本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種基于二氧化硅的熒光納米材料、其制備方法及其在活體熒光成像中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤的死亡率逐年攀升，是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一。調(diào)查顯示中國每年大約有200萬的新發(fā)病例，130萬人死于惡性腫瘤，是目前中國人的第二大主要死因。目前癌癥的治療方法有多種，包括手術(shù)切除、化療及放射治療等等。其中手術(shù)切除主要是依靠醫(yī)生多年的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，但是經(jīng)驗(yàn)對于癌癥邊界的判斷存在很大的誤差和局限性。因此如何精準(zhǔn)的定位癌癥邊界是手術(shù)成功的關(guān)鍵，而且微小病灶的發(fā)現(xiàn)也有利于癌癥的有效消除，減少復(fù)發(fā)的可能性。

光學(xué)成像診斷優(yōu)點(diǎn)突出，它對人體無損、無創(chuàng)、無電離輻射、設(shè)備體積小，便于攜帶，且成像迅速，靈敏度較高。為了提高熒光成像的分辨率和對比度，一種診斷輔助試劑——熒光染料被引入。傳統(tǒng)的熒光染料主要是小分子，其在體內(nèi)成非特異性分布，僅能對血管或某些特定器官進(jìn)行成像，限制了其在疾病診斷中的應(yīng)用。隨著納米技術(shù)及熒光成像設(shè)備的發(fā)展，近年來，光學(xué)成像中的激發(fā)熒光成像在腫瘤邊界以及術(shù)中導(dǎo)航領(lǐng)域獲得了越來越廣泛的應(yīng)用。然而目前激發(fā)熒光在術(shù)中導(dǎo)航中的應(yīng)用大都限于淺表腫瘤如乳腺癌，其在一些內(nèi)部腫瘤的應(yīng)用報(bào)道極少。這主要是由于激發(fā)熒光成像背景噪聲大，成像靈敏度低等原因造成的，從而使得癌癥的診斷及治療不夠精準(zhǔn)。為了改善這一現(xiàn)狀。研究人員對熒光染料進(jìn)行修飾，其主要采取的技術(shù)就是物理包埋以及化學(xué)鍵連到納米粒子上，雖然在一定程度上增加了熒光染料在腫瘤部位的富集，然而眾所周知多數(shù)熒光染料在聚集狀態(tài)下其熒光會(huì)發(fā)生一定程度的淬滅，所以上述方法并不能有效提高腫瘤部位的熒光強(qiáng)度。因此如何提高腫瘤部位的熒光強(qiáng)度，降低背景噪聲是目前熒光成像技術(shù)中亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的主要目的是為了解決現(xiàn)有熒光染料存在的穩(wěn)定性差以及體內(nèi)非特異性分布的缺點(diǎn)，而提供了基于二氧化硅的pH敏感的熒光納米材料的制備方法及應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，作為本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種基于二氧化硅的pH敏感的熒光納米材料，所述熒光納米材料的粒徑在30-200nm范圍之間；以及

所述熒光納米材料的內(nèi)核為二氧化硅納米粒子，所述二氧化硅納米粒子的表面通過對pH敏感的化學(xué)鍵與熒光染料連接。

作為本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種基于二氧化硅的pH敏感的熒光納米材料的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，將乙醇、氨水、去離子水混合，在30℃條件下攪拌0.5～1h；

步驟2，迅速加入硅烷試劑，繼續(xù)劇烈機(jī)械攪拌15min～24h，反應(yīng)結(jié)束后離心洗滌，將固體產(chǎn)物分散在乙醇中，由此得到二氧化硅納米粒子；

步驟3，將熒光染料分散在二甲基亞砜中，滴加到步驟2制備得到的二氧化硅納米粒子中，根據(jù)需要加入不同的催化劑進(jìn)行反應(yīng)0-24h，分離純化得最終產(chǎn)物。

作為優(yōu)選，該制備方法還包括：

步驟4，將步驟3的最終產(chǎn)物分散到去離子水或pH為7.4的磷酸緩沖鹽溶液中，通過EDC/NHS反應(yīng)將靶分子連接到所述最終產(chǎn)物的表面。

作為本發(fā)明的再一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種如上所述的基于二氧化硅的pH敏感的熒光納米材料在活體熒光成像中的應(yīng)用。

