373-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]丙酸 MS m/z(ESIMH+)292.1
實(shí)施例B138(E)-2-[4-(1-異喹啉基甲基)苯基]-1-乙烯基甲基砜 MS m/z(ESIMH+)324.1實(shí)施例B1391-{4-[2-(甲基磺?；?乙基]芐基}異喹啉 MS m/z(ESIMH+)326.1實(shí)施例B1402-苯甲酰基-6，7-二甲氧基-1，2-二氫-1-異喹啉腈 將氰化鉀(1.0g，16mmol)水溶液(2.3ml)和苯甲酰氯(1.1ml，9.5mmol)加到6，7-二甲氧基異喹啉(1.0g，5.3mmol)的二氯甲烷(6.0ml)溶液中，其是根據(jù)Tetrahedron，37(23)，3977(1981)合成的，并將該反應(yīng)混合物在加熱回流下攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用硅藻土過濾，并用二氯甲烷和水洗滌。分出濾液之后，二氯甲烷層依次用水，2N鹽酸，水，及2N氫氧化鈉洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(573mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.92(3H，s)，3.94(3H，s)，5.99(1H，d)，6.51-6.55(2H，m)，6.73(1H，s)，6.85(1H，s)，7.45-7.49(2H，m)，7.53-7.56(1H，m)，7.58-7.61(2H，m)實(shí)施例B1411-(4-丁基芐基)-6，7-二甲氧基異喹啉
按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B140的化合物與實(shí)施例B1的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.51-1.58(2H，m)，2.54(2H，t)，3.88(3H，s)，4.01(3H，s)，4.57(2H，s)，7.05(1H，s)，7.07(2H，d)，7.19(2H，d)，7.32(1H，s)，7.43(1H，d)，8.37(1H，d)實(shí)施例B1421-(3-甲氧基苯基)-2-硝基-1-乙醇 將氫氧化鈉水溶液(1.5g氫氧化鈉(37mmol)溶解于15ml水)滴加到間甲氧基苯甲醛(5.0g，37mmol)與硝基甲烷(4.0ml，73mmol)的甲醇(50ml)溶液中，同時(shí)保持溶液的溫度不高于30℃。然后將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌4小時(shí)。在冰上冷卻之后，加入乙酸水溶液(將冰醋酸(37mmol)溶解于250ml水)，所得反應(yīng)混合物用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯層依次用水和5％的碳酸氫鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(6.09g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.83(3H，s)，4.52(1H，dd)，4.61(1H，dd)，4.76-4.78(1H，m)，5.44-5.48(1H，m)，6.90(1H，dd)，6.96-6.98(2H，m)，7.25-7.34(1H，m)實(shí)施例B1432-氨基-1-(3-甲氧基苯基)-1-乙醇 將鈀-碳(10％，0.64g)和甲酸銨(4.8g)加到實(shí)施例B142的化合物(3.0g，15mmol)于四氫呋喃(43ml)和甲醇(43ml)的混合溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。濾出催化劑，用乙醚稀釋濾液，通過過濾除去沉淀物，并濃縮所得濾液，進(jìn)而得到標(biāo)題化合物(1.82g)。該化合物無需純化即可用于下列反應(yīng)。
實(shí)施例B1442-(4-丁基苯基)乙酸 將亞硫酰氯(4.7ml，66mmol)滴加到4-正丁基芐基醇(9.6g，59mmol)的乙醚(120ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。減壓下除去溶劑，并通過用苯共沸蒸餾除去過量的亞硫酰氯。將剩余物溶解于二甲基亞砜(50ml)，向該溶液中加入氰化鈉(86g，1.8mol)和四正丁基碘化銨(2.2g，5.9mmol)，并將所得混合物在室溫下攪拌16小時(shí)。加水，并用乙酸乙酯萃取該混合物。乙酸乙酯層依次用水及飽和的鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到正丁基苯基乙腈(8.2g)，其為黃色的油狀物。下一步，將濃硫酸(48ml)滴加到水(58ml)中，并將該溶液冷卻至50℃，將上面得到的正丁基苯基乙腈(8.2g)滴加到該溶液中。將所得混合物在加熱回流下攪拌16小時(shí)。冷卻至室溫之后，通過過濾收集沉淀的結(jié)晶，用水洗滌，并將其溶解于0.1N的氫氧化鈉水溶液(200ml)中。加入蘇長巖(Norit)(5g)，并將該混合物攪拌回流2小時(shí)。通過硅藻土濾出蘇長巖之后，將濾液冷卻至室溫并用1N鹽酸酸化，以沉淀結(jié)晶。通過過濾收集沉淀的介晶，用水洗滌，并干燥，得到標(biāo)題化合物(3.5g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.93(3H，t)，1.30-1.40(2H，m)，1.53-1.62(2H，m)，2.59(2H，t)，3.62(2H，s)，7.15(2H，d)，7.20(2H，d)在NMR光譜中未發(fā)現(xiàn)羧基的OH。
實(shí)施例B145N-[2-羥基-2-(3-甲氧基苯基)乙基]-2-(4-丁基苯基)-乙酰胺 將亞硫酰氯(0.76ml，10mmol)加到實(shí)施例B144的化合物(1.0g，5.2mmol)的苯(10ml)溶液中，并將該混合物回流攪拌2小時(shí)。濃縮之后，通過苯的共沸蒸餾除去過量的亞硫酰氯。將所得剩余物與實(shí)施例B143的化合物(0.87g，5.2mmol)溶解于乙醚(5ml)，向其中加入氫氧化鈉水溶液(0.21g的氫氧化鈉溶解于4.2ml水)，并在室溫下劇烈攪拌該混合物30分鐘。分出乙醚層并減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物(600mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.94(3H，t)，1.31-1.40(2H，m)，1.57-1.63(2H，m)，2.60(2H，m)，3.30-3.37(1H，m)，3.56(2H，s)，3.60-3.66(1H，m)，3.80(3H，s)，3.81(1H，d)，4.79-4.81(1H，m)，6.80-6.89(3H，m)，7.10(2H，d)，7.16(2H，d)，7.20-7.25(1H，m)實(shí)施例B1461-(4-丁基芐基)-6-甲氧基異喹啉 將三氯氧磷(1.6ml)加到實(shí)施例B145的化合物(600mg，1.7mmol)的乙腈(15ml)溶液中，并將該混合物回流攪拌1小時(shí)30分鐘。將該混合物在冰上冷卻，用5％的碳酸氫鈉水溶液使之呈堿性，用乙酸乙酯萃取，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(82mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.58(2H，m)，2.53(2H，t)，3.92(3H，s)，4.57(2H，s)，7.05-7.07(3H，m)，7.13-7.18(3H，m)，7.45(1H，d)，8.06(1H，d)，8.41(1H，d)實(shí)施例1471-(4-丁基芐基)-6-異喹啉醇 將47％的氫溴酸溶液加到實(shí)施例B146的化合物(82mg)中，并將該混合物回流攪拌19小時(shí)。將該混合物減壓濃縮，加水，并將所得混合物用碳酸鈉中和，以沉淀結(jié)晶。濾集所得結(jié)晶，用水洗滌，然后干燥，得到標(biāo)題化合物(74mg)。
1H-NMR(CD3OD)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.25-1.34(2H，m)，1.49-1.57(2H，m)，2.52(2H，t)，4.63(2H，s)，7.03-7.13(6H，m)，7.49(1H，d)，8.10(1H，d)，8.18(1H，d)
實(shí)施例B1481-(4-丁基芐基)-6-丙氧基異喹啉 將碳酸銀(40mg，0.14mmol)加到實(shí)施例B147的化合物(20mg，0.069mmol)與1-碘丙烷(0.4ml，4.1mmol)的甲苯(1.0ml)溶液中，并于暗處將該混合物在50℃下攪拌4小時(shí)。冷卻至室溫之后，將該混合物通過硅藻土過濾，并用甲苯與甲醇(9∶1)的混合溶液洗滌。將所得濾液減壓濃縮，并將所得剩余物用硅膠柱色譜進(jìn)行純化，得到標(biāo)題化合物(13mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.08(3H，t)，1.30-1.33(2H，m)，1.51-1.57(2H，m)，1.86-1.91(2H，m)，2.54(2H，t)，4.05(2H，t)，4.58(2H，s)，7.05-7.07(3H，m)，7.14-7.18(3H，m)，7.43-7.44(1H，m)，8.05-8.07(1H，m)，8.40-8.41(1H，m)實(shí)施例B1491-(4-丁基芐基)-6-(2-哌啶子基乙氧基)異喹啉 按與實(shí)施例148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.26-1.36(2H，m)，1.46-1.57(8H，m)，2.50-2.54(6H，m)，2.83-2.86(2H，m)，4.23(2H，t)，4.56(2H，s)，7.04-7.06(3H，m)，7.13-7.17(3H，m)，7.43(1H，d)，8.04(1H，d)，8.40(1H，d)實(shí)施例B150N-({[1-(4-丁基芐基)-6-異喹啉基]氧基}乙基)-N，N-二甲基胺 按與實(shí)施例148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.26-1.36(2H，m)，1.49-1.57(2H，m)，2.37(6H，s)，2.52(2H，t)，2.80(2H，t)，4.19(2H，t)，4.57(2H，s)，7.04-7.06(3H，m)，7.15-7.19(3H，m)，7.43(1H，d)，8.05(1H，d)，8.40(1H，d)實(shí)施例B1512-苯甲?；?7-甲氧基-1，2-二氫-1-異喹啉腈 按與實(shí)施例B140相同的方式處理7-甲氧基異喹啉(其是根據(jù)Tetrahedron，27，1253(1971)合成的)，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.87(3H，s)，6.03(1H，brd)，6.56-6.54(2H，m)，6.90(1H，s)，6.95(1H，dd)，7.17(1H，d)，7.46-7.50(2H，m)，7.54-7.62(3H，m)實(shí)施例B1521-(4-丁基芐基)-7-甲氧基異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B1的化合物與實(shí)施例B151的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.56-1.58(2H，m)，2.55(2H，t)，3.82(3H，s)，4.59(2H，s)，7.07(2H，d)，7.20(2H，d)，7.26-7.29(1H，m)，7.35(1H，d)，7.49(1H，d)，7.70(1H，d)，8.38-8.40(1H，m)實(shí)施例B1531-(4-溴芐基)-7-甲氧基異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B31的化合物與實(shí)施例B151的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.84(3H，s)，4.57(2H，s)，7.14-7.16(2H，m)，7.26(1H，s)，7.29-7.32(1H，m)，7.37-7.39(2H，m)，7.51(1H，d)，7.73(1H，d)，8.39(1H，d)實(shí)施例B1541-(4-丁基芐基)-7-異喹啉醇 按與實(shí)施例B147相同的方式，通過處理實(shí)施例B152的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)0.83(3H，t)，1.21-1.26(2H，m)，1.44-1.48(2H，m)，4.68(2H，s)，7.11(2H，d)，7.18(2H，d)，7.59-7.62(2H，m)，8.10-8.17(2H，m)，8.38(1H，d)，10.9(1H，brs)(丁基的兩個(gè)亞甲基質(zhì)子與DMSO信號(hào)重疊，不能觀測到)實(shí)施例B1551-(4-丁基芐基)-7-異喹啉基三氟甲磺酸酯 將4-硝基苯酚三氟甲磺酸酯(0.72g，2.7mmol)(其是根據(jù)J.Org.Chem.，64，7638(1999)合成的)，及碳酸鉀(1.1g，8.1mmol)加到實(shí)施例B154的化合物(1.0g，2.7mmol)的二甲基甲酰胺(30ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。加水之后，所的混合物用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯層用1N的氫氧化鈉及飽和的鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(1.0g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.27-1.37(2H，m)，1.51-1.59(2H，m)，2.54(2H，t)，5.10(2H，s)，6.38(1H，s)，6.95(2H，d)，7.04(2H，d)，7.44(1H，d)，7.55(1H，d)，7.75(1H，d)，8.45(1H，d)實(shí)施例B1561-(4-丁基芐基)-7-異喹啉腈
在氮?dú)夥障?，將氰化鋅(215mg，1.8mmol)，四(三苯基膦)合鈀(41mg，0.035mmol)，及氯化鋰(120mg，2.8mmol)加到實(shí)施例B155的化合物(400mg，0.95mmol)的二甲基甲酰胺(2ml)溶液中，并將該混合物在120℃下攪拌2小時(shí)。冷卻至室溫之后，加入飽和的碳酸氫鈉，并用乙酸乙酯萃取所得的混合物。乙酸乙酯層用飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(71mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.26-1.35(2H，m)，1.47-1.55(2H，m)，2.50(2H，t)，4.91(2H，s)，6.97(2H，d)，7.07(2H，d)，7.28-7.31(1H，m)，7.42(1H，d)，7.51(1H，d)，7.74(1H，d)，8.34(1H，d)實(shí)施例B1571-(4-丁基芐基)-7-[2-(1，1，1-三甲基甲硅烷基)-1-乙炔基]-異喹啉 將乙酸鈀(11mg，0.047mmol)，1，1′-雙(二苯基膦)二茂鐵(72mg，0.13mmol)，及氯化鋰(25mg，0.59mmol)加到實(shí)施例B155的化合物(100mg，0.24mmol)與三甲基甲硅烷基乙炔(65μl，0.47mmol)的二甲基甲酰胺(3.0m1)溶液中，將該反應(yīng)體系用氮?dú)獯迪?。加入三乙?59μl，0.43mmol)和碘化銅(2mg，0.018mmol)，并將該混合物在80℃下攪拌21小時(shí)，然后冷卻至室溫。加入水和乙酸乙酯進(jìn)行分配，乙酸乙酯層用水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(7.0mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.28-0.32(9H，m)，0.92(3H，t)，1.32-1.38(2H，m)，1.54-1.57(2H，m)，2.57(2H，t)，4.63(2H，s)，7.10(2H，d)，7.20(2H，d)，7.52(1H，d)，7.67-7.69(1H，m)，7.75(1H，d)，8.34(1H，d)，8.51(1H，d)實(shí)施例B1581-(4-丁基芐基)-7-(1-乙炔基)異喹啉
將碳酸鉀(13mg，0.094mmol)加到實(shí)施例B157的化合物(6mg，0.016mmol)的甲醇(1.0ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。減壓濃縮之后，所得剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(3.0mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.29-1.38(2H，m)，1.52-1.57(2H，m)，2.55(2H，t)，3.19(1H，s)，4.62(2H，s)，7.09(2H，d)，7.20(2H，d)，7.53(1H，d)，7.67-7.69(1H，m)，7.77(1H，d)，8.36(1H，s)，8.52(1H，d)實(shí)施例B1591-(4-丁基芐基)-7-乙基異喹啉 將鈀-碳(10％，5.0mg)加到實(shí)施例B158的化合物(2.0mg)的四氫呋喃(2.0ml)溶液中，并將該混合物在氮?dú)夥?1atm)下于室溫?cái)嚢?小時(shí)。濾除催化劑，并濃縮濾液。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(0.21mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(6H，t)，1.25-1.32(2H，m)，1.48-1.57(2H，m)，2.53(2H，t)，2.80(2H，q)，4.62(2H，s)，7.06(2H，d)，7.20(2H，d)，7.49-7.52(2H，m)，7.73(1H，d)，7.95(1H，s)，8.43(1H，d)實(shí)施例B1601-(4-丁基芐基)-7-[4-(四氫-2H-2-吡喃氧基)-1-丁炔基]-異喹啉 將乙酸鈀(11mg，0.047mmol)，1，1′-雙(二苯基膦)二茂鐵(72mg，0.13mmol)，及氯化鋰(25mg，0.59mmol)加到實(shí)施例B155的化合物(100mg，0.24mmol)與2-(3-丁炔氧基)四氫-2H-吡喃(73mg，0.47mmol)的二甲基甲酰胺(3.0ml)溶液中，并用氮?dú)獯迪丛摲磻?yīng)體系。同時(shí)，加入三乙胺(59μl，0.43mmol)和碘化銅(2mg，0.018mmol)，并將所的混合物在80℃下攪拌24小時(shí)。將該混合物冷卻至室溫，加水，并用乙酸乙酯萃取所得的混合物。乙酸乙酯層用水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(25mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.28-1.38(2H，m)，1.52-1.67(6H，m)，1.72-1.79(1H，m)，1.79-1.88(1H，m)，2.54(2H，t)，2.78(2H，t)，3.53-3.56(1H，m)，3.66-3.72(1H，m)，3.91-3.99(2H，m)，4.60(2H，s)，4.71-4.73(1H，m)，7.08(2H，d)，7.19(2H，d)，7.50(1H，d)，7.59-7.62(1H，m)，7.72(1H，d)，8.24(1H，s)，8.48(1H，d)實(shí)施例B1614-[1-(4-丁基芐基)-7-異喹啉基]-3-丁炔-1-醇 按與實(shí)施例B29相同的方式，通過處理實(shí)施例B160的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.39(2H，m)，1.51-1.57(2H，m)，1.83(1H，brs)，2.55(2H，t)，2.75(2H，t)，3.84-3.89(2H，m)，4.60(2H，s)，7.08(2H，d)，7.18(2H，d)，7.50(1H，d)，7.60-7.62(1H，m)，7.73(1H，d)，8.25(1H，s)，8.48(1H，d)實(shí)施例B1624-[1-(4-丁基芐基)-7-異喹啉基]-1-丁醇 按與實(shí)施例B30相同的方式，通過處理實(shí)施例B161的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.28-1.36(2H，m)，1.50-1.59(4H，m)，1.67-1.77(3H，m)，2.53(2H，t)，2.79(2H，t)，3.63(2H，t)，4.62(2H，s)，7.06(2H，d)，7.18(2H，d)，7.47-7.52(2H，m)，7.73(1H，d)，7.92(1H，s)，8.43(1H，d)
實(shí)施例B1631-(4-丁基芐基)-7-丙氧基異喹啉 按與實(shí)施例B148相同的方式，通過處理實(shí)施例B154的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.05(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.56(2H，m)，1.76-1.84(2H，m)，2.53(2H，t)，3.92(2H，t)，4.58(2H，s)，7.06(2H，d)，7.19(2H，d)，7.26-7.29(1H，m)，7.34(1H，d)，7.48(1H，d)，7.70(1H，d)，8.38(1H，d)實(shí)施例B1641-(4-丁基芐基)-7-(2-哌啶子基乙氧基)異喹啉 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.43-1.58(4H，m)，1.61-1.69(4H，m)，2.51-2.55(6H，m)，2.79(2H，t)，4.11(2H，t)，4.57(2H，s)，7.06(2H，d)，7.18(2H，d)，7.28-7.30(1H，m)，7.36(1H，d)，7.48(1H，d)，7.70(1H，d)，8.38(1H，d)實(shí)施例B165N-(2-{[1-(4-丁基芐基)-7-異喹啉基]氧基}乙基)-N，N-二甲基胺 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.57(2H，m)，2.35(6H，s)，2.53(2H，t)，2.75(2H，t)，4.06(2H，t)，4.58(2H，s)，7.06(2H，d)，7.18(2H，d)，7.30-7.33(1H，m)，7.36(1H，d)，7.48(1H，d)，7.70(1H，d)，8.39(1H，d)實(shí)施例B1661-(4-丁基芐基)-7-異喹啉基-(2-嗎啉基乙基)醚 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.58(2H，m)，2.51-2.58(6H，m)，2.81(2H，t)，3.75(4H，t)，4.11(2H，t)，4.58(2H，s)，7.06(2H，d)，7.17(2H，d)，7.28-7.31(1H，m)，7.35(1H，d)，7.49(1H，d)，7.71(1H，d)，8.39(1H，d)實(shí)施例B1677-(芐氧基)-1-(4-丁基芐基)異喹啉 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.54(2H，m)，2.54(2H，t)，4.54(2H，s)，5.06(2H，s)，7.05(2H，d)，7.14(2H，d)，7.34-7.43(7H，m)，7.49(1H，d)，7.72(1H，d)，8.39(1H，d)實(shí)施例B1681-(4-丁基芐基)-7-(2-吡啶基甲氧基)異喹啉 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.49-1.57(2H，m)，2.52(2H，t)，4.51(2H，s)，5.25(2H，s)，7.02(2H，d)，7.14(2H，d)，7.24-7.27(1H，m)，7.40(1H，dd)，7.47-7.50(3H，m)，7.68-7.72(1H，d)，7.74(1H，d)，8.39(1H，d)，8.64-8.66(1H，m)
實(shí)施例B1691-(4-丁基芐基)-7-(3-吡啶基甲氧基)異喹啉 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.58(2H，m)，2.54(2H，t)，4.57(2H，s)，5.06(2H，s)，7.07(2H，d)，7.15(2H，d)，7.31-7.36(2H，m)，7.42(1H，d)，7.51(1H，d)，7.74-7.76(2H，m)，8.42(1H，d)，8.61-8.62(1H，m)，8.69-8.70(1H，m)實(shí)施例B1701-(4-丁基芐基)-7-(4-吡啶基甲氧基)異喹啉 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.56(2H，m)，2.54(2H，t)，4.53(2H，s)，5.09(2H，s)，7.04(2H，d)，7.09(2H，d)，7.33-7.39(4H，m)，7.51(1H，d)，7.76(1H，d)，8.41(1H，d)，8.63-8.64(2H，m)實(shí)施例B1711-(4-丁基芐基)-7-[(2-甲氧基芐基)氧基]異喹啉 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.57(2H，m)，2.53(2H，t)，3.82(3H，s)，4.52(2H，s)，5.04(2H，s)，6.88-6.91(1H，m)，6.99-7.02(2H，m)，7.05(2H，d)，7.14(2H，d)，7.32(1H，t)，7.36(1H，dd)，7.43(1H，d)，7.48(1H，d)，7.72(1H，d)，8.39(1H，d)
實(shí)施例B1721-(4-丁基芐基)-7-[(3-甲氧基芐基)氧基]異喹啉 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.56(2H，m)，2.53(2H，t)，3.90(3H，s)，4.53(2H，s)，5.16(2H，s)，6.93-6.98(2H，m)，7.03(2H，d)，7.15(2H，d)，7.30-7.35(1H，m)，7.37(1H，dd)，7.41-7.43(1H，m)，7.47(1H，d)，7.51(1H，d)，7.71(1H，d)，8.37(1H，d)實(shí)施例B1731-(4-丁基芐基)-7-[(4-甲氧基芐基)氧基]異喹啉 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.37(2H，m)，1.51-1.57(2H，m)，2.54(2H，t)，3.83(3H，s)，4.55(2H，s)，4.99(2H，s)，6.93(2H，d)，7.06(2H，d)，7.15(2H，d)，7.32-7.36(3H，m)，7.44(1H，d)，7.48(1H，d)，7.71(1H，d)，8.38(1H，d)實(shí)施例B1747-(1，3-苯并二氧戊環(huán)(Benzodioxol)-5-基甲氧基)-1-(4-丁基芐基)異喹啉 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.37(2H，m)，1.51-1.57(2H，m)，2.54(2H，t)，4.55(2H，s)，4.95(2H，s)，5.98(2H，s)，6.82(1H，d)，6.88(1H，dd)，6.92(1H，d)，7.06(2H，d)，7.15(2H，d)，7.33(1H，dd)，7.42(1H，d)，7.48(1H，d)，7.72(1H，d)，8.39(1H，d)
實(shí)施例B1751-(4-丁基芐基)-7-[(2-硝基芐基)氧基]異喹啉 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.87(3H，t)，1.26-1.34(2H，m)，1.48-1.56(2H，m)，2.51(2H，t)，4.53(2H，s)，5.49(2H，s)，7.03(2H，d)，7.14(2H，d)，7.40(1H，dd)，7.430-7.434(1H，m)，7.45-7.49(1H，m)，7.51(1H，d)，7.64-7.68(1H，m)，7.76(1H，d)，7.85-7.87(1H，m)，8.22-8.24(1H，d)，8.41(1H，d)實(shí)施例B1761-(4-丁基芐基)-7-[(3-硝基芐基)氧基]異喹啉 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.56(2H，m)，2.54(2H，t)，4.55(2H，s)，5.14(2H，s)，7.05(2H，d)，7.11(2H，d)，7.37-7.40(2H，m)，7.51(1H，d)，7.55-7.59(1H，m)，7.73-7.78(2H，m)，8.19-8.22(1H，m)，8.32-8.33(1H，m)，8.42(1H，d)實(shí)施例B1771-(4-丁基芐基)-7-(苯乙氧基)異喹啉 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.26-1.36(2H，m)，1.49-1.57(2H，m)，2.52(2H，t)，3.10(2H，t)，4.18(2H，t)，4.56(2H，s)，7.04(2H，d)，7.16(2H，d)，7.26-7.28(4H，m)，7.33-7.35(3H，m)，7.48(1H，d)，7.70(1H，d)，8.38-8.39(1H，m)
