提取蛋白質的方法
【專利摘要】本公開內容提供了用于從微生物群體提取可溶性蛋白質的方法，所述方法包括使表達所述可溶性蛋白質的微生物群體與一定量的溶液接觸，所述溶液包含有效地從所述微生物群體提取所述可溶性蛋白質的約1％(體積/體積)至小于50％(體積/體積)的羧酸。
【專利說明】
提取蛋白質的方法
[0001] 相關的申請數(shù)據(jù)
[0002] 本申請要求于2013年9月24日提交的標題為"Method of extracting protein"的 澳大利亞臨時專利申請No. 2013903669的優(yōu)先權。該申請的全部內容通過引用并入本文。
技術領域
[0003] 本公開內容涉及用于從微生物提取蛋白質的方法。
【背景技術】
[0004] 微生物允許在相對短的時間段內以高水平產生重組蛋白質。此外，可相對容易地 對許多微生物進行遺傳修飾從而以高水平表達目的蛋白質。因此，微生物是為了產生用于 工業(yè)應用(例如，用于治療或診斷或美容應用）的蛋白質所選擇的細胞類型之一。
[0005] 對于許多應用，必須提取微生物中表達的蛋白質并純化到至少某種程度。為了純 化這些蛋白質，常常需要使用本領域已知的方法(例如勻漿化或化學裂解)來裂解細胞。然 而，通過這些方法釋放蛋白質還導致從該微生物釋放大量另外的蛋白質以及核酸、脂質、內 毒素和其他細胞組分。尤其是在對在微生物內可溶的蛋白質而非包含在聚集體或包涵體中 的蛋白質進行純化的情況，因為許多污染物在微生物內也是可溶的。這些污染性蛋白質和 其他物質常常與目的蛋白質一起被提取。因此，隨后必須純化目的蛋白質以除去這些污染 物。較高濃度的污染物可能需要更多個純化步驟和/或更多種試劑，導致產生純化的蛋白質 的成本增加。
[0006] 傳統(tǒng)的蛋白質提取方法也常常使用昂貴且常常高度易燃的有機溶劑，因此需要用 于密閉、防火、防爆和處置的專用設備。因此，期望不使用這樣的溶劑，特別是當純化大量的 蛋白質時。
[0007] 使用苛刻的有機溶劑還可能需要在提取過程中不被降解或腐蝕的專用設備?；?者，提取方法中使用的設備由于降解/腐蝕必須定期更換。
[0008] 用于從微生物中提取蛋白質的一些方法還也使用酶，例如溶菌酶。然而，難以使用 這些方法從大量的細胞提取蛋白質，原因是溶菌酶添加效率低下且難以將該酶分散遍布大 細胞團塊中。
[0009] 根據(jù)上文，對于本領域技術人員顯而易見的是，期望允許從微生物提取蛋白質并 降低來自細胞的核酸和/或脂質和/或內毒素和/或其他細胞蛋白質的污染水平的方法。理 想地，所述方法允許當沉淀污染物時，待提取的蛋白質處于可溶的形式。

【發(fā)明內容】

[0010] 本公開內容是基于本發(fā)明人開發(fā)的允許提取蛋白質（例如，從微生物中提取可溶 性蛋白質）的方法，其中所述蛋白質保持可溶，同時來自所述微生物的大量的內源蛋白質、 核酸和/或脂質沉淀。該方法與一些其他方法相比，允許本發(fā)明人以更高的純度提取可溶性 蛋白質，同時提取與那些方法類似水平的蛋白質。因此，由本發(fā)明人產生的方法通過回收高 產率的具有降低的污染水平之蛋白質而有助于下游純化步驟。如本文所例證的，本發(fā)明人 已經(jīng)使用多種羧酸來從細菌(例如，大腸桿菌(Escherichia coli))提取可溶性蛋白質。這 些結果通常被用作微生物的模型。
[0011]在一個實例中，發(fā)明人已使用足夠低濃度的羧酸(例如，小于約50%的羧酸）以高 水平的純度提取了可溶性蛋白質，所述方法可以用標準設備來進行。本發(fā)明人產生的方法 的一些實例允許提取的蛋白質直接施加到過濾器上，例如，在切向流過濾或深度過濾中常 用的過濾膜，而無需添加降低損壞過濾器之風險的緩沖劑。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，將羧酸(例如， 乙酸）的濃度增加至高于約37%或50%或62%降低蛋白質的純度至(例如)小于當用約25% 的酸提取蛋白質時的純度。就這點而言，使用包含約25 %羧酸的溶液導致高水平的純度。使 用包含100%的羧酸的溶液進行提取導致用于進一步純化的足夠純的蛋白質，但是所述蛋 白質沒有用包含約25%的羧酸的溶液提取的蛋白質那么純。
[0012] 在另一個實例中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用約25%至約100%的羧酸提取所述蛋白質持 續(xù)多于約（例如)20分鐘或30分鐘對于提取的蛋白質的量影響不大。因此，本發(fā)明人已確定 可在相對較短的時間段內進行提取(如果需要的話）。
[0013] 從上文可明顯看出，本發(fā)明人已經(jīng)證明可以用羧酸提取可溶性蛋白質，所述羧酸 是廉價的且不需要用于處理、儲存和/或處置的專用設備。本發(fā)明人使用的示例性的羧酸是 乙酸。
[0014] 本發(fā)明人已經(jīng)表明多種濃度的羧酸在該方法中是有效的。本發(fā)明人還表明可通過 提高酸的體積與微生物的重量的比率來改進提取的蛋白質的量和/或提取的蛋白質的純 度。
[0015] 本發(fā)明人產生的方法不一定需要專用設備，例如，勻漿器或超聲波破碎儀 (sonicator)或苛刻的有機溶劑或酶(例如溶菌酶)來提取可溶性蛋白質。
[0016] 本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)為用于從微生物提取可溶性蛋白質的方法以及用于純化用于人 或非人動物的蛋白質的方法提供了基礎。
[0017] 基于以上討論，本公開內容提供了用于從微生物群體提取可溶性蛋白質的方法， 所述方法包括使表達可溶性蛋白質的微生物群體與溶液接觸，所述溶液包含一定量的有效 地從微生物群體提取可溶性蛋白質的羧酸。
[0018] 在一個實例中，所述羧酸是乙酸。
[0019] 在一個實例中，所述微生物群體與所述溶液接觸足夠的時間以提取可溶性蛋白 質。例如，使所述微生物群體接觸持續(xù)少于約48小時或24小時，或20小時，例如，少于約12小 時，例如少于約8小時或6小時。例如，使所述微生物群體接觸持續(xù)少于約2小時或1小時，例 如，約20分鐘至1小時。
[0020] 本公開內容提供了用于從微生物群體提取可溶性蛋白質的方法，所述方法包括使 表達所述可溶性蛋白質的微生物群體與一定量的溶液接觸，所述溶液包含有效地從微生物 群體提取可溶性蛋白質的約1 % (體積/體積)至約1 〇〇 % (體積/體積）的羧酸。例如，所述溶 液包含約1 %至約90 %或80 %或70 %或60 %或50 %的羧酸。例如，所述溶液包含約10 %至約 90 %或80 %或70 %或60 %或50 %的羧酸。例如，所述溶液包含約20 %至約90 %或80 %或 70%或60%或50%的羧酸。在一些實例中，所述方法包括使所述群體與這樣的溶液接觸，持 續(xù)如本文所述的指定時間段(例如，1小時或更少）。
[0021]本公開內容提供了用于從微生物群體提取可溶性蛋白質的方法，所述方法包括使 表達可溶性蛋白質的微生物群體與一定量的溶液接觸，所述溶液包含有效地從微生物群體 提取可溶性蛋白質的約1 % (體積/體積)至小于50 % (體積/體積)的羧酸。
[0022]在一個實例中，溶液包含約1 % (體積/體積)至約40% (體積/體積)的羧酸。
[0023]在一個實例中，溶液包含約1 % (體積/體積)至約37.5% (體積/體積)的羧酸。
[0024]在一個實例中，溶液包含約1 % (體積/體積)至約30% (體積/體積)的羧酸。
[0025] 在一個實例中，溶液包含約1 % (體積/體積)至約25% (體積/體積)的羧酸。
[0026] 例如，溶液包含約10% (體積/體積)至約40% (體積/體積)的羧酸。
[0027] 例如，溶液包含約10% (體積/體積)至約37.5% (體積/體積)的羧酸。
[0028]例如，溶液包含約10% (體積/體積)至約25% (體積/體積)的羧酸。
[0029]例如，溶液包含約20% (體積/體積)至約40% (體積/體積)的羧酸。
[0030] 例如，溶液包含約20% (體積/體積)至約37.5% (體積/體積)的羧酸。
[0031] 例如，溶液包含約25% (體積/體積)至約37.5% (體積/體積)的羧酸。
[0032] 本文描述了另外量的乙酸，并且認為在作必要改變的情況下適用于本公開內容的 本實例。