基于上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明的方法和由此制備的熒光納米材料具有如下有益效果：本發(fā)明所涉及的原料廉價(jià)，反應(yīng)條件溫和，具有較強(qiáng)的可操作性以及可控性；制備的熒光納米材料粒徑均勻可控，具有很好的穩(wěn)定性，其在循環(huán)過程中不產(chǎn)生熒光或者僅發(fā)出十分微弱的熒光，而在弱酸性環(huán)境中發(fā)出強(qiáng)烈熒光，從而起到對比增強(qiáng)的效果，這主要是由于在中性pH條件下染料分子連接在納米粒子表面處于聚集狀態(tài)熒光發(fā)生淬滅，而在弱酸性環(huán)境中染料與納米粒子間化學(xué)鍵發(fā)生斷裂，染料游離出來，從而顯示出強(qiáng)烈的熒光，因此其在病變組織熒光成像以及與其他成像模式或治療模式相結(jié)合的領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景；本發(fā)明工藝簡單，生成效率高，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)且具有很好的臨床應(yīng)用潛力。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的制備方法示意圖；

圖2為本發(fā)明以帶氨基的Cy7熒光染料為例的納米粒子的掃描電鏡圖；

圖3為本發(fā)明以帶氨基的Cy7熒光染料為例的納米粒子的熒光發(fā)射光譜圖；

圖4為本發(fā)明以帶氨基的Cy7熒光染料為例的納米粒子的粒徑分布圖。

具體實(shí)施方式

為了更清楚的說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)當(dāng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明為了解決現(xiàn)有熒光染料存在的穩(wěn)定性差以及體內(nèi)非特異性分布的缺點(diǎn)，而提供了一種基于二氧化硅的熒光納米材料、其制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明是通過化學(xué)反應(yīng)在二氧化硅納米粒子的表面通過pH敏感的化學(xué)鍵將熒光染料連接到其表面制備得到基于二氧化硅的pH敏感的熒光納米材料并將其應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明的二氧化硅納米粒子可以通過改變原料成分，使得其表面帶有一些易于修飾的活性基團(tuán)，比如氨基、羥基、羧基等等；制備得到的二氧化硅納米粒子具有穩(wěn)定性好、粒徑均一可控、低毒，且活體熒光顯像對比度高等優(yōu)點(diǎn)，在病變組織熒光成像領(lǐng)域具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

更具體地，本發(fā)明公開了一種基于二氧化硅的熒光納米材料的制備方法，包括以下步驟：

步驟1：將乙醇、氨水、去離子水按照一定比例混合于容器，例如燒瓶中，在30℃下攪拌0.5～1h；

步驟2：迅速加入一定體積的硅烷試劑，繼續(xù)劇烈攪拌15min～24h，反應(yīng)結(jié)束后離心洗滌，例如在10000rpm下離心，用乙醇洗滌三次，最后超聲分散在乙醇中；

步驟3：將熒光染料分散在二甲基亞砜(DMSO)中，滴加到制備得到的二氧化硅納米粒子中，根據(jù)需要加入不同的催化劑進(jìn)行反應(yīng)0-24h，最終通過離心或透析或超濾的方法除去游離的染料，并將粒子分散到去離子水或pH為7.4的磷酸緩沖鹽溶液中；

步驟4：通過EDC/NHS反應(yīng)將靶分子連接到納米粒子的表面，即得到所需的基于二氧化硅的熒光納米材料。

其中，靶分子包括小分子以及抗體類靶分子。

上述反應(yīng)中，可以通過改變乙醇、氨水、去離子水以及硅烷試劑的比例以及反應(yīng)時(shí)間來調(diào)節(jié)納米材料的粒徑。

上述反應(yīng)中，熒光染料選自熒光素類、羅丹明類、花青素類、碳菁類熒光染料中的一種或多種，例如帶氨基的Cy7熒光染料等。

上述反應(yīng)中，對pH敏感的化學(xué)鍵可以選自亞胺鍵、馬來酸二甲酯鍵、腙鍵、肟鍵、酰腙鍵、縮醛/縮酮鍵、原酸酯鍵中的一種或多種?？梢酝ㄟ^精細(xì)有機(jī)合成路線設(shè)計(jì)方法在二氧化硅納米粒子與熒光染料之間形成上述化學(xué)鍵，對于上述帶氨基的Cy7熒光染料例如通過添加酸、堿進(jìn)行反應(yīng)得到上述化學(xué)鍵。

上述反應(yīng)中，反應(yīng)條件溫和，連接靶分子之后能夠增加納米粒子的靶向性，增加其在靶組織的富集，增加靶組織與正常組織之間的對比度。

上述反應(yīng)中，通過改變熒光分子在二氧化硅表面的密度，使得染料發(fā)生熒光淬滅，當(dāng)且僅當(dāng)納米材料達(dá)到靶組并進(jìn)入細(xì)胞溶酶體或內(nèi)涵體之后pH敏感的化學(xué)鍵發(fā)生斷裂才會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。