實(shí)施例B1781-(4-丁基芐基)-7-(3-苯基丙氧基)異喹啉 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.49-1.57(2H，m)，2.09-2.15(2H，m)，2.52(2H，t)，2.82(2H，t)，3.97(2H，t)，4.55(2H，s)，7.04(2H，d)，7.16(2H，d)，7.20-7.23(3H，m)，7.27-7.33(4H，m)，7.48(1H，d)，7.70(1H，d)，8.38(1H，d)實(shí)施例B1791-(4-丁基芐基)-7-(2-環(huán)己基乙氧基)異喹啉 按與實(shí)施例B148相同的方式，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，0.94-1.02(2H，m)，1.17-1.36(4H，m)，1.36-1.57(4H，m)，1.65-1.76(7H，m)，2.53(2H，t)，3.98(2H，t)，4.58(2H，s)，7.06(2H，d)，7.19(2H，d)，7.25-7.28(1H，m)，7.33(1H，d)，7.47(1H，d)，7.69(1H，d)，8.37(1H，d)實(shí)施例B1806-苯甲酰基-5，6-二氫[1，3]二氧戊環(huán)[4，5-g]異喹啉-5-腈 按與實(shí)施例B140相同的方式，通過處理[1，3]二氧戊環(huán)[4，5-g]異喹啉，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)5.94-5.96(1H，m)，6.03(1H，d)，6.04(1H，d)，6.47-6.54(2H，m)，6.70(1H，s)，6.83(1H，s)，7.45-7.49(2H，m)，7.54-7.62(3H，m)實(shí)施例B181
5-(4-丁基芐基)[1，3]二氧戊環(huán)[4，5-g]異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B180的化合物與實(shí)施例B1的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.28-1.37(2H，m)，1.51-1.57(2H，m)，2.54(2H，t)，4.50(2H，s)，6.05(2H，s)，7.05-7.07(3H，m)，7.16(2H，d)，7.38(7.40(2H，m)，8.35(1H，d)實(shí)施例B1822-苯甲?；?6-溴-1，2-二氫-1-異喹啉腈 按與實(shí)施例B140相同的方式，通過處理6-溴異喹啉(其是根據(jù)J.Am.Chem.Soc.，183(1942)合成的)，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)6.01(1H，d)，6.53(1H，brs)，6.70(1H，brd)，7.24(1H，d)，7.33(1H，d)，7.47-7.51(3H，m)，7.56(3H，m)實(shí)施例B1836-溴-1-(4-丁基芐基)異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B182的化合物與實(shí)施例B1的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.36(2H，m)，1.50-1.58(2H，m)，2.53(2H，t)，4.60(2H，s)，7.06(2H，d)，7.15(2H，d)，7.46(1H，d)，7.59(1H，q)，7.98(1H，d)，8.02(1H，d)，8.51(1H，d)實(shí)施例B1842-苯甲?；?5-溴-1，2-二氫-1-異喹啉腈與2-苯甲?；?7-溴-1，2-二氫-1-異喹啉腈的混合物
按與實(shí)施例B140相同的方式，通過處理5-或7-溴異喹啉(其是根據(jù)J.Am.Chem.Soc.，61，183(1939)合成的)，得到標(biāo)題化合物。所得化合物無需分離與純化即可用于下列反應(yīng)。
實(shí)施例B1857-溴-1-(4-丁基芐基)異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B184的化合物與實(shí)施例B1的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.28-1.37(2H，m)，1.51-1.58(2H，m)，2.55(2H，t)，4.58(2H，s)，7.09(2H，d)，7.18(2H，d)，7.51-7.53(1H，m)，7.69-7.70(2H，m)，8.33-8.34(1H，m)，8.52(1H，d)實(shí)施例B1865-苯甲酰基-4，5-二氫噻吩并[3，2-c]吡啶-4-腈 按與實(shí)施例B140相同的方式，通過處理噻吩并[3，2-c]吡啶(其是根據(jù)J.Heterocycl.Chem.，30，183(1993)合成的)，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)6.05(1H，d)，6.57(1H，brd)，6.66(1H，s)，7.07(1H，d)，7.32(1H，d)，7.46-7.50(2H，m)，7.54-7.62(3H，m)實(shí)施例B1874-(4-丁基芐基)噻吩并[3，2-c]吡啶 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B186的化合物與實(shí)施例B1的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.27-1.37(2H，m)，1.51-1.59(2H，m)，2.54(2H，t)，4.47(2H，s)，7.07(2H，d)，7.19(2H，d)，7.42(1H，d)，7.47(1H，dd)，7.68(1H，d)，8.41(1H，d)實(shí)施例B1884-(4-甲氧基芐基)噻吩并[3，2-c]吡啶 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B186的化合物與4-甲氧基芐基氯，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.75(3H，s)，4.44(2H，s)，6.79-6.82(2H，m)，7.19-7.22(2H，m)，7.43(1H，d)，7.46(1H，dd)，7.68(1H，d)，8.41(1H，d)實(shí)施例B1894-(噻吩并[3，2-c]吡啶-4-基甲基)苯基三氟甲磺酸酯 將三溴化硼的二氯甲烷溶液(1.0M，10ml，10mmol)滴加到冷卻至0℃的實(shí)施例B188的化合物(510mg，2.0mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中，并將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌1.5小時(shí)。通過加入飽和的碳酸氫鈉水溶液使該反應(yīng)混合物呈弱堿性，用乙酸乙酯萃取，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。將所得剩余物溶解于吡啶，并將所得溶液冷卻至0℃。向其中滴加三氟甲磺酸酐(0.34ml，2.1mmol)之后，將混合物在該溫度下攪拌2小時(shí)，倒在冰上，用乙酸乙酯萃取，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(312mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.52(2H，s)，7.16-7.18(2H，m)，7.36(2H，m)，7.43-7.44(1H，m)，7.49(1H，d)，7.73(1H，d)，8.42(1H，d)實(shí)施例B190
4-(4-溴芐基)噻吩并[3，2-c]吡啶 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B186的化合物與實(shí)施例B31的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.45(2H，s)，7.14-7.16(2H，m)，7.37-7.39(2H，m)，7.41-7.43(1H，m)，7.45(1H，d)，7.71(1H，d)，8.41(1H，d)實(shí)施例B1914-(4-溴-2-氟芐基)噻吩并[3，2-c]吡啶 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B186的化合物與4-溴-2-氟芐基溴，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.46(2H，s)，7.11(1H，t)，7.15-7.18(1H，m)，7.22-7.25(1H，m)，7.47(1H，d)，7.49(1H，d)，7.71(1H，d)，8.41(1H，d)實(shí)施例B1924-{4-[4-(四氫-2H-2-吡喃氧基)-1-丁炔基]芐基}噻吩并[3，2-c]吡啶 按與實(shí)施例B42相同的方式，通過處理實(shí)施例B189的化合物與2-(3-丁炔氧基)四氫-2H-吡喃，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.40-1.90(6H，m)，2.69(2H，t)，3.45-3.65(2H，m)，3.78-3.95(2H，m)，4.48(2H，s)，4.66-4.69(1H，m)，7.18(2H，d)，7.27(2H，d)，7.41(1H，d)，7.44(1H，d)，7.70(1H，d)，8.41(1H，d)。
實(shí)施例B1934-[4-(噻吩并[3，2-c]吡啶-4-基甲基)苯基]-3-丁炔-1-醇
按與實(shí)施例B47相同的方式，通過處理實(shí)施例B192的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.67(2H，t)，3.79(2H，t)，4.50(2H，s)，7.20(2H，d)，7.32(2H，d)，7.41(1H，d)，7.44(1H，d)，7.71(1H，d)，8.42(1H，d)。
在NMR光譜中未觀察到羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例B1946-苯甲?；?6，7-二氫噻吩并[2，3-c]吡啶-7-腈 按與實(shí)施例B140相同的方式，通過處理噻吩并[2，3-c]吡啶(其是根據(jù)J.Heterocycl.Chem.，30，183(1993)合成的)，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)6.07(1H，d)，6.56(1H，brd)，6.75(1H，s)，6.97(1H，d)，7.37(1H，d)，7.46-7.51(2H，m)，7.54-7.64(3H，m)實(shí)施例B1957-(4-丁基芐基)噻吩并[2，3-c]吡啶 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B194的化合物與實(shí)施例B1的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.28-1.37(2H，m)，1.51-1.59(2H，m)，2.55(2H，t)，4.40(2H，s)，7.09(2H，d)，7.28(2H，d)，7.34(1H，d)，7.57(1H，d)，7.62(1H，d)，8.47(1H，d)實(shí)施例B1967-(4-甲氧基芐基)噻吩并[2，3-c]吡啶
按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B194的化合物與4-甲氧基芐基氯，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.76(3H，s)，4.38(2H，s)，6.81-6.83(2H，m)，7.28-7.30(2H，m)，7.35(1H，d)，7.57(1H，d)，7.62(1H，d)，8.47(1H，d)實(shí)施例B1974-(噻吩并[2，3-c]吡啶-7-基甲基)苯基三氟甲磺酸酯 按與實(shí)施例B1相同的方式89，通過處理實(shí)施例B196的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.44(2H，s)，7.17-7.19(2H，m)，7.38-7.40(1H，m)，7.44-7.46(2H，m)，7.61(1H，d)，7.65-7.67(1H，m)，8.47-8.49(1H，m)實(shí)施例B1987-(4-溴芐基)噻吩并[2，3-c]吡啶 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B194的化合物與實(shí)施例B31的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.37(2H，s)，7.23-7.25(2H，m)，7.37(1H，d)，7.39-7.41(2H，m)，7.59(1H，d)，7.63-7.65(1H，m)，8.47(1H，d)實(shí)施例B1997-(4-溴-2-氟芐基)噻吩并[2，3-c]吡啶
按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理實(shí)施例B194的化合物與4-溴-2-氟芐基溴，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.40-4.41(2H，m)，7.12-7.20(2H，m)，7.23-7.26(1H，m)，7.37-7.39(1H，m)，7.59-7.62(1H，m)，7.65-7.67(1H，m)，8.45-8.47(1H，m)實(shí)施例B2007-{4-[4-(四氫-2H-2-吡喃氧基)-1-丁炔基]芐基}噻吩并[2，3-c]吡啶 按與實(shí)施例B42相同的方式通過處理實(shí)施例B197的化合物與2-(3-丁炔氧基)四氫-2H-吡喃，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.50-1.90(6H，m)，2.69(2H，t)，3.49-3.54(1H，m)，3.58-3.65(1H，m)，3.85-3.95(2H，m)，4.41(2H，s)，4.68(1H，t)，7.26-7.31(4H，m)，7.36(1H，d)，7.58(1H，d)，7.63(1H，d)，8.47(1H，d)。
實(shí)施例B2014-[4-(噻吩并[2，3-c]吡啶-7-基甲基)苯基]-3-丁炔-1-醇 按與實(shí)施例B47相同的方式，通過處理實(shí)施例B200的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.99(1H，brs)，2.67(2H，t)，3.79(2H，t)，4.42(2H，s)，7.27-7.34(4H，m)，7.36(1H，d)，7.59(1H，d)，7.64(1H，d)，8.47(1H，d)。
實(shí)施例B2022-氯-3-(甲氧基甲氧基)吡啶 在氮?dú)夥障?，將氫化鈉(66％，633mg，17.4mmol)加到冰冷卻的2-氯-3-羥基吡啶(2.05g，15.8mmol)的四氫呋喃(30ml)溶液中，并將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌15分鐘。加入氯甲基甲基醚(1.32ml，17.4mmol)，并將所得反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌30分鐘，然后再在室溫下攪拌2小時(shí)。加水之后，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯萃取，用飽和鹽水洗滌，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(2.44g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.53(3H，s)，5.28(2H，s)，7.19(1H，dd)，7.49(1H，dd)，8.06(1H，dd)實(shí)施例B2032-氯-4-碘-3-(甲氧基甲氧基)吡啶 在氮?dú)夥障?，將?shí)施例B202的化合物(1.40g，8.06mmol)的乙醚(8ml)溶液滴加到冷卻至-78℃的1.51M叔丁基鋰-正戊烷溶液(8.01ml，12.1mmol)的乙醚(15ml)溶液中，并將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌15分鐘。加碘(3.07g，12.1mmol)之后，將反應(yīng)混合物逐漸溫暖至室溫。進(jìn)一步加入三氟甲磺酸鈉溶液，并分出乙醚層，用飽和鹽水洗滌，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(356mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.73(3H，s)，5.22(2H，s)，7.69(1H，d)，7.80(1H，d)實(shí)施例B2047-氯呋喃并[2，3-c]吡啶 將三甲基甲硅烷基乙炔(28.3μl，0.201mmol)和三乙胺(59.8μl，0.429mmol)加到實(shí)施例B203的化合物(36.6mg，0.143mmol)，四(三苯基膦)合鈀(16.5mg，0.0143mmol)，及碘化銅(I)(2.7mg，0.014mmol)的二甲基甲酰胺(1.5ml)溶液中，并將該混合物在50℃下攪拌4小時(shí)。待將該混合物冷卻至室溫之后，向其中加水，并用乙酸乙酯萃取所得的混合物，用飽和鹽水洗滌，然后減壓濃縮。將剩余物溶解于甲醇(5ml)，向其中加入碳酸鉀(100mg，0.724mmol)，并將所的混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。加水之后，用乙醚萃取該混合物，用飽和鹽水洗滌，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(5.5mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)6.89(1H，d)，7.51(1H，d)，7.83(1H，d)，8.21(1H，d)實(shí)施例B2054-丁基芐基氯化鎂 通過加熱回流引發(fā)實(shí)施例B1的化合物(1.04g，5.69mmol)，鎂(761mg，31.3mmol)，及催化劑量的1，2-二溴乙烷的乙醚(11ml)混合溶液。移除熱源之后，以使該反應(yīng)混合物保持溫和回流的方式向其中滴加實(shí)施例B1的化合物(4.16g，22.8mmol)的乙醚(60ml)溶液，并將該混合物加熱回流30分鐘。將混合物冷卻至室溫，得到標(biāo)題化合物，其為0.4M的乙醚溶液。將該溶液本身用于下列反應(yīng)。
實(shí)施例B2067-(4-丁基芐基)呋喃并[2，3-c]吡啶 將實(shí)施例B205的化合物(300μl，0.1mmol)加到實(shí)施例B204的化合物(5.0mg，0.033mmol)與[1，1′-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯合鎳(II)(4.5mg，0.0065mmol)的四氫呋喃(1ml)溶液中，并將該混合物在50℃下攪拌1小時(shí)。待將該混合物冷卻至室溫之后，向其中加入乙酸乙酯。將所得混合物用飽和的氯化銨水溶液及飽和的鹽水洗滌，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)NH-硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(2.9mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.29-1.35(2H，m)，1.50-1.58(2H，m)，2.54(2H，t)，4.40(2H，s)，6.78(1H，d)，7.08(2H，d)，7.30(2H，d)，7.40(1H，d)，7.72(1H，d)，8.34(1H，d)實(shí)施例B2077-(4-丁基芐基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶 在冰冷卻下，將實(shí)施例B205的化合物(800μl，0.3mmol)加到1-氯吡咯并吡啶(19.4mg，0.127mmol)(其是根據(jù)H07-165，708A方法，由2-氯-3-氨基吡啶合成的)，及二氯(二苯基膦丙烷)合鎳(6.9mg，0.013mmol)的四氫呋喃(1ml)溶液中，并將該混合物在加熱回流下攪拌4小時(shí)。待將其冷卻至室溫之后，向其中加入乙酸乙酯。將所得混合物用飽和的氯化銨水溶液及飽和的鹽水洗滌，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(7.1mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.31-1.37(2H，m)，1.55-1.59(2H，m)，2.58(2H，t)，4.44(2H，s)，6.50(1H，d)，7.12(2H，d)，7.18(1H，d)，7.22(2H，d)，7.45(1H，d)，8.21(1H，d)在NMR光譜中未觀察到NH質(zhì)子。
實(shí)施例B2084-(4-丁基芐基)-1-咪唑并[4，5-c]吡啶 將實(shí)施例B205的化合物(3.45ml，1.38mmol)加到1-氯咪唑并吡啶(88.6mg，0.577mmol)(其是根據(jù)J.Heterocycl.Chem.，2，196(1965)中所述的方法由4-氨基-2-氯吡啶合成的)，及二氯(二苯基膦丙烷)合鎳(31.3mg，0.0577mmol)的四氫呋喃(2ml)溶液中，并將該混合物在加熱回流下攪拌2小時(shí)。待將其冷卻至室溫之后，向其中加入乙酸乙酯。所的混合物通過硅膠過濾并減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(64.2mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.86(3H，t)，1.23-1.32(2H，m)，1.44-1.52(2H，m)，2.47(2H，t)，4.56(2H，s)，7.02(2H，d)，7.19(2H，d)，7.34(1H，d)，8.00(1H，s)，8.25-8.27(1H，m)在NMR光譜中未觀察到NH質(zhì)子實(shí)施例B2094-溴-1-異喹啉醇 將溴(1.78ml，34.5mmol)加到冰冷卻的1-羥基異喹啉(5.01g，34.5mmol)的乙酸(50ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。加入水，乙酸乙酯，及四氫呋喃，并用濾紙過濾所得的反應(yīng)混合物。有機(jī)層用飽和鹽水洗滌并減壓濃縮。剩余物經(jīng)乙酸乙酯與己烷的重結(jié)晶，得到標(biāo)題化合物(6.19g)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)7.56(1H，s)，7.59-7.63(1H，m)，7.76-7.78(1H，m)，7.84-7.89(1H，m)，8.23-8.26(1H，m)，11.59(1H，br s)實(shí)施例B2101，4-二溴異喹啉 將實(shí)施例B209的化合物(1.40g，8.06mmol)與三溴化磷(6ml)的混合溶液在150℃下攪拌1小時(shí)，然后再加熱回流1小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，倒在冰上，然后溫暖至室溫。加入乙酸乙酯，并將所的混合物用飽和鹽水洗滌且減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(845mg)。
1H-MR(CDCl3)δ(ppm)7.76-7.80(1H，m)，7.86-7.90(1H，m)，8.19(1H，d)，8.31-8.34(1H，m)，8.48(1H，s)實(shí)施例B2114-溴-1-(4-丁基芐基)異喹啉 將實(shí)施例B205的化合物(2.5ml，1mmol)加到實(shí)施例B210的化合物(200mg，0.697mmol)與[1，1′-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯合鎳(II)(75.6mg，0.139mmol)的四氫呋喃(2ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌30分鐘。加入乙酸乙酯之后，將所得混合物依次用飽和的氯化銨水溶液，飽和的碳酸氫鈉水溶液，及飽和的鹽水洗滌，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(98mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.29-1.34(2H，m)，1.51-1.60(2H，m)，2.53(2H，t)，4.59(2H，s)，7.06(2H，d)，7.16(2H，d)，7.57-7.61(1H，m)，7.73-7.77(1H，m)，8.15-8.19(2H，m)，8.69(1H，s)實(shí)施例B2121-(4-丁基芐基)-5，6，7，8-四氫異喹啉 將實(shí)施例B211的化合物(13.0mg，0.0367mmol)溶解于乙酸乙酯與甲醇的混合溶液中(1∶1，1ml)，加入10％的鈀-碳(含50％的水，13mg)，并將該混合物在大氣壓大小的氫氣氛下于室溫?cái)嚢?2小時(shí)。待用氮?dú)獯迪捶磻?yīng)體系之后，通過硅藻土濾除催化劑。將所得濾液減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物(8.8mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.28-1.38(2H，m)，1.52-1.59(2H，m)，1.74-1.82(4H，m)，2.55(2H，t)，2.66(2H，t)，2.81(2H，t)，4.26(2H，s)，7.07-7.15(5H，m)，8.32(1H，d)實(shí)施例B2131-[2-(苯基)芐基]異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理代替正丁基芐基氯的2-苯基芐基溴，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.62(2H，s)，7.05(1H，d)，7.16(1H，dd)，7.22-7.50(8H，m)，7.52(1H，d)，7.58(1H，dd)，7.65(1H，d)，7.76(1H，d)，8.47(1H，d)。
實(shí)施例B2141-[4-氟-2-(三氟甲基)芐基]異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理代替正丁基芐基氯的4-氟-2-(三氟甲基)芐基，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.83(2H，s)，6.87(1H，dd)，7.01(1H，ddd)，7.43(1H，dd)，7.54(1H，dd)，7.61(1H，d)，7.67(1H，dd)，7.85(1H，d)，7.96(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B2151，3-苯并二氧戊環(huán)-4-基-(1-異喹啉基)甲醇 按與實(shí)施例B82相同的方式，通過處理2，3-亞甲二氧基苯甲醛，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)5.97-5.99(1H，m)，6.09(1H，brs)，6.20-6.40(1H，m)，6.54-6.60(2H，m)，6.65-6.70(2H，m)，7.52(1H，dd)，7.63(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.84(1H，d)，8.04(1H，d)，8.53(1H，d)。
實(shí)施例B2161，3-苯并二氧戊環(huán)-4-基-(1-異喹啉基)甲基乙酸酯 按與實(shí)施例B38相同的方式，通過處理實(shí)施例B215的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.23(3H，s)，5.98-6.02(2H，m)，6.74-6.79(1H，m)，6.90-6.93(1H，m)，7.15-7.19(1H，m)，7.23-7.28(1H，m)，7.58(1H，dd)，7.60(1H，d)，7.66(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.28(1H，d)，8.57(1H，d)。