[0033]使用包含40 %或37.5 %或25 %或更少的羧酸的溶液有助于以更少的步驟進行下 游純化和/或降低成本。這是因為用于處理提取的蛋白質（例如，通過切向流過濾）的一些過 濾器可被高于40%或37.5%或25%的羧酸（例如，乙酸）水平損壞。被這些條件損壞的示例 性的過濾器包含復溶纖維素 (reconstituted cellulose)或聚醚砜或由其組成。
[0034] 本公開內容還提供了用于從微生物群體提取可溶性蛋白質的方法，所述方法包括 使表達可溶性蛋白質的微生物群體與一定量的溶液接觸，持續(xù)少于約20小時或15小時或10 小時或5小時或4小時或3小時或2小時或1小時，所述溶液包含有效地從微生物群體提取可 溶性蛋白質的羧酸。在一個實例中，使微生物群體與溶液接觸持續(xù)少于約1小時，例如，約10 分鐘至約1小時。在一個實例中，使微生物群體與溶液接觸約20分鐘至約1小時。
[0035] 本文描述了另外的提取時間，并且認為在作必要改變的情況下適用于本公開內容 的本實施例。
[0036] 在一個實例中，所述溶液包含約10 %至約100 %的羧酸，例如，約10 %至90 %或 80%或75%或70%或本文所述的量。
[0037] 在本公開內容的方法的一個實例中，以約1:1(酸的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù))至 約20:1 (酸的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù))的溶解比率添加所述羧酸。例如，以約5:1 (酸的毫 升數(shù):微生物(濕)的克數(shù))至約20:1(酸的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù)），例如至以約10:1(酸 的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù))的溶解比率添加所述羧酸。在本公開內容的一個示例性形式 中，以約9:1(酸的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù))的溶解比率添加所述羧酸。
[0038] 在一個實例中，將所述羧酸添加到未懸浮于溶液(例如細胞培養(yǎng)基）中的微生物。 例如，所述微生物已通過離心被沉淀。
[0039] 在一個實例中，將所述羧酸添加到包含微生物的溶液，例如，細胞培養(yǎng)基或其他溶 液，使得其包含約1 % (體積/體積)至小于50 % (體積/體積)的羧酸。
[0040] 羧酸對于本領域技術人員將是顯而易見的。示例性的羧酸列于表1。
[0041 ]在一個實例中，羧酸的pKa為至少約3。如本文所例證的，合適的羧酸包括乙酸或甲 酸。本發(fā)明人已經(jīng)示出，與尿素或氫氧化鈉或異丙醇相比，乙酸對于可用于以更高回收率 和/或純度水平提取可溶性蛋白質。
[0042]在一個實例中并且視情況而定，本文所述的根據(jù)任何實例的方法包括使微生物群 體與溶液接觸約5小時或更少，例如4小時或更少，例如3小時或更少或者2小時或更少。在一 個實例中，所述方法包括使微生物群體與于溶液接觸約1小時或更少。本領域的技術人員將 理解，該方法需要群體與酸進行實際接觸。因此，術語"或更少"意指至少1分鐘，例如，至少5 分鐘或10分鐘或15分鐘。
[0043]在一個實例中，所述方法還包括使微生物群體與洗滌劑，例如Tween(聚氧乙烯-山 梨糖醇單油酸酯，例如，Tween20或Tween80)或來自TritonX類洗滌劑(聚乙二醇對-(1，1，3， 3_四甲基丁基)_苯基醚)的洗滌劑接觸。在一個實例中，所述洗滌劑與羧酸一起添加。在一 個實例中，在羧酸之后添加洗滌劑。在一個實例中，在羧酸之前添加洗滌劑。
[0044] 在一個實例中，可溶性蛋白質是由微生物群體重組表達的。
[0045] 示例性的微生物包括細菌、酵母或真菌。示例性的微生物包括細菌，例如革蘭氏陰 性細菌，例如大腸桿菌。
[0046] 在一個實例中，可溶性蛋白質具有當從微生物群體提取該蛋白質時允許該蛋白質 保持可溶的pi。在一個實例中，蛋白質具有中性的pi，例如，約6至約8，例如，約6.5至約7.5。
[0047] 在另一個實例中，蛋白質具有堿性的pi。例如，可溶性蛋白質的pi為7.5或更大。在 另一個實例中，可溶性蛋白質的pi為約10.4。
[0048] 在另一個實例中，蛋白質具有酸性的pi。例如，蛋白質的pi為約6.5或更小。在另一 個實例中，蛋白質的pi為6或更小或者5.5或更小。例如，蛋白質的pi為5或更小。例如，蛋白 質的pi為約4.7或更小，例如，約4.65或4.6。
[0049] 在一個實例中，蛋白質選自硬蛋白、伴侶蛋白、熱休克蛋白、肽(例如，利尿鈉肽）以 及包含抗體的可變結構域的蛋白質。
[0050] 在一個實例中，所述蛋白質是融合蛋白。例如，所述蛋白質包含肽或多肽的多個拷 貝（例如，兩個或三個拷貝）。在另一個實例中，所述蛋白質包含彼此融合的兩個多肽，例如， 肽或多肽與幫助純化的標簽(例如，六-組氨酸標簽)或抗體(例如，IgGl抗體)的Fc區(qū)融合。
[0051] 在一個實例中，所述方法還包括將包含可溶性蛋白質的溶液與微生物群體的不溶 性組分分離。例如，所述方法還包括離心和/或過濾溶液并通過離心回收可溶性級分(例如， 上清液）。
[0052] 本公開內容還提供了用于從微生物群體純化可溶性蛋白質的方法，所述方法包括 執(zhí)行如本文所述的用于提取蛋白質的方法以及純化通過所述方法提取的可溶性蛋白質。 [0053]在一個實例中，本文所述的方法還包括修飾經(jīng)純化或經(jīng)提取的蛋白質。例如，通過 將所述蛋白質與另一個蛋白質綴合或將其切割(例如，以除去標簽和/或切割融合蛋白內的 肽的多個拷貝）而對其進行修飾。
[0054]本公開內容還提供了用于產生經(jīng)修飾的蛋白質的方法，所述方法包括獲得通過如 本文所述的方法純化的蛋白質或通過如本文所述的方法提取的蛋白質以及并修飾所述蛋 白質。在一個實例中，修飾所述蛋白質包括使另一個化合物與所述蛋白質綴合。在另一個實 例中，修飾所述蛋白質包括使其與蛋白酶接觸，從而切割所述蛋白質。
[0055]在一個實例中，如本文所述的方法還包括將治療性蛋白質配制成藥物組合物或化 妝品組合物（cosmetic composition)或獸醫(yī)用組合物（veterinary composition) 〇
[0056]在一個實例中，如本文所述的方法還包括將所述蛋白質固定到固體支持物或半固 體支持物上或者固體支持物或半固體支持物中。示例性的支持物是貼劑和/或植入物和/或 醫(yī)療裝置。
[0057]本公開內容還提供了用于產生藥物組合物或化妝品組合物或獸醫(yī)用組合物的方 法，所述方法包括獲得通過本文所述的方法提取、純化或產生的蛋白質并將所述蛋白質配 制成藥物組合物或化妝品組合物或獸醫(yī)用組合物。
[0058] 本公開內容還提供了用于產生固體或半固體支持物的方法，所述方法包括獲得通 過根據(jù)任何實例的本文所述的方法提取、純化或產生的蛋白質，并將所述蛋白質固定到固 體支持物或半固體支持物上或者固體支持物或半固體支持物中。
[0059] 在一個實例中，所述組合物、固體支持物或半固體支持物是用于向人或非人動物 施用或應用，或者在人或非人動物上施用或應用。
[0060] 在一個實例中，所述組合物、固體支持物或半固體支持物用作藥物或用作化妝品。
[0061] 在一個實例中，所述組合物、固體支持物或半固體支持物用于藥物用途、化妝品用 途、藥物化妝品用途(cosmaceutical use)、獸醫(yī)用途或用于植入。
[0062] 在一個實例中，所述組合物、固體支持物或半固體支持物是用于經(jīng)口、通過植入、 皮內、肌內、皮下、靜脈內、動脈內、肌內、作為氣霧劑或眼內施用。
[0063] 本公開內容還提供通過執(zhí)行本文所述的方法而產生的蛋白質或組合物或固體支 持物或半固體支持物。
[0064] 在一個實例中，所述蛋白質(包括經(jīng)修飾的蛋白質）、組合物、固體支持物或半固體 支持物是用于制藥用途、化妝品用途、藥物化妝品用途、獸醫(yī)用途或用于植入。在一個實例 中，所述組合物是藥物組合物。在一個實例中，所述組合物是化妝品組合物。本文所述的方 法還可用于生產用于培養(yǎng)或固定細胞(例如，干細胞或祖細胞或皮膚細胞）的支架或用于生 產用于工業(yè)應用(例如，在食品或紡織工業(yè)中）的酶。
