采用碳納米材料調(diào)控草坪堆肥基質(zhì)真菌鑒定分析方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種碳納米材料調(diào)控草坪堆肥基質(zhì)真菌鑒定分析方法，以生活垃圾堆肥和土壤混合物為草坪基質(zhì)材料，以向其中混合四種不同碳納米材料作為處理組，通過(guò)草坪植物培養(yǎng)，研究添加不同碳納米材料一段時(shí)間后基質(zhì)中可培養(yǎng)真菌類群的變化，并通過(guò)分子測(cè)序技術(shù)分析基質(zhì)中可培養(yǎng)真菌的分類地位。通過(guò)將碳納米材料添加進(jìn)草坪建植體系后真菌類群的變化的認(rèn)識(shí)，為碳納米材料在垃圾堆肥草坪基質(zhì)中真菌類群調(diào)控應(yīng)用提供技術(shù)支撐。
【專利說(shuō)明】
采用碳納米材料調(diào)控草坪堆肥基質(zhì)真菌鑒定分析方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種采用碳納米材料調(diào)控草坪堆肥基質(zhì)真菌 鑒定分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 碳納米材料是三維結(jié)構(gòu)中至少有一個(gè)小于100 nm的材料。碳納米材料具有尺寸 小，比表面積大，表面能高，表面原子比例大的特點(diǎn)，在力學(xué)、光學(xué)、熱學(xué)、電學(xué)等方面表現(xiàn)出 了優(yōu)異性能。納米顆粒存在很多微界面，各種界面反應(yīng)可以通過(guò)其強(qiáng)化，在土壤重金屬污 染以及污水凈化方面發(fā)揮著顯著的作用。
[0003] 碳元素在自然界含量非常高，對(duì)于有機(jī)物和生命體也非常重要。1985年，科學(xué)家發(fā) 現(xiàn)了由60個(gè)C原子組成的C6Q。隨后碳納米管和石墨烯等也相繼被發(fā)現(xiàn)。2004年，Geim等人 成功制備出了單層石墨烯。之后隨著石墨烯在光、電、熱、磁上的特殊性質(zhì)被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，有 關(guān)碳材料的研究又進(jìn)入了一個(gè)全新的領(lǐng)域。
[0004] 隨著科學(xué)技術(shù)、現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展以及人口的不斷增加，世界上很多國(guó)家都呈 現(xiàn)出水體、土壤以及大氣污染日益嚴(yán)重的趨勢(shì)。報(bào)道指出，中國(guó)50%的河流以及80%以上的湖 泊已經(jīng)遭受到了污染，地表水的m類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中國(guó)的許多湖泊已經(jīng)達(dá)不到了。全國(guó)的耕地 中有8000萬(wàn)hm 2以上受到了不同程度的污染，而其中最突出的問(wèn)題就是有機(jī)污染物以及 重金屬的污染，這一情況已經(jīng)嚴(yán)重制約了中國(guó)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施，甚至威脅到了國(guó)人 的健康。
[0005] 傳統(tǒng)的水體修復(fù)技術(shù)比如截污、底泥疏浚等雖然暫時(shí)能夠起一些作用，但是都治 標(biāo)不治本，而生物修復(fù)限制因素有很多，比如環(huán)境溫度和酸堿性等，這就使得生物修復(fù)客 觀上存在著很大的局限性。作為傳統(tǒng)的污染土壤修復(fù)方法，客土法、淋濾法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且 對(duì)于大面積的修復(fù)起不到很好的作用。與傳統(tǒng)的環(huán)境修復(fù)方法相比較，將納米材料用于重 金屬修復(fù)，因其超強(qiáng)的吸附能力和超大的比表面積，不僅不存在傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，還表現(xiàn)出 極高的修復(fù)效率。另外大氣污染方面形勢(shì)也是十分嚴(yán)峻，空氣中超標(biāo)的S0 2、CO和NOx等時(shí)刻 威脅著我們的身體健康。納米材料具有極佳的催化效率，甚至能夠催化極不易發(fā)生的反應(yīng) 為解決產(chǎn)生大氣污染問(wèn)題提供了新的方法和思路。因此，利用納米材料解決水體和土壤以 及大氣的污染問(wèn)題越來(lái)越值得人們關(guān)注。而碳納米材料的研究又是其中極有發(fā)展前景的領(lǐng) 域。