實(shí)施例B2171-(1，3-苯并二氧戊環(huán)-4-基甲基)異喹啉 按與實(shí)施例B39相同的方式，通過處理實(shí)施例B216的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.62(2H，s)，6.02(2H，s)，6.64-6.70(3H，m)，7.57(1H，dd)，7.58(1H，d)，7.66(1H，dd)，7.83(1H，d)，8.23(1H，d)，8.50(1H，d)。
實(shí)施例B2181-(1-萘甲基)異喹啉 按與實(shí)施例B2相同的方式，通過處理代替正丁基芐基氯的1-(氯甲基)萘，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)5.13(2H，s)，6.96(1H，d)，7.29(1H，d)，7.45-7.67(5H，m)，7.72(1H，d)，7.84-7.90(2H，m)，8.08(1H，d)，8.26(1H，d)，8.52(1H，d)。
實(shí)施例B2193-溴苯基丁酸酯 將正丁酰氯(7.25ml)加到冰冷卻的3-溴苯酚(10.0g)的吡啶(50ml)溶液中，并將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌3小時(shí)，然后再在室溫下攪拌3.5小時(shí)。加冰之后，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯萃取，用1N鹽酸和水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(12.77g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.04(3H，t)，1.72-1.82(2H，m)，2.54(2H，t)，7.04(1H，dd)，7.22-7.29(2H，m)，7.36(1H，d)。
實(shí)施例B2201-(4-溴-2-羥基苯基)-1-丁酮 在氮?dú)夥障?，將三氯化鋁(10.51g)加到實(shí)施例B219的化合物(12.77g)的氯苯(70ml)溶液中，并將該反應(yīng)混合物在加熱回流下攪拌9小時(shí)。待反應(yīng)混合物冷卻至室溫之后，向其中加冰。所得混合物用乙酸乙酯萃取，用水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。如此得到的化合物無需進(jìn)一步純化即可用于下面的反應(yīng)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.53-1.65(2H，m)，3.00(2H，t)，7.02(1H，dd)，7.19(1H，d)，7.78(1H，d)，12.50(1H，s)。
實(shí)施例B2211-(4-溴-2-甲氧基苯基)-1-丁酮 將碳酸鉀(9.07g)和碘甲烷(3.92ml)加到實(shí)施例B220的化合物(13.30g)的丙酮(75ml)溶液中，并將該反應(yīng)混合物在加熱回流下攪拌4小時(shí)。用硅藻土過濾反應(yīng)混合物，加入乙醚以通過過濾除去不溶物，并將濾液減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(9.52g)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.95(3H，t)，1.64-1.74(2H，m)，2.91(2H，t)，3.90(3H，s)，7.10(1H，d)，7.14(1H，dd)，7.54(1H，d)。
實(shí)施例B2224-溴-1-丁基-2-甲氧基苯 按與實(shí)施例B3相同的方式，通過處理實(shí)施例B221的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.92(3H，t)，1.29-1.39(2H，m)，1.48-1.56(2H，m)，2.54(2H，t)，3.81(3H，s)，6.95(1H，s)，6.96-7.02(2H，m)。
實(shí)施例B223(4-丁基-3-甲氧基苯基)(1-異喹啉基)酮 按與實(shí)施例B36相同的方式，通過處理實(shí)施例B222的化合物，得到包含標(biāo)題化合物的混合物。
該混合物無需分離與純化即可用于下面的反應(yīng)。
實(shí)施例B224(4-丁基-3-甲氧基苯基)(1-異喹啉基)甲醇 按與實(shí)施例B37相同的方式，通過處理實(shí)施例B223的化合物，得到包含標(biāo)題化合物的混合物。
該混合物無需分離與純化即可用于下面的反應(yīng)。
實(shí)施例B225(4-丁基-3-甲氧基苯基)(1-異喹啉基)甲基乙酸酯 按與實(shí)施例B38相同的方式，通過處理實(shí)施例B224的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.24-1.38(2H，m)，1.46-1.60(2H，m)，2.24(3H，s)，2.54(2H，t)，3.76(3H，s)，6.97(1H，s)，6.98(1H，d)，7.06(1H，d)，7.53-7.67(4H，m)，7.83(1H，d)，8.26(1H，d)，8.58(1H，d)。
實(shí)施例B226
1-(4-丁基-3-甲氧基芐基)異喹啉 按與實(shí)施例B39相同的方式，通過處理實(shí)施例B225的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.27-1.38(2H，t)，1.45-1.54(2H，t)，2.52(2H，t)，3.72(3H，s)，4.63(2H，s)，6.78(1H，d)，6.79(1H，s)，6.99(1H，d)，7.53(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.64(1H，dd)，7.80(1H，d)，8.19(1H，d)，8.49(1H，d)。
實(shí)施例B2272-丁基-5-(1-異喹啉基甲基)苯酚 按與實(shí)施例B40相同的方式，通過處理實(shí)施例B226的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.30-1.40(2H，m)，1.52-1.65(2H，m)，2.55(2H，t)，4.55(2H，s)，6.46(1H，brs)，6.85(1H，d)，7.03(1H，d)，7.32-7.40(1H，m)，7.55(1H，dd)，7.68(1H，dd)，7.81(1H，d)，7.94-8.05(1H，m)，8.14(1H，d)。
在NMR光譜中未發(fā)現(xiàn)酚羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例B2282-溴-3-(甲氧基甲氧基)吡啶 按與實(shí)施例B202相同的方式，利用2-溴-3-羥基吡啶合成標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.53(3H，s)，5.29(2H，s)，7.19-7.23(1H，m)，7.42-7.45(1H，m)，8.04-8.06(1H，m)實(shí)施例B229
2-(4-丁基芐基)-3-(甲氧基甲氧基)吡啶 將實(shí)施例B205的化合物(7ml，3mmol)加到冰冷卻的實(shí)施例B228的化合物(524mg，2.40mmol)與二氯(二苯基膦丙烷)合鎳(65.0mg，0.120mmol)的四氫呋喃(10ml)溶液中，并將該混合物在加熱回流下攪拌5小時(shí)。待將其冷卻至室溫之后，加入乙酸乙酯。所得混合物依次用飽和的氯化銨水溶液，飽和的碳酸氫鈉水溶液，及飽和的鹽水洗滌，然后減壓濃縮。剩余物通過NH-硅膠過濾。減壓濃縮之后，將剩余物溶解于甲醇(15ml)，加入三乙胺(500μl，3.59mmol)和10％鈀-碳(含水50％，50mg)，并在大氣壓大小的氫氣氛下將所得混合物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。待用氮?dú)獯迪捶磻?yīng)體系之后，通過硅藻土濾除催化劑，并將濾液減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(280mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89(3H，t)，1.28-1.34(2H，m)，1.52-1.58(2H，m)，2.53(2H，t)，3.33(3H，s)，4.16(2H，s)，5.16(2H，s)，7.04-7.10(3H，m)，7.20(2H，d)，7.33-7.35(1H，m)，8.19-8.20(1H，m)實(shí)施例B2302-(4-丁基芐基)-3-吡啶醇 將三氟乙酸(1ml)加到實(shí)施例B229的化合物(256mg，0.849mmol)的二氯甲烷(5ml)溶液中，并將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。加入飽和的碳酸氫鈉水溶液和乙酸乙酯之后，將反應(yīng)混合物用飽和鹽水洗滌并減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(182mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.28-1.37(2H，m)，1.51-1.58(2H，m)，2.54(2H，t)，4.20(2H，s)，7.02-7.08(4H，m)，7.22(2H，d)，8.08-8.09(1H，m)在NMR光譜中未觀察到酚羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例B2312-(4-丁基芐基)-3-甲氧基吡啶 將碳酸鉀(33.0mg，0.239mmol)和碘甲烷(14.9μl，0.239mmol)加到實(shí)施例B230的化合物(19.2mg，0.0796mmol)的丙酮(1ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。加入乙酸乙酯之后，將反應(yīng)混合物用飽和鹽水洗滌并減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(1.47mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.32-1.34(2H，m)，1.53-1.57(2H，m)，2.54(2H，t)，3.82(3H，s)，4.14(2H，s)，7.06(2H，d)，7.10-7.11(2H，m)，7.21(2H，d)，8.12-8.14(1H，m)實(shí)施例B2322-(4-丁基芐基)-3-氯吡啶 將實(shí)施例B205的化合物(12ml，5mmol)加到冰冷卻的2，3-二氯吡啶(525mg，3.55mmol)與二氯(二苯基膦丙烷)合鎳(96.2mg，0.178mmol)的四氫呋喃(4ml)混合溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。加入乙酸乙酯之后，將反應(yīng)混合物依次用飽和的氯化銨水溶液，飽和的碳酸氫鈉水溶液，及飽和的鹽水洗滌，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(199mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.29-1.38(2H，m)，1.52-1.60(2H，m)，2.56(2H，t)，4.28(2H，s)，7.08-7.13(3H，m)，7.21(2H，d)，7.64(1H，dd)，8.46(1H，dd)實(shí)施例B2332-(4-丁基芐基)-3-乙基吡啶
將乙基氯化鎂(0.97M，102μl，0.993mmol)加到實(shí)施例B232的化合物(12.9mg，0.0496mmol)與二氯(二苯基膦二茂鐵)合鎳(3.4mg，0.0050mmol)的四氫呋喃(1ml)混合溶液中。將反應(yīng)混合物在50℃下攪拌1小時(shí)，然后再加熱回流2小時(shí)。待將反應(yīng)混合物冷卻至室溫之后，向其中加入乙酸乙酯。將反應(yīng)混合物用飽和的氯化銨水溶液及飽和的鹽水洗滌，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(3.29mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90-0.93(6H，m)，1.30-1.37(2H，m)，1.54-1.59(2H，m)，2.55-2.59(4H，m)，4.12(2H，s)，7.05-7.18(5H，m)，7.55-7.59(1H，m)，8.53-8.55(1H，m)實(shí)施例B234N-(2-溴-3-吡啶基)氨基甲酸叔丁酯 將N-溴琥珀酰亞胺(7.51g，42.2mmol)加到冰冷卻的3-氨基吡啶(3.97g，42.2mmol)的二甲基甲酰胺(25ml)混合溶液中，并將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌30分鐘。加入乙酸乙酯之后，將反應(yīng)混合物用飽和鹽水洗滌并減壓濃縮。將剩余物的二氯甲烷(20ml)溶液在冰上冷卻，然后向該溶液中加入三乙胺(3.74ml，26.8mmol)，催化劑量的二甲基氨基吡啶，及焦碳酸二叔丁酯(3.08ml，13.4mmol)，并將該混合物在室溫下攪拌過夜。減壓濃縮之后，剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(344mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.55(9H，s)，7.03(1H，brs)，7.25(1H，dd)，8.03(1H，dd)，8.46(1H，d)實(shí)施例B2352-溴-3-(N-叔丁氧基羰基-N-甲基)氨基吡啶 將碘甲烷(157μl，2.52mmol)與66％的氫化鈉(91.6mg，2.52mmol)加到冰冷卻的實(shí)施例B234的化合物(344mg，1.26mmol)的二甲基甲酰胺(5ml)溶液中，并將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌40分鐘。加入乙酸乙酯之后，反應(yīng)混合物用飽和鹽水洗滌并通過硅膠過濾。將有機(jī)層減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物(356mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.36(9H，s)，3.17(3H，s)，7.30(1H，dd)，7.55(1H，d)，8.30(1H，dd)實(shí)施例B236N-[2-(4-丁基芐基)-3-吡啶基]-N-甲基胺 向按與實(shí)施例B211相同的方式，通過將4-丁基芐基引入實(shí)施例B235的化合物(62.8mg，0.219mmol)中而得到的化合物的二氯甲烷溶液中(2ml)加入三氟乙酸(2ml)。將該混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后將其滴加到碳酸氫鈉水溶液中。加入乙酸乙酯之后，將混合物用飽和鹽水洗滌并減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(29.7mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.29-1.38(2H，m)，1.53-1.60(2H，m)，2.56(2H，t)，2.72(3H，s)，3.63(1H，br s)，4.09(2H，s)，6.86(1H，d)，7.08-7.12(5H，m)，7.98(1H，dd)實(shí)施例B237N-[2-(4-丁基芐基)-3-吡啶基]-N，N-二甲基胺 將乙酸(12.1μl，0.211mmol)，37％福爾馬林(15.8μl，0.211mmol)，及三乙酰氧基硼氫化鈉(44.7mg，0.211mmol)加到冰冷卻的實(shí)施例B236的化合物(26.8mg，0.105mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌30分鐘。加入乙酸乙酯之后，將混合物用飽和的碳酸氫鈉水溶液及飽和的鹽水洗滌并減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(23.3mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.30-1.36(2H，m)，1.52-1.59(2H，m)，2.55(2H，t)，2.67(6H，s)，4.24(2H，s)，7.06(2H，d)，7.10(1H，dd)，7.18(2H，d)，7.40(1H，dd)，8.27(1H，dd)實(shí)施例B2382-(4-丁基芐基)4-甲氧基吡啶 按與實(shí)施例B211相同的方式，利用2-氯-4-甲氧基吡啶，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.91(3H，t)，1.31-1.37(2H，m)，1.53-1.59(2H，m)，2.57(2H，t)，3.78(3H，s)，4.06(2H，s)，6.61-6.65(2H，m)，7.11(2H，d)，7.17(2H，d)，8.36(1H，d)實(shí)施例B2392-(4-丁基芐基)-4-氯吡啶 將三氯氧磷(57.0μl，0.612mmol)加到冰冷卻的實(shí)施例B238的化合物(52.0mg，0.204mmol)的二甲基甲酰胺(1ml)溶液中，并將該反應(yīng)混合物在100℃下攪拌8小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻，倒在冰上，并溫暖至室溫。加入乙酸乙酯之后，將混合物用飽和的碳酸氫鈉水溶液及飽和的鹽水洗滌，然后減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(2.29mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.92(3H，t)，1.31-1.38(2H，m)，1.53-1.61(2H，m)，2.59(2H，t)，4.10(2H，s)，7.12-.18(6H，m)，8.44(1H，d)實(shí)施例B2402-氯-3-甲氧基吡啶 按與實(shí)施例B231相同的方式，利用2-氯-3-羥基吡啶，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.93(3H，s)，7.21-7.22(2H，m)，7.99-8.01(1H，m)實(shí)施例B2412-氯-3，4-二甲氧基吡啶 在氮?dú)夥障?，將二異丙基?84.0μl，0.599mmol)與實(shí)施例B240的化合物(860mg，5.99mmol)的四氫呋喃(4ml)溶液加到冷卻至-78℃的1.06M苯基鋰環(huán)戊烷-乙醚溶液的四氫呋喃(11ml)溶液中。將該反應(yīng)混合物在-40℃下攪拌1小時(shí)，然后再在-18℃下攪拌20分鐘。再次將反應(yīng)混合物冷卻至-78℃，向其中滴加三甲氧基硼酸酯(2.04ml，18.0mmol)，并將所得的混合物在0℃下攪拌20分鐘。在該溫度下，依次加入氨水(29％，30ml)，氯化銨(4.5g)，及過氧化氫水溶液(30％，12ml)，并將該混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。加入飽和的硫代硫酸鈉，乙酸和乙酸乙酯，并將混合物用飽和鹽水洗滌。通過硅膠過濾得到乙酸乙酯層，并減壓濃縮。所得剩余物按與實(shí)施例B231相同的方式進(jìn)行處理，得到標(biāo)題化合物(31.3mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.89(3H，s)，3.94(3H，s)，6.82(1H，d)，8.05(1H，d)實(shí)施例B2422-(4-丁基芐基)-3，4-二甲氧基吡啶 按與實(shí)施例B206相同的方式，利用實(shí)施例B241的化合物，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.90(3H，t)，1.26-1.35(2H，m)，1.53-1.57(2H，m)，2.54(2H，t)，3.70(3H，s)，3.89(3H，s)，4.12(2H，s)，6.72(1H，d)，7.06(2H，d)，7.21(2H，d)，8.20(1H，d)實(shí)施例B2432，4-二(4-丁基芐基)-3-甲氧基吡啶
在氮?dú)夥障聦?shí)施例B240的化合物(436mg，3.04mmol)的乙醚(2ml)溶液加到冷卻至-78℃的1.43M叔丁基鋰正戊烷溶液(2.76ml，3.95mmol)的乙醚(5ml)溶液中，并將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌30分鐘。進(jìn)一步加入四甲基乙二胺(688μl，4.56mmol)與六氯乙烷(719mg，3.04mmol)的乙醚(3ml)溶液，并將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌1小時(shí)。逐漸溫暖至室溫之后，加入乙酸乙酯，并將混合物用飽和鹽水洗滌。減壓濃縮經(jīng)硅膠過濾得到的乙酸乙酯層。所得剩余物按與實(shí)施例B206相同的方式進(jìn)行處理，得到標(biāo)題化合物(10.1mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.89-0.94(6H，m)，1.31-1.37(4H，m)，1.52-1.62(4H，m)，2.53-2.59(4H，m)，3.74(3H，s)，4.07(2H，s)，4.13(2H，s)，6.84(1H，d)，6.98(1H，d)，7.04-7.22(8H，m)實(shí)施例B2442-(4-溴-2-氟芐基)-3-(甲氧基甲氧基)吡啶 在氮?dú)夥障?，將?shí)施例B228的化合物(422mg，1.94mmol)的四氫呋喃(3ml)溶液加到冷卻至-78℃的2.47M正丁基鋰己烷溶液(862μl，2.13mmol)的四氫呋喃(3ml)溶液中，并將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌1小時(shí)。加入溴化銅(I)(139mg，0.968mmol)之后，將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌1小時(shí)，并再次冷卻至-78℃。下一步，加入4-溴-2-氟芐基溴(259mg，0.968mmol)，將所得混合物在0℃下攪拌1小時(shí)。進(jìn)一步加入四甲基乙二胺(584μl，3.88mmol)，并將所得反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌1小時(shí)。向反應(yīng)混合物中加入乙醚氨水溶液，有機(jī)層用飽和鹽水洗滌并減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(81.0mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.38(3H，s)，4.17(2H，s)，5.18(2H，s)，7.04(1H，t)，7.11-7.22(3H，m)，7.38(1H，dd)，8.19(1H，dd)實(shí)施例B2452-(4-溴-2-氟芐基)-3-吡啶醇 將三氟乙酸(1ml)加到實(shí)施例B244的化合物(134mg，0.411mmol)的二氯甲烷(4ml)溶液中，并將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。該混合物用飽和的碳酸氫鈉水溶液中和之后，加入乙酸乙酯。乙酸乙酯層用飽和鹽水洗滌并減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(97.5mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.17(2H，s)，7.10-7.24(5H，m)，8.15(1H，t)在NMR光譜中未發(fā)現(xiàn)酚羥基的質(zhì)子。
實(shí)施例B2462-(4-溴-2-氟芐基)-3-甲氧基吡啶 將碳酸鉀(38.7mg，0.280mmol)和碘甲烷(10.5μl，0.168mmol)加到實(shí)施例B245的化合物(15.8mg，0.0560mmol)的二甲基甲酰胺(1ml)溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。加入乙酸乙酯之后，將反應(yīng)混合物用飽和的鹽水洗滌并減壓濃縮。剩余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，得到標(biāo)題化合物(14.0mg)。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.82(3H，s)，4.15(2H，s)，7.03(1H，t)，7.12-7.22(4H，m)，8.13(1H，dd)實(shí)施例B的系列化合物是按與實(shí)施例B246相同的方式合成的，并通過LC-MS[洗脫液含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液∶含0.1％三氟乙酸的水溶液＝1∶99～100∶0/20-分鐘循環(huán)，流速20ml/分鐘，色譜柱YMC CombiprepODS-AM，20mm(Φ)×50mm(長)]進(jìn)行純化。
實(shí)施例B247
2-(4-溴-2-氟芐基)-3-乙氧基吡啶 MS m/z(ESIMH+)310.0實(shí)施例B2482-(4-溴-2-氟芐基)-3-丙氧基吡啶 MS m/z(ESIMH+)324.0實(shí)施例B2492-(4-溴-2-氟芐基)-3-丁氧基吡啶 MS m/z(ESIMH+)338.1實(shí)施例B2502-(4-溴-2-氟芐基)-3-(戊基氧基)吡啶 MS m/z(ESIMH+)352.1實(shí)施例B2512-(4-溴-2-氟芐基)-3-(己基氧基)吡啶
MS m/z(ESIMH+)366.0實(shí)施例B2522-(4-溴-2-氟芐基)-3-(2-氟乙氧基)吡啶 MS m/z(ESIMH+)328.0實(shí)施例B2532-(4-溴-2-氟芐基)-3-(3-氟丙氧基)吡啶 MS m/z(ESIMH+)342.0實(shí)施例B2542-(4-溴-2-氟芐基)-3-異丙氧基吡啶 MS m/z(ESIMH+)324.0實(shí)施例B2552-(4-溴-2-氟芐基)-3-(2，2，2-三氟乙氧基)吡啶 MS m/z(ESIMH+)364.0實(shí)施例B2562-(4-溴-2-氟芐基)-3-(3，3，3-三氟丙氧基)吡啶

MS m/z(ESIMH+)378.0實(shí)施例B257利用實(shí)施例A2的釀酒酵母報(bào)告系統(tǒng)評(píng)價(jià)化合物。與化合物未經(jīng)處理時(shí)所獲得的濃度相比，將細(xì)胞壁級(jí)分中頭孢菌素酶活性變成50％或更小時(shí)的濃度定義為IC50值。有代表性的化合物的效果示于表1中。
表1

工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明公開了編碼參與GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁之轉(zhuǎn)運(yùn)過程的蛋白質(zhì)的基因。此外，本發(fā)明還公開了篩選抑制這些蛋白質(zhì)活性的化合物的方法，本發(fā)明還公開了抑制這種活性的有代表性的化合物。
利用這些新的化合物，本發(fā)明表明可以提供具有新的抑制GPI-錨定蛋白質(zhì)到細(xì)胞壁之轉(zhuǎn)運(yùn)過程機(jī)制的抗真菌劑。
序列表<110>衛(wèi)材株式會(huì)社(Eisai Co.，Ltd.)<120>真菌細(xì)胞壁合成基因<130>E1-A0101Y1P<150>JP 2000-206968<151>2000-07-07<150>JP 2000-316027<151>2000-10-17<160>63<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1497<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1494)<400>1atg gca aca gta cat cag aag aat atg tcg act tta aaa cag aga aaa 48Met Ala Thr Val His Gln Lys Asn Met Ser Thr Leu Lys Gln Arg Lys1 5 10 15gag gac ttt gtg aca ggg ctc aat ggc ggt tct ata aca gaa att aac 96Glu Asp Phe Val Thr Gly Leu Asn Gly Gly Ser Ile Thr Glu Ile Asn20 25 30gca gtg aca tca att gct ttg gta act tac ata tca tgg aac tta ttg 144Ala Val Thr Ser Ile Ala Leu Val Thr Tyr Ile Ser Trp Asn Leu Leu35 40 45aaa aat tcc aac ctt atg cct cct ggc att tcc agc gtg caa tac ata 192Lys Asn Ser Asn Leu Met Pro Pro Gly Ile Ser Ser Val Gln Tyr Ile50 55 60att gat ttt gca ttg aac tgg gtt gct ttg ctt cta tct att act att 240Ile Asp Phe Ala Leu Asn Trp Val Ala Leu Leu Leu Ser Ile Thr Ile65 70 75 80tat gct agt gaa cca tac ctt cta aac acg cta ata ctg tta cct tgt 288