本發(fā)明還公開了一種通過上述制備方法制備得到的基于二氧化硅的熒光納米材料。

本發(fā)明還公開了一種基于二氧化硅的熒光納米材料在制備活體熒光成像顯影劑中的應(yīng)用，從而對病灶組織進(jìn)行診斷。

下面結(jié)合具體優(yōu)選實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案和效果做進(jìn)一步的說明。需要說明的是，以下的具體實(shí)施方式只是舉例說明，本發(fā)明的技術(shù)方案并不限于以下所列舉的具體實(shí)施方式，還可以是各種實(shí)施方式之間的任意組合。

此外，為了描述的清楚，將實(shí)施例1-36的差異對比放于表1中，實(shí)施例37-108如后所述只是步驟(5)中的不同，為了節(jié)約篇幅未在表1中展現(xiàn)。

實(shí)施例1

(1)量取330mL乙醇、8mL氨水與110mL去離子水在圓底燒瓶中混合，在30℃條件下攪拌0.5h；

(2)量取20mL的正硅酸乙酯以及氨基丙基三乙氧基硅烷混合物(兩者的體積比為9∶1～0∶10)迅速加入到步驟(1)中的混合溶液中，繼續(xù)強(qiáng)烈地機(jī)械攪拌15min，反應(yīng)結(jié)束后離心(10 000rpm，10min)，并用乙醇和去離子水分別洗滌2-3次；

(3)將得到的表面帶有氨基的二氧化硅納米粒子分散在pH為8.0的磷酸鹽緩沖液，含氨基的熒光染料分散在DMSO溶液中，按照氨基摩爾比10∶1～2∶1的比例將溶液混合，室溫避光磁力攪拌0.5h；

(4)50μL0.25％戊二醛溶液滴加到步驟(3)中的混合溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)12h；

(5)最后將反應(yīng)溶液10000rpm離心10min，并用去離子水洗滌三次。

實(shí)施例2：

(1)量取330mL乙醇、8mL氨水與110mL去離子水在圓底燒瓶中混合，在30℃條件下攪拌0.5h；

(2)量取20mL的正硅酸乙酯以及氨基丙基三乙氧基硅烷混合物(兩者的體積比為9∶1～0∶10)迅速加入到步驟(1)中的混合溶液中，繼續(xù)強(qiáng)烈地機(jī)械攪拌15min，反應(yīng)結(jié)束后離心(10 000rpm，10min)，并用乙醇和去離子水分別洗滌2-3次；

(3)將得到的表面帶有氨基的二氧化硅納米粒子分散在pH8.0的磷酸鹽緩沖液，含醛基的熒光染料分散在DMSO溶液中，按照氨基∶醛基摩爾比10∶1～2∶1的比例將溶液混合，室溫避光磁力攪拌反應(yīng)24h；

(4)最后將反應(yīng)溶液10 000rpm離心10min，并用去離子水洗滌三次。

實(shí)施例3：

(1)量取330mL乙醇、8mL氨水與110mL去離子水在圓底燒瓶中混合，在30℃條件下攪拌0.5h；

(2)量取20mL的正硅酸乙酯以及氨基丙基三乙氧基硅烷混合物(兩者的體積比為9∶1～0∶10)迅速加入到步驟(1)中的混合溶液中，繼續(xù)強(qiáng)烈地機(jī)械攪拌15min，反應(yīng)結(jié)束后離心(10 000rpm，10min)，并用乙醇和去離子水分別洗滌2-3次；

(3)將得到的表面帶有氨基的二氧化硅納米粒子分散在pH為8.0的磷酸鹽緩沖液，含羰基的熒光染料分散在DMSO溶液中，按照氨基摩爾比10∶1～2∶1的比例將溶液混合，磁力攪拌室溫混合0.5h；

(4)4倍羰基當(dāng)量的DCC加入到上去混合溶液中，繼續(xù)避光攪拌反應(yīng)24h；

(5)最后將反應(yīng)溶液10 000rpm離心10min，并用去離子水洗滌三次。

實(shí)施例4-6：

同具體實(shí)施方式1-3，不同之處僅在于，步驟(2)中加入的正硅酸乙酯部分替換為聚乙二醇修飾的硅烷試劑，結(jié)果相似。

實(shí)施例7-36：

同實(shí)施例1-6不同之處僅在于，在步驟(2)中將氨基丙基三乙氧基硅烷替換為氨基丙基三甲氧基硅烷、氨基甲基三甲基硅烷、3-氨基丙基二(三甲基硅氧基)甲基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三(甲氧基乙氧基乙氧基)硅烷中的一種或幾種代替，結(jié)果相似。

實(shí)施例37-108：

同實(shí)施例1-36不同之處僅在于，在步驟(5)之后，按照氨基：NHS活化的抗體(實(shí)施例37-72)或小分子類靶分子(實(shí)施例73-108)摩爾比1∶1～100∶1的比例加入活化的靶分子，得到靶向性的基于二氧化硅的pH敏感的熒光納米粒子。

表1

以上所述的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。