[0006] 近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)碳納米管能夠有效的吸附水體中重金屬離子。Li等的實(shí)驗(yàn)表 明碳納米管能夠吸附水體中的鉛離子，并且與溶液的PH值有很大的相關(guān)性。隨著溶液pH值 的增加，碳納米管對(duì)鉛離子的吸附能力也隨之增大。Langmuir和Freundlich模型可以解 釋這個(gè)吸附過(guò)程。隨后，Li等還研究了不同氧化方式處理的碳納米管對(duì)鎘離子的吸附效果 比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)氧化處理后，碳納米管的比表面積顯著增加，表面官能團(tuán)的數(shù)量也有明顯增 多。具體來(lái)說(shuō)，碳納米管經(jīng)KMnO 4氧化之后的吸附效果明顯高于H2O2和HNO3的氧化效果。另 外，Li等人接下來(lái)又進(jìn)行了碳納米管吸附銅離子的實(shí)驗(yàn)、研究了不同形態(tài)的碳納米管對(duì)鉛 離子的吸附比較、碳納米管對(duì)鉛離子的吸附動(dòng)力學(xué)性質(zhì)以及解吸附的情況，并且討論了碳 納米管對(duì)鉛離子、銅離子以及鎘離子在相同溶液中的競(jìng)爭(zhēng)吸附情況。研究發(fā)現(xiàn)，碳納米管對(duì) 對(duì)溶液中以上三種不同離子的吸附順序?yàn)镻b 2+>Cu2+>Cd2+，其中對(duì)鉛離子(Pb2+)、銅離子 (Cu 2+)的吸附可以用Langmuir方程解釋。
[0007] 李延輝等利用HNO3氧化處理的碳納米管進(jìn)行了對(duì)Pb2+的吸附實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)HNO3 氧化處理之后的碳納米管表面積明顯增大，另外-OH、-C0、-C00H等官能團(tuán)被引入到了碳納 米管的表面。這能夠明顯增強(qiáng)碳納米管吸附Pb 2+的作用面積以及作用力，從而提高碳納米管 對(duì)Pb2+的吸附量。結(jié)果表明，吸附量隨著溫度的升高而升高，這說(shuō)明碳納米管對(duì)Pb 2+的吸附 是一個(gè)放熱過(guò)程。再生試驗(yàn)表明，吸附效果隨PH值的增加而顯著增加。當(dāng)pH低至2時(shí)，碳納米 管上吸附的Pb 2+脫附率到了 85%，從而為實(shí)現(xiàn)碳納米管吸附材料的循環(huán)利用提供了理論依 據(jù)。
[0008] 除此之外，石墨烯和氧化石墨烯對(duì)于有機(jī)物污染以及由石油泄露造成的環(huán)境污染 也有很強(qiáng)的修復(fù)作用。石墨烯改性之后對(duì)環(huán)境中污染物的吸附效果更佳，并且吸附量增大、 性能更加穩(wěn)定。Chen等人 ]制備出的三維多孔氧化石墨稀薄膜在選擇吸附方面表現(xiàn)出了巨 大的潛力。它吸附機(jī)油的重量能夠達(dá)到自身重量的37倍，吸附有機(jī)溶劑的重量則大于自身 重量的26倍，它的吸附效果相比片狀石墨烯和泡沫石墨烯高很多。除此之外，該多孔氧化 石墨烯薄膜的性質(zhì)十分穩(wěn)定，可利用己烷去除表面的吸附物質(zhì)之后循環(huán)利用。較高的吸附 量和較長(zhǎng)的循環(huán)使用次數(shù)使得該三維多孔氧化石墨烯薄膜去除有機(jī)物以及清理石油污染 方面表現(xiàn)出了極大的應(yīng)用前景。
[0009] 上述分析表明，石墨烯和碳納米管等碳納米材料在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用主要在土壤、 水體以及大氣污染修復(fù)方面，而作為生物調(diào)控劑進(jìn)行應(yīng)用，尤其碳納米材料在堆肥草坪基 質(zhì)中作為微生物調(diào)控劑，研究目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。
[0010]隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)和城市化速度的加快，城市生活和生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的垃圾廢物 呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)。與此同時(shí)，生活垃圾的配套處理卻還不夠完備，大量垃圾暴露在城市 中，對(duì)環(huán)境造成了很大的影響。堆肥化處理是城市生活垃圾處理及資源化比較便捷的方式， 這不僅能夠消化城市中的生活垃圾，緩解了生活垃圾帶來(lái)的城市環(huán)境壓力，同時(shí)也生產(chǎn)出 了大量堆肥肥料供給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
[0011] 生活垃圾中含有大量植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，因此將生活垃圾堆肥化處理并 將堆肥用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是其資源化利用的有效途徑。
[0012] 研究發(fā)現(xiàn)將適量垃圾堆肥添加到土壤當(dāng)中能夠有效增加作物產(chǎn)量。因土壤理化性 質(zhì)以及作物類型不同，其增幅也存在顯著差異。周德智等 ]研究了添加垃圾堆肥后，黃棕壤、 潮土以及紅壤中種植的小麥產(chǎn)量變化。結(jié)果顯示，添加適量垃圾堆肥后，作物均有增產(chǎn)效 果，其中紅壤土效果最好(作物增產(chǎn)46%)。賀立源等 [43]研究發(fā)現(xiàn)，小白菜的產(chǎn)量隨著垃圾堆 肥施用量的提高而增加，且與對(duì)照相比差異達(dá)到顯著水平。此外，堆肥的施用不僅對(duì)作物產(chǎn) 量有影響，對(duì)作物的品質(zhì)也有顯著的提高效果。方亭等人的研究發(fā)現(xiàn)，將垃圾堆肥添加到棕 紅壤土中，土壤作物油菜的籽粒中蛋白質(zhì)的含量顯著升高，大豆籽粒中所含的蛋白質(zhì)明顯 增加。