Tyr Ala Ser Glu Pro Tyr Leu Leu Asn Thr Leu Ile Leu Leu Pro Cys85 90 95ttg ctc gca ttc ata tat gga aaa ttt act agc tcg agt aaa cct tct336Leu Leu Ala Phe Ile Tyr Gly Lys Phe Thr Ser Ser Ser Lys Pro Ser100 105 110aat cca ata tac aat aaa aaa aaa atg att aca cag cgg ttc caa cta384Asn Pro Ile Tyr Asn Lys Lys Lys Met Ile Thr Gln Arg Phe Gln Leu115 120 125gaa aaa aag ccg tat att act gcg tat cgt ggt ggg atg ctt att ctg432Glu Lys Lys Pro Tyr Ile Thr Ala Tyr Arg Gly Gly Met Leu Ile Leu130 135 140act gct att gcc atc ttg gct gta gat ttt cca att ttc cca agg agg480Thr Ala Ile Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Pro Ile Phe Pro Arg Arg145 150 155 160ttt gcc aag gtg gaa act tgg ggg aca tcc ctg atg gat ctt ggt gta528Phe Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Leu Met Asp Leu Gly Val165 170 175gga tca ttc gtt ttc agt aac ggt att gtt tct tct agg gca ctg ttg576Gly Ser Phe Val Phe Ser Asn Gly Ile Val Ser Ser Arg Ala Leu Leu180 185 190aaa aac cta agc ttg aag agt aaa ccc agc ttc tta aaa aat gca ttt624Lys Asn Leu Ser Leu Lys Ser Lys Pro Ser Phe Leu Lys Asn Ala Phe195 200 205aat gcc tta aaa tca gga gga act cta ttg ttc cta gga ttg ctg agg672Asn Ala Leu Lys Ser Gly Gly Thr Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Arg210 215 220ttg ttt ttt gta aaa aat ttg gaa tat caa gaa cat gtc aca gaa tat720Leu Phe Phe Val Lys Asn Leu Glu Tyr Gln Glu His Val Thr Glu Tyr225 230 235 240ggg gtt cat tgg aat ttt ttt atc acc cta tca ttg ttg cca ctt gta768Gly Val His Trp Asn Phe Phe Ile Thr Leu Ser Leu Leu Pro Leu Val245 250 255ttg acc ttt att gat ccc gtc aca aga atg gtt cca cgc tgc tca att816Leu Thr Phe Ile Asp Pro Val Thr Arg Met Val Pro Arg Cys Ser Ile260 265 270gca ata ttc att tca tgc att tat gaa tgg cta ctt tta aag gac gat864Ala Ile Phe Ile Ser Cys Ile Tyr Glu Trp Leu Leu Leu Lys Asp Asp275 280 285cgc act tta aac ttt tta att ttg gct gat aga aat tgt ttc ttc agt912Arg Thr Leu Asn Phe Leu Ile Leu Ala Asp Arg Asn Cys Phe Phe Ser290 295 300gct aat aga gaa ggc atc ttc tca ttt cta ggt tat tgc tcg att ttt960Ala Asn Arg Glu Gly Ile Phe Ser Phe Leu Gly Tyr Cys Ser Ile Phe305 310 315 320
ctt tgg ggc caa aac acg gga ttt tac ttg ttg gga aat aaa cca act 1008Leu Trp Gly Gln Asn Thr Gly Phe Tyr Leu Leu Gly Asn Lys Pro Thr325 330 335tta aac aat ctt tat aag cct tct acg caa gac gta gtt gca gca tca 1056Leu Asn Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Gln Asp Val Val Ala Ala Ser340 345 350aag aag tct tcg act tgg gac tat tgg act tca gta acc cca tta agt 1104Lys Lys Ser Ser Thr Trp Asp Tyr Trp Thr Ser Val Thr Pro Leu Ser355 360 365ggc ctc tgt ata tgg agt aca att ttt ctt gtt atc agc cag ttg gtt 1152Gly Leu Cys Ile Trp Ser Thr Ile Phe Leu Val Ile Ser Gln Leu Val370 375 380ttt caa tac cat cct tat agt gtt tca aga agg ttt gct aac tta cca 1200Phe Gln Tyr His Pro Tyr Ser Val Ser Arg Arg Phe Ala Asn Leu Pro385 390 395 400tat act ttg tgg gtc att act tat aat tta cta ttt ttg act ggg tac 1248Tyr Thr Leu Trp Val Ile Thr Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Thr Gly Tyr405 410 415tgc ttg act gac aaa att ttc ggt aat tct tcg gaa tat tat aaa gtt 1296Cys Leu Thr Asp Lys Ile Phe Gly Asn Ser Ser Glu Tyr Tyr Lys Val420 425 430gcc gaa tgc ttg gaa tca atc aac tcc aat ggg ttg ttt tta ttt ttg 1344Ala Glu Cys Leu Glu Ser Ile Asn Ser Asn Gly Leu Phe Leu Phe Leu435 440 445ttg gca aat gtc tct act ggt tta gtc aat atg tct atg gtc acg ata 1392Leu Ala Asn Val Ser Thr Gly Leu Val Asn Met Ser Met Val Thr Ile450 455 460gat tct tca ccc tta aaa tca ttc ctg gtt ttg ttg gca tac tgc tca 1440Asp Ser Ser Pro Leu Lys Ser Phe Leu Val Leu Leu Ala Tyr Cys Ser465 470 475 480ttc ata gct gtc ata tcg gtt ttc ttg tat aga aaa aga ata ttc att 1488Phe Ile Ala Val Ile Ser Val Phe Leu Tyr Arg Lys Arg Ile Phe Ile485 490 495aag cta taa 1497Lys Leu<210>2<211>498<212>PRT<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>2Met Ala Thr Val His Gln Lys Asn Met Ser Thr Leu Lys Gln Arg Lys
1 5 10 15Glu Asp Phe Val Thr Gly Leu Asn Gly Gly Ser Ile Thr Glu Ile Asn20 25 30Ala Val Thr Ser Ile Ala Leu Val Thr Tyr Ile Ser Trp Asn Leu Leu35 40 45Lys Asn Ser Asn Leu Met Pro Pro Gly Ile Ser Ser Val Gln Tyr Ile50 55 60Ile Asp Phe Ala Leu Asn Trp Val Ala Leu Leu Leu Ser Ile Thr Ile65 70 75 80Tyr Ala Ser Glu Pro Tyr Leu Leu Asn Thr Leu Ile Leu Leu Pro Cys85 90 95Leu Leu Ala Phe Ile Tyr Gly Lys Phe Thr Ser Ser Ser Lys Pro Ser100 105 110Asn Pro Ile Tyr Asn Lys Lys Lys Met Ile Thr Gln Arg Phe Gln Leu115 120 125Glu Lys Lys Pro Tyr Ile Thr Ala Tyr Arg Gly Gly Met Leu Ile Leu130 135 140Thr Ala Ile Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Pro Ile Phe Pro Arg Arg145 150 155 160Phe Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Leu Met Asp Leu Gly Val165 170 175Gly Ser Phe Val Phe Ser Asn Gly Ile Val Ser Ser Arg Ala Leu Leu180 185 190Lys Asn Leu Ser Leu Lys Ser Lys Pro Ser Phe Leu Lys Asn Ala Phe195 200 205Asn Ala Leu Lys Ser Gly Gly Thr Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Arg210 215 220Leu Phe Phe Val Lys Asn Leu Glu Tyr Gln Glu His Val Thr Glu Tyr225 230 235 240Gly Val His Trp Asn Phe Phe Ile Thr Leu Ser Leu Leu Pro Leu Val245 250 255Leu Thr Phe Ile Asp Pro Val Thr Arg Met Val Pro Arg Cys Ser Ile260 265 270Ala Ile Phe Ile Ser Cys Ile Tyr Glu Trp Leu Leu Leu Lys Asp Asp275 280 285Arg Thr Leu Asn Phe Leu Ile Leu Ala Asp Arg Asn Cys Phe Phe Ser290 295 300Ala Asn Arg Glu Gly Ile Phe Ser Phe Leu Gly Tyr Cys Ser Ile Phe305 310 315 320Leu Trp Gly Gln Asn Thr Gly Phe Tyr Leu Leu Gly Asn Lys Pro Thr325 330 335Leu Asn Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Gln Asp Val Val Ala Ala Ser340 345 350Lys Lys Ser Ser Thr Trp Asp Tyr Trp Thr Ser Val Thr Pro Leu Ser
355 360 365Gly Leu Cys Ile Trp Ser Thr Ile Phe Leu Val Ile Ser Gln Leu Val370 375 380Phe Gln Tyr His Pro Tyr Ser Val Ser Arg Arg Phe Ala Asn Leu Pro385 390 395 400Tyr Thr Leu Trp Val Ile Thr Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Thr Gly Tyr405 410 415Cys Leu Thr Asp Lys Ile Phe Gly Asn Ser Ser Glu Tyr Tyr Lys Val420 425 430Ala Glu Cys Leu Glu Ser Ile Asn Ser Asn Gly Leu Phe Leu Phe Leu435 440 445Leu Ala Asn Val Ser Thr Gly Leu Val Asn Met Ser Met Val Thr Ile450 455 460Asp Ser Ser Pro Leu Lys Ser Phe Leu Val Leu Leu Ala Tyr Cys Ser465 470 475 480Phe Ile Ala Val Ile Ser Val Phe Leu Tyr Arg Lys Arg Ile Phe Ile485 490 495Lys Leu<210>3<21l>1458<212>DNA<213>白色假絲酵母(Candida albicans)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1455)<400>3atg tca tcg tct tta aaa caa ttg aaa gaa caa ttt gtc tca gat ttg48Met Ser Ser Ser Leu Lys Gln Leu Lys Glu Gln Phe Val Ser Asp Leu1 5 10 15act ggt ggc aca att gaa gaa att tat gct gta acc agt ata gca tta96Thr Gly Gly Thr Ile Glu Glu Ile Tyr Ala Val Thr Ser Ile Ala Leu20 25 30tca tct tat ttg tcc ttt aga ttg ttg aaa aag tct ctt ggt gat tta144Ser Ser Tyr Leu Ser Phe Arg Leu Leu Lys Lys Ser Leu Gly Asp Leu35 40 45gct ttg att tac gac tac att ctt aat gtg ttg aca att cta gca tcc192Ala Leu Ile Tyr Asp Tyr Ile Leu Asn Val Leu Thr Ile Leu Ala Ser50 55 60att act gtt tat agc aac agc cct tct tat ttg cat tat ttt att gtt240Ile Thr Val Tyr Ser Asn Ser Pro Ser Tyr Leu His Tyr Phe Ile Val
65 70 75 80att cca tca tta gtt ata tat cta gtg aat tac cat gtt gag aaa cca288Ile Pro Ser Leu Val Ile Tyr Leu Val Asn Tyr His Val Glu Lys Pro85 90 95tct tca ccc cat aga caa aat gat aca aaa gaa gat aaa tcg gac gaa336Ser Ser Pro His Arg Gln Asn Asp Thr Lys Glu Asp Lys Ser Asp Glu100 105 110cta ttg ccg aga aaa caa ttt ata aca gcc tat cgt tct caa atg ttg384Leu Leu Pro Arg Lys Gln Phe Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Gln Met Leu115 120 125ata att act aat cta gct ata tta gct gtt gat ttt cct att ttc cca432Ile Ile Thr Asn Leu Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Pro Ile Phe Pro130 135 140aga aga ttt gcc aaa gtg gaa aca tgg ggc acg tca atg atg gat tta480Arg Arg Phe Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Met Met Asp Leu145 150 155 160gga gtt ggg tcg ttt gtg ttc tcc atg ggg ttg gct aat tct cga caa528Gly Val Gly Ser Phe Val Phe Ser Met Gly Leu Ala Asn Ser Arg Gln165 170 175ttg atc aag aac cac acc gac aac tac aaa ttt agt tgg aag agt tat576Leu Ile Lys Asn His Thr Asp Asn Tyr Lys Phe Ser Trp Lys Ser Tyr180 185 190ttg aaa aca atc aag cag aac ttt atc aag tca gtg cct ata ctt gtt624Leu Lys Thr Ile Lys Gln Asn Phe Ile Lys Ser Val Pro Ile Leu Val195 200 205tta gga gct att cgt ttt gtt agt gtt aag caa ttg gac tat cag gaa672Leu Gly Ala Ile Arg Phe Val Ser Val Lys Gln Leu Asp Tyr Gln Glu210 215 220cac gaa aca gag tat gga atc cat tgg aat ttt ttc ttc aca tta ggg720His Glu Thr Glu Tyr Gly Ile His Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly225 230 235 240ttc ttg cca att gta ttg gga ata tta gac ccg gtg ttg aat ttg gtt768Phe Leu Pro Ile Val Leu Gly Ile Leu Asp Pro Val Leu Asn Leu Val245 250 255cca cgc ttc ata ata gga att ggt atc tca att gct tat gag gta gcg816Pro Arg Phe Ile Ile Gly Ile Gly Ile Ser Ile Ala Tyr Glu Val Ala260 265 270ttg aat aag act ggt ttg ttg aag ttc att ttg agc agc gaa aac aga864Leu Asn Lys Thr Gly Leu Leu Lys Phe Ile Leu Ser Ser Glu Asn Arg275 280 285ctt gaa tct ctc atc acc atg aat aaa gaa ggt att ttt tcg ttt att912Leu Glu Ser Leu Ile Thr Met Asn Lys Glu Gly Ile Phe Ser Phe Ile290 295 300gga tat ctt tgt att ttt ata att ggt cag tct ttt ggg tca ttt gtt960
Gly Tyr Leu Cys Ile Phe Ile Ile Gly Gln Ser Phe Gly Ser Phe Val305 310 315 320tta aca ggc tac aaa aca aag aac aac tta ata acc att agc aaa att1008Leu Thr Gly Tyr Lys Thr Lys Asn Asn Leu Ile Thr Ile Ser Lys Ile325 330 335cgt att tca aaa aaa caa cac aag aaa gag ctg ctg ctg ttt ttc tca1056Arg Ile Ser Lys Lys Gln His Lys Lys Glu Leu Leu Leu Phe Phe Ser340 345 350gtc gcc act act cag gga tta tat ttg gca tgt atc ttc tat cac tta1104Val Ala Thr Thr Gln Gly Leu Tyr Leu Ala Cys Ile Phe Tyr His Leu355 360 365gct ttc agt ttg ttc atc agc aac tta tca ttc ttg caa cca att tca1152Ala Phe Ser Leu Phe Ile Ser Asn Leu Ser Phe Leu Gln Pro Ile Ser370 375 380aga cga ttg gcc aat ttc ccc tac gtc atg tgg gtc gtt tcg tac aat1200Arg Arg Leu Ala Asn Phe Pro Tyr Val Met Trp Val Val Ser Tyr Asn385 390 395 400gct acg ttt tta tta tgt tat gac tta att gaa aaa ttt atc ccg ggg1248Ala Thr Phe Leu Leu Cys Tyr Asp Leu Ile Glu Lys Phe Ile Pro Gly405 410 415aac ctt act tct act gta ttg gac tct att aat aac aat ggt tta ttt1296Asn Leu Thr Ser Thr Val Leu Asp Ser Ile Asn Asn Asn Gly Leu Phe420 425 430atc ttc ttg gtc agc aat tta tta aca ggg ttt att aac atg tcc atc1344Ile Phe Leu Val Ser Asn Leu Leu Thr Gly Phe Ile Asn Met Ser Ile435 440 445aac act ttg gaa act agc aat aaa atg gca gtg att atc ttg att ggc1392Asn Thr Leu Glu Thr Ser Asn Lys Met Ala Val Ile Ile Leu Ile Gly450 455 460tat agt ctt act tgg aca ttg ctc gcc tta tat ttg gat aag agg aag1440Tyr Ser Leu Thr Trp Thr Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Asp Lys Arg Lys465 470 475 480atc tac atc aag ctt tag1458Ile Tyr Ile Lys Leu485<210>4<211>485<212>PRT<213>白色假絲酵母(Candida albicans)<400>4Met Ser Ser Ser Leu Lys Gln Leu Lys Glu Gln Phe Val Ser Asp Leu
1 5 10 15Thr Gly Gly Thr Ile Glu Glu Ile Tyr Ala Val Thr Ser Ile Ala Leu20 25 30Ser Ser Tyr Leu Ser Phe Arg Leu Leu Lys Lys Ser Leu Gly Asp Leu35 40 45Ala Leu Ile Tyr Asp Tyr Ile Leu Asn Val Leu Thr Ile Leu Ala Ser50 55 60Ile Thr Val Tyr Ser Asn Ser Pro Ser Tyr Leu His Tyr Phe Ile Val65 70 75 80Ile Pro Ser Leu Val Ile Tyr Leu Val Asn Tyr His Val Glu Lys Pro85 90 95Ser Ser Pro His Arg Gln Asn Asp Thr Lys Glu Asp Lys Ser Asp Glu100 105 110Leu Leu Pro Arg Lys Gln Phe Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Gln Met Leu115 120 125Ile Ile Thr Asn Leu Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Pro Ile Phe Pro130 135 140Arg Arg Phe Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Met Met Asp Leu145 150 155 160Gly Val Gly Ser Phe Val Phe Ser Met Gly Leu Ala Asn Ser Arg Gln165 170 175Leu Ile Lys Asn His Thr Asp Asn Tyr Lys Phe Ser Trp Lys Ser Tyr180 185 190Leu Lys Thr Ile Lys Gln Asn Phe Ile Lys Ser Val Pro Ile Leu Val195 200 205Leu Gly Ala Ile Arg Phe Val Ser Val Lys Gln Leu Asp Tyr Gln Glu210 215 220His Glu Thr Glu Tyr Gly Ile His Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly225 230 235 240Phe Leu Pro Ile Val Leu Gly Ile Leu Asp Pro Val Leu Asn Leu Val245 250 255Pro Arg Phe Ile Ile Gly Ile Gly Ile Ser Ile Ala Tyr Glu Val Ala260 265 270Leu Asn Lys Thr Gly Leu Leu Lys Phe Ile Leu Ser Ser Glu Asn Arg275 280 285Leu Glu Ser Leu Ile Thr Met Asn Lys Glu Gly Ile Phe Ser Phe Ile290 295 300Gly Tyr Leu Cys Ile Phe Ile Ile Gly Gln Ser Phe Gly Ser Phe Val305 310 315 320Leu Thr Gly Tyr Lys Thr Lys Asn Asn Leu Ile Thr Ile Ser Lys Ile325 330 335Arg Ile Ser Lys Lys Gln His Lys Lys Glu Leu Leu Leu Phe Phe Ser340 345 350Val Ala Thr Thr Gln Gly Leu Tyr Leu Ala Cys Ile Phe Tyr His Leu