[0065] 本公開內容還提供了包含如本文所述的蛋白質、組合物、固體支持物或半固體支 持物的裝置。在一個實例中，所述裝置是注射器、貼劑(patch)或植入物。
【附圖說明】
[0066]圖1是示出了從大腸桿菌(E.coli.)提取重組蛋白質的多種處理的聚丙烯酰胺凝 膠電泳分析結果之照片圖像副本。泳道1，大小標準;泳道2，15mM NaOH提取;泳道3,0.57(體 積/體積）乙酸提取(室溫）；泳道4,0.57%(體積/體積）乙酸提取(4°〇;泳道5，10%(重量/ 體積）甲酸提取;泳道6，尿素提取;泳道7，正丙醇提取。
[0067] 圖2是示出了從大腸桿菌提取重組蛋白質的多種處理的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析 結果之照片圖像副本。泳道1，大小標準;泳道2，10% (體積/體積）乙酸提取;泳道3,5% (體 積/體積)乙酸提取;泳道4，2 % (體積/體積)乙酸提取;泳道5，尿素提取。
[0068] 圖3是示出了乙酸的濃度(體積/體積）、溶解比率和每升發(fā)酵物回收的重組蛋白質 的量(g)之間關系的圖示。
[0069] 圖4是示出了乙酸的濃度(體積/體積）、溶解比率和提取的重組蛋白質的純度之間 的關系的圖示。
[0070] 圖5是示出了表達重組蛋白質的大腸桿菌的提取物之SDS-PAGE分析結果之照片圖 像副本。使用如在該圖的上方所示的不同濃度的乙酸(體積/體積)產生提取物。
[0071] 圖6是示出了如使用RP-HPLC測定的大腸桿菌的提取物中重組蛋白質的產率和純 度的圖示。使用如所示的不同濃度的乙酸(體積/體積)產生提取物。
[0072]圖7包括兩個圖示，其示出了如使用RP-HPLC測定的大腸桿菌的提取物中重組蛋白 質的產率(左側圖）和純度(右側圖）。使用如所示的不同濃度的乙酸(體積/體積）以及在不 同的時間段內產生提取物。
[0073]圖8是示出了表達重組蛋白質的大腸桿菌的提取物的SDS-PAGE分析結果之照片圖 像副本。使用如在該圖的上方所示的不同濃度的乙酸(體積/體積)在20分鐘的時間內產生 提取物。
[0074]圖9是示出了表達含有肽的多個拷貝的重組融合蛋白質的大腸桿菌提取物SDS-PAGE分析結果之照片圖像副本。泳道1，大小標準;泳道2,細胞裂解物;泳道3,25% (體積/體 積）乙酸提取。
【具體實施方式】 [0075] 一般定義
[0076] 在整個本說明書中，除非另有明確說明或上下文另有要求，否則提及單個步驟、物 質組合(composition of matter)、步驟的組或物質組合的組應認為包含一個或多個（即， 一個或更多個)這些步驟、物質組合、步驟的組或物質組合的組。
[0077] 本領域技術人員將理解，除了具體描述的那些之外，本公開內容易于進行多種變 化和修改。應理解，本公開內容涵蓋所有這樣的變化和修改。本公開內容還單獨地或共同地 包括本說明書中提及或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及所述步驟或特征的任 何兩個或更多個或者任何和所有的組合。
[0078] 本公開內容并不限于本文所述的具體實例的范圍，這些實例僅意在示例的目的。 功能等同的產物、組合物和方法顯然在本公開內容的范圍之內。
[0079] 除非另有明確說明，否則本文的任何實例都應認為在作必要改變的情況下 (mutatis mutandis)適用于任何其他實施方案。
[0080] 除非另有明確定義，否則應認為本文使用的所有技術和科學術語具有如本領域 (例如，在細胞培養(yǎng)、分子遺傳學、免疫學、免疫組織化學、蛋白質化學和生物化學中）普通技 術人員通常理解的相同含義。
[0081] 除非另外指明，否則本發(fā)明中使用的重組蛋白質和細胞培養(yǎng)技術是本領域技術人 員已知的標準方法。在貫穿以下來源的文獻中描述并解釋了這樣的技術，例如，J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley和Sons(1984)，J·Sambrook等 .Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)，T.A.Brown(編輯），Essential Molecular Biology:A Practical Approach，第1 卷 和第2卷，IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(編輯），DNA Cloning:A Practical Approach，1-4卷，IRL Press(1995 和 1996)，以及F.M.Ausubel 等（編輯），Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub·Associates和Wiley-Interscience (1988，包括目前為止所有的更新）D
[0082]術語"和/或"，例如，"X和/或Y"應被理解為意指"X和Y"或"X或Y"并且應認為其為 兩種含義或任一含義提供了明確的支持。
[0083]在整個本說明書中，詞語"包括"或變體例如"包含"或"含有"應被理解為暗示包含 所述元素、整體或步驟，或者元素、整體或步驟的組，但并不排除任何其他的元素、整體或步 驟，或元素、整體或步驟的組。
[0084]如本文使用的術語"來自"應被認為表示從指定來源獲得的特定整體，但是不是必 需從該來源直接獲得。
[0085] 選定的定義
[0086]術語"提取"意指從表達可溶性蛋白質的微生物移出可溶性蛋白質。在一些實例 中，提取可溶性蛋白質是將蛋白質(例如)與在提取之前微生物中存在的其他物質或組分的 至少約10 %、約20 %、約30 %、約40 %、約50 %、約60 %、約70 %分離。
[0087]如本文使用的術語"可溶性蛋白質"將被理解為意指當在微生物(例如，微生物的 胞質溶膠或周質內）中表達時，蛋白質是可溶的形式。例如，所述蛋白質在細胞的胞質溶膠 或周質中不形成不溶性聚集體，例如，包涵體。
[0088] 術語"微生物"對本領域技術人員是顯而易見的，如指任何微小單細胞的或多細胞 的生物體。示例性的微生物是單細胞的。在本公開內容的方法中有用的微生物的實例包括 酵母、真菌和細菌。
[0089] 術語"微生物群體"包括在培養(yǎng)或發(fā)酵過程中產生的微生物。在一個實例中，在培 養(yǎng)物中的微生物源自一個克隆，即，是克隆的。例如，細胞在遺傳上基本上相同，除了在培養(yǎng) 過程中產生的突變。
[0090] 如本文使用的術語"羧酸"涵蓋包含至少一個羧基基團的任何有機酸，包括表1中 列出的羧酸。在一個實例中，羧酸的pKa大于2或2.5或3或3.5或3.6或3.7或3.8或3.9或4或 4.1或4.2或4.3或4.4或4.5。例如，羧酸是乙酸或甲酸或檸檬酸或乳酸或尿酸或苯甲酸或氯 乙酸或丙酸。在一個實例中，羧酸是甲酸或乙酸或苯甲酸或丙酸。在一個實例中，羧酸是乙 酸或苯甲酸或丙酸。在一個實例中，羧酸是乙酸。
[0091] 本領域技術人員將理解術語"％ (體積/體積)"（同義詞"體積百分比"或"體積百分 比的體積"）將被理解為通過式（（溶質(羧酸)的總體積/溶液的總體積）X 100%)所計算的。
[0092] 術語"濕重"僅意指沒有首先干燥微生物而測量的微生物群體的重量。例如，微生 物的重量是在從細胞培養(yǎng)物收獲后(例如，通過離心和/或過濾)測定的，但是沒有干燥所述 細胞。
[0093] 根據(jù)本文所述，術語"溶解比率"的含義對于本領域技術人員將是顯而易見的。特 別地，該術語指的是包含羧酸的溶液的體積與微生物群體的濕重的比率。
[0094] 羧酸
[0095] 如本文中所討論的，本公開內容考慮使用任何羧酸來從細胞提取可溶性蛋白質。
[0096] 在一個實例中，所述羧酸具有足夠低的pKa值以允許當以本文所討論的％ (體積/ 體積)使用時進行提取。
[0097] 在一個實例中，所述羧酸具有足夠高的pKa值，當以約1 %至小于50 %，例如以1 % 至約37.5%的％ (體積/體積)使用時，其不損壞用于提取蛋白質的設備，例如，反應容器。 [0098]示例性的羧酸及其pKa列于表1中。