[0013] 然而，近些年來(lái)人們也開(kāi)始意識(shí)到垃圾堆肥中不僅含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還含有一 定量的重金屬，如果長(zhǎng)期施用會(huì)增加土壤中重金屬的含量。因此，將堆肥用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可能 會(huì)帶來(lái)一系列的食品安全問(wèn)題。可見(jiàn)，避開(kāi)食物鏈實(shí)現(xiàn)垃圾堆肥的資源化利用意義重大。不 僅如此，為防止堆肥利用導(dǎo)致土壤重金屬污染，甚至給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)威脅，在應(yīng)用的同時(shí)必 須考慮重金屬修復(fù)的問(wèn)題。
[0014] 傳統(tǒng)的草皮生產(chǎn)通常是利用優(yōu)質(zhì)土壤。這會(huì)對(duì)土壤的物理性質(zhì)產(chǎn)生很大的影響， 導(dǎo)致肥力下降。另外草皮生產(chǎn)時(shí)2 cm以上的耕層土壤會(huì)被帶走，肥沃的耕層土壤進(jìn)入城市 生態(tài)系統(tǒng)，而經(jīng)過(guò)幾次的草皮生產(chǎn)之后，農(nóng)田土壤將變得越來(lái)越貧瘠，以致于最終無(wú)法再進(jìn) 行農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，這是對(duì)國(guó)土資源極大的浪費(fèi)。如果草坪建植以生活垃圾堆肥作為基本體系， 不僅能夠消化城市垃圾，還能夠減輕草坪生產(chǎn)帶給耕層土壤的破壞作用。
[0015] 納米技術(shù)近年來(lái)發(fā)展十分迅速，在材料、信息、環(huán)境等方面均表現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用 前景。雖然已經(jīng)有一些研究理論研究，表明納米材料會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生不同程度的影 響，但應(yīng)用其調(diào)控作用，還尚無(wú)相關(guān)技術(shù)報(bào)道。
[0016] 真菌屬于真核微生物，在自然界中的分布非常廣泛，真菌的多樣性對(duì)于生物圈的 穩(wěn)態(tài)和平衡發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)真菌也為人類提供了大量的生物資源。在生物量方面， 土壤中的真菌占了重要的部分。其中有200多種為條件致病菌。真菌能夠分解土壤當(dāng)中的 有機(jī)質(zhì)形成腐殖質(zhì)，為植物提供養(yǎng)分，供給土壤動(dòng)物的生長(zhǎng)，并且真菌也是生態(tài)環(huán)境指標(biāo)的 重要衡量標(biāo)準(zhǔn)。農(nóng)田、草地、林地等等地方我們都能夠輕易找到真菌的身影，但是由于其所 處的環(huán)境不同，在不同的環(huán)境因子影響下，土壤中真菌的菌落組成、分布都會(huì)出現(xiàn)不同的規(guī) 律。研究發(fā)現(xiàn)真菌在環(huán)境中發(fā)揮著各式各樣的功能，比如講解纖維素、螯合金屬離子等等， 這些功能也使真菌生態(tài)環(huán)境中處于具足輕重的地位。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 碳納米材料因其特殊的結(jié)構(gòu)具有很大的應(yīng)用范圍，吸附水體和土壤中的重金屬就 是其中一項(xiàng)重要的應(yīng)用。本技術(shù)從基質(zhì)微生物角度出發(fā)，以生活垃圾堆肥和土壤混合物為 草坪基質(zhì)材料，以向其中混合四種不同碳納米材料作為處理組，通過(guò)草坪植物培養(yǎng)，研究添 加不同碳納米材料一段時(shí)間后基質(zhì)中可培養(yǎng)真菌類群的變化，并通過(guò)分子測(cè)序技術(shù)分析基 質(zhì)中可培養(yǎng)真菌的分類地位。通過(guò)將碳納米材料添加進(jìn)草坪建植體系后真菌類群的變化的 認(rèn)識(shí)，為碳納米材料在垃圾堆肥草坪基質(zhì)中真菌類群調(diào)控應(yīng)用提供技術(shù)支撐。
[0018] 為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明公開(kāi)了如下的技術(shù)內(nèi)容： 一種采用碳納米材料調(diào)控草坪堆肥基質(zhì)真菌鑒定分析的方法，其特征在于按如下的步 驟進(jìn)行： (1)實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用土壤取自天津師范大學(xué)校園0-20 cm表層土壤，基本性質(zhì)為：含水量19.4%，pH 7.27，電導(dǎo)率2250的/〇11，有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為52.3、3.75、2.15 8/1^。
[0019] 實(shí)驗(yàn)用生活垃圾堆肥來(lái)自天津市小淀垃圾處理廠。pH為7.49,電導(dǎo)率2300 ns/crn， 有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為132、6.81、25.18/1^。重金屬(^、〇1、？13、211、0(1含量分別為703、 341、217、677、5.01 mg/kg。