355 360 365Ala Phe Ser Leu Phe Ile Ser Asn Leu Ser Phe Leu Gln Pro Ile Ser370 375 380Arg Arg Leu Ala Asn Phe Pro Tyr Val Met Trp Val Val Ser Tyr Asn385 390 395 400Ala Thr Phe Leu Leu Cys Tyr Asp Leu Ile Glu Lys Phe Ile Pro Gly405 410 415Asn Leu Thr Ser Thr Val Leu Asp Ser Ile Asn Asn Asn Gly Leu Phe420 425 430Ile Phe Leu Val Ser Asn Leu Leu Thr Gly Phe Ile Asn Met Ser Ile435 440 445Asn Thr Leu Glu Thr Ser Asn Lys Met Ala Val Ile Ile Leu Ile Gly450 455 460Tyr Ser Leu Thr Trp Thr Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Asp Lys Arg Lys465 470 475 480Ile Tyr Ile Lys Leu485<210>5<211>1458<212>DNA<213>白色假絲酵母(Candida albicans)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1455)<400>5atg tca tcg tct tta aaa caa ttg aaa gaa caa ttt gtc tca gat ttg48Met Ser Ser Ser Leu Lys Gln Leu Lys Glu Gln Phe Val Ser Asp Leu1 5 10 15act ggt ggc aca att gaa gaa att tat gct gta acc agt ata gca tta96Thr Gly Gly Thr Ile Glu Glu Ile Tyr Ala Val Thr Ser Ile Ala Leu20 25 30tca tct tat ttg tcc ttt aga ttg ttg aaa aag tct ctt ggt gat tta144Ser Ser Tyr Leu Ser Phe Arg Leu Leu Lys Lys Ser Leu Gly Asp Leu35 40 45gct ttg att tac gac tac att ctt aat gtg ttg aca att cta gca tcc192Ala Leu Ile Tyr Asp Tyr Ile Leu Asn Val Leu Thr Ile Leu Ala Ser50 55 60att act gtt tat agc aac agc cct tct tat ttg cat tat ttt att gtt240Ile Thr Val Tyr Ser Asn Ser Pro Ser Tyr Leu His Tyr Phe Ile Val65 70 75 80
att cca tca tta gtt ata tat cta gtg aat tac cat gtt gag aaa cca288Ile Pro Ser Leu Val Ile Tyr Leu Val Asn Tyr His Val Glu Lys Pro85 90 95tct tca ccc cat aga caa aat gat aca aaa gaa gat aaa tcg gac gaa336Ser Ser Pro His Arg Gln Asn Asp Thr Lys Glu Asp Lys Ser Asp Glu100 105 110cta ttg ccg aga aaa caa ttt ata aca gcc tat cgt tct caa atg ttg384Leu Leu Pro Arg Lys Gln Phe Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Gln Met Leu115 120 125ata att act aat cta gct ata tta gct gtt gat ttt cct att ttc cca432Ile Ile Thr Asn Leu Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Pro Ile Phe Pro130 135 140aga aga ttt gcc aaa gtg gaa aca tgg ggc acg tca atg atg gat tta480Arg Arg Phe Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Met Met Asp Leu145 150 155 160gga gtt ggg tcg ttt gtg ttc tcc atg ggg ttg gct aat tct cga caa528Gly Val Gly Ser Phe Val Phe Ser Met Gly Leu Ala Asn Ser Arg Gln165 170 175ttg atc aag aac cac acc gac aat tac aaa ttt agt tgg aag agt tat576Leu Ile Lys Asn His Thr Asp Asn Tyr Lys Phe Ser Trp Lys Ser Tyr180 185 190ttg aaa aca atc aag cag aac ttt atc aag tca gtg cct ata ctt gtt624Leu Lys Thr Ile Lys Gln Asn Phe Ile Lys Ser Val Pro Ile Leu Val195 200 205tta gga gct att cgt ttt gtt agt gtt aag caa ttg gac tat cag gaa672Leu Gly Ala Ile Arg Phe Val Ser Val Lys Gln Leu Asp Tyr Gln Glu210 215 220cac gaa aca gag tat gga atc cat tgg aat ttt ttc ttc aca tta ggg720His Glu Thr Glu Tyr Gly Ile His Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly225 230 235 240ttc ttg cca att gta ttg gga ata tta gac ccg gtg ttg aat ttg gtt768Phe Leu Pro Ile Val Leu Gly Ile Leu Asp Pro Val Leu Asn Leu Val245 250 255cca cgc ttc ata ata gga att ggt atc tca att ggt tat gag gta gcg816Pro Arg Phe Ile Ile Gly Ile Gly Ile Ser Ile Gly Tyr Glu Val Ala260 265 270ttg aat aag act ggt ttg ttg aag ttc att ttg agc agc gaa aac aga864Leu Asn Lys Thr Gly Leu Leu Lys Phe Ile Leu Ser Ser Glu Asn Arg275 280 285ctt gaa tct ctc atc gcc atg aat aaa gaa ggt att ttt tcg ttt att912Leu Glu Ser Leu Ile Ala Met Asn Lys Glu Gly Ile Phe Ser Phe Ile290 295 300gga tat ctt tgt att ttt ata att ggt cag tct ttt ggg tca ttt gtt960Gly Tyr Leu Cys Ile Phe Ile Ile Gly Gln Ser Phe Gly Ser Phe Val
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Thr Gly Gly Thr Ile Glu Glu Ile Tyr Ala Val Thr Ser Ile Ala Leu20 25 30Ser Ser Tyr Leu Ser Phe Arg Leu Leu Lys Lys Ser Leu Gly Asp Leu35 40 45Ala Leu Ile Tyr Asp Tyr Ile Leu Asn Val Leu Thr Ile Leu Ala Ser50 55 60Ile Thr Val Tyr Ser Asn Ser Pro Ser Tyr Leu His Tyr Phe Ile Val65 70 75 80Ile Pro Ser Leu Val Ile Tyr Leu Val Asn Tyr His Val Glu Lys Pro85 90 95Ser Ser Pro His Arg Gln Asn Asp Thr Lys Glu Asp Lys Ser Asp Glu100 105 110Leu Leu Pro Arg Lys Gln Phe Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Gln Met Leu115 120 125Ile Ile Thr Asn Leu Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Pro Ile Phe Pro130 135 140Arg Arg Phe Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Met Met Asp Leu145 150 155 160Gly Val Gly Ser Phe Val Phe Ser Met Gly Leu Ala Asn Ser Arg Gln165 170 175Leu Ile Lys Asn His Thr Asp Asn Tyr Lys Phe Ser Trp Lys Ser Tyr180 185 190Leu Lys Thr Ile Lys Gln Asn Phe Ile Lys Ser Val Pro Ile Leu Val195 200 205Leu Gly Ala Ile Arg Phe Val Ser Val Lys Gln Leu Asp Tyr Gln Glu210 215 220His Glu Thr Glu Tyr Gly Ile His Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly225 230 235 240Phe Leu Pro Ile Val Leu Gly Ile Leu Asp Pro Val Leu Asn Leu Val245 250 255Pro Arg Phe Ile Ile Gly Ile Gly Ile Ser Ile Gly Tyr Glu Val Ala260 265 270Leu Asn Lys Thr Gly Leu Leu Lys Phe Ile Leu Ser Ser Glu Asn Arg275 280 285Leu Glu Ser Leu Ile Ala Met Asn Lys Glu Gly Ile Phe Ser Phe Ile290 295 300Gly Tyr Leu Cys Ile Phe Ile Ile Gly Gln Ser Phe Gly Ser Phe Val305 310 315 320Leu Thr Gly Tyr Lys Thr Lys Asn Asn Leu Ile Thr Ile Ser Lys Ile325 330 335Arg Ile Ser Lys Lys Gln His Lys Lys Glu Leu Leu Leu Phe Phe Ser340 345 350Val Ala Thr Thr Gln Gly Leu Tyr Leu Ala Cys Ile Phe Tyr His Leu355 360 365
Ala Phe Ser Leu Phe Ile Ser Asn Leu Ser Phe Leu Gln Pro Ile Ser370 375 380Arg Arg Leu Ala Asn Phe Pro Tyr Val Met Trp Val Val Ser Tyr Asn385 390 395 400Ala Thr Phe Leu Leu Cys Tyr Asp Leu Ile Glu Lys Phe Ile Pro Gly405 410 415Asn Leu Thr Ser Thr Val Leu Asp Ser Ile Asn Asn Asn Gly Leu Phe420 425 430Ile Phe Leu Val Ser Asn Leu Leu Thr Gly Phe Ile Asn Met Ser Ile435 440 445Asn Thr Leu Glu Thr Ser Asn Lys Met Ala Val Ile Ile Leu Ile Gly450 455 460Tyr Ser Leu Thr Trp Thr Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Asp Lys Arg Lys465 470 475 480Ile Tyr Ile Lys Leu485<210>7<211>1458<212>DNA<213>白色假絲酵母(Candida albicans)<400>7atgtcatcgt ctttaaaaca attgaaagaa caatttgtct cagatttgac tggtggcaca60attgaagaaa tttatgctgt aaccagtata gcattatcat cttatttgtc ctttagattg 120ttgaaaaagt ctcttggtga tttagctttg atttacgact acattcttaa tgtgttgaca 180attctagcat ccattactgt ttatagcaac agcccttctt atttgcatta ttttattgtt 240attccatcat tagttatata tctagtgaat taccatgttg agaaaccatc ttcaccccat 300agacaaaatg atacaaaaga agataaatcg gacgaactat tgccgagaaa acaatttata 360acagcctatc gttctcaaat gttgataatt actaatctag ctatattagc tgttgatttt 420cctattttcc caagaagatt tgccaaagtg gaaacatggg gcacgtcaat gatggattta 480ggggttgggt cgtttgtgtt ctccatgggg ttggctaatt ctcgacaatt gatcaagaac 540cacaccgaca actacaaatt tagttggaag agttatttga aaacaatcaa gcagaacttt 600atcaagtcag tgcctatact tgttttagga gctattcgtt ttgttagtgt taagcaattg 660gactatcagg aacacgaaac agagtatgga atccattgga attttttctt cacattaggg 720ttcttgccaa ttgtattggg aatattagac ccggtgttga atttggttcc acgcttcata 780ataggaattg gtatctcaat tggttatgag gtagcgttga ataagactgg tttgttgaag 840ttcattttga gcagcgaaaa cagacttgaa tctctcatcg ccatgaataa agaaggtatt 900ttttcgttta ttggatatct ttgtattttt ataattggtc agtcttttgg gtcatttgtt 960ttaacaggct acaaaacaaa gaacaactta ataaccatta gcaaaattcg tatttcaaaa 1020aaacaacaca agaaagagct gctgctgttt ttctcagtcg ccactactca gggattatat 1080ttggcatgta tcttctatca cttagctttc agtttgttca tcagcaactt atcattcttg 1140caaccaattt caagacgatt ggccaatttc ccctacgtca tgtgggtcgt ttcgtacaat 1200
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<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>8gcagtcgact cgatgaggtc tttgctaatc ttg 33<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>9gcagaattcg acaccacaac cttgaacgta ttg 33<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>10cccgaattca ctgacggtca aatccaagct act 33
<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>11ggaagctttt ataacaacat agcggcagca gc32<210>12<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>12cccgcggccg cttgatagta agcttgcttg ggccgcatca tgtaattag 49<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>13cccggtacca aattaaagcc ttcgagcctc cca 33<210>14<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列
<400>14cccggatcct gtttgcagca tgagacttgc ata 33<210>15<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>15cccgcggccg ccccttccaa ttcgaaaacc ttccccagag cagcc 45<210>16<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>16ggttcgaagc cgcaaaaaca gaacaacaaa tt32<210>17<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
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<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>18gggtctagaa ctgacggtca aatccaagct act 33<210>19<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>19ggaagctttt ataacaacat agcggcagca gc32<210>20<211>18<212>PRT<213>白色假絲酵母(Candida albicans)<400>20Cys Phe Thr Ala Gly Thr Asn Thr Val Thr Phe Asn Asp Gly Asp Lys1 5 10 15Asp Ile18<210>21<211>27<212>DNA<213>白色假絲酵母(Candida albicans)<400>21aaactgttca ctgaacaacc aaatctc 27
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<210>27<211>1380<212>DNA<213>粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1380)<400>27atg tca tac aaa ttg gaa aaa gaa gca ttt gtc tca aac ctg acg ggt48Met Ser Tyr Lys Leu Glu Lys Glu Ala Phe Val Ser Asn Leu Thr Gly1 5 10 15tca agt tcc att gag aca tgt ggc ttg tta tta ata gga att gct tgc96Ser Ser Ser Ile Glu Thr Cys Gly Leu Leu Leu Ile Gly Ile Ala Cys20 25 30aac gtt ttg tgg gta aac atg act gcg aga aac atc tta ccc aaa ggg144Asn Val Leu Trp Val Asn Met Thr Ala Arg Asn Ile Leu Pro Lys Gly35 40 45aat ctt ggg ttt ctt gtt gag ttt ttc atc ttt tgc tta att cca tta192Asn Leu Gly Phe Leu Val Glu Phe Phe Ile Phe Cys Leu Ile Pro Leu50 55 60ttt gtc att tac gtt tca tcg aaa gtt ggc gtt ttc act ctt tgc ata240Phe Val Ile Tyr Val Ser Ser Lys Val Gly Val Phe Thr Leu Cys Ile65 70 75 80gcc tct ttt ttg cct tcc ttc gtc ctt cat gtt ata agt cca att aat288Ala Ser Phe Leu Pro Ser Phe Val Leu His Val Ile Ser Pro Ile Asn85 90 95tgg gat gtg ctg aga aga aaa cct ggt tgt tgt ctt act aaa aaa aat336Trp Asp Val Leu Arg Arg Lys Pro Gly Cys Cys Leu Thr Lys Lys Asn100 105 110gaa aat act ttt gat cga cga att gct gga gtc aca ttt tat cgt tct384Glu Asn Thr Phe Asp Arg Arg Ile Ala Gly Val Thr Phe Tyr Arg Ser115 120 125caa atg atg ttg gtt act gtc act tgc atc ctg gcc gtt gac ttt acc432Gln Met Met Leu Val Thr Val Thr Cys Ile Leu Ala Val Asp Phe Thr130 135 140ctt ttc ccg agg aga tat gcc aaa gtt gaa acc tgg gga aca tca ctg480Leu Phe Pro Arg Arg Tyr Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Leu145 150 155 160atg gat ctt ggt gtt gga tct ttc atg ttt tct tca ggt act gtg gct528Met Asp Leu Gly Val Gly Ser Phe Met Phe Ser Ser Gly Thr Val Ala165 170 175
gga cgg aaa aat gac att aaa aaa cca aat gcg ttt aaa aat gta ttg576Gly Arg Lys Asn Asp Ile Lys Lys Pro Asn Ala Phe Lys Asn Val Leu180 185 190tgg aat tct ttc atc ctt ttg att tta gga ttt gcg cgc atg ttt tta624Trp Asn Ser Phe Ile Leu Leu Ile Leu Gly Phe Ala Arg Met Phe Leu195 200 205acg aaa agc atc aat tac caa gaa cat gta agc gaa tat ggc atg cat672Thr Lys Ser Ile Asn Tyr Gln Glu His Val Ser Glu Tyr Gly Met His210 215 220tgg aac ttt ttt ttc acc cta ggt ttc atg gct ctt ggc gta ttt ttt720Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly Phe Met Ala Leu Gly Val Phe Phe225 230 235 240ttt cgt cgt tct tta aaa aaa gtc tcc tat ttt aat tta gca acc ttc768Phe Arg Arg Ser Leu Lys Lys Val Ser Tyr Phe Asn Leu Ala Thr Phe245 250 255att act ctt ctt cat cat tgt ttg ctt gtt tta acc cct ttc caa aaa816Ile Thr Leu Leu His His Cys Leu Leu Val Leu Thr Pro Phe Gln Lys260 265 270tgg gca cta tcc gcc ccc aga aca aat att ttg gct cag aat aga gag864Trp Ala Leu Ser Ala Pro Arg Thr Asn Ile Leu Ala Gln Asn Arg Glu275 280 285ggt att gct tct ctt ccc gga tac att gct att tac ttt tat gga atg912Gly Ile Ala Ser Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Ile Tyr Phe Tyr Gly Met290 295 300tat acc ggt agt gta gtt ttg gct gat cga cct cta atg tat act aga960Tyr Thr Gly Ser Val Val Leu Ala Asp Arg Pro Leu Met Tyr Thr Arg305 310 315 320gct gag tcg tgg aag cgc ttt caa cgt cta tta ttc ccg cta tgc att1008Ala Glu Ser Trp Lys Arg Phe Gln Arg Leu Leu Phe Pro Leu Cys Ile325 330 335ttg tta gtg ttg tat ctt gtg tct aac ttt ttg tca gtt ggt gtt tct1056Leu Leu Val Leu Tyr Leu Val Ser Asn Phe Leu Ser Val Gly Val Ser340 345 350cgc cga ctt gct aat acg cct tat gtt gcg aat gtt gcc ttt atc aat1104Arg Arg Leu Ala Asn Thr Pro Tyr Val Ala Asn Val Ala Phe Ile Asn355 360 365atg ttt ttt ctt act ata tac ata ctt att gat gcc tat tta ttc cca1152Met Phe Phe Leu Thr Ile Tyr Ile Leu Ile Asp Ala Tyr Leu Phe Pro370 375 380tct tct gtg cca tat gga agt cgc gtc ccc aaa ctg ctt gaa gat gcc1200Ser Ser Val Pro Tyr Gly Ser Arg Val Pro Lys Leu Leu Glu Asp Ala385 390 395 400aat aat aat ggc ttg ttg gtg ttt ttg att gct aac gtt tta aca gga1248Asn Asn Asn Gly Leu Leu Val Phe Leu Ile Ala Asn Val Leu Thr Gly
405 410 415gta gtt aat tta tcg ttc gac acc ctt cat tct agc aat gca aaa ggc 1296Val Val Asn Leu Ser Phe Asp Thr Leu His Ser Ser Asn Ala Lys Gly420 425 430ttg aca atc atg act atg tat ctt ttt att att tgc tat atg gca cat 1344Leu Thr Ile Met Thr Met Tyr Leu Phe Ile Ile Cys Tyr Met Ala His435 440 445tgg ctt gct caa cac gga att cgt ttt cgc ctt tag 1380Trp Leu Ala Gln His Gly Ile Arg Phe Arg Leu450 455 460<210>28<211>459<212>PRT<213>粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)<400>28Met Ser Tyr Lys Leu Glu Lys Glu Ala Phe Val Ser Asn Leu Thr Gly1 5 10 15Ser Ser Ser Ile Glu Thr Cys Gly Leu Leu Leu Ile Gly Ile Ala Cys20 25 30Asn Val Leu Trp Val Asn Met Thr Ala Arg Asn Ile Leu Pro Lys Gly35 40 45Asn Leu Gly Phe Leu Val Glu Phe Phe Ile Phe Cys Leu Ile Pro Leu50 55 60Phe Val Ile Tyr Val Ser Ser Lys Val Gly Val Phe Thr Leu Cys Ile65 70 75 80Ala Ser Phe Leu Pro Ser Phe Val Leu His Val Ile Ser Pro Ile Asn85 90 95Trp Asp Val Leu Arg Arg Lys Pro Gly Cys Cys Leu Thr Lys Lys Asn100 105 110Glu Asn Thr Phe Asp Arg Arg Ile Ala Gly Val Thr Phe Tyr Arg Ser115 120 125Gln Met Met Leu Val Thr Val Thr Cys Ile Leu Ala Val Asp Phe Thr130 135 140Leu Phe Pro Arg Arg Tyr Ala Lys Val Glu Thr Trp Gly Thr Ser Leu145 150 155 160Met Asp Leu Gly Val Gly Ser Phe Met Phe Ser Ser Gly Thr Val Ala165 170 175Gly Arg Lys Asn Asp Ile Lys Lys Pro Asn Ala Phe Lys Asn Val Leu180 185 190Trp Asn Ser Phe Ile Leu Leu Ile Leu Gly Phe Ala Arg Met Phe Leu195 200 205
