檸檬苦素類化合物在制備治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檸檬苦素類化合物及含其的藥物組合物在制備治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用。該應(yīng)用中所述化合物為首次報(bào)道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的檸檬苦素類化合物，可以從吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)中提取、分離純化得到。體外試驗(yàn)證明該化合物可直接抑制K562細(xì)胞的增殖，抑制能力隨濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)；同時(shí)，該化合物可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，且這種促凋亡的效應(yīng)隨著濃度和時(shí)間的增加而增加?；衔?Ⅰ)可能為慢性粒細(xì)胞白血病的治療提供一種潛在的手段，可以用來(lái)開(kāi)發(fā)成治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物。
【專利說(shuō)明】
檸檬苦素類化合物在制備治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)中分離得到的一 種檸檬苦素類化合物及含其的藥物組合物在制備治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢性粒細(xì)胞白血病是一種影響血液及骨髓的惡性腫瘤，它的特點(diǎn)是產(chǎn)生大量不成 熟的白細(xì)胞，這些白細(xì)胞在骨髓內(nèi)聚集，抑制骨髓的正常造血;并且能夠通過(guò)血液在全身擴(kuò) 散，導(dǎo)致病人出現(xiàn)貧血、容易出血、感染及器官浸潤(rùn)等。慢性粒細(xì)胞白血病是一種相對(duì)少見(jiàn) 的惡性腫瘤，大約占所有癌癥的0.3%，占成人白血病的20% ;-般人群中，大約每10萬(wàn)有1 至2個(gè)人患有該病。慢性粒細(xì)胞白血病可以發(fā)生于任何年齡的人群，但以50歲以上的人群最 常見(jiàn)，平均發(fā)病年齡為65歲，男性比女性更常見(jiàn)。
[0003] 吳茱萸為傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。其味辛、苦，性熱，有小毒;具 有散寒止痛，降逆止嘔，助陽(yáng)止瀉的功效。主要用于治療厥陰頭痛，寒疝腹痛，寒濕腳氣等。 1977-2010版《中國(guó)藥典》均收載吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa(Juss .) Benth ·，石虎E · Rutaecarpa(Juss · )Benth · var · Officinal is (Dode)Huang 或疏毛吳茱萸 E .Rutaecarpa( Juss · )Benth · var .Bodinieri (Dode)Huang的干燥近成熟果實(shí)。常綠灌木或 小喬木，主要分布在中國(guó)的貴州、四川、湖南、湖北、江西、廣西、安徽和浙江省等。
[0004] 吳茱萸主要包括生物堿類、檸檬苦素類、揮發(fā)油類、黃酮類等化學(xué)成分。生物堿是 吳茱萸成分研究的主流。目前，從該屬植物中已經(jīng)分離鑒定出多種生物堿，主要有吲哚類、 喹諾酮類、呋喃喹啉類和吖喧酮類生物堿，另外，還有其他類型生物堿。檸檬苦素也是吳茱 萸的重要活性成分，主要包括檸檬苦素(C 26H3Q08)，吳茱萸苦素，吳茱萸內(nèi)酯醇，黃柏酮，吳茱 萸苦素乙酸酯，格羅苦素甲等化合物。吳茱萸富含揮發(fā)油，主要成分是月桂烯（占揮發(fā)油總 量的45.37 % )。此外，還包括萜類，異戊烯黃酮類黃酮化合物，香豆精，留體(β-谷留醇），木 質(zhì)素，多糖，花色苷，多種氨基酸類化合物及微量元素和脂肪酸類化合物等。
[0005] 現(xiàn)代藥理研究表明，吳茱萸具有鎮(zhèn)痛作用，體溫上升作用，對(duì)消化系統(tǒng)具有抗?jié)?瘍、雙向調(diào)節(jié)腸運(yùn)動(dòng)和保肝利膽作用，對(duì)子宮平滑肌和支氣管具有雙向調(diào)節(jié)作用，對(duì)心血管 系統(tǒng)具有降低血壓，溶栓、增加血流量、擴(kuò)張血管等作用，其中生物堿、檸檬苦素類化合物為 其主要有效成分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供從吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)中分離得到的一種檸檬苦素類 化合物及含其的藥物組合物在制備治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種檸檬苦素類化合物在制備治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用，具有下述 結(jié)構(gòu)式的化合物(I)，
[0009]
[0010] 化合物(I)從吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)中分離得到，具體包含以下操作步驟：
[0011] (a)吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)粉碎，用80~90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃 縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙 酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
[0012] (b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再 用75%乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；
[0013] (C)步驟(b)中75%乙醇洗脫物浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、55:1、 35:1、15 :1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至1」5個(gè)組分；
