專利名稱：從分枝層壁菌制備環(huán)胞多肽a的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從如下所述的分枝層壁菌(Tolypocladium sp.)中制備環(huán)胞多肽A的方法。
人們通常都知道，環(huán)胞多肽A作為器官移植手術中防止器官排斥的—種免疫抑制劑具有有益的用途。按照已知方法，環(huán)胞多肽可通過對變形分枝層壁菌(Tolypocladium varium)真菌菌株的培養(yǎng)而制備成復合物。英國第2227489號專利披露了生產(chǎn)環(huán)胞多肽復合物或其組分(即環(huán)胞多肽A、環(huán)胞多肽B和環(huán)胞多肽C)的一種微生物方法。該已知方法建議在一營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)變形分枝層壁菌(Tolypocladium varium)真菌菌株來生產(chǎn)環(huán)胞多肽復合物。如同通常在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中所用的那樣，該營養(yǎng)培養(yǎng)基含有碳源、有機及無機氮源和無機鹽。發(fā)酵象通常一樣在有氧條件下進行，溫度為25～30℃。如需要的話，將所生成的環(huán)胞多肽復合物加以分離，并提純而生成純化復合物。
該已知方法建議了一種優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基，它含有作為氮源的胨、硫酸銨和胰蛋白胨。優(yōu)選的碳源為葡萄糖、麥芽糖和山梨糖醇。培養(yǎng)物變形分枝層壁菌Sp nov Cy/93存放號為NCAlM(P)F-001005。已知方法未提到僅生產(chǎn)環(huán)胞多肽A且其純度不低于98％的方法。
本發(fā)明的目的在于提出一種制備環(huán)胞多肽A的改良性方法。
本發(fā)明的另一目的在于提出一種制備高產(chǎn)率環(huán)胞多肽A的方法。
本發(fā)明還有一個目的是提出一種制備具有基本均一純度環(huán)胞多肽A的方法。
本發(fā)明使用了一新真菌分枝層壁菌(Tolypocladium)的某一菌種，其保藏號為NRRL 18950。與本發(fā)明中所用菌種相關的分枝層壁菌其它菌種的特性如表1所示。
表1分枝層壁菌不同菌種特性之比較
表1(續(xù))<
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依據(jù)本發(fā)明，可提供從如下的分枝層壁菌某菌種中制備環(huán)胞多肽A的一種方法，其包括把上述分枝層壁菌某菌種在—營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵而得到一種發(fā)酵培養(yǎng)基，用甲醇從上述發(fā)酵培養(yǎng)基中提取真菌生物量而得到一甲醇提取液，通過蒸發(fā)步驟從上述提取液中去除甲醇而得到第一種殘余物，從該殘余物中制備出水溶液，再從該水溶液中制備出乙酸乙酯提取液，把該提取液脫色和濃縮而得到第二種殘余物，然后分兩步對其進行層析法提純，即第一步是以硅膠柱為固相，而以己烷、氯仿和甲醇混合溶劑為移動相；第二步則以樹脂柱為固相，以甲醇為移動相。
該方法細節(jié)將隨后進行詳盡討論。其中包括兩類發(fā)酵技術，即(i)靜態(tài)發(fā)酵和(ii)固態(tài)底物發(fā)酵。
依據(jù)本發(fā)明，把少量土在無菌水中懸浮，然后用蒸餾水高度稀釋。把所烯釋的土壤懸浮液的一小部分撒在培養(yǎng)基上。
培養(yǎng)基的PH值可維持在6.5，內(nèi)合右旋糖、胨、瓊脂和水。在培養(yǎng)基中加入適量的試劑(硫酸鏈霉素)以防止細菌生長。
然后，把上述制備的土壤懸浮液撒在上述培養(yǎng)基的固體表面上，取合適的容器盛裝，如陪氏培養(yǎng)皿。
在約22-30℃溫度下對培養(yǎng)皿進行培育。7天后會注意到有大量真菌菌落生成。當認為真菌菌落的生長達到滿意程度時就中止其生長。
把單個真菌菌落移到少量含有同上培養(yǎng)基成分的試管中，把試管口。封閉并在25℃條件貯存。