Thr Lys Ser Ile Asn Tyr Gln Glu His Val Ser Glu Tyr Gly Met His210 215 220Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly Phe Met Ala Leu Gly Val Phe Phe225 230 235 240Phe Arg Arg Ser Leu Lys Lys Val Ser Tyr Phe Asn Leu Ala Thr Phe245 250 255Ile Thr Leu Leu His His Cys Leu Leu Val Leu Thr Pro Phe Gln Lys260 265 270Trp Ala Leu Ser Ala Pro Arg Thr Asn Ile Leu Ala Gln Asn Arg Glu275 280 285Gly Ile Ala Ser Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Ile Tyr Phe Tyr Gly Met290 295 300Tyr Thr Gly Ser Val Val Leu Ala Asp Arg Pro Leu Met Tyr Thr Arg305 310 315 320Ala Glu Ser Trp Lys Arg Phe Gln Arg Leu Leu Phe Pro Leu Cys Ile325 330 335Leu Leu Val Leu Tyr Leu Val Ser Asn Phe Leu Ser Val Gly Val Ser340 345 350Arg Arg Leu Ala Asn Thr Pro Tyr Val Ala Asn Val Ala Phe Ile Asn355 360 365Met Phe Phe Leu Thr Ile Tyr Ile Leu Ile Asp Ala Tyr Leu Phe Pro370 375 380Ser Ser Val Pro Tyr Gly Ser Arg Val Pro Lys Leu Leu Glu Asp Ala385 390 395 400Asn Asn Asn Gly Leu Leu Val Phe Leu Ile Ala Asn Val Leu Thr Gly405 410 415Val Val Asn Leu Ser Phe Asp Thr Leu His Ser Ser Asn Ala Lys Gly420 425 430Leu Thr Ile Met Thr Met Tyr Leu Phe Ile Ile Cys Tyr Met Ala His435 440 445Trp Leu Ala Gln His Gly Ile Arg Phe Arg Leu450 455<210>29<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<220>
<221>misc_feature
<222>(3)<223>n代表a，g，c或t<220>
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<220>
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<221>misc_feature<222>(24)<223>n代表a，g，c或t<400>30ttccartgna ynccrtaytc ngtnacrtgy tcytgrta 38<210>31<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<220>
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<221>misc_feature<222>(24)<223>n代表a，g，c或t<400>31
gtraaraara arttccartg naynccrtay tc32<210>32<211>188<212>DNA<213>煙曲霉(Aspergillus fumigatus)<400>32atggatctgg gcgttggatc gtttgtcttt tcgggcggag tagtatccgc tcgctcacta 60ctcaagagca ggaccaatgg ctctaaaagg ttgcctcttg ccaagaggtt gattgcgtcg 120acgcgacact ctattcctct gctcgtcctc ggcctgattc ggctatacag cgtcaaaggc 180ttggacta 188<210>33<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>33ggagtagtat ccgctcgctc acta 24<210>34<211>25<212>DNA<213>人工的<400>34gtccaagcct ttgacgctgt atagc25<210>35<211>25<212>DNA<213>人工的<400>35gggatgtgct gcaaggcgat taagt25
<210>36<211>26<212>DNA<213>人工的<400>36tttatgcttc cggctcgtat gttgtg 26<210>37<211>25<212>DNA<213>人工的<400>37aaaggtgcaa atcccgcggc attga25<210>38<211>28<212>DNA<213>人工的<400>38agttcactat atatcttcaa cacaccac 28<210>39<211>1576<212>DNA<213>煙曲霉(Aspergillus fumigatus)<220>
<221>CDS<222>(31)..(1536)<400>39aaggtgcaaa tcccgcggca ttgagtcaag atg gat cca gat tat aaa gct cgc54Met Asp Pro Asp Tyr Lys Ala Arg1 5aaa gag gcc ttt gtc tca ggt ctt gca gga gga agc atc ctg gaa atc102Lys Glu Ala Phe Val Ser Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ile Leu Glu Ile10 15 20aac gcc gtc acc ttg gtt gct tcg gta tcc gtt ttt ctg tgg tca att150
Asn Ala Val Thr Leu Val Ala Ser Val Ser Val Phe Leu Trp Ser Ile25 30 35 40cta caa tct cgc cta tcc ttt ttc aca ccc tac agc gcc gct gcc ctt198Leu Gln Ser Arg Leu Ser Phe Phe Thr Pro Tyr Ser Ala Ala Ala Leu45 50 55ctc gtt gat ttc ctg ctc aat gta cta gct atc ttg ttc gca acc act246Leu Val Asp Phe Leu Leu Asn Val Leu Ala Ile Leu Phe Ala Thr Thr60 65 70tta tac tct tcg gcg cct ctt ctt ctc aat ctc ctt cta ata tct ccc294Leu Tyr Ser Ser Ala Pro Leu Leu Leu Asn Leu Leu Leu Ile Ser Pro75 80 85gct ctg ctg ata ctc ctc tct acg aaa cgt cct cgg acc ccc gtc aaa342Ala Leu Leu Ile Leu Leu Ser Thr Lys Arg Pro Arg Thr Pro Val Lys90 95 100gcg aaa cct cct cgc cag tcc gct aga gct ggg aaa gat gac tcg aaa390Ala Lys Pro Pro Arg Gln Ser Ala Arg Ala Gly Lys Asp Asp Ser Lys105 110 115 120cat gcg aca gcc ttg cca gag tct cta ccc att cat cca ttt ctc acg438His Ala Thr Ala Leu Pro Glu Ser Leu Pro Ile His Pro Phe Leu Thr125 130 135aca tat cgc gcc gcc atg atg gtt atc acg tgc atc gct atc ttg gct486Thr Tyr Arg Ala Ala Met Met Val Ile Thr Cys Ile Ala Ile Leu Ala140 145 150gtg gat ttt cgc att ttt cct cgc cga ttc gcc aag gta gaa aac tgg534Val Asp Phe Arg Ile Phe Pro Arg Arg Phe Ala Lys Val Glu Asn Trp155 160 165ggt aca tca ctc atg gat ctg ggc gtt gga tcg ttt gtc ttt tcg ggc582Gly Thr Ser Leu Met Asp Leu Gly Val Gly Ser Phe Val Phe Ser Gly170 175 180gga gta gta tcc gct cgc tca cta ctc aag agc agg acc aat ggc tct630Gly Val Val Ser Ala Arg Ser Leu Leu Lys Ser Arg Thr Asn Gly Ser185 190 195 200aaa agg ttg cct ctt gcc aag agg ttg att gcg tcg acg cga cac tct678Lys Arg Leu Pro Leu Ala Lys Arg Leu Ile Ala Ser Thr Arg His Ser205 210 215att cct ctg ctc gtc ctc ggc ctg att cgg cta tac agc gtc aaa ggc726Ile Pro Leu Leu Val Leu Gly Leu Ile Arg Leu Tyr Ser Val Lys Gly220 225 230ttg gac tat gcg gag cac gtc acc gag tac ggc gta cat tgg aac ttc774Leu Asp Tyr Ala Glu His Val Thr Glu Tyr Gly Val His Trp Asn Phe235 240 245ttc ttt aca ttg ggt ctt ttg cct ccg ttc gtg gag gtc ttc gac gcc822Phe Phe Thr Leu Gly Leu Leu Pro Pro Phe Val Glu Val Phe Asp Ala250 255 260
ttg gct acg atc att ccg tca tac gag gtt ctc tcc gtg ggg atc gcc870Leu Ala Thr Ile Ile Pro Ser Tyr Glu Val Leu Ser Val Gly Ile Ala265 270 275 280gtc ttg tat caa gtt gcc cta gag tca aca gac ttg aaa agc tac atc918Val Leu Tyr Gln Val Ala Leu Glu Ser Thr Asp Leu Lys Ser Tyr Ile285 290 295ctc gtc tcc cct cgt ggg cca agc tta ctg tcc aag aat cgt gaa ggc966Leu Val Ser Pro Arg Gly Pro Ser Leu Leu Ser Lys Asn Arg Glu Gly300 305 310gtc ttc tcc ttc tca ggt tat ctc gcg att ttt ctt gct ggt cgt gcg1014Val Phe Ser Phe Ser Gly Tyr Leu Ala Ile Phe Leu Ala Gly Arg Ala315 320 325atc ggc att cgg ata atc cct cgc gga act tct ttc tca aga agc cca1062Ile Gly Ile Arg Ile Ile Pro Arg Gly Thr Ser Phe Ser Arg Ser Pro330 335 340gaa cag gcc agg aga cgg gtc ctg atc agc ctt ggc gtg caa gcg tta1110Glu Gln Ala Arg Arg Arg Val Leu Ile Ser Leu Gly Val Gln Ala Leu345 350 355 360gtg tgg acc act ctt ttt gtg ttg aac tcc act tat gcg atg gga tac1158Val Trp Thr Thr Leu Phe Val Leu Asn Ser Thr Tyr Ala Met Gly Tyr365 370 375gga gct aat atc cct gtc tcc cgc cgc ctc gct aac atg ccc tat gtc1206Gly Ala Asn Ile Pro Val Ser Arg Arg Leu Ala Asn Met Pro Tyr Val380 385 390ctt tgg gtt tcg gcg ttc aac acc gcg caa ctg ttt gtg ttc tgc ctg1254Leu Trp Val Ser Ala Phe Asn Thr Ala Gln Leu Phe Val Phe Cys Leu395 400 405atc gaa aca ctc tgc ttt cct gca gtt cat cgg aca acg act caa gag1302Ile Glu Thr Leu Cys Phe Pro Ala Val His Arg Thr Thr Thr Gln Glu410 415 420agc gaa tct gag cga gtc gat ttt gct acg agc cga atc atg tcg gcc1350Ser Glu Ser Glu Arg Val Asp Phe Ala Thr Ser Arg Ile Met Ser Ala425 430 435 440ttc aat aag aac agt ctc gcg atc ttt ctt ttg gcc aat ctt ctg act1398Phe Asn Lys Asn Ser Leu Ala Ile Phe Leu Leu Ala Asn Leu Leu Thr445 450 455gga gct gtg aat ctg agc atc tcc aca att gat gct aat aca gcg cag1446Gly Ala Val Asn Leu Ser Ile Ser Thr Ile Asp Ala Asn Thr Ala Gln460 465 470gcc atc gct gtt ctc att gga tat tca tcc att atc aca ggg gtt gct1494Ala Ile Ala Val Leu Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ile Thr Gly Val Ala475 480 485cta gca ttg cat cat gcc aat atc aaa gta ctt cct ttc tag1536Leu Ala Leu His His Ala Asn Ile Lys Val Leu Pro Phe
490 495 500ggtatttacg agcaattggt ggtgtgttga agatatatag 1576<210>40<211>501<212>PRT<213>煙曲霉(Aspergillus fumigatus)<400>40Met Asp Pro Asp Tyr Lys Ala Arg Lys Glu Ala Phe Val Ser Gly Leu1 5 10 15Ala Gly Gly Ser Ile Leu Glu Ile Asn Ala Val Thr Leu Val Ala Ser20 25 30Val Ser Val Phe Leu Trp Ser Ile Leu Gln Ser Arg Leu Ser Phe Phe35 40 45Thr Pro Tyr Ser Ala Ala Ala Leu Leu Val Asp Phe Leu Leu Asn Val50 55 60Leu Ala Ile Leu Phe Ala Thr Thr Leu Tyr Ser Ser Ala Pro Leu Leu65 70 75 80Leu Asn Leu Leu Leu Ile Ser Pro Ala Leu Leu Ile Leu Leu Ser Thr85 90 95Lys Arg Pro Arg Thr Pro Val Lys Ala Lys Pro Pro Arg Gln Ser Ala100 105 110Arg Ala Gly Lys Asp Asp Ser Lys His Ala Thr Ala Leu Pro Glu Ser115 120 125Leu Pro Ile His Pro Phe Leu Thr Thr Tyr Arg Ala Ala Met Met Val130 135 140Ile Thr Cys Ile Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Arg Ile Phe Pro Arg145 150 155 160Arg Phe Ala Lys Val Glu Asn Trp Gly Thr Ser Leu Met Asp Leu Gly165 170 175Val Gly Ser Phe Val Phe Ser Gly Gly Val Val Ser Ala Arg Ser Leu180 185 190Leu Lys Ser Arg Thr Asn Gly Ser Lys Arg Leu Pro Leu Ala Lys Arg195 200 205Leu Ile Ala Ser Thr Arg His Ser Ile Pro Leu Leu Val Leu Gly Leu210 215 220Ile Arg Leu Tyr Ser Val Lys Gly Leu Asp Tyr Ala Glu His Val Thr225 230 235 240Glu Tyr Gly Val His Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly Leu Leu Pro245 250 255Pro Phe Val Glu Val Phe Asp Ala Leu Ala Thr Ile Ile Pro Ser Tyr260 265 270
Glu Val Leu Ser Val Gly Ile Ala Val Leu Tyr Gln Val Ala Leu Glu275 280 285Ser Thr Asp Leu Lys Ser Tyr Ile Leu Val Ser Pro Arg Gly Pro Ser290 295 300Leu Leu Ser Lys Asn Arg Glu Gly Val Phe Ser Phe Ser Gly Tyr Leu305 310 315 320Ala Ile Phe Leu Ala Gly Arg Ala Ile Gly Ile Arg Ile Ile Pro Arg325 330 335Gly Thr Ser Phe Ser Arg Ser Pro Glu Gln Ala Arg Arg Arg Val Leu340 345 350Ile Ser Leu Gly Val Gln Ala Leu Val Trp Thr Thr Leu Phe Val Leu355 360 365Asn Ser Thr Tyr Ala Met Gly Tyr Gly Ala Asn Ile Pro Val Ser Arg370 375 380Arg Leu Ala Asn Met Pro Tyr Val Leu Trp Val Ser Ala Phe Asn Thr385 390 395 400Ala Gln Leu Phe Val Phe Cys Leu Ile Glu Thr Leu Cys Phe Pro Ala405 410 415Val His Arg Thr Thr Thr Gln Glu Ser Glu Ser Glu Arg Val Asp Phe420 425 430Ala Thr Ser Arg Ile Met Ser Ala Phe Asn Lys Asn Ser Leu Ala Ile435 440 445Phe Leu Leu Ala Asn Leu Leu Thr Gly Ala Val Asn Leu Ser Ile Ser450 455 460Thr Ile Asp Ala Asn Thr Ala Gln Ala Ile Ala Val Leu Ile Gly Tyr465 470 475 480Ser Ser Ile Ile Thr Gly Val Ala Leu Ala Leu His His Ala Asn Ile485 490 495Lys Val Leu Pro Phe500<210>41<211>1648<212>DNA<213>煙曲霉(Aspergillus fumigatus)<220>
<221>內(nèi)含子<222>(122)..(198)<220>
<221>CDS<222>(26)..(121)
<220>
<221>CDS<222>(199)..(1608)<400>41gcaaatcccg cggcattgag tcaag atg gat cca gat tat aaa gct cgc aaa52Met Asp Pro Asp Tyr Lys Ala Arg Lys1 5gag gcc ttt gtc tca ggt ctt gca gga gga agc atc ctg gaa atc aac100Glu Ala Phe Val Ser Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ile Leu Glu Ile Asn10 15 20 25gcc gtc acc ttg gtt gct tcg gttcgtgtta ctatcttatt gtggctactt 151Ala Val Thr Leu Val Ala Ser30cgcctacatt gtttctcgac taaccgagtc tctttgcgat caatcag gta tcc gtt207Val Ser Val35ttt ctg tgg tca att cta caa tct cgc cta tcc ttt ttc aca ccc tac255Phe Leu Trp Ser Ile Leu Gln Ser Arg Leu Ser Phe Phe Thr Pro Tyr40 45 50agc gcc gct gcc ctt ctc gtt gat ttc ctg ctc aat gta cta gct atc303Ser Ala Ala Ala Leu Leu Val Asp Phe Leu Leu Asn Val Leu Ala Ile55 60 65ttg ttc gca acc act tta tac tct tcg gcg cct ctt ctt ctc aat ctc351Leu Phe Ala Thr Thr Leu Tyr Ser Ser Ala Pro Leu Leu Leu Asn Leu70 75 80ctt cta ata tct ccc gct ctg ctg ata ctc ctc tct acg aaa cgt cct399Leu Leu Ile Ser Pro Ala Leu Leu Ile Leu Leu Ser Thr Lys Arg Pro85 90 95cgg acc ccc gtc aaa gcg aaa cct cct cgc cag tcc gct aga gct ggg447Arg Thr Pro Val Lys Ala Lys Pro Pro Arg Gln Ser Ala Arg Ala Gly100 105 110 115aaa gat gac tcg aaa cat gcg aca gcc ttg cca gag tct cta ccc att495Lys Asp Asp Ser Lys His Ala Thr Ala Leu Pro Glu Ser Leu Pro Ile
120 125 130cat cca ttt ctc acg aca tat cgc gcc gcc atg atg gtt atc acg tgc543His Pro Phe Leu Thr Thr Tyr Arg Ala Ala Met Met Val Ile Thr Cys135 140 145atc gct atc ttg gct gtg gat ttt cgc att ttt cct cgc cga ttc gcc591Ile Ala Ile Leu Ala Val Asp Phe Arg Ile Phe Pro Arg Arg Phe Ala150 155 160aag gta gaa aac tgg ggt aca tca ctc atg gat ctg ggc gtt gga tcg639Lys Val Glu Asn Trp Gly Thr Ser Leu Met Asp Leu Gly Val Gly Ser165 170 175ttt gtc ttt tcg ggc gga gta gta tcc gct cgc tca cta ctc aag agc687Phe Val Phe Ser Gly Gly Val Val Ser Ala Arg Ser Leu Leu Lys Ser180 185 190 195agg acc aat ggc tct aaa agg ttg cct ctt gcc aag agg ttg att gcg735Arg Thr Asn Gly Ser Lys Arg Leu Pro Leu Ala Lys Arg Leu Ile Ala200 205 210tcg acg cga cac tct att cct ctg ctc gtc ctc ggc ctg att cgg cta783Ser Thr Arg His Ser Ile Pro Leu Leu Val Leu Gly Leu Ile Arg Leu215 220 225tac agc gtc aaa ggc ttg gac tat gcg gag cac gtc acc gag tac ggc831Tyr Ser Val Lys Gly Leu Asp Tyr Ala Glu His Val Thr Glu Tyr Gly230 235 240gta cat tgg aac ttc ttc ttt aca ttg ggt ctt ttg cct ccg ttc gtg879Val His Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Gly Leu Leu Pro Pro Phe Val245 250 255gag gtc ttc gac gcc ttg gct acg atc att ccg tca tac gag gtt ctc927Glu Val Phe Asp Ala Leu Ala Thr Ile Ile Pro Ser Tyr Glu Val Leu260 265 270 275tcc gtg ggg atc gcc gtc ttg tat caa gtt gcc cta gag tca aca gac975Ser Val Gly Ile Ala Val Leu Tyr Gln Val Ala Leu Glu Ser Thr Asp280 285 290ttg aaa agc tac atc ctc gtc tcc cct cgt ggg cca agc tta ctg tcc1023Leu Lys Ser Tyr Ile Leu Val Ser Pro Arg Gly Pro Ser Leu Leu Ser