[0099] 表1:示例性的羧酸及其pKa
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[0101]
[0102]
[0103] 在一個實例中，羧酸的pKa大于2。例如，羧酸是戊酸、三甲基乙酸、檸檬酸、異檸檬 酸、己二酸、adiparn i c酸、己酸、2-溴苯甲酸、3-溴苯甲酸、2-氯苯甲酸、3-氯苯甲酸、4-氯苯 甲酸、2-碘苯甲酸、3-碘苯甲酸、喹啉酸、苯甲酸、庚酸、辛酸、甲酸、溴乙酸、氯乙酸、碘乙酸、 硫代乙酸、乙酸、乙醇酸、丙烯酸、丙酸、乳酸、甘油酸、草酰乙酸、乙酰乙酸、琥珀酸、蘋果酸、 丁酸、2-甲基丙酸、3-羥基丁酸、4-羥基丁酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、尿酸、戊二酸或1-谷 氨酸。
[0104] 在一個實例中，羧酸的pKa小于3。例如，羧酸是甲酸、碘乙酸、硫代乙酸、乙酸、乙醇 酸、丙烯酸、丙酸、乳酸、甘油酸、乙酰乙酸、琥珀酸、蘋果酸、丁酸、2-甲基丙酸、3-羥基丁酸、 4-羥基丁酸、4-氨基丁酸、尿酸、戊二酸、戊酸、三甲基乙酸、檸檬酸、異檸檬酸、己二酸、 adiparni c酸、己酸、3-氯苯甲酸、4-氯苯甲酸、3-碘苯甲酸、苯甲酸、庚酸或辛酸。
[0105] 在一個實例中，羧酸的pKa大于4。例如，羧酸是乙酸、丙烯酸、丙酸、琥珀酸、丁酸、 2-甲基丙酸、3-羥基丁酸、4-羥基丁酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、戊二酸、戊酸、己二酸、己 酸、庚酸、辛酸或苯甲酸。
[0106] 在一個實例中，羧酸的pKa大于4.5。例如，羧酸是乙酸、丙酸、丁酸、2-甲基丙酸、3-羥基丁酸、4-羥基丁酸、戊酸、三甲基乙酸、adiparni c酸、己酸或辛酸。
[0107] 在一個實例中，羧酸是乙酸或甲酸。
[0108] 在本公開內容的一個示例性形式中，羧酸是乙酸。本發(fā)明人已經(jīng)表明這種酸提供 了優(yōu)異的提取性質（例如，產率和/或純度），甚至與另一種羧酸（甲酸)相比也是如此。該羧 酸也相對便宜（例如，與某些有機溶劑相比），且通常不需要用于處理、儲存或處置的專用設 備。
[0109] 在其中微生物群體與組合物接觸指定時間段之本公開內容的實例中，以約1 %至 小于100%的％ (體積/體積)使用羧酸。例如，以約1%至約95%的％ (體積/體積)使用羧酸。 例如，以約1 %至約90%的％ (體積/體積)使用羧酸。例如，以約1 %至約85%的％ (體積/體 積)使用羧酸。例如，以約1 %至約80 %的％ (體積/體積)使用羧酸。例如，以約1 %至約75 % 的％ (體積/體積)使用羧酸。例如，以約1 %至約70 %的％ (體積/體積)使用羧酸。例如，以約 1 %至約65 %的％ (體積/體積)使用羧酸。例如，以約1 %至約60 %的％ (體積/體積)使用羧 酸。例如，以約1 %至約55 %的％ (體積/體積)使用羧酸。
[0110] 在本公開內容的方法的一個實例中，以約1 %至約50%的％ (體積/體積)使用羧 酸。例如，以約1 %至約45%的％ (體積/體積)使用羧酸。例如，以約2%至約50%的％ (體積/ 體積）使用羧酸。例如，以約2 %至約40 %的％ (體積/體積）使用羧酸。例如，以約2 %至約 37.5 %的％ (體積/體積)使用羧酸。例如，以約3 %至約37.5 %的％ (體積/體積)使用羧酸。 例如，以約3%至約30%的％ (體積/體積)使用羧酸。例如，以約5%至約30%的％ (體積/體 積）使用羧酸。例如以約6 %至約30 %的％ (體積/體積）使用羧酸。例如，以約7 %至約30 % 的％ (體積/體積)使用羧酸。例如，以約8%至約30%的％ (體積/體積)使用羧酸。例如，以約 9%至約30%的％ (體積/體積)使用羧酸。例如，以約10%至約37.5%的％ (體積/體積)使用 羧酸。例如，以約1 〇 %至約25 %的％ (體積/體積)使用羧酸。例如，以1 %或2 %或5 %或10 % 或15%或17.5%或25%或37.5%的％(體積/體積)使用羧酸。例如，以25 %的％ (體積/體 積)使用羧酸。
[0111] 在一個實例中，使羧酸在不具有顯著的或可檢測的緩沖能力的溶液中稀釋。
[0112] 在一個實例中，將羧酸在水中稀釋。
[0113] 在一個實例中，含有羧酸的溶液的pH為2至6,例如，2至5,例如2至4。例如，含有羧 酸的溶液的pH值為2至3。在一個實例中，含有羧酸的溶液的Η為2至2.5。
[0114] 提取
[0115]在一個實例中，以約1:1 (酸的毫升數(shù):微生物(濕）的克數(shù))至約20:1 (酸的毫升數(shù)： 微生物(濕)的克數(shù))的溶解比率添加羧酸。例如，以約2:1 (酸的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù)） 至約15:1 (酸的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù))的溶解比率添加羧酸。例如，以約3:1 (酸的毫升 數(shù):微生物(濕)的克數(shù))至約10:1 (酸的毫升數(shù):微生物(濕）的克數(shù)）的溶解比率添加羧酸。 以約5:1(酸的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù))至約10:1(酸的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù))的溶 解比率添加羧酸。例如，以約5:1 (酸的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù))或約6:1 (酸的毫升數(shù):微 生物(濕）的克數(shù))或約7:1(酸的毫升數(shù):微生物(濕）的克數(shù))或約8:1(酸的毫升數(shù):微生物 (濕)的克數(shù))或約9:1(酸的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù))的溶解比率添加羧酸。
[0116] 在本公開內容的一個示例性形式中，以約9:1(酸的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù))的 溶解比率添加羧酸。
[0117] 對于本領域技術人員顯而易見的是，在一些實例中，需要在對微生物進行稱重之 前收獲微生物。用于收獲微生物的方法對于本領域的技術人員將是顯而易見的，且包括例 如，連續(xù)流動離心(例如，使用圓盤堆疊式(disc-stack)離心機，例如購自Alfa Laval或GEA Westfalia Separator Group GmbH的那些）、微過濾(microfiltration)或切向流過濾。
[0118] 在收獲之后可容易地確定微生物的重量?；蛘撸_定微生物的樣品的重量并使用 該重量來計算或估計全部微生物群體的重量。
[0119] 在一個替代性實例中，收獲微生物的培養(yǎng)物的樣品并稱重，并使用該重量來計算 或估計培養(yǎng)物中微生物的重量。然后向培養(yǎng)物直接添加所需量的含有羧酸的溶液。
[0120] 在另一個實例中，基于向培養(yǎng)物(例如，培養(yǎng)基和進料）中添加的每種組分的已知 重量來估計微生物的培養(yǎng)物的重量，并且使用這些重量來計算或估計培養(yǎng)物中微生物的重 量。然后向培養(yǎng)物直接添加所需量的含有羧酸的溶液。
[0121] 在一個實例中，使微生物群體與溶液接觸一段時間并且置于足以提取可溶性蛋白 質的條件下。
[0122] 如本文以上所討論的，本發(fā)明人已經(jīng)確定根據(jù)任何實例的本文公開的方法幫助從 微生物群體快速提取可溶性蛋白質。例如，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當將微生物群體與包含羧酸的溶液 接觸約20分鐘或約1小時或約20小時時，從微生物群體中提取了類似量的蛋白質。在一個實 例中，方法包括使微生物群體與包含羧酸的溶液接觸少于五小時或四小時或三小時或兩小 時。例如，方法包括使微生物群體與包含羧酸的溶液接觸一小時或更少，例如45分鐘或30分 鐘或20分鐘。本公開內容還考慮更長的提取時間。例如，使微生物群體與羧酸接觸約1小時 至約20小時，例如1至5小時，例如，1至3小時。在一個實例中，使微生物群體與羧酸接觸約1 小時。