[0014] (d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和10:1的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；
[0015] (e)步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為 80 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物 (1)〇
[0016] 進(jìn)一步地，步驟(a)中，用85%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0017]進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0018] -種藥物組合物在制備治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用，該藥物組合物含 有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物(I)和藥學(xué)上可接受的載體。
[0019] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì) 人和動(dòng)物無(wú)毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0020] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過(guò)口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無(wú)菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0022] 本發(fā)明的應(yīng)用可以治療慢性粒細(xì)胞白血病，本應(yīng)用中所述化合物（I)可直接抑制 K562細(xì)胞的增殖，抑制能力隨濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。同時(shí)，化合物（I)可誘 導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，且這種促凋亡的效應(yīng)隨著濃度和時(shí)間的增加而增加。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0024]圖2為化合物（I)理論E⑶值與實(shí)驗(yàn)E⑶值比較。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0026]實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0027] 試劑來(lái)源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購(gòu)自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購(gòu)自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0028]制備方法：（a)將吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)（8kg)粉碎，用85%乙醇熱回流提取 (25LX3次），合并提取液，濃縮至無(wú)醇味（3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3 次)和水飽和的正丁醇（3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（347g)和 正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8 個(gè)柱體積，再用75%乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫 物浸膏（131g);(c)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1(8 個(gè)柱體積）、55:1 (8個(gè)柱體積）、35:1 (6個(gè)柱體積）、15:1 (8個(gè)柱體積)和1:1 (5個(gè)柱體積)的二 氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4(29g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依 次用體積比為20:1(8個(gè)柱體積）、15:1(10個(gè)柱體積)和10:1(6個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇 梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2(llg)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用 體積百分濃度為80 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮 得到純的化合物（I)(33mg)。