對菌落殘余在顯微鏡下進行檢查并鑒定至屬水平。其中一個菌落具有分枝層壁菌真菌的特性，發(fā)現(xiàn)如表1所示。本發(fā)明中的這種分枝層壁菌菌種在—營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長，該培養(yǎng)基含有葡萄糖、胨、酪蛋白酸水解物和無菌水，PH保持在4-6之間；把—匙該菌種孢子懸浮液接種到瓊脂斜面培養(yǎng)基上，斜面培養(yǎng)基含麥芽汁、酵母膏和瓊脂，PH值為4-6，培養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基直到培養(yǎng)物達到操作程度。
當生長足夠時，把培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到玻璃安瓶中進行凍干處理。
在利用固相態(tài)發(fā)酵作用獲取環(huán)胞多肽A的情況下，把如上得到的主種子接種到—液體培養(yǎng)基中。經(jīng)過足夠的生長后，把培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到固體底物發(fā)酵淺盤中，盤中含無菌小麥麥夫/稻麥夫，PH值控制在4-6之間。將相對濕度維持在約85-90％，溫度條件為25-30℃并通氣，在固體底物上開始出現(xiàn)真菌的生長。把真菌生長連同營養(yǎng)培養(yǎng)基用甲醇進行提取并蒸發(fā)處理而得到第一種殘余物，把該殘余物溶于無菌水中而得到—水溶液。把該水溶液的乙酸乙酯提取液脫色并濃縮而得到第二種殘余物。將第二種殘余物進行二步層析法處理，第一步用硅膠柱，第二步為樹脂柱。第一步中以己烷、氯仿和甲醇混合溶劑(比例為10∶9∶1)作為移動相。第二步層析中用甲醇作為移動相。于是在這兩步層析中得到了高純度的環(huán)胞多肽A。
在靜態(tài)發(fā)酵方法中，把主種子分二階段接種到—液體培養(yǎng)基中而形成該菌種的種菌。該液體培養(yǎng)基含葡萄糖、胨、酪蛋白酸水解物和無菌水，培養(yǎng)3-4天，此為第一階段。在25℃下培養(yǎng)2-3天，此為第二階段，把所得到的種菌轉(zhuǎn)移到靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基成分為葡萄糖、甘油、酪蛋白酸水解物、麥芽汁、胨、PL-α氨基丁酸和無菌水，PH值為4～6，并發(fā)酵21天。上述培養(yǎng)基具體組成為2～6％的葡萄糖、2～5.5％的甘油、1.5～5.5％的酪蛋白酸水解物、0.5～4.5％的麥芽汁，0.25～2.5％的胨、0.1～3％的DL-α氨基丁酸，其余為無菌水。
舉例來說，培養(yǎng)基含4％的葡萄糖、4％的甘油、3％的酪蛋白酸水解物、2％的麥芽汁、1％的胨、0.5％的DL-α氨基丁酸。
如果培養(yǎng)基成分超出上述范圍，環(huán)胞多肽A的產(chǎn)量就非常低。
將在上述靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上生長的Tolypocladium真菌生物量進行過濾，把由此回收的真菌生物量在有機溶劑(如甲醇)中進行提取。把甲醇從該甲醇提取液中蒸發(fā)掉而得到第一種殘余物，把該殘余物溶解在蒸餾水中而得到—水溶液；用乙酸乙酯對該水溶液進行提取而得—乙酸乙酯提取液。將該提取液用鈉溶液沖洗并蒸發(fā)而得到第二種殘余物，對該殘余物進行上面所述的二步柱層析分離。
兩種柱層析都能得到98％純度的環(huán)胞多肽A。
在下面的流程圖示中，我們解釋了利用靜態(tài)發(fā)酵步驟制備環(huán)胞多肽A的典型過程。
表2利用靜態(tài)發(fā)酵的本發(fā)明方法的環(huán)胞多肽A的產(chǎn)量
利用固態(tài)底物發(fā)酵(SSF)制備環(huán)胞多肽A的方法如下所示。(10批的平均值)
權利要求