[0123] 可將微生物群體與羧酸在2 °C至40 °C的溫度（例如4°C至約30 °C )下接觸，例如，在 室溫下。本領域技術人員將理解室溫將取決于進行提取的環(huán)境。例如，在制造設施中，溫度 可以是 16°C 至 26°C，例如 18°C 至 25°C，例如，19°C 或 20°C 或 21°C 或 22°C 或 23°C 或 24°C。
[0124] 可使用用于混合的標準技術來攪拌包含羧酸的溶液和微生物群體。
[0125] 在與羧酸接觸后，可從污染物中分離出含有可溶性蛋白質的溶液。例如，可使含有 羧酸的溶液、微生物群體和可溶性蛋白質進行離心和/或微過濾。然后回收含有可溶性蛋白 質的可溶性級分。
[0126] 在一個實例中，本文所述的提取方法不包括使微生物群體與無機酸接觸。
[0127] 在一個實例中，本文所述的提取方法不包括使微生物群體與除羧酸之外的有機溶 劑或水接觸。在一個實例中，所述方法不包括使微生物群體與醇(例如，丁醇或丙醇)接觸。
[0128] 在一個實例中，本文所述的提取方法不包括超聲破碎和/或勻漿化。
[0129] 在一個實例中，本文所述的提取方法不包括添加增溶劑（solubi 1 ization 6111^11〇61')例如聚乙稀亞胺、硫酸鎂(1^3〇4)、氯化鎂(18(]12)、硫酸|15([3 304)或氯化|丐 (CaCl2)0
[0130] 微生物
[0131] 適合用于表達根據(jù)本公開內容進行提取的可溶性蛋白質的微生物對于本領域技 術人員將是顯而易見的。例如，所述微生物是酵母、真菌或細菌。
[0132] 示例性的酵母包括巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、Pichia finlandica、喜 海藻糖畢赤酵母（Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醒畢赤酵母（Pichia membranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataea minuta,Pichia 1indneri)、Pichia opuntiae、耐熱畢赤酉孝母（Pichia thermo to 1 erans)、Pichia salict aria、Pichia guercuum、Pichia pi jperi、樹干畢赤酵母（Pichia stiptis)、甲醇畢赤酵母（Pichia methanolica)、畢赤酵母屬(Pichia sp ·)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、釀酒酵 母屬（Saccharomyces sp.)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、克魯維酵母菌屬 (Kluyveromyces sp ·)、乳酸克魯維酵母（luyveromyces lactis)和白色念珠菌（Candida albicans)〇
[0133] 示例性的絲狀真菌包括構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉（Aspergillus oryzae)、里氏木霉（Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、鏡抱菌屬（Fusar ium sp ·)、禾赤鏡抱（Fusar ium gramineum)、鏡抱霉 (Fusarium venenatum)和粗糖鏈抱霉（Neurospora crassa)。
[0134] 適合用于本公開內容的細菌包括古細菌和真細菌，特別是真細菌。例如，革蘭氏陰 性細菌，例如腸桿菌科在本公開內容的方法中是有用的。有用的細菌的實例包括埃希氏菌 屬（Escherichia)、腸桿菌屬（Enterobacter)、固氮菌屬（Azotobacter)、歐文氏菌屬 (Erwinia)、芽孢桿菌屬（Bacillus)、假單胞菌屬（Pseudomonas)、克雷伯氏菌屬 (Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、志 賀氏菌屬（511186113)、根瘤菌屬（1?1112〇1313)、透明顫菌屬（￥；[1^608(3；[113)和副球菌屬 (Paracoccus)0
[0135] 在一個實例中，微生物為大腸桿菌。合適的大腸桿菌宿主包括E.coli W3110(ATCC 27,325)、E.coli 294(ATCC 31,446或33,625)、E.coli B和E.coli XI 776(ATCC 31,537)。 這些實例是說明性的而不是限制性的。也可使用任何上述微生物的突變體細胞。當利用重 組表達的優(yōu)點時，可通過考慮微生物中表達載體的可復制性來選擇合適的微生物。例如，當 使用已知的質粒例如pBR322、pBR325、pACYC177或pK410時，大腸桿菌屬、沙雷氏菌屬或沙門 氏菌屬物種可適合用作宿主。
[0136] 當提取內源蛋白質時，選擇表達所述蛋白質的微生物是十分重要的。
[0137] 重組表達
[0138] 在一個實例中，可溶性蛋白質被重組（即使用重組方法/手段)表達。例如，在表達 構建體內將編碼可溶性蛋白質的核酸與啟動子有效地連接。表達構建體可被引入到微生物 中，在那里其可并入微生物的基因組或其中的質粒中或可保持游離(episomal)。在一些實 例中，表達構建體是表達載體。
[0139] 如本文使用的術語"啟動子"應以其最廣的范圍進行理解，并且包括基因組基因的 轉錄調控序列，包括精確的轉錄啟始需要的TATA盒或起始元件，可有或不具有另外的調控 元件(例如，上游激活序列、轉錄因子結合位點、增強子和沉默子），其例如應答發(fā)育和/或外 部刺激或以組織特異性方式改變核酸的表達。在本文的上下文中，術語"啟動子"還用于描 述重組的、合成的或融合的核酸或衍生物，其賦予、激活或增強與其有效地連接的核酸的表 達。優(yōu)選的啟動子可含有一個或更多個特異性調控元件的另外拷貝以進一步增強所述核酸 的表達和/或改變其空間表達和/或時間表達。
[0140] 如本文使用的術語"有效地連接"意指相對于核酸來定位啟動子以使核酸的表達 被該啟動子控制。
[0141] 術語"表達構建體"應以其最廣的范圍進行理解，并且包括這樣的核酸，其包含與 編碼可溶性蛋白質的核酸有效地連接的啟動子和表達該可溶性蛋白質的所需的任何其他 元件。
[0142] 術語"表達載體"指這樣的核酸，其包含與編碼可溶性蛋白質的核酸有效地連接的 至少一個啟動子和表達可溶性蛋白質所需的任何其他元件以及允許該載體在微生物中復 制的序列以及任選地編碼選擇標記的序列。在本發(fā)明的上下文中，應理解，表達載體可以是 質粒、噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒亞基因組或基因組片段或能夠以可表達形式保持和/或復 制異源DNA的其他核酸。用于在多種細胞中進行表達的許多表達載體是可商購的。合適的載 體的選擇在本領域技術人員的知識范圍內。
[0143] 適合于在細菌細胞的病毒和細菌細胞（例如選自大腸桿菌屬、葡萄球菌屬 (Staphylococcus sp·)、棒桿菌屬(Corynebacterium sp·)、沙門氏菌屬、芽抱桿菌屬和假 單胞菌屬的細菌細胞）中表達的典型的啟動子包括但不限于:laez啟動子、Ipp啟動子、溫度 敏感型A L或1[?啟動子、T7啟動子、T3啟動子、SP6啟動子或半人工啟動子例如IPTG誘導型tac 啟動子或lacUV5啟動子。用于在細菌細胞中表達本發(fā)明的核酸片段的許多其他基因構建體 系統(tǒng)是本領域中已知的并且在例如Ausubel等（在：Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience，ISBN 047 150338，1987)和/或Sambrook等（在：Molecular Cl oning: Mo 1ecular Cloning：A Laboratory Manual , Co 1d Spring Harbor Laboratories，New York，第三版2001)中進行了描述。