[0029] 結(jié)構(gòu)確證:冊(cè)431]\^顯示[]\1+他]+為111/2 661.3022，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C36H46〇iq，不飽和度為 14。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ppm，DMS〇-d6，400MHz): H-1 (3 · 52，ddd，J = 8. l，3.4,2.2)，H-2(1.96，m)，H-2(2.28，ddd，J=16.2,3.4,2.8)，H-3(5.05，dd，J = 2.8， 2.8)，H-5(1.34，d，J=12.6)，H-6(4.07，dd，J=12.6,3.1)，H-7(5.61，d，J = 3.1)，H-9 (1.69，dd，J=11.3,7.4)，H-ll(2.61，m)，H-ll(2.18，m)，H-15(6.01，s)，H-17(3.39，s)，H-18(1.41，s)，H-19(0.97，s)，H-21(7.38，br，s)，H-22(6.19，br，d，J=1.6)，H-23(7.35，dd，J = 1.6，1.6)，H-28(3.25，br，d，J = 7.7)，H-28(3.46，d，J = 7.7)，H-29(1.07，s)，H-30(1.26， s)，H-3'（6.69，m)，H-4'（1.81，dq，J=7.1，l.l)，H-5'（1.85，br，s)，H-3"（6.72，m)，H-4" (1.75，dq，J = 7.1，l.l)，H-5"（ 1 · 81，dq，J = 1 · 1，1 · 1);核磁共振碳譜數(shù)據(jù) δ。(ppm，DMS〇-d6， 125MHz):73.7(CH，1-C)，30.8(CH2,2-C)，73.1(CH，3-C)，41.7(C，4-C)，40.1(CH，5-C)，71.1 (CH，6-C)，73.8(CH，7-C)，45.7(C，8-C)，34.0(CH，9-C)，39.6(C，10-C)，37.1(CH 2，n-C)， 210.1(C，12-C)，54.1(C，13-C)，191.3(C，14-C)，124.7(CH，15-C)，205.2(C，16-C)，60.1 (CH，17-C)，26.1(CH 3，18-C)，15.7(CH3，19-C)，119.1(C，20-C)，141.1(CH，21-C)，110.9(CH， 22-C)，142.3(CH，23-C)，67.6(CH2,28-C)，18.1(CH 3,29-C)，25.1(CH3,30-C)，166.9(C，r-C)，127.9(C，2'-C)，138.2(CH，3'-C)，12.7(CH3,4'-C)，14.1(CH3,5'-C)，166.7(C，1"-C)， 127.9(<：，2"-〇，138.1(01，3"-〇，12.9(013,4"-〇，13.8(013,5"-〇 ;碳原子標(biāo)記參見(jiàn)圖1。 紅外光譜表明該化合物含有羥基(3435CHT1)和羰基（1742和1714CHT 1)基團(tuán)，紫外光譜顯示 該化合物在230nm處有紫外吸收，表明含有α，β-不飽和酯羰基結(jié)構(gòu)。4和13C NMR數(shù)據(jù)表明該 化合物含有的兩個(gè)羰基(一個(gè)α，β_不飽和酮羰基），一個(gè)取代呋喃環(huán)，兩個(gè)巴豆酰氧基基 團(tuán)，四個(gè)含氧次甲基，1個(gè)含氧亞甲基以及四個(gè)甲基。兩個(gè)巴豆酰氧基分別與C-3和C-7相連； HMBC 譜中，!1-30!15.〇5，(1(1，了 = 2.8,2.8!^)和!1-70!15.61，(1，了 = 3.1!^)與相應(yīng)酯羰基碳[3 <：166.9和166.7]的相關(guān)性驗(yàn)證了上述結(jié)論。此外，〇1(3073.7)，〇6(3071.1)和(：-28(3 C67.6)的化學(xué)位移表明了 1-0Η，6-0Η和28-0Η的存在。此外，根據(jù)HMBC譜中H-170H3.39，s) 與 〇2〇0(：119.1)，(：-21(3(：141.1)和(：-22(3(：11〇.9)的相關(guān)性，可推斷呋喃環(huán)位于(：-17位 上。ROESY譜中，H3-29與Η-2β，H-6和H3-19; H3-19與Η-2β，H-6和H3-30;以及H3-30與H-6的相關(guān) 性表明11-20，!1-6，!13-19，!1 3-29和!13-3是|3構(gòu)型，因而使得(：-6位的羥基是€[-構(gòu)型。了 5,6 (12.6Hz)的耦合常數(shù)表明Η-5是α-構(gòu)型，從而確立了Η-9和Η3-18為α-構(gòu)型;ROESY譜中Η-9與 Η-5和Η3-18的相關(guān)性驗(yàn)證了上述推論。此外，九2{!(3.4抱），如,3(2.8他）和九7(3.1他）較小 的耦合常數(shù)表明Η-1，Η-3和Η-7為β-構(gòu)型，從而C-l，C-3，C-7位其余的取代基團(tuán)均為α-構(gòu)型。 綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物 如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過(guò)Ε⑶試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。
[0030]實(shí)施例2:化合物（I)藥理作用試驗(yàn) [0031] -、材料和儀器
[0032] Κ562細(xì)胞由中科院上海生物細(xì)胞所提供?；衔铮↖)為自制，HPLC歸一化純度大于 98% ΑΡΜΙ-1640干粉培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司。小牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料研究 所。青霉素、鏈霉素購(gòu)于華北制藥廠。Glutamine、MTT、DMSO購(gòu)于AMRESOLAnnexinv-FITC細(xì) 胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。M0PS，Rnasin、瓊脂糖、嗅乙錠、溴 酚蘭華美生物工程公司華美生物工程公司。
[0033] C02孵箱（美國(guó)Thermo公司），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠），磁力攪拌器(上海南 匯電訊器材廠），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），水平式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠），電 子分析天平(德國(guó)Sartorius公司），自動(dòng)酶標(biāo)儀(德國(guó)Humareader公司），U-3010型紫外分光 光度計(jì)（日本HITACHI公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BECKMAN公司），Eppendorf Centrifuge 5417R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司）。
[0034]二、試驗(yàn)方法 [0035] 1、K562細(xì)胞的培養(yǎng)