[0020] 供試納米炭黑(CB)購(gòu)于天津秋實(shí)炭黑廠，粒徑為20~70 nm，比表面積為1200 m2/ g，pH值為7.0，實(shí)驗(yàn)前利用KMnO4對(duì)其改性處理。
[0021] 石墨烯(G)微片購(gòu)于南京吉倉(cāng)納米科技有限公司，結(jié)構(gòu)為黑色薄片狀，微片尺寸 0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面積40-60 m2/g，密度約2.25 g/cm3,電導(dǎo)率 8000-10000 S/ m，含碳量>99.5%。
[0022]氧化石墨烯(GO)購(gòu)于蘇州恒球納米公司，為黑色或褐黃色粉末，平均厚度3.4-7 nm，片層直徑10-50 μπι，比表面積100-300 m2/g，純度>90%〇
[0023]碳納米管（CNT)購(gòu)于北京博宇高科技新材料技術(shù)有限公司，直徑20-40 nm，長(zhǎng)度 10-30 um，_⑶OH含量 1.43%，純度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面積>110 m2/g，導(dǎo)電：>102 s/ cm 〇
[0024] (2)實(shí)驗(yàn)方法： 取土后立即測(cè)量土壤含水量，計(jì)算得到土壤干重與濕重的比例。按照比例算得干重 1500 g所對(duì)應(yīng)的濕土重量。稱得相應(yīng)重量的濕土與30 g垃圾堆肥混合，攪拌均勻，裝入內(nèi)徑 15 cm高20 cm的塑料花盆中，共裝15盆。
[0025] 實(shí)驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，石墨烯(G)、氧化石墨烯(GO)、碳納米管（CNT)、改性納米炭黑 (CB)按干土重1%的比例分別加入到混合基質(zhì)中，以不添加碳納米材料的處理為對(duì)照(CK)， 添加碳納米材料后充分混勻，每盆播種高羊茅種子5g。培養(yǎng)期間溫度為19~27 °C，相對(duì)濕 度為60~72%，每天給土壤補(bǔ)充水分，使土壤濕度保持在土壤持水量的70%。培養(yǎng)130d后，將 盆中0-5cm深度土壤取出混勻，過(guò)60目篩，冰箱-20°C保存，供微生物分離與計(jì)數(shù)分析。
[0026] 本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)加了采用碳納米材料調(diào)控草坪堆肥基質(zhì)真菌鑒定分析方法在 確定真菌菌落的組成方面的應(yīng)用。其中的所述真菌菌落的組成包括：青霉菌屬 「Pe/jiciDit/?入木霉菌屬入球毛殼菌屬M(fèi)r入小球腔菌屬 (^e jOiOSjOAaeriaA鐮刀菌屬(T^sariuW、曲霉菌屬（JsjOergiDus)、淺色生赤殼菌屬 (Bionectria ochroleuca)。
[0027] 本發(fā)明所述的納米碳石墨稀(G)、氧化石墨稀(GO)、碳納米管(CNT)、改性納米炭黑 (CB)。改性納米炭黑（CB)，實(shí)驗(yàn)前利用KMnO 4對(duì)其改性處理指的是：稱取納米碳10 g于250 mL錐形瓶中，加入100 mLO.03 mol .I/1的KMnO4溶液，靜置10 min后，放于萬(wàn)用電熱器上沸 騰回流I h。冷卻后，用去離子水反復(fù)沖洗，使溶液不再渾濁且pH穩(wěn)定。轉(zhuǎn)移至燒杯，IKTC條 件下烘干至恒重。
[0028]本發(fā)明更加詳細(xì)的描述如下： 1研制材料與方法 1.1實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用土壤取自天津師范大學(xué)校園0-20 cm表層土壤，基本性質(zhì)為：含水量19.4%，pH 7.27，電導(dǎo)率2250的/〇11，有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為52.3、3.75、2.15 8/1^。
[0029] 實(shí)驗(yàn)用生活垃圾堆肥來(lái)自天津市小淀垃圾處理廠。pH為7.49,電導(dǎo)率2300 nS/crn， 有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為132、6.81、25.18/1^。重金屬(^、〇1、？13、211、0(1含量分別為703、 341、217、677、5.01 mg/kg。
[0030] 供試納米炭黑(CB)購(gòu)于天津秋實(shí)炭黑廠，粒徑為20~70 nm，比表面積為1200 m2/ g，pH值為7.0，實(shí)驗(yàn)前利用KMnO4對(duì)其改性處理。
[0031] 石墨烯(G)微片購(gòu)于南京吉倉(cāng)納米科技有限公司，結(jié)構(gòu)為黑色薄片狀，微片尺寸 0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面積40-60 m2/g，密度約2.25 g/cm3,電導(dǎo)率 8000-10000 S/ m，含碳量>99.5%。
[0032]氧化石墨烯(GO)購(gòu)于蘇州恒球納米公司，為黑色或褐黃色粉末，平均厚度3.4-7 nm，片層直徑10-50 μπι，比表面積100-300 m2/g，純度>90%〇