295 300 305aag aat cgt gaa ggc gtc ttc tcc ttc tca ggt tat ctc gcg att ttt1071Lys Asn Arg Glu Gly Val Phe Ser Phe Ser Gly Tyr Leu Ala Ile Phe310 315 320ctt gct ggt cgt gcg atc ggc att cgg ata atc cct cgc gga act tct1119Leu Ala Gly Arg Ala Ile Gly Ile Arg Ile Ile Pro Arg Gly Thr Ser325 330 335ttc tca aga agc cca gaa cag gcc agg aga cgg gtc ctg atc agc ctt1167Phe Ser Arg Ser Pro Glu Gln Ala Arg Arg Arg Val Leu Ile Ser Leu340 345 350 355ggc gtg caa gcg tta gtg tgg acc act ctt ttt gtg ttg aac tcc act1215Gly Val Gln Ala Leu Val Trp Thr Thr Leu Phe Val Leu Asn Ser Thr360 365 370tat gcg atg gga tac gga gct aat atc cct gtc tcc cgc cgc ctc gct1263Tyr Ala Met Gly Tyr Gly Ala Asn Ile Pro Val Ser Arg Arg Leu Ala375 380 385aac atg ccc tat gtc ctt tgg gtt tcg gcg ttc aac acc gcg caa ctg1311Asn Met Pro Tyr Val Leu Trp Val Ser Ala Phe Asn Thr Ala Gln Leu390 395 400ttt gtg ttc tgc ctg atc gaa aca ctc tgc ttt cct gca gtt cat cgg1359Phe Val Phe Cys Leu Ile Glu Thr Leu Cys Phe Pro Ala Val His Arg405 410 415aca acg act caa gag agc gaa tct gag cga gtc gat ttt gct acg agc1407Thr Thr Thr Gln Glu Ser Glu Ser Glu Arg Val Asp Phe Ala Thr Ser420 425 430 435cga atc atg tcg gcc ttc aat aag aac agt ctc gcg atc ttt ctt ttg1455Arg Ile Met Ser Ala Phe Asn Lys Asn Ser Leu Ala Ile Phe Leu Leu440 445 450gcc aat ctt ctg act gga gct gtg aat ctg agc atc tcc aca att gat1503Ala Asn Leu Leu Thr Gly Ala Val Asn Leu Ser Ile Ser Thr Ile Asp455 460 465gct aat aca gcg cag gcc atc gct gtt ctc att gga tat tca tcc att1551Ala Asn Thr Ala Gln Ala Ile Ala Val Leu Ile Gly Tyr Ser Ser Ile
470 475 480atc aca ggg gtt gct cta gca ttg cat cat gcc aat atc aaa gta ctt 1599Ile Thr Gly Val Ala Leu Ala Leu His His Ala Asn Ile Lys Val Leu485 490 495cct ttc tag ggtatttacg agcaattggt ggtgtgttga agatatatag 1648Pro Phe500<210>42<211>27<212>DNA<213>人工的<400>42gccataataa gctaccgaat tgcaatg 27<210>43<211>26<212>DNA<213>人工的<400>43cattaacacc cccattgaca accacg 26<210>44<211>1869<212>DNA<213>新型隱球酵母(Cryptocccus neoformans)<400>44ggggattaca agtcggccaa agaggccttt gtctcggata acccaggtgc ttctatctgg 60agtatcaacg ctgtcagcct ggtcgcactg gtatgtagct cgttctccga ggggttctgt 120catttggaga cgcttattaa ttgggatcgc aggcgacata tgctctctgg atcgccttat 180cgccgtacat ccgtcatgga ctcctgaaca actacctgat ctgtgttctt cccctattat 240tcggggtgac catcttctca acttcgcctc tcgtatttac ctcttttttg tccattattt 300ccctcgcttt catcacgaaa tcccaaaaat gcttcaaatc tgtcagttcg cccgaaaagc 360caaaaggcca atggctagac gaatcagact ccgatgagga accagcggaa cctgcttctg 420cagctggatc tgcagcagtc tcaccagtaa agcttctacc ttcccaagtg gcgttcgctt 480cgggatccct attatctccc gatccgacaa catcccccat gtcgccaagt agttcttcag 540
cttcaggaca tgaagaccct ttggggatta tgggcgttaa cagacggagg tcgctattag 600aaggagtttc gcttgatgtt ccgtcacata tcgactccaa ggtcagaata tctcctgttc 660cctacttgag gctcaaaaag tctagggcaa cgaaggcgca atgggtgaaa gaaaagggaa 720gattaccatt tttgacagtg taccgagcgc acatgatgct catgactgtt atctgcatct 780tggcggtaga ttttgaagtg tttcctagat ggcagggcaa gtgcgaagat tttggtacta 840gtctggtaag ctttccttca gccatggtcc agtgctcacc gctctacttg ccgtagatgg 900acgtgggtgt cgggtcattc gtcttttccc tcggtctcgt ctccacaaaa tctctttctc 960ctccacctcc aactcctacg ccctcctcgc ccgctctcaa ctctcacatc attcccctca 1020ccccgtcccc gttcacttcc atcctcatct cgctccgaaa atccatcccc atcctcgtcc 1080tcggctttat acggttgatt atggtcaagg gatctgatta tcctgagcat gtgacggagt 1140acggcgtgca ctggaatttc ttcttcaccc tcgcattggt tcctgtgctc gccgtgggca 1200ttcgaccatt gacgcagtgg cttcgctgga gtgtgcttgg ggtaatcatc tctttgctgc 1260atcagctgtg gttaacatat tatctccaat ccatcgtctt ctcattcggc cggtcaggta 1320tctttctagc aaacaaggaa ggcttctcct ctcttcctgg ttatctttcc atatttttga 1380tcggcttgtc tattggagat catgttttaa ggctcagttt accaccaaga agagagaggg 1440tcgtgtcaga aacaaatgaa gagcatgagc agagtcattt tgagagaaaa aaattggatt 1500tgattatgga gttgattgga tatagcttag gctggtgggc actcttagga ggctggattt 1560gggccggcgg ggaggtatcc aggcgtttag taagtggaca tctttggtaa tattgtacct 1620atactaatcc ctgcataaag gccaacgctc cttatgtatt ttgggtagcg gcatacaata 1680ccacctttct cctcggctac ctcctcctta cccacattat tccatctccc acctcttccc 1740aaacatcacc atcgatctta gtgcctccct tgctcgacgc tatgaataaa aacggtctcg 1800cgatattttt ggcggccaac ttgcttacag gactggtgaa tgtgagcatg aagacaatgt 1860atgcgccgg 1869<210>45<211>27<212>DNA<213>人工的<400>45gtaaaggaag gcgctagaaa agatatg 27<210>46<211>26<212>DNA<213>人工的<400>46ctcatcggag tctgattcgt ctagcc 26<210>47
<211>470<212>DNA<213>新型隱球酵母(Cryptocccus neoformans)<400>47gaaggcgcta gaaaagatat ggtcttgtca tagcattaaa tccccgccat aataagctac 60tgaattgcaa tgggggatta caagtcggcc aaagaggcct ttgtctcgga taacccaggt 120gcttctatct ggagtatcaa cgctgtcagc ctggtcgcac tggtatgtag ctcgttctcc 180gaggggttct gtcatttgga gacgcttatt aattgggatc gcaggcgaca tatgctctct 240ggatcgcctt atcgccgtac atccgtcatg gactcctgaa caactacctg atctgtgttc 300ttcccctatt attcggggtg accatcttct caacttcgcc tctcgtattt acctcttttt 360tgtccattat ttccctcgct ttcatcacga aatcccaaaa atgcttcaaa tctgtcagtt 420cgcccgaaaa gccaaaaggc caatggctag acgaatcaga ctccgatgag470<210>48<211>37<212>DNA<213>人工的<400>48gcccacgcgt cgactagtac tttttttttt ttttttt 37<210>49<211>29<212>DNA<213>人工的<400>49catcttggcg gtagattttg aagtgttcc26<210>50<211>20<212>DNA<213>人工的<400>50ggccacgcgt cgactagtac 20<210>51<211>1136
<212>DNA<213>新型隱球酵母(Cryptocccus neoformans)<400>51gcggtagatt ttgaagtgtt ccctagatgg cagggcaagt gcgaagattt tggtactagt 60ctgatggacg tgggtgtcgg gtcattcgtc ttttccctcg gtctcgtctc cacaaaatct 120ctttctcctc cacctccaac tcctacgccc tcctcgcccg ctctcaactc tcacatcatt 180cccctcaccc cgtccccgtt cacttccatc ctcatctcgc tccgaaaatc catccccatc 240ctcgtcctcg gctttatacg gttgattatg gtcaagggat ctgattatcc tgagcatgtg 300acggagtacg gcgtgcactg gaatttcttc ttcaccctcg cattggttcc tgtgctcgcc 360gtgggcattc gaccattgac gcagtggctt cgctggagtg tgcttggggt aatcatctct 420ttgctgcatc agctgtggtt aacatattat ctccaatcca tcgtcttctc attcggccgg 480tcaggtatct ttctagcaaa caaggaaggc ttctcctctc ttcctggtta tctttccata 540tttttgatcg gcttgtctat tggagatcat gttttaaggc tcagtttacc accaagaaga 600gagagggtcg tgtcagaaac aaatgaagag catgagcaga gtcattttga gagaaaaaaa 660ttggatttga ttatggagtt gattggatat agcttaggct ggtgggcact cttaggaggc 720tggatttggg ccggcgggga ggtatccagg cgtttagcca acgctcctta tgtattttgg 780gtagcggcat acaataccac ctttctcctc ggctacctcc tccttaccca cattattcca 840tctcccacct cttcccaaac atcaccatcg atcttagtgc ctcccttgct cgacgctatg 900aataaaaacg gtctcgcgat atttttggcg gccaacttgc ttacaggact ggtgaatgtg 960agcatgaaga caatgtatgc gccggcgtgg ttgtcaatgg gggtgttaat gttgtatacc 1020ttgacaatca gttgtgtagg gtggatactg aaaggacgga ggatcaagat atagttaaag 1080tgtttaccat gcaggatact gagtatctcg gttcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1136<210>52<211>27<212>DNA<213>人工的<400>52gtcttgtcat agcattaaat ccccgcc 27<210>53<211>28<212>DNA<213>人工的<400>53gaaccgagat actcagtatc ctgcatgg 28<210>54
<211>2045<212>DNA<213>新型隱球酵母(Cryptocccus neoformans)<220>
<221>內(nèi)含子<222>(137)..(198)<220>
<221>內(nèi)含子<222>(892)..(942)<220>
<221>內(nèi)含子<222>(1636)..(1686)<220>
<221>CDS<222>(44)..(2001)<400>54gtcatagcat taaatccccg ccataataag ctactgaatt gca atg ggg gat tac55Met Gly Asp Tyr1aag tcg gcc aaa gag gcc ttt gtc tcg gat aac cca ggt gct tct atc103Lys Ser Ala Lys Glu Ala Phe Val Ser Asp Asn Pro Gly Ala Ser Ile5 10 15 20tgg agt atc aac gct gtc agc ctg gtc gca ctg gtatgtagct cgttctccga 156Trp Ser Ile Asn Ala Val Ser Leu Val Ala Leu25 30ggggttctgt catttggaga cgcttattaa ttgggatcgc ag gcg aca tat gct 210Ala Thr Tyr Ala35ctc tgg atc gcc tta tcg ccg tac atc cgt cat gga ctc ctg aac aac258Leu Trp Ile Ala Leu Ser Pro Tyr Ile Arg His Gly Leu Leu Asn Asn40 45 50tac ctg atc tgt gtt ctt ccc cta tta ttc ggg gtg acc atc ttc tca306Tyr Leu Ile Cys Val Leu Pro Leu Leu Phe Gly Val Thr Ile Phe Ser55 60 65act tcg cct ctc gta ttt acc tct ttt ttg tcc att att tcc ctc gct354Thr Ser Pro Leu Val Phe Thr Ser Phe Leu Ser Ile Ile Ser Leu Ala70 75 80ttc atc acg aaa tcc caa aaa tgc ttc aaa tct gtc agt tcg ccc gaa402Phe Ile Thr Lys Ser Gln Lys Cys Phe Lys Ser Val Ser Ser Pro Glu
85 90 95aag cca aaa ggc caa tgg cta gac gaa tca gac tcc gat gag gaa cca450Lys Pro Lys Gly Gln Trp Leu Asp Glu Ser Asp Ser Asp Glu Glu Pro100 105 110 115gcg gaa cct gct tct gca gct gga tct gca gca gtc tca cca gta aag498Ala Glu Pro Ala Ser Ala Ala Gly Ser Ala Ala Val Ser Pro Val Lys120 125 130ctt cta cct tcc caa gtg gcg ttc gct tcg gga tcc cta tta tct ccc546Leu Leu Pro Ser Gln Val Ala Phe Ala Ser Gly Ser Leu Leu Ser Pro135 140 145gat ccg aca aca tcc ccc atg tcg cca agt agt tct tca gct tca gga594Asp Pro Thr Thr Ser Pro Met Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ala Ser Gly150 155 160cat gaa gac cct ttg ggg att atg ggc gtt aac aga cgg agg tcg cta642His Glu Asp Pro Leu Gly Ile Met Gly Val Asn Arg Arg Arg Ser Leu165 170 175tta gaa gga gtt tcg ctt gat gtt ccg tca cat atc gac tcc aag gtc690Leu Glu Gly Val Ser Leu Asp Val Pro Ser His Ile Asp Ser Lys Val180 185 190 195aga ata tct cct gtt ccc tac ttg agg ctc aaa aag tct agg gca acg738Arg Ile Ser Pro Val Pro Tyr Leu Arg Leu Lys Lys Ser Arg Ala Thr200 205 210aag gcg caa tgg gtg aaa gaa aag gga aga tta cca ttt ttg aca gtg786Lys Ala Gln Trp Val Lys Glu Lys Gly Arg Leu Pro Phe Leu Thr Val215 220 225tac cga gcg cac atg atg ctc atg act gtt atc tgc atc ttg gcg gta834Tyr Arg Ala His Met Met Leu Met Thr Val Ile Cys Ile Leu Ala Val230 235 240gat ttt gaa gtg ttt cct aga tgg cag ggc aag tgc gaa gat ttt ggt882Asp Phe Glu Val Phe Pro Arg Trp Gln Gly Lys Cys Glu Asp Phe Gly245 250 255act agt ctg gtaagctttc cttcagccat ggtccagtgc tcaccgctct931Thr Ser Leu260acttgccgta g atg gac gtg ggt gtc ggg tca ttc gtc ttt tcc ctc ggt 981Met Asp Val Gly Val Gly Ser Phe Val Phe Ser Leu Gly265 270 275ctc gtc tcc aca aaa tct ctt tct cct cca cct cca act cct acg ccc1029Leu Val Ser Thr Lys Ser Leu Ser Pro Pro Pro Pro Thr Pro Thr Pro280 285 290tcc tcg ccc gct ctc aac tct cac atc att ccc ctc acc ccg tcc ccg1077Ser Ser Pro Ala Leu Asn Ser His Ile Ile Pro Leu Thr Pro Ser Pro295 300 305ttc act tcc atc ctc atc tcg ctc cga aaa tcc atc ccc atc ctc gtc1125
Phe Thr Ser Ile Leu Ile Ser Leu Arg Lys Ser Ile Pro Ile Leu Val310 315 320ctc ggc ttt ata cgg ttg att atg gtc aag gga tct gat tat cct gag1173Leu Gly Phe Ile Arg Leu Ile Met Val Lys Gly Ser Asp Tyr Pro Glu325 330 335cat gtg acg gag tac ggc gtg cac tgg aat ttc ttc ttc acc ctc gca1221His Val Thr Glu Tyr Gly Val His Trp Asn Phe Phe Phe Thr Leu Ala340 345 350 355ttg gtt cct gtg ctc gcc gtg ggc att cga cca ttg acg cag tgg ctt1269Leu Val Pro Val Leu Ala Val Gly Ile Arg Pro Leu Thr Gln Trp Leu360 365 370cgc tgg agt gtg ctt ggg gta atc atc tct ttg ctg cat cag ctg tgg1317Arg Trp Ser Val Leu Gly Val Ile Ile Ser Leu Leu His Gln Leu Trp375 380 385tta aca tat tat ctc caa tcc atc gtc ttc tca ttc ggc cgg tca ggt1365Leu Thr Tyr Tyr Leu Gln Ser Ile Val Phe Ser Phe Gly Arg Ser Gly390 395 400atc ttt cta gca aac aag gaa ggc ttc tcc tct ctt cct ggt tat ctt1413Ile Phe Leu Ala Asn Lys Glu Gly Phe Ser Ser Leu Pro Gly Tyr Leu405 410 415tcc ata ttt ttg atc ggc ttg tct att gga gat cat gtt tta agg ctc1461Ser Ile Phe Leu Ile Gly Leu Ser Ile Gly Asp His Val Leu Arg Leu420 425 430 435agt tta cca cca aga aga gag agg gtc gtg tca gaa aca aat gaa gag1509Ser Leu Pro Pro Arg Arg Glu Arg Val Val Ser Glu Thr Asn Glu Glu440 445 450cat gag cag agt cat ttt gag aga aaa aaa ttg gat ttg att atg gag1557His Glu Gln Ser His Phe Glu Arg Lys Lys Leu Asp Leu Ile Met Glu455 460 465ttg att gga tat agc tta ggc tgg tgg gca ctc tta gga ggc tgg att1605Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Trp Trp Ala Leu Leu Gly Gly Trp Ile470 475 480tgg gcc ggc ggg gag gta tcc agg cgt tta gtaagtggac atctttggta 1655Trp Ala Gly Gly Glu Val Ser Arg Arg Leu485 490atattgtacc tatactaatc cctgcataaa g gcc aac gct cct tat gta ttt 1707Ala Asn Ala Pro Tyr Val Phe495 500tgg gta gcg gca tac aat acc acc ttt ctc ctc ggc tac ctc ctc ctt1755Trp Val Ala Ala Tyr Asn Thr Thr Phe Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Leu505 510 515acc cac att att cca tct ccc acc tct tcc caa aca tca cca tcg atc1803Thr His Ile Ile Pro Ser Pro Thr Ser Ser Gln Thr Ser Pro Ser Ile520 525 530
tta gtg cct ccc ttg ctc gac gct atg aat aaa aac ggt ctc gcg ata 1851Leu Val Pro Pro Leu Leu Asp Ala Met Asn Lys Asn Gly Leu Ala Ile535 540 545ttt ttg gcg gcc aac ttg ctt aca gga ctg gtg aat gtg agc atg aag 1899Phe Leu Ala Ala Asn Leu Leu Thr Gly Leu Val Asn Val Ser Met Lys550 555 560aca atg tat gcg ccg gcg tgg ttg tca atg ggg gtg tta atg ttg tat 1947Thr Met Tyr Ala Pro Ala Trp Leu Ser Met Gly Val Leu Met Leu Tyr565 570 575 580acc ttg aca atc agt tgt gta ggg tgg ata ctg aaa gga cgg agg atc 1995Thr Leu Thr Ile Ser Cys Val Gly Trp Ile Leu Lys Gly Arg Arg Ile585 590 595aag ata tagttaaagt gtttaccatg caggatactg agtatctcgg ttca 2045Lys Ile<210>55<211>23<212>DNA<213>人工的<400>55cagcctggtc gcactggcga cat 23<210>56<211>25<212>DNA<213>人工的<400>56cataaggagc gttggctaaa cgcct25<210>57<211>1418<212>DNA<213>新型隱球酵母(Cryptocccus neoformans)<400>57cagcctggtc gcactggcga catatgctct ctggatcgcc ttatcgccgt acatccgtca 60tggactcctg aacaactacc tgatctgtgt tcttccccta ttattcgggg tgaccatctt 120ctcaacttcg cctctcgtat ttacctcttt tttgtccatt atttccctcg ctttcatcac 180gaaatcccaa aaatgcttca aatctgtcagt tcgcccgaa aagccaaaag gccaatggct 240