1)一種從分枝層壁菌某種(Tolypocladium sp.)制備環(huán)胞多肽A的方法，其包括把上述分枝層壁菌在—營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵而得到—發(fā)酵培養(yǎng)基，用甲醇提取上述發(fā)酵培養(yǎng)基中的真菌生物量而得到—甲醇提取液，通過蒸發(fā)步驟從上述提取液中去除甲醇而得到第一種殘余物，制備上述第一種殘余物的水溶液，制備該水溶液的乙酸乙酯提取液，將上述提取液脫色并濃縮而得到第二種殘余物，然后分二步對其進行層析法純化，即第一步以硅膠柱為固相，以己烷、氯仿和甲醇混合溶劑為移動相，第二步以樹脂柱為固相而以甲醇為移動相。
2)根據(jù)權利要求1的方法，其中發(fā)酵步驟以靜態(tài)發(fā)酵進行。
3)根據(jù)權利要求1的方法，其中發(fā)酵步驟以固體底物發(fā)酵進行。
4)根據(jù)權利要求1的方法，其中接種到營養(yǎng)培養(yǎng)基中的上述分枝層壁菌某菌種為主種子。
5)根據(jù)權利要求4的方法，培養(yǎng)基中含有上述分枝層壁菌某菌種懸浮孢子，培養(yǎng)基成分為葡萄糖、胨、酪蛋白酸水解物和無菌水，PH值維持在4-6之間，把—匙該菌種孢子懸浮液接種到瓊脂斜面培養(yǎng)基中，該斜面培養(yǎng)基含麥芽汁、酵母膏和瓊脂，PH值為4-6，對瓊脂斜面培養(yǎng)基進行培養(yǎng)直到培養(yǎng)物中形成孢子，這樣來得到主種子。
6)根據(jù)權利要求1的方法，其包括形成該菌種之種菌的步驟，而接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中至少有兩種階段。
7)根據(jù)權利要求6的方法，其中上述第一階段步驟包括把主種子轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含葡萄糖、胨、酪蛋白酸水解物和無菌水，PH值為4～6，生長3-4天。
8)根據(jù)權利要求6的方法，其中上述第二階段步驟包括把來自第一階段的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到—培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含葡萄糖、胨、酪蛋白酸水解物和無菌水，PH值為4-6，生長2-3天。
9)根據(jù)權利要求5的方法，其中培養(yǎng)步驟進行10-14天。
10)根據(jù)權利要求1和2的方法，其中營養(yǎng)培養(yǎng)基含葡萄糖、甘油、酪蛋白酸水解物、麥芽汁、胨和DL-α氨基丁酸和無菌水、PH值為4-6。
11)根據(jù)權利要求10的方法，其中上述培養(yǎng)基含2-6％的葡萄糖、2-5.5％的甘油、1.5-5.5％的酪蛋白酸水解物、0.5-4.5％的麥芽汁、0.25-2.5％的胨、0.1-3％的DL-α氨基丁酸、其余為無菌水。
12)根據(jù)權利要求1的方法，其中先用碳酸氫鈉溶液乙酸乙酯提取液后用水沖洗來進行脫色步驟。
13)根據(jù)權利要求1的方法，其中上述生物量的甲醇提取液是用甲醇搖動生物量而制成，并把由此得到的甲醇提取液進行快速蒸發(fā)處理而得到一面糊狀殘余物。
14)根據(jù)權利要求13的方法，其中把甲醇殘余物溶解于蒸餾水中而獲得—水溶液，然后用乙酸乙酯提取而得到—乙酸乙酯部分提取液，對此用碳酸氫鈉處理并用水沖洗。
15)根據(jù)權利要求14的方法，通過快速蒸發(fā)而得到乙酸乙酯部分的濃縮物。
16)根據(jù)權利要求1的方法，其中上述混合溶劑由己烷、氯仿和甲醇組成，其比例為10∶9∶1。
17)由同權利要求1方法制備的環(huán)胞多肽A。
全文摘要
本發(fā)明涉及到從分枝層壁菌某種(Tolypocladium sp.)制備環(huán)胞多肽A的方法，包括制備上述Tolypocladium某菌種發(fā)酵培養(yǎng)基的步驟。從上述發(fā)酵培養(yǎng)基中提取真菌生物量而得到—甲醇提取液，通過蒸發(fā)去除甲醇而得到第一種殘余物。從這第一種殘余物水溶液中制備出乙酸乙酯提取液，對其脫色和濃縮而得到第二種殘余物，對第二種殘余物進行純化步驟處理。
文檔編號C07K7/64GK1130210SQ9510045
公開日1996年9月4日 申請日期1995年2月28日 優(yōu)先權日1995年2月28日
發(fā)明者K·巴拉雷曼, N·馬修 申請人:國家研究發(fā)展公司