[0033]碳納米管（CNT)購(gòu)于北京博宇高科技新材料技術(shù)有限公司，直徑20-40 nm，長(zhǎng)度 10-30 um，_⑶OH含量 1.43%，純度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面積>110 m2/g，導(dǎo)電：>102 s/ cm 〇
[0034]技術(shù)設(shè)計(jì) 取土后立即測(cè)量土壤含水量，計(jì)算得到土壤干重與濕重的比例。按照比例算得干重 1500 g所對(duì)應(yīng)的濕土重量。稱得相應(yīng)重量的濕土與30 g垃圾堆肥混合，攪拌均勻，裝入內(nèi)徑 15 cm高20 cm的塑料花盆中，共裝15盆。
[0035] 實(shí)驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，石墨烯(G)、氧化石墨烯(GO)、碳納米管（CNT)、改性納米炭黑 (CB)按干土重1%的比例分別加入到混合基質(zhì)中，以不添加碳納米材料的處理為對(duì)照(CK)， 每個(gè)處理三次重復(fù)。添加碳納米材料后充分混勻，每盆播種高羊茅種子5g。培養(yǎng)期間溫度為 19~27 °C，相對(duì)濕度為60~72%，每天給土壤補(bǔ)充水分，使土壤濕度保持在土壤持水量的 70%。培養(yǎng)130d后，將盆中0-5cm深度土壤取出混勻，過(guò)60目篩，冰箱-20 °C保存，供微生物分 離與計(jì)數(shù)分析。
[0036]研制方法 1.3.1真菌培養(yǎng)基配制方法 培養(yǎng)真菌用孟加拉紅培養(yǎng)基，具體配方為蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氫鉀lg、硫 酸鎂(MgS〇4*7H20) 0.5g、瓊脂20g、l%的孟加拉紅溶液3.3mL、蒸餾水100〇111匕121°(：滅菌 20分鐘，室溫晾至50-60°C時(shí)加入1%鏈霉素3ml，充分混勻，之后將其倒入培養(yǎng)皿，備用。鏈霉 素的加入能夠有效地抑制培養(yǎng)基中真菌的生長(zhǎng)。
[0037]真菌培養(yǎng)最適濃度的確定 根據(jù)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)以及以往培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)初步確定真菌培養(yǎng)觀察的最適濃度在HT2-10一3之間。取0.5g對(duì)照組中的基質(zhì)土壤倒入裝有50ml無(wú)菌水的錐形瓶中，制成HT 2濃度的土 壤浸出液，封口后置于搖床上，以150 rpm振蕩20 min。振蕩停止后靜置10 S。吸取I mL 土壤浸出液移入試管中并添加9 mL無(wú)菌水，將其稀釋10倍，制成KT3濃度的土壤浸出液，充 分混勻。分別取200ul 土壤浸出液均勻涂布到LB培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿倒置放入28度的恒溫培 養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)。連續(xù)觀察真菌生長(zhǎng)情況，待其大小適宜數(shù)量穩(wěn)定后進(jìn)行計(jì)數(shù)。預(yù)實(shí)驗(yàn)的 結(jié)果發(fā)現(xiàn)1〇_ 2這一濃度為草坪堆肥基質(zhì)中真菌培養(yǎng)觀察的最適濃度。培養(yǎng)時(shí)間為兩天時(shí)最 適宜計(jì)數(shù)。
[0038]真菌平板計(jì)數(shù)方法 實(shí)驗(yàn)采用稀釋平板涂布法分離基質(zhì)中的真菌，具體操作過(guò)程為:稱取0.5 g草坪堆肥基 質(zhì)倒入裝有50 mL無(wú)菌水的錐形瓶中，將錐形瓶封口后置于搖床上以150 rpm振蕩20 min，得到HT2濃度的土壤懸濁液。取土壤懸濁液200ul注射到固體孟加拉紅培養(yǎng)基上并涂 布均勻，之后將培養(yǎng)皿倒置于28 °C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2d，選擇菌落數(shù)在30-300個(gè)范圍內(nèi) 的平板進(jìn)行分離計(jì)數(shù)，并按菌落特征歸類、編號(hào)。用平板劃線法對(duì)分離到的真菌進(jìn)行純化， 并置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0039]真菌的分子生物學(xué)鑒定方法 對(duì)培養(yǎng)皿中每種純培養(yǎng)得到的真菌利用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)提 取真菌基因組DNA，按試劑盒操作流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將所得DNA用于真菌18SrDNA PCR擴(kuò)增實(shí) 驗(yàn)。擴(kuò)增引物 ITSl(5 '-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '）、ITS4(5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '）， PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2min，94°C變性30s，59°C退火30s，72°C延伸90s，共35個(gè)循 環(huán)，最后72°C延伸7min_]。擴(kuò)增體系如下（50 yL):引物1(27F) 2yL;引物2(1492R) 2yL; IOx Buffer(Mg2+) 5yL;dNTP lyL;Taq酶 lyL;DNA模板 10yL;ddH20 29yL。將擴(kuò)增產(chǎn)物各 取7yL分別與2yL 6 XGlycerol DNA loading buffer混合均勾，取7yL混合液點(diǎn)樣，進(jìn)行 1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察，觀察到明亮目標(biāo)條帶后將所 得PCR產(chǎn)物交由北京華大基因公司純化與測(cè)序。