[0144] 已經(jīng)描述用于在細菌細胞中表達重組多肽的許多表達載體以及有效的核糖體結 合位點，例如，PKC30(Shimatake和Rosenberg，Nature 292，128，1981) ;pKK173_3(Amann和 Brosius，Gene 40,183,1985)，pET-3(Studier和Moffat，J Mol.Biol.189,113,1986);pCR 載體套件（Invitrogen)、pGEM_T Easy載體(Promega)、pL表達載體套件（Invitrogen)、包含 阿拉伯糖誘導型啟動子的pBAD/TOPO或pBAD/thi〇-T0P0載體系列（Invitrogen，Carlsbad， CA)，其中后者被設計為還產生具有Trx環(huán)的融合蛋白用于對所表達的蛋白質進行構象約 束;pFLEX表達載體系列（Pfizer nc，CT，USA);pQE表達載體系列（QIAGEN，CA，USA)，或PL表 達載體系列（Invitrogen)等。
[0145] 適于在酵母細胞（例如，選自包含巴斯德畢赤酵母、釀酒酵母和粟酒裂殖酵母 (S. pombe)的組的酵母細胞）中表達的典型的啟動子包括但不限于:ADH1啟動子、GAL 1啟動 子、GAL4啟動子、CUPI啟動子、PH05啟動子、nmt啟動子、RPR1啟動子或TEF1啟動子。
[0146] 用于在酵母細胞中表達的表達載體包括但不限于:pACT載體(Clontech)、pDBleu- X載體、pPIC載體套件（Invitrogen)、pGAPZ載體套件（Invitrogen)、pHYB載體 (Invitrogen)、pYDl載體（Invitrogen)和pMVITl、pMVIT41、ρΝΜΤ81 Τ0Ρ0載體（Invitrogen)、 pPC86_Y載體（Invitrogen)、pRH載體系列（Invitrogen)、pYESTrp載體系列（Invitrogen)。 許多其他表達構建體及其使用方法在本領域中是已知的并且在例如在Giga-Hama和 Kumagai(在：Foreign Gene Expression in Fission Yeast：Schizosaccharomyces pombe，Springer Verlag，ISBN 3540632700，1997)以及Guthrie和Fink(在：Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology Academic Press, ISBN0121822540, 2002)中進行了描述。
[0147] 使用本領域已知的標準方法將表達構建體或表達載體引入微生物中。例如，如在 Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中描述的，使用多價陽離子(例如|丐）的處理通常用于含有堅實細 壁障礙的細菌細胞。用于轉化的另一種方法采用聚乙二醇/DMS0,如在Chung和Miller， Nucleic Acids Res.，16:3580(1988)中描述的。其他方法包括電穿孔、使用陽離子脂質轉 染、病毒遞送和真菌的接合策略(mating strategies)。
[0148] 在產生重組的微生物后，將所述微生物在足以產生表達可溶性蛋白質的微生物群 體的條件下進行培養(yǎng)。因此，本發(fā)明的方法還涵蓋產生重組細胞和/或表達所述可溶性蛋白 質。
[0149] 將用于產生可溶性蛋白質的微生物培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，在其中啟動子可按照 例如在Sambrook等（同上)和/或Ausubel等（同上)一般描述的和/或為可商購的啟動子那樣 被誘導。也可包括除了碳、氮和無機磷酸鹽來源之外的適當濃度的任何其他必要的補充劑， 單獨地引入或作為與另一種補充劑或培養(yǎng)基的混合物(例如復合氮源）引入。培養(yǎng)基的pH可 以是約5至9的任何pH值，這主要取決于宿主生物體。對于可溶性蛋白質的積累，將微生物在 足以積累可溶性蛋白質的條件下培養(yǎng)。這樣的條件包括，例如，允許通過微生物表達和積累 蛋白質的溫度、營養(yǎng)物(nutrient)和細胞密度條件。此外，這樣的條件是在其下微生物可以 進行轉錄、翻譯以及從一個細胞區(qū)室向另一個細胞區(qū)室遞送蛋白質的基本細胞功能的那些 條件，如本領域技術人員已知的。
[0150] 在誘導型表達的情況下，例如，利用誘導型啟動子，通常培養(yǎng)細胞直到達到一定的 光密度，在該點啟動誘導(例如，通過添加誘導劑、通過耗盡阻抑物或培養(yǎng)基成分等）以誘導 編碼可溶性蛋白質的基因的表達。
[0151] 蛋白質
[0152] 本公開內容涵蓋在微生物中保持可溶的（例如，在細菌中不形成包涵體的)任何蛋 白質的提取。
[0153] 在一個實例中，可溶性蛋白質具有當從微生物群體提取蛋白質時允許蛋白保持可 溶的pi。
[0154] 在一個實例中，可溶性蛋白質的pi為約7.5或更大或者8或更大或者8.5或更大或 者9或更大或者9.5或更大或者10或更大或者10.5或更大或者11或更大或者11.5或更大或 者12或更大或者12.5或更大或13或更大。
[0155] 在一個實例中，可溶性蛋白質的pi為約6.5或更小或者6或更小或者5.5或更小或 者5或更少或者4.5或更小或者4或更少或者3.5或更或者3或更少或者2.5或更小或者2或更 小。例如，所述蛋白質的PI為約3至6，例如約4至5，例如約4.6。
[0156] 在一個實例中，可溶性蛋白質的pi為約7，例如，約6至7。
[0157] 用于確定或估計蛋白質的pi的方法對于本領域的技術人員將是顯而易見的。使用 如在Biel lqvist等Electrophoresis，14:1023-1031，1993中描述的方法可預測蛋白質的理 論pi〇在從貝勾自Swiss Institute of Bioinformatics之ExPasy Proteomics Server可得 的Compute pi工具中實現(xiàn)了由Bjellqvist等描述的算法。
[0158] 或者，使用等電點聚焦（isoelectric focusing，IEF)來測定蛋白質的pi。IEF包括 向固定的pH梯度（IPG)凝膠添加兩性電解質溶液。IPG是與pH梯度共聚合的丙烯酰胺凝膠基 質。電流通過所述凝膠，產生"正"陽極和"負"陰極端。帶負電荷的蛋白質在介質中通過pH梯 度朝"正"端移動而帶正電荷的蛋白質朝向"負"端移動。隨著蛋白質朝向其電荷的相反電極 移動，其移動通過變化著的pH梯度，直到達到某個點，在這個點中達到了所述蛋白質等電點 的pH。在該點處該蛋白質不再具有凈電荷（因為相關的官能團的質子化或去質子化），因此 在凝膠內不再繼續(xù)前進。
[0159] 在一個實例中，蛋白質用于治療目的，例如，在人中。示例性的蛋白質包括重組人 白介素-ll(〇preleukin;pI 11.85)、干擾素 （alfacon 1;ρΙ9)、干擾素 β(ΡΙ 8.9)、干擾素 γ、組織纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA)、尿激酶、奧曲肽（pi 8.29)或角質形成細胞生長因子(pi 10.42)。
[0160] 在一個實例中，蛋白質是干擾素，例如，干擾素 β。
[0161] 在一個實例中，蛋白質是白細胞介素，例如，淋巴因子，例如，IL-2。
[0162] 在一個實例中，蛋白質包含抗體的可變結構域。示例性的含有可變結構域的蛋白 質包括，例如，結構域抗體(例如，US6248516)、Fab片段、Fab'片段、F(ab'）片段、scFv(例如， 如在US5260203中描述的）、雙抗體、三抗體、四抗體或高階復合物（例如，如在W098/044001 和/或W094/007921中描述的）。例如，蛋白質是抗體的Fab片段。例如，蛋白質是阿昔單抗 (已13(^1；[1]^13)、蘭尼單抗（抑11；[13丨2111]^13)或賽妥珠單抗（〇61'1：〇1丨2111]^13)(其可與聚乙二醇綴 合以產生聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol))。