[0036]將新購(gòu)買的細(xì)胞株的培養(yǎng)瓶表面用75%酒精擦拭3遍。將細(xì)胞懸液吸入離心管， lOOOrpm離心10min。棄去上清，滴加含10%NBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，輕輕吹打制備成細(xì) 胞懸液。接種于培養(yǎng)瓶中，置于37°C，5%C0 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液傳代。
[0037] 2、實(shí)驗(yàn)分組
[0038]正常對(duì)照組：10%NBS 的 RPMI-1640;實(shí)驗(yàn)組：D1:10%NBS 的 RPMI-1640+終濃度 100mg/L化合物（I) ;D2:10%NBS的即RPMI-1640+終濃度200mg/L化合物（I) ;D3:10%NBS的 即RPMI-1640+終濃度400π^/1 化合物（I) ;D4:10%NBS的即RPMI-1640+終濃度800mg/L化合 物⑴。
[0039] 3、MTT法檢測(cè)化合物（I)對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響
[0040] (1)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用含10%NBS的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞配制成細(xì)胞 懸液，以5X103細(xì)胞/孔接種于無(wú)菌96孔培養(yǎng)板中。（2)依實(shí)驗(yàn)分組，每組加入不同濃度的藥 物50yL，設(shè)無(wú)細(xì)胞孔為空白對(duì)照組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，將96孔培養(yǎng)板放入C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (3) 24、48和72h后取出96孔培養(yǎng)板，每孔加入20yL MTT (5mg/mL)，放入C02培養(yǎng)箱中孵育4h， 即有紫藍(lán)色結(jié)晶物生成，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，結(jié)晶物的生成量與細(xì)胞數(shù)成正比。（4)每孔 加入酸化的SDS 1 OOyL放入C02培養(yǎng)箱中過(guò)夜。（5)用酶標(biāo)儀測(cè)定0D，比色時(shí)以空白孔調(diào)零。 [0041 ] 4、AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
[0042] (1)取生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞，用含10%NBS的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞配制成細(xì)胞懸 液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5X105/mL，接種于無(wú)菌6孔培養(yǎng)板，每孔2mL細(xì)胞。（2)依實(shí)驗(yàn)分組加 入不同濃度藥物，2mL/孔，將6孔培養(yǎng)板放入C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（3)48h和72h后收集各孔細(xì) 胞于離心管中，lOOOrpm離心5min，棄上清。（4)用4°C預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，（1500rpm，離 心5min)，棄上清，用200yL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，并移入流式管中。（5)每管加入5yL Annexinv-FITC混合后，加入5yL PI，混勻。（6)室溫，避光反應(yīng)10min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 [0043] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0044] 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均重復(fù)3次操作，結(jié)果用(x±s表示，P〈0.05示有顯著性差異。組間 比較采用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0045]三、結(jié)果及結(jié)論
[0046] 1、MTT法檢測(cè)化合物(I)對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用
[0047] 化合物（I)作用K562細(xì)胞24h、48h、72h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)0D49Q顯示:作用24h后D1和 D2實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞K562細(xì)胞抑制作用不明顯(P>0.05，P>0.05)，D3和D4可明顯抑制562結(jié)果(P 〈0.05，？〈0.01)，作用4811和7211后，不同濃度的化合物（1)均可抑制1(562細(xì)胞增殖，且隨劑量 和時(shí)間的增加抑制細(xì)胞增殖的作用增強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表1 (*:和對(duì)照比P〈〇. 05; :和對(duì)照KP〈 0·01)〇
[0048] 2、Annexinv-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀分析結(jié)果