[0040] 真菌18SrDNA序列分析方法 測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI Blast( http: //www.ncbi.nlm.nih.gov)比對(duì)分析，獲得相似度最 高的五個(gè)菌株的18SrDNA序列。運(yùn)用ClustalX進(jìn)行多重對(duì)比、用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分 析，采用Neighbor-join法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展數(shù)(Bootstrap)為1000。根據(jù)序列的同源程 度初步確定待鑒定的菌株在分類學(xué)上的地位。將培養(yǎng)得到菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的模式菌株 進(jìn)行比較，如果相似度達(dá)到96%以上，那么可將培養(yǎng)得到的菌株與模式菌株歸為一個(gè)屬，也 就將培養(yǎng)菌株鑒定到了屬的水平。
[0041 ]研制結(jié)果分析 2.1基質(zhì)中可培養(yǎng)真菌的18SrDNA分析 經(jīng)過(guò)對(duì)草坪堆肥基質(zhì)中真菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù)以及種類劃分歸類，挑選出了不同特征的真菌 菌落。
[0042] 通過(guò)對(duì)不同真菌18SrDNA的PCR，得到了多條擴(kuò)增片段，并且通過(guò)與DNA Marker的 位置對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其條帶符合真菌的特征，送測(cè)后的結(jié)果顯示如下： 本實(shí)驗(yàn)共獲得19條有效序列，將獲得的序列通過(guò)Blast程序與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已 知序列進(jìn)行相似性比對(duì)，其類別信息、相似性百分比及GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表1。
[0043]表1基質(zhì)中可培養(yǎng)真菌的ISSrDNA序列相似性分析
通過(guò)序列相似性分析發(fā)現(xiàn)菌株1和菌株12為青霉菌屬(PefliciDiUffi)，菌株2、7、9、10、 13、15、16、18為木霉菌屬（TricAocZerffia)，菌株3為球毛殼菌屬(driAroAacier)，菌株4為小 球腔菌屬(IeptospAaeria)，菌株5、6、11為鐮刀菌屬(/7UsaritWff)，菌株8、14、17為曲霉菌屬 (Js jOergiDus)，菌株19為淺色生赤殼菌屬(BicMeciria ocAro_/euca)。以上菌株與模式菌 株的相似性均達(dá)到96%以上，可信度比較高。
[0044] 將分離出的19株形態(tài)不同的真菌菌株的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast分析及多重比對(duì)，利 用MEGA5.1以18SrDNA同源性為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
[0045] 研制結(jié)論 本技術(shù)結(jié)合分子測(cè)序技術(shù)對(duì)添加碳納米材料后草坪堆肥基質(zhì)中可培養(yǎng)真菌類群進(jìn)行 鑒定分析，主要研究結(jié)果如下:共分離得到19株真菌，經(jīng)18SrDNA測(cè)序結(jié)果表明這19株真菌 分別屬于青霉菌屬人木霉菌屬〔rricAoc/ei-ffla人球毛殼菌屬Q(mào)riAroAacier入 小球腔菌屬deptospAaeria人鐮刀菌屬(T 7UsaritWff人曲霉菌屬(JsjOergiDus)、淺色生赤殼 菌屬CMeciria 可培養(yǎng)真菌總數(shù)和多樣性指數(shù)無(wú)顯著差異，但是添加納米 材料后真菌菌落的組成卻發(fā)生了變化。
[0046]
【附圖說(shuō)明】： 圖1是對(duì)其進(jìn)行ISSrDNA擴(kuò)增之后的電泳圖；
【具體實(shí)施方式】： 下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為 本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的范 圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā) 明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬 于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所用原料、試劑均有市售。