[0163] 在一個實例中，蛋白質是硬蛋白。例如，蛋白質是膠原（例如，I型膠原、II型膠原、 III型膠原、IV型膠原蛋白、V型膠原、VI型膠原、VII型膠原、VIII型膠原、IX型膠原、X型膠 原、XI型膠原或XII型膠原）、生腱蛋白（例如，生腱蛋白C或生腱蛋白X)、層粘連蛋白（例如， 層粘連蛋白α、層粘連蛋白β或層粘連蛋白γ)、肌原纖蛋白、ALCAM、玻連蛋白、飾膠蛋白聚 糖、基質gla蛋白、彈性蛋白、彈性蛋白原或覆膜蛋白。
[0164] 在一個實例中，蛋白質包含或具有卷曲螺旋結構。例如，蛋白質選自纖維蛋白原、 未交聯(lián)的角蛋白（表皮素）、肌球蛋白、原肌球蛋白和膠原。
[0165] 在另一個實例中，蛋白質是伴侶蛋白或熱休克蛋白。在一個實例中，蛋白質是I型 伴侶蛋白或II型伴侶蛋白。在Hill等，Genome Res. 14:1669-1675,2004中描述了示例性的 伴侶蛋白。在一個實例中，蛋白質是伴侶蛋白10,例如，如在US7618935中描述的。
[0166] 在另一個實例中，可溶性蛋白質是利尿鈉肽或其活性片段。
[0167] 在另一個實例中，可溶性蛋白質是蛋白質的免疫原性片段，例如，如在疫苗中使用 的。
[0168] 在一個實例中，蛋白質是融合蛋白。
[0169] 例如，這樣的融合蛋白可包含肽或多肽的多個拷貝，例如，以幫助大規(guī)模生產。
[0170] 在另一個實例中，融合蛋白包含標簽例如以幫助純化或檢測，例如，六-組氨酸標 簽。
[0171 ]在另一個實例中，融合蛋白包含彼此融合的兩個肽或多肽。例如，融合蛋白包含與 抗體(例如，IgG抗體）的Fc區(qū)融合的肽或多肽。例如，融合蛋白包含與抗體的Fc區(qū)融合的一 個或更多個（例如，兩個）血小板生成素受體結合結構域。例如，融合蛋白是羅米司亭 (romiplostim)〇
[0172]本文中提及的蛋白質包括該蛋白質的突變體，例如，包含一個或更多個保守氨基 酸替換、一個或更多個缺失和/或一個或更多個插入。在一個實例中，蛋白質包含少于20個 替換和/或缺失和/或插入。
[0173]蛋白質修飾
[0174]通過本公開內容的方法提取或回收的蛋白質可以被修飾，例如，通過與另一種化 合物綴合。
[0175] 例如，所述另一種化合物選自：放射性同位素、可檢測標記、治療性化合物、膠體、 毒素、核酸、肽、蛋白質，增加了對象中蛋白質的半衰期的化合物及其混合物。
[0176] 示例性的化合物列于表2中。
[0177] 表2.用于綴合的化合物。
[0178]
[0179] 蛋白質純化
[0180] 在一些實例中，本公開內容的方法包括另外地純化所述蛋白質。用于純化蛋白質 的多種方法是本領域中已知的。
[0181] 可使用例如，離子交換色譜、羥磷灰石色譜、氟磷灰石色譜、置換色譜、凝膠電泳、 透析、超濾或親和色譜來純化從微生物制備的蛋白質。這些技術在本領域中是已知的，并 且，在例如 Scopes(在：Protein pur if icat ion principles and practice，第三版，1994) 中進行了描述。取決于要回收的蛋白質，用于蛋白質純化的其他技術例如乙醇沉淀、反相 HPLC、在硅膠上的色譜、在肝素上的色譜、色譜聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀也是可用的。
[0182] 本領域技術人員還將意識到可修飾可溶性蛋白質以包含幫助純化或檢測的標簽， 例如，聚-組氨酸標簽，例如，六-組氨酸標簽、或流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)標簽、 或猿猴病毒5(Simian Virus 5，V5)標簽、或FLAG標簽、或谷胱甘肽S轉移酶(glutathione S_transferase，GST)標簽。優(yōu)選地，所述標簽是六-組氨酸標簽。然后使用本領域中已知的 方法(例如，親和純化)對所得的蛋白質進行純化。例如，通過以下純化包含六-組氨酸標簽 的蛋白質：使包含蛋白質的樣品與固定在固體或半固體支持物上的特異性地結合六-組氨 酸標簽的鎳-氨三乙酸(Ni-NTA)接觸，洗滌所述樣品以除去未結合的蛋白質，隨后洗脫結合 的蛋白質。
[0183] 制劑
[0184] 如本文所述提取和/或純化的蛋白質可以配制成組合物。例如，所述組合物可用于 胃腸外施用、局部施用（topical administration)、經(jīng)口施用、肌內施用、眼內施用、皮下施 用、局部施用（local administration)、氣霧劑施用、皮內施用或透皮施用以用于預防性或 治療性治療或美容治療。
[0185] 通常，治療有效量的蛋白質配制成用于向對象施用的組合物。短語"治療有效量" 指的是足以促進、誘導和/或增強對象中的治療或其他治療效果的量。如明顯可以看出，在 這樣的組合物中蛋白質的濃度可以廣泛變化，并且按照所選擇的特定施用方式和患者的需 求，主要基于流體體積、粘度、體重等進行選擇。根據(jù)疾病的類型和嚴重性，治療有效量可以 是約lyg/kg至150mg/kg的蛋白質，無論是例如通過一次或更多次單獨的施用或是通過連續(xù) 的輸注。通常日劑量可以是約1 yg/kg至10Omg/kg或更高。向患者施用的蛋白質的示例性劑 量是約0. lmg/kg患者體重至約10mg/kg患者體重。
[0186] 用于施用的組合物通常包含蛋白質溶解在可藥用載體(優(yōu)選水性載體）中的溶液。 可使用多種水性載體，例如，緩沖鹽水等。另一些示例性的載體包括水、鹽水、林格氏溶液、 葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可使用非水性載劑，例如，混合的油和油酸乙酯。脂質體 也可用作載體。載體可含有少量的提高等張性和化學穩(wěn)定性的添加劑，例如，緩沖劑和防腐 劑。所述組合物可包含如接近生理條件所需的可藥用的輔助物質，例如pH調節(jié)劑和緩沖劑、 毒性調節(jié)劑等，例如，乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。
[0187] 用于制備藥物組合物的技術在本領域中通常是已知的，如由Remingtor/ s Pharmaceutical Sciences，第16版，Mack Publishing Company，1980所舉例說明的。
[0188] 根據(jù)任何實施例由本文所述的方法提取、分離或產生的蛋白質也可固定到固體或 半固體支持物中或者固定到固體或半固體支持物上。示例性的半固體支持物通常是由材料 (通常是聚合物)制成的基質，其可通過酶或酸/堿水解降解或者通過溶解降解。一旦插入到 身體中，酶和體液便對所述基質發(fā)揮作用。緩釋的基質理想地是選自生物相容性材料，例如 脂質體、聚丙交酯（聚乳酸）、聚乙交酯（乙醇酸的聚合物）、聚丙交酯共-乙交酯（乳酸和乙醇 酸的共聚物)聚酸酐、聚（原酸)酯化〇17(〇1'1:11〇)68七61')、聚蛋白、透明質酸、膠原、硫酸軟骨 素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸）、 多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。
[0189] 示例性的固體支持物包括塑料、繃帶、縫線、支架、起搏器、耳蝸植入物或骨和/或 脊柱植入物。
[0190] 本文所述的組合物、半固體支持物和固體支持物可包含另外的組分。例如，另外的 組分是化合物(例如，蛋白質），其提供治療或美容益處或者增加所提取蛋白質的治療或美 容益處或者與所提取的蛋白質相互作用或結合例如以形成復合物。
[0191]本文所述的組合物、半固體支持物和固體支持物適用于多種用途，包括制藥、獸 醫(yī)、化妝品、藥物化妝品或用于植入或施用到對象上。半固體和固體支持物對于填充組織、 矯正組織缺損以及密封傷口是有用的。類似地，為組織基質的組合物可用于填充組織、矯正 組織缺損以及密封傷口。
[0192]可通過注射、植入、噴霧、擦拭、饒(pouring)、涂或接觸來施用本文所述的組合物、 固體支持物或半固體支持物。