[0049] 磷脂酞絲氨酸(Phosphotidyl Serine，PS)外翻是細(xì)胞凋亡的早期事件。AnnexinV 是一種Ca2 +依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。先后標(biāo)記了FITC和PI (Propidium Iodide)的雙染細(xì)胞，可通過(guò)流式細(xì)胞儀將活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞(雙參數(shù)散點(diǎn) 圖右下象限）、晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。結(jié)果表明不同濃度的化合物（I)作用K562 細(xì)胞48h和72h均可明顯誘導(dǎo)K562細(xì)胞早期凋亡，這種效應(yīng)隨化合物（I)的濃度增加和作用 時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表2(*:和對(duì)照比P〈0.05;#:和對(duì)照比P〈0.01)。
[0050] 結(jié)論，化合物（I)可直接抑制K562細(xì)胞的增殖，抑制能力隨濃度的增加和作用時(shí)間 的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。同時(shí)，化合物（I)可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，且這種促凋亡的效應(yīng)隨著濃度和時(shí) 間的增加而增加。研究結(jié)果顯示，化合物（I)可能為慢性粒細(xì)胞白血病的治療提供一種潛在 的手段。
[0051 ] 表1不同濃度的化合物（I)作用K562細(xì)胞后的MTT值(X土s，N=8)
[00521
[0053] 表2不同濃度化合物（I)作用K562細(xì)胞后早期凋亡率(X土s，N=3)
[0054]
[0055] 實(shí)施例3
[0056] 片劑的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的 比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0057] 實(shí)施例4
[0058] 口服液制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服 液。
[0059] 實(shí)施例5
[0060] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒 石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0061 ] 實(shí)施例6
[0062] 注射液的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾， 灌封滅菌制成注射液。
[0063] 實(shí)施例7
[0064] 無(wú)菌粉針的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無(wú)菌注射用水 中，攪拌使溶，用抽濾漏斗過(guò)濾，無(wú)菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無(wú)菌熔封得粉針 劑。
[0065] 上述實(shí)施例的作用在于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種巧樣苦素類化合物在制備治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用，其特征在 于:具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I)，2. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述化合物（I)從吳榮英的干燥近成熟果實(shí)中分 離得到，具體包含W下操作步驟： (a) 將吳榮英的干燥近成熟果實(shí)粉碎，用80~90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮 至無(wú)醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸 乙醋萃取物和正下醇萃取物； (b) 步驟(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用 75%乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏； (C)步驟(b)中75%乙醇洗脫物浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、55:1、35: 1、15:1和1:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分； (d) 步驟k)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和10:1的二氯 甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分； (e) 步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為80%的 甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:步驟(a)中，用85%乙醇熱回流提取，合并 提取液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。5. -種藥物組合物在制備治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用，其特征在于:該藥 物組合物含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物(I)和藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號(hào)】A61P35/02GK106083975SQ201610392074
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月3日 公開(kāi)號(hào)201610392074.3, CN 106083975 A, CN 106083975A, CN 201610392074, CN-A-106083975, CN106083975 A, CN106083975A, CN201610392074, CN201610392074.3
【發(fā)明人】吳芊葭
【申請(qǐng)人】吳芊葭