[0047] 實(shí)施例1 (1)實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用土壤取自天津師范大學(xué)校園10 cm表層土壤，基本性質(zhì)為：含水量19.4%，pH 7.27，電導(dǎo)率2250的/〇11，有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為52.3、3.75、2.15 8/1^。
[0048] 實(shí)驗(yàn)用生活垃圾堆肥來(lái)自天津市小淀垃圾處理廠。pH為7.49,電導(dǎo)率2300 nS/crn， 有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為132、6.81、25.18/1^。重金屬(^、〇1、？13、211、0(1含量分別為703、 341、217、677、5.01 mg/kg。
[0049] 供試納米炭黑（CB)購(gòu)于天津秋實(shí)炭黑廠，粒徑為20 nm，比表面積為1200 m2/g， pH值為7.0，實(shí)驗(yàn)前利用KMn〇4對(duì)其改性處理。
[0050] 石墨烯(G)微片購(gòu)于南京吉倉(cāng)納米科技有限公司，結(jié)構(gòu)為黑色薄片狀，微片尺寸 0.5 um，厚度5 nm，比表面積40 m2/g，密度約2.25 g/cm3,電導(dǎo)率8000 S/m，含碳量>99.5%。
[0051] 氧化石墨烯(GO)購(gòu)于蘇州恒球納米公司，為黑色或褐黃色粉末，平均厚度3.4-7 nm，片層直徑ΙΟμπι，比表面積100 m2/g，純度>90%〇
[0052]碳納米管（CNT)購(gòu)于北京博宇高科技新材料技術(shù)有限公司，直徑20 nm，長(zhǎng)度 10um，-C00H含量 1.43%，純度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面積>110 m2/g，導(dǎo)電：>102 s/cm〇 [0053] (2)實(shí)驗(yàn)方法： 取土后立即測(cè)量土壤含水量，計(jì)算得到土壤干重與濕重的比例。按照比例算得干重 1500 g所對(duì)應(yīng)的濕土重量。稱得相應(yīng)重量的濕土與30 g垃圾堆肥混合，攪拌均勻，裝入內(nèi)徑 15 cm高20 cm的塑料花盆中，共裝15盆。
[0054] 實(shí)驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，石墨烯(G)、氧化石墨烯(GO)、碳納米管（CNT)、改性納米炭黑 (CB)按干土重1%的比例分別加入到混合基質(zhì)中，以不添加碳納米材料的處理為對(duì)照(CK)， 添加碳納米材料后充分混勻，每盆播種高羊茅種子5g。培養(yǎng)期間溫度為19 °C，相對(duì)濕度為 60%，每天給土壤補(bǔ)充水分，使土壤濕度保持在土壤持水量的70%。培養(yǎng)130d后，將盆中Icm深 度土壤取出混勻，過(guò)60目篩，冰箱-20°C保存，供微生物分離與計(jì)數(shù)分析。
[0055] 實(shí)施例2 (1)實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用土壤取自天津師范大學(xué)校園20 cm表層土壤，基本性質(zhì)為：含水量19.4%，pH 7.27，電導(dǎo)率2250的/〇11，有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為52.3、3.75、2.15 8/1^。
[0056] 實(shí)驗(yàn)用生活垃圾堆肥來(lái)自天津市小淀垃圾處理廠。pH為7.49,電導(dǎo)率2300 yS/cm， 有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為132、6.81、25.18/1^。重金屬(^、〇1、？13、211、0(1含量分別為703、 341、217、677、5.01 mg/kg。
[0057] 供試納米炭黑（CB)購(gòu)于天津秋實(shí)炭黑廠，粒徑為70 nm，比表面積為1200 m2/g， pH值為7.0，實(shí)驗(yàn)前利用KMn〇4對(duì)其改性處理。
[0058]石墨烯(G)微片購(gòu)于南京吉倉(cāng)納米科技有限公司，結(jié)構(gòu)為黑色薄片狀，微片尺寸20 um，厚度25 nm，比表面積60 m2/g，密度約2.25 g/cm3,電導(dǎo)率10000 S/m，含碳量>99.5%。
[0059]氧化石墨烯(GO)購(gòu)于蘇州恒球納米公司，為黑色或褐黃色粉末，平均厚度7 nm，片 層直徑50 μπι，比表面積100-300 m2/g，純度>90%。
[0060]碳納米管（CNT)購(gòu)于北京博宇高科技新材料技術(shù)有限公司，直徑40 nm，長(zhǎng)度30 um，_C00H含量 1.43%，純度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面積>110 m2/g，導(dǎo)電：>102 s/cm。
[0061 ] (2)實(shí)驗(yàn)方法： 取土后立即測(cè)量土壤含水量，計(jì)算得到土壤干重與濕重的比例。按照比例算得干重 1500 g所對(duì)應(yīng)的濕土重量。稱得相應(yīng)重量的濕土與30 g垃圾堆肥混合，攪拌均勻，裝入內(nèi)徑 15 cm高20 cm的塑料花盆中，共裝15盆。