agacgaatca gactccgatg aggaaccagc ggaacctgct tctgcagctg gatctgcagc 300agtctcacca gtaaagcttc taccttccca agtggcgttc gcttcgggat ccctattatc 360tcccgatccg acaacatccc ccatgtcgcc aagtagttct tcagcttcag gacatgaaga 420ccctttgggg attatgggcg ttaacagacg gaggtcgcta ttagaaggag tttcgcttga 480tgttccgtca catatcgact ccaaggtcag aatatctcct gttccctact tgaggctcaa 540aaagtctagg gcaacgaagg cgcaatgggt gaaagaaaag ggaagattac catttttgac 600agtgtaccga gcgcacatga tgctcatgac tgttatctgc atcttggcgg tagattttga 660agtgtttcct agatggcagg gcaagtgcga agattttggt actagtctga tggacgtggg 720tgtcgggtca ttcgtctttt ccctcggtct cgtctccaca aaatctcttt ctcctccacc 780tccaactcct acgccctcct cgcccgctct caactctcac atcattcccc tcaccccgtc 840cccgttcact tccatcctca tctcgctccg aaaatccatc cccatcctcg tcctcggctt 900tatacggttg attatggtca agggatctga ttatcctgag catgtgacgg agtacggcgt 960gcactggaat ttcttcttca ccctcgcatt ggttcctgtg ctcgccgtgg gcattcgacc 1020attgacgcag tggcttcgct ggagtgtgct tggggtaatc atctctttgc tgcatcagct 1080gtggttaaca tattatctcc aatccatcgt cttctcattc ggccggtcag gtatctttct 1140agcaaacaag gaaggcttct cctctcttcc tggttatctt tccatatttt tgatcggctt 1200gtctattgga gatcatgttt taaggctcag tttaccacca agaagagaga gggtcgtgtc 1260agaaacaaat gaagagcatg agcagagtca ttttgagaga aaaaaattgg atttgattat 1320ggagttgatt ggatatagct taggctggtg ggcactctta ggaggctgga tttgggccgg 1380cggggaggta tccaggcgtt tagccaacgc tccttatg 1418<210>58<211>1797<212>DNA<213>新型隱球酵母(Cryptocccus neoformans)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1794)<400>58atg ggg gat tac aag tcg gcc aaa gag gcc ttt gtc tcg gat aac cca 48Met Gly Asp Tyr Lys Ser Ala Lys Glu Ala Phe Val Ser Asp Asn Pro1 5 10 15ggt gct tct atc tgg agt atc aac gct gtc agc ctg gtc gca ctg gcg 96Gly Ala Ser Ile Trp Ser Ile Asn Ala Val Ser Leu Val Ala Leu Ala20 25 30aca tat gct ctc tgg atc gcc tta tcg ccg tac atc cgt cat gga ctc 144Thr Tyr Ala Leu Trp Ile Ala Leu Ser Pro Tyr Ile Arg His Gly Leu35 40 45ctg aac aac tac ctg atc tgt gtt ctt ccc cta tta ttc ggg gtg acc 192Leu Asn Asn Tyr Leu Ile Cys Val Leu Pro Leu Leu Phe Gly Val Thr50 55 60
atc ttc tca act tcg cct ctc gta ttt acc tct ttt ttg tcc att att240Ile Phe Ser Thr Ser Pro Leu Val Phe Thr Ser Phe Leu Ser Ile Ile65 70 75 80tcc ctc gct ttc atc acg aaa tcc caa aaa tgc ttc aaa tct gtc agt288Ser Leu Ala Phe Ile Thr Lys Ser Gln Lys Cys Phe Lys Ser Val Ser85 90 95tcg ccc gaa aag cca aaa ggc caa tgg cta gac gaa tca gac tcc gat336Ser Pro Glu Lys Pro Lys Gly Gln Trp Leu Asp Glu Ser Asp Ser Asp100 105 110gag gaa cca gcg gaa cct gct tct gca gct gga tct gca gca gtc tca384Glu Glu Pro Ala Glu Pro Ala Ser Ala Ala Gly Ser Ala Ala Val Ser115 120 125cca gta aag ctt cta cct tcc caa gtg gcg ttc gct tcg gga tcc cta432Pro Val Lys Leu Leu Pro Ser Gln Val Ala Phe Ala Ser Gly Ser Leu130 135 140tta tct ccc gat ccg aca aca tcc ccc atg tcg cca agt agt tct tca480Leu Ser Pro Asp Pro Thr Thr Ser Pro Met Ser Pro Ser Ser Ser Ser145 150 155 160gct tca gga cat gaa gac cct ttg ggg att atg ggc gtt aac aga cgg528Ala Ser Gly His Glu Asp Pro Leu Gly Ile Met Gly Val Asn Arg Arg165 170 175agg tcg cta tta gaa gga gtt tcg ctt gat gtt ccg tca cat atc gac576Arg Ser Leu Leu Glu Gly Val Ser Leu Asp Val Pro Ser His Ile Asp180 185 190tcc aag gtc aga ata tct cct gtt ccc tac ttg agg ctc aaa aag tct624Ser Lys Val Arg Ile Ser Pro Val Pro Tyr Leu Arg Leu Lys Lys Ser195 200 205agg gca acg aag gcg caa tgg gtg aaa gaa aag gga aga tta cca ttt672Arg Ala Thr Lys Ala Gln Trp Val Lys Glu Lys Gly Arg Leu Pro Phe210 215 220ttg aca gtg tac cga gcg cac atg atg ctc atg act gtt atc tgc atc720Leu Thr Val Tyr Arg Ala His Met Met Leu Met Thr Val Ile Cys Ile225 230 235 240ttg gcg gta gat ttt gaa gtg ttt cct aga tgg cag ggc aag tgc gaa768Leu Ala Val Asp Phe G1u Val Phe Pro Arg Trp Gln Gly Lys Cys Glu245 250 255gat ttt ggt act agt ctg atg gac gtg ggt gtc ggg tca ttc gtc ttt816Asp Phe Gly Thr Ser Leu Met Asp Val Gly Val Gly Ser Phe Val Phe260 265 270tcc ctc ggt ctc gtc tcc aca aaa tct ctt tct cct cca cct cca act864Ser Leu Gly Leu Val Ser Thr Lys Ser Leu Ser Pro Pro Pro Pro Thr275 280 285cct acg ccc tcc tcg ccc gct ctc aac tct cac atc att ccc ctc acc912Pro Thr Pro Ser Ser Pro Ala Leu Asn Ser His Ile Ile Pro Leu Thr
290 295 300ccg tcc ccg ttc act tcc atc ctc atc tcg ctc cga aaa tcc atc ccc960Pro Ser Pro Phe Thr Ser Ile Leu Ile Ser Leu Arg Lys Ser Ile Pro305 310 315 320atc ctc gtc ctc ggc ttt ata cgg ttg att atg gtc aag gga tct gat1008Ile Leu Val Leu Gly Phe Ile Arg Leu Ile Met Val Lys Gly Ser Asp325 330 335tat cct gag cat gtg acg gag tac ggc gtg cac tgg aat ttc ttc ttc1056Tyr Pro Glu His Val Thr Glu Tyr Gly Val His Trp Asn Phe Phe Phe340 345 350acc ctc gca ttg gtt cct gtg ctc gcc gtg ggc att cga cca ttg acg1104Thr Leu Ala Leu Val Pro Val Leu Ala Val Gly Ile Arg Pro Leu Thr355 360 365cag tgg ctt cgc tgg agt gtg ctt ggg gta atc atc tct ttg ctg cat1152Gln Trp Leu Arg Trp Ser Val Leu Gly Val Ile Ile Ser Leu Leu His370 375 380cag ctg tgg tta aca tat tat ctc caa tcc atc gtc ttc tca ttc ggc1200Gln Leu Trp Leu Thr Tyr Tyr Leu Gln Ser Ile Val Phe Ser Phe Gly385 390 395 400cgg tca ggt atc ttt cta gca aac aag gaa ggc ttc tcc tct ctt cct1248Arg Ser Gly Ile Phe Leu Ala Asn Lys Glu Gly Phe Ser Ser Leu Pro405 410 415ggt tat ctt tcc ata ttt ttg atc ggc ttg tct att gga gat cat gtt1296Gly Tyr Leu Ser Ile Phe Leu Ile Gly Leu Ser Ile Gly Asp His Val420 425 430tta agg ctc agt tta cca cca aga aga gag agg gtc gtg tca gaa aca1344Leu Arg Leu Ser Leu Pro Pro Arg Arg Glu Arg Val Val Ser Glu Thr435 440 445aat gaa gag cat gag cag agt cat ttt gag aga aaa aaa ttg gat ttg1392Asn Glu Glu His Glu Gln Ser His Phe Glu Arg Lys Lys Leu Asp Leu450 455 460att atg gag ttg att gga tat agc tta ggc tgg tgg gca ctc tta gga1440Ile Met Glu Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Trp Trp Ala Leu Leu Gly465 470 475 480ggc tgg att tgg gcc ggc ggg gag gta tcc agg cgt tta gcc aac gct1488Gly Trp Ile Trp Ala Gly Gly Glu Val Ser Arg Arg Leu Ala Asn Ala485 490 495cct tat gta ttt tgg gta gcg gca tac aat acc acc ttt ctc ctc ggc1536Pro Tyr Val Phe Trp Val Ala Ala Tyr Asn Thr Thr Phe Leu Leu Gly500 505 510tac ctc ctc ctt acc cac att att cca tct ccc acc tct tcc caa aca1584Tyr Leu Leu Leu Thr His Ile Ile Pro Ser Pro Thr Ser Ser Gln Thr515 520 525tca cca tcg atc tta gtg cct ccc ttg ctc gac gct atg aat aaa aac1632
Ser Pro Ser Ile Leu Val Pro Pro Leu Leu Asp Ala Met Asn Lys Asn530 535 540ggt ctc gcg ata ttt ttg gcg gcc aac ttg ctt aca gga ctg gtg aat 1680Gly Leu Ala Ile Phe Leu Ala Ala Asn Leu Leu Thr Gly Leu Val Asn545 550 555 560gtg agc atg aag aca atg tat gcg ccg gcg tgg ttg tca atg ggg gtg 1728Val Ser Met Lys Thr Met Tyr Ala Pro Ala Trp Leu Ser Met Gly Val565 570 575tta atg ttg tat acc ttg aca atc agt tgt gta ggg tgg ata ctg aaa 1776Leu Met Leu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Cys Val Gly Trp Ile Leu Lys580 585 590gga cgg agg atc aag ata tag 1797Gly Arg Arg Ile Lys Ile595<210>59<211>598<212>PRT<213>新型隱球酵母(Cryptocccus neoformans)<400>59Met Gly Asp Tyr Lys Ser Ala Lys Glu Ala Phe Val Ser Asp Asn Pro1 5 10 15Gly Ala Ser Ile Trp Ser Ile Asn Ala Val Ser Leu Val Ala Leu Ala20 25 30Thr Tyr Ala Leu Trp Ile Ala Leu Ser Pro Tyr Ile Arg His Gly Leu35 40 45Leu Asn Asn Tyr Leu Ile Cys Val Leu Pro Leu Leu Phe Gly Val Thr50 55 60Ile Phe Ser Thr Ser Pro Leu Val Phe Thr Ser Phe Leu Ser Ile Ile65 70 75 80Ser Leu Ala Phe Ile Thr Lys Ser Gln Lys Cys Phe Lys Ser Val Ser85 90 95Ser Pro Glu Lys Pro Lys Gly Gln Trp Leu Asp Glu Ser Asp Ser Asp100 105 110Glu Glu Pro Ala Glu Pro Ala Ser Ala Ala Gly Ser Ala Ala Val Ser115 120 125Pro Val Lys Leu Leu Pro Ser Gln Val Ala Phe Ala Ser Gly Ser Leu130 135 140Leu Ser Pro Asp Pro Thr Thr Ser Pro Met Ser Pro Ser Ser Ser Ser145 150 155 160Ala Ser Gly His Glu Asp Pro Leu Gly Ile Met Gly Val Asn Arg Arg165 170 175
Arg Ser Leu Leu Glu Gly Val Ser Leu Asp Val Pro Ser His Ile Asp180 185 190Ser Lys Val Arg Ile Ser Pro Val Pro Tyr Leu Arg Leu Lys Lys Ser195 200 205Arg Ala Thr Lys Ala Gln Trp Val Lys Glu Lys Gly Arg Leu Pro Phe210 215 220Leu Thr Val Tyr Arg Ala His Met Met Leu Met Thr Val Ile Cys Ile225 230 235 240Leu Ala Val Asp Phe Glu Val Phe Pro Arg Trp Gln Gly Lys Cys Glu245 250 255Asp Phe Gly Thr Ser Leu Met Asp Val Gly Val Gly Ser Phe Val Phe260 265 270Ser Leu Gly Leu Val Ser Thr Lys Ser Leu Ser Pro Pro Pro Pro Thr275 280 285Pro Thr Pro Ser Ser Pro Ala Leu Asn Ser His Ile Ile Pro Leu Thr290 295 300Pro Ser Pro Phe Thr Ser Ile Leu Ile Ser Leu Arg Lys Ser Ile Pro305 310 315 320Ile Leu Val Leu Gly Phe Ile Arg Leu Ile Met Val Lys Gly Ser Asp325 330 335Tyr Pro Glu His Val Thr Glu Tyr Gly Val His Trp Asn Phe Phe Phe340 345 350Thr Leu Ala Leu Val Pro Val Leu Ala Val Gly Ile Arg Pro Leu Thr355 360 365Gln Trp Leu Arg Trp Ser Val Leu Gly Val Ile Ile Ser Leu Leu His370 375 380Gln Leu Trp Leu Thr Tyr Tyr Leu Gln Ser Ile Val Phe Ser Phe Gly385 390 395 400Arg Ser Gly Ile Phe Leu Ala Asn Lys Glu Gly Phe Ser Ser Leu Pro405 410 415Gly Tyr Leu Ser Ile Phe Leu Ile Gly Leu Ser Ile Gly Asp His Val420 425 430Leu Arg Leu Ser Leu Pro Pro Arg Arg Glu Arg Val Val Ser Glu Thr435 440 445Asn Glu Glu His Glu Gln Ser His Phe Glu Arg Lys Lys Leu Asp Leu450 455 460Ile Met Glu Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Trp Trp Ala Leu Leu Gly465 470 475 480Gly Trp Ile Trp Ala Gly Gly Glu Val Ser Arg Arg Leu Ala Asn Ala485 490 495Pro Tyr Val Phe Trp Val Ala Ala Tyr Asn Thr Thr Phe Leu Leu Gly500 505 510Tyr Leu Leu Leu Thr His Ile Ile Pro Ser Pro Thr Ser Ser Gln Thr515 520 525
Ser Pro Ser Ile Leu Val Pro Pro Leu Leu Asp Ala Met Asn Lys Asn530 535 540Gly Leu Ala Ile Phe Leu Ala Ala Asn Leu Leu Thr Gly Leu Val Asn545 550 555 560Val Ser Met Lys Thr Met Tyr Ala Pro Ala Trp Leu Ser Met Gly Val565 570 575Leu Met Leu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Cys Val Gly Trp Ile Leu Lys580 585 590Gly Arg Arg Ile Lys Ile595<210>60<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>60aaagaattca tggcaacagt acatcagaag 30<210>61<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>61gggcactgtt gaaaaaccta 20<210>62<211>1428<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(1428)<400>62
gttgttcaaa atgggggtaa aattgagacg tcttacttga gcggcattta cgatcattct60tattacatca ttccaagtaa taaagctctt gactccttca atgatttacc tgagattata 120gatgataatg atggtatagt tacagaattt ttcattgaac gctgcttgta ttatcaaaaa 180ttactacacc caatagattt atggtcaaaa cccttcctca gcacaataga gtttcaagtt 240tcgtcttctt caaagttatt gcatcatgaa ttttcttctt ccccttttct gaatgttact 300atcactggat tctctggcgt agagctgtta catctgacta aagtattaaa tcttctaaaa 360ccaatgggca tcaattatgt agaatacctc aataaatcca ctgacattct gctaatcaac 420ttagcagctt tacccagtat cccgaaaacc catccgttat ggtcgaatga atttagcgat 480ctttttactc agttttgcat taataacaat aatgatgatc ctggtgataa taacagaaaa 540gattttcaaa ataattcaat cttgagaaat tcgatgaaaa ggaaaattga atatatcaag 600aaattccact ccataccggt agttactcca gcatttattt ttaaattatt gtccgctgca 660tctggagaaa ataatgaaat ctttttaaac aatatcaagt ggtgtattat ctgcccaaga 720ggacacaagg acgattttaa atgtaagata aaaaaaccat actataccag cattagttca 780gaaaaaaagt accaaaacaa tgatccaaaa atcgacaaaa ctattctttt gaaaagaaac 840aattcctcat tatcggagca ctctatgaaa gataccaaaa acgaattatt gcagaaaatt 900agagaaactg attctggaag aaaaaagcgt agtgtctcat cgagtatcat ggatgtttct 960tcagagagac aaatgccgga tacgaaaagg atcaagttgg agtcactgcc aaaaaatttc 1020gttcctaaac aaattaaacg aaccacgagt tggggcacaa taatgtcaga aaatgtgcct 1080acagagcagc cgactgcaat ttctaatcca gaagagatcc caagaactga ggaagtttca 1140catactcaag ttacctatgg ctccattcaa gataagaaac gtactgcctc tttagaaaaa 1200cctatgagac gacagacaag aaatcagaca aaggaattag attcttgaaa tgtagtccgt 1260aattttataa gatattcatt tacatacgcc atctacagca ttattcaaat ctactcatct 1320atatgtatta ccgttttgta tgataatact ttccatgaca tgctcgcgtg aaaaaacagc 1380atgagaaaaa gaggatcgca ataagaagac acgtaaatat ctaaataa 1428<210>63<211>133<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>終止子<222>(1)..(133)<400>63taacacacca tccacatttc catgtagttc gtatacaaac cctaccagta aaataaaatt 60aactcctatg tgctttaaat aaaaattata aaccgcctcc aatagttgac gtagtcaggc 120atgaaagtgc tac 13權(quán)利要求
1.一種編碼蛋白質(zhì)的DNA，當(dāng)該DNA在真菌中過量表達(dá)時(shí)，所述蛋白質(zhì)具有賦予真菌對(duì)式(Ia)所示化合物的耐受性的活性，其中該DNA選自(a)編碼包含SEQ ID NO6的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，(b)包含SEQ ID NO5的核苷酸序列的DNA，(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含SEQ ID NO5的核苷酸序列的DNA雜交的DNA，(d)編碼蛋白質(zhì)的DNA，其中所述蛋白包含SEQ ID NO6的氨基酸序列且其中增加、缺失、取代和/或插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸
2.一種編碼蛋白質(zhì)的DNA，該蛋白質(zhì)具有降低真菌細(xì)胞壁中GPI-錨定蛋白質(zhì)的量的活性，其中所述活性是由于該DNA功能缺陷，并且其中該DNA選自(a)編碼包含SEQ ID NO6的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，(b)包含SEQ ID NO5的核苷酸序列的DNA，(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含SEQ ID NO5的核苷酸序列的DNA雜交的DNA，(d)編碼蛋白質(zhì)的DNA，所述蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO6的氨基酸序列且其中增加、缺失、取代和/或插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
3.通過權(quán)利要求1或2的DNA編碼的蛋白質(zhì)。
4.其中插入了權(quán)利要求1或2的DNA的載體。
5.包含權(quán)利要求1或2的DNA或者權(quán)利要求4的載體的轉(zhuǎn)化體。
6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)化體，其為過量表達(dá)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)的真菌。
7.一種真菌，其中權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)的功能有缺陷。
8.一種制備權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)化體，并由該轉(zhuǎn)化體或其培養(yǎng)上清液收集所表達(dá)的蛋白質(zhì)的步驟。
9.一種與權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。
10.一種篩選具有抗真菌作用的化合物的方法，其中該方法包括以下步驟(a)使試樣與權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)接觸；(b)檢測該蛋白質(zhì)與試樣之間的結(jié)合活性；及(c)選取具有與該蛋白質(zhì)結(jié)合的活性的化合物。
11.一種篩選具有抗真菌作用的化合物的方法，其中該方法包括以下步驟(a)使試樣與過量表達(dá)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)的真菌接觸；(b)檢測轉(zhuǎn)運(yùn)到真菌細(xì)胞壁上的GPI-錨定蛋白質(zhì)的量；及(c)選取這樣的化合物，其使步驟(b)中所檢測的GPI-錨定蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到真菌細(xì)胞壁上的量與試樣與未過量表達(dá)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)的真菌接觸時(shí)所檢測到的轉(zhuǎn)運(yùn)量相比減少。
12.一種具有抗真菌作用的化合物，其是通過權(quán)利要求10或11的篩選方法分離的。
13.一種抗真菌劑，其包含權(quán)利要求9的抗體或者權(quán)利要求12的化合物作為活性成分。
14.一種治療真菌感染的方法，包括將治療有效量的權(quán)利要求13的抗真菌劑給藥于哺乳動(dòng)物。
全文摘要
構(gòu)建一種反映將GPI－錨定蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞壁的過程的報(bào)告系統(tǒng)，并且公開了抑制該轉(zhuǎn)運(yùn)過程的化合物。此外，確定賦予上述化合物以耐受性的基因，并且揭示篩選化合物的方法，該化合物抑制由該基因編碼的蛋白質(zhì)的活性。因此，該新化合物提供了依據(jù)新機(jī)制的抗真菌劑，所述機(jī)制中，GPI－錨定蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞壁的過程受到抑制。
文檔編號(hào)G01N33/15GK1873002SQ20061009411
公開日2006年12月6日 申請日期2001年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月7日
發(fā)明者塚原克平, 畑桂, 相根康司, 中本和孝, 土谷滿美子, 渡邊直彰, 大場史記, 塚田格, 上田教博, 田中圭悟, 甲斐純子 申請人:衛(wèi)材株式會(huì)社