[0062] 實(shí)驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，石墨烯(G)、氧化石墨烯(GO)、碳納米管（CNT)、改性納米炭黑 (CB)按干土重1%的比例分別加入到混合基質(zhì)中，以不添加碳納米材料的處理為對(duì)照(CK)， 添加碳納米材料后充分混勻，每盆播種高羊茅種子5g。培養(yǎng)期間溫度為27 °C，相對(duì)濕度為 72%，每天給土壤補(bǔ)充水分，使土壤濕度保持在土壤持水量的70%。培養(yǎng)130d后，將盆中5cm深 度土壤取出混勻，過(guò)60目篩，冰箱-20°C保存，供微生物分離與計(jì)數(shù)分析。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種采用碳納米材料調(diào)控草坪堆肥基質(zhì)真菌鑒定分析的方法，其特征在于按如下的 步驟進(jìn)行： (1) 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用土壤取0-20 cm表層土壤； 供試納米炭黑粒徑為20~70 nm，比表面積為1200 m2/g，pH值為7.0,實(shí)驗(yàn)前利用KMn〇4 對(duì)其改性處理； 石墨烯微片尺寸0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面積40-60 m2/g，密度約2.25 g/cm3,電 導(dǎo)率 8000-10000 S/m，含碳量>99.5%; 氧化石墨烯平均厚度3.4-7 nm，片層直徑10-50 μπι，比表面積100-300 m2/g，純度>90%; 碳納米管直徑20-40 nm，長(zhǎng)度10-30 um，_⑶OH含量1.43%，純度>90wt%，灰粉<8wt%，比 表面積>110 m2/g，導(dǎo)電：>102 s/cm; (2) 實(shí)驗(yàn)方法： 取土后立即測(cè)量土壤含水量，計(jì)算得到土壤干重與濕重的比例，按照比例算得干重 1500 g所對(duì)應(yīng)的濕土重量，稱得相應(yīng)重量的濕土與30 g垃圾堆肥混合，攪拌均勻，裝入內(nèi)徑 15 cm高20 cm的塑料花盆中，共裝15盆； 實(shí)驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理:石墨烯(G)、氧化石墨烯(GO)、碳納米管(CNT)、改性納米炭黑(CB)按 干土重1%的比例分別加入，添加碳納米材料后充分混勻，以不添加碳納米材料的處理為對(duì) 照(CK)，每盆播種高羊茅種子5g，培養(yǎng)期間溫度為19~27 °C，相對(duì)濕度為60~72%，每天給 土壤補(bǔ)充水分，使土壤濕度保持在土壤持水量的70%，培養(yǎng)130d后，將盆中0-5cm深度土壤取 出混勻，過(guò)60目篩，冰箱-20°C保存，供微生物分離與計(jì)數(shù)分析。2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中土壤的基本性質(zhì)為:含水量19.4%，pH 7.27，電導(dǎo)率2250 的/〇11，有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為52.3、3.75、2.15 8/1^; 實(shí)驗(yàn)用生活垃圾堆肥來(lái)自天津市小淀垃圾處理廠，pH為7.49,電導(dǎo)率2300 uS/cm，有機(jī) 質(zhì)、全磷、全氮分別為132、6.81、25.1&/1^; 重金屬〇、&1、？13、211丄(1含量分別為703、341、217、677、5.0111^/1^; 納米炭黑，粒徑為20~70 nm，比表面積為1200 m2/g，pH值為7.0,實(shí)驗(yàn)前利用KMn〇4對(duì) 其改性處理； 石墨烯微片尺寸0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面積40-60 m2/g，密度約2.25 g/cm3,電 導(dǎo)率 8000-10000 S/m，含碳量>99.5%; 氧化石墨烯平均厚度3.4-7 nm，片層直徑10-50 μπι，比表面積100-300 m2/g，純度>90%; 碳納米管，直徑20-40 nm，長(zhǎng)度10-30 um，-C00H含量1.43%，純度>90wt%，灰粉<8wt%，比 表面積>110 m2/g，導(dǎo)電:>102 s/cm。3. 權(quán)利要求1所述采用碳納米材料調(diào)控草坪堆肥基質(zhì)真菌鑒定分析方法在確定真菌菌 落的組成方面的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述真菌菌落的組成包括:青霉菌屬入木 霉菌屬人球毛殼菌屬入小球腔菌屬(^ejOioSjOAaei-ia)、鏡刀菌 屬人曲霉菌屬、淺色生赤殼菌屬 6?io/3eci_ria ocAro_/et/ca」。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK106086154SQ201610443330
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月21日
【發(fā)明人】多立安, 趙樹(shù)蘭, 鄭亞南
【申請(qǐng)人】天津師范大學(xué)