[0193] 本公開內容還涵蓋包含通過本文所述的方法分離、提取或產生的蛋白質的醫(yī)療裝 置。術語"醫(yī)療裝置"涵蓋管理機構歸類為醫(yī)療裝置的任何物質組合。因此，該術語可涵蓋繃 帶和其他敷料、縫線、植入物、注射器、支架、無針頭噴射器和起搏器等。
[0194] 試劑盒
[0195] 本公開內容還提供了與用于本文所述的方法的說明書一起包裝的包含羧酸的試 劑盒。
[0196] 在一個實例中，試劑盒還包含用于產生表達待提取的可溶性蛋白質之微生物群體 的微生物。
[0197] 在另一個實例中，試劑盒包含產生表達待提取的可溶性蛋白質之微生物群體的微 生物和通過執(zhí)行本文所述的方法提取蛋白質的說明書。
[0198] 在另一個實例中，試劑盒包含通過執(zhí)行本公開內容的方法中提取的蛋白質。
[0199] 在另一個實例中，試劑盒包含根據(jù)本公開內容的固體支持物或半固體支持物或醫(yī) 療裝置。
[0200] 實施例
[0201] 以下的實施例證明不同的羧酸可用于從微生物(例如，大腸桿菌)提取可溶性蛋白 質（例如，重組可溶性蛋白質）。
[0202] 實施例1:用于提取重組蛋白質的不同方法的比較
[0203]測試了使用羧酸、正丙醇或尿素的方案從細菌細胞提取pi為約7.5且MW為約72kDa 的重組蛋白質的能力。
[0204]經(jīng)測試的提取方案為：
[0205] 1 · 1 OOmM(0 · 57 % (體積/體積））乙酸(室溫）；
[0206] 2 · 1 OOmM乙酸(0 · 57 % (體積/體積））（在4°C);
[0207] 3 · 2 · 2M( 10% (重量/體積））甲酸(4°C);
[0208] 4.60 % 正丙醇；
[0209] 5.15mM NaOH;和
[0210] 6.尿素提取溶液。
[0211] 表3示出了用每種溶液處理的細胞的重量。
[0212] 表3:處理組
[0213]
[0214] 向lg(濕重）細胞添加 5mL溶液并混合1小時。然后使用離心沉淀溶液并回收上清 液。
[0215] 將用15mM NaOH處理的細胞孵育15分鐘，之后添加 lOOyL 1M硼酸鹽(pH 8.0)以將 pH調節(jié)至約8.0，并使該溶液達到約20mM硼酸鹽。
[0216] 在處理后，使用hemovac干燥10yL的正丙醇提取液并重懸浮于13yL的十二烷基硫 酸鋰(LDS)樣品緩沖液中以加載到4-12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠上。對于所有其 他樣品，將l〇yL的上清液與3yL LDS樣品緩沖液混合，并加載到凝膠上。結果在圖1中示出。 [0217]結果表明NaOH或0.57% (體積/體積）乙酸沒有顯著程度地將重組蛋白質溶解。甲 酸提取液特異性溶解蛋白質，正丙醇也一樣。尿素溶解了許多細胞蛋白質導致圖1的過載結 果。尿素的結果也可能受到預期溶解的大量核酸的不利影響。
[0218]實施例2:重組蛋白質的乙酸提取
[0219]如實施例1中所證明的，可使用甲酸從大腸桿菌提取重組蛋白質。乙酸類似于甲 酸，到目前為止乙酸是相對較弱的羧酸。乙酸還是廉價的，其儲存、處理和處置是安全的。因 此，測試了乙酸從大腸桿菌提取實施例1中所述的重組蛋白質。
[0220] 在2%(體積/體積），？!12.71;5%(體積/體積），？!1值2.47;和10%(體積/體積），？!1 2.22條件下測試了乙酸。
[0221] 如下溶解細胞：
[0222] 2% 乙酸：1.12g(濕)細胞糊(cell paste)+5mL 2% (體積/體積）乙酸。
[0223] 5%乙酸：1.01g(濕)細胞糊+5mL 5% (體積/體積）乙酸。
[0224] 10%乙酸：1 g(濕)細胞糊+5mL 10% (體積/體積）乙酸。
[0225] 厘:1 .OSg(濕)細胞糊+5mL尿素緩沖液。
[0226]將樣品進行渦旋并用刮鏟（spatula)破壞細胞糊以使其混合。然后將樣品置于旋 轉混合器上混合約1.5小時。從每種樣品中取出lmL的樣品，并通過在Eppendorf?臺式離心 機中在14,000rpm下離心沉淀。取出10yL的上清液用于通過SDS-PAGE分析進行分析。結果示 于圖2。
[0227] SDS-PAGE分析表明乙酸溶解對于蛋白質是非常特異的，即來自細胞的其他蛋白質 沒有很大程度的溶解。這與用尿素提取相反。
[0228] 離心后，乙酸提取溶解易于沉淀且上清液的顏色為淺黃色。與此相反，在尿素提取 和離心后，上清液為暗黃色且具有軟的或"粘稠"的顆粒狀物。
[0229] HPLC分析表明在色譜圖上用2% (體積/體積）、5% (體積/體積）或10% (體積/體 積）乙酸洗脫提取的重組蛋白質與對照蛋白（即，使用另一種方法產生的）在相同的點上。這 些數(shù)據(jù)表明正確形成了該蛋白質并且不會出現(xiàn)被酸提取破壞。
[0230] HPLC和SDS-PAGE兩項分析表明10%乙酸提取比5%提取產生更多的重組蛋白質， 并且5%提取比2%提取產生更多。此外，乙酸提取的蛋白質比用尿素提取的蛋白質基本上 更純（如通過HPLC分析判斷的用10 %乙酸提取的70.6 %純度相對于尿素提取的48.6 %純 度)。
[0231]實施例3:乙酸提取條件的表征
[0232]為了確定乙酸濃度、孵育時間和溶解比率(mL酸：g濕細胞）的影響，開發(fā)了Box-Behnken設計?？紤]的因素有：
[0233]乙酸濃度（％體積/體積）：最小值= 10%，最大值= 25%
[0234]孵育時間（小時）：最小值=1，最大值=5
[0235] 溶解比率(mL酸/g濕細胞）：最小值=1，最大值=9
[0236] 測試的變量在表4中列出。
[0237] 表4.試驗設計
[0238]
[0239] 將所有的反應物均進行渦旋，并用玻璃巴斯德移液管將粘附到反應管的任何細胞 塊混合，之后放置在旋轉混合器上持續(xù)反應時間。
[0240] 對反應1進行取樣，然后返回旋轉混合器再持續(xù)19小時。
[0241] 在取樣之前渦旋反應物以確保溶液完全混合。在每個時間點，從反應中取出lmL的 溶液，在Eppendorf ?離心機中以14000rpm離心4分鐘，取出約500yL的上清液并儲存，之后通 過HPLC進行分析。結果總結于表5中。
[0242] 表5.提取的結果
[0243]
[0244] 結果還示于圖3和4中。
[0245] 結果表明乙酸在不同時間長度的孵育后能夠提取重組蛋白質，并且孵育時間基本 上不影響回收或純度。因此，這些結果證明，在所測試條件下細胞的裂解和/或蛋白質提取 快速發(fā)生，即，在1小時的裂解和/或提取水平類似于在3、5或20小時的水平。這似乎違反直 覺，原因是預期更長的孵育時間將導致更高水平的細胞裂解。結果還證明乙酸濃度和溶解 比率對產率(濃度:估計的回歸系數(shù)〇. 22;p<0.005;比率:估計的回歸系數(shù)0.16，p<0.05) 和純度(濃度:估計的回歸系數(shù)12.05;p<0.005,比率:估計的回歸系數(shù)13.65，p<0.005)具 有最強的影響。純度和產率兩者隨濃度和溶解比率的增加而增加。
[0246] 實施例4:乙酸的量對蛋白質回收率和純度的影響
[0247] 進行測定以確定不同的乙酸濃度和提取時間對從大腸桿菌提取的重組蛋白質的 量和蛋白質的純度的影響。測定了實施例1中表達相同蛋白質的細胞。
[0248] 使提取（使用乙酸濃度（％):25%、37.5%、50%、62.5%、75%、87.5%、100%)進 行完全（即，過夜提取20±4小時）。然后通過RP-HPLC分析上清液以及通過與參考標準的峰 面積和純度進行比較來測定提取的重組蛋白質的量和產生的純度。
[0249]圖5示出的SDS-PAGE分析表明，增加提取的乙酸濃度增加了重組蛋白質的水平，但 是提取的污染物水平也增加。
[0250] 使用RP-HPLC對提取物進行分析的結果示于表6中，這些數(shù)據(jù)表明，高于約62.5% 時，純度開始降低。
[0251] 表6:在過夜孵育后，如通過RP-HPLC分析的乙酸濃度對從大腸桿菌細胞提取重組 蛋白質的影響
[0252]
[0253]表6中列出的數(shù)據(jù)在圖6中以圖形示出，其示出乙酸濃度與重組蛋白質的產率之間 的相關性以及一旦達到閾值濃度，乙酸濃度與純度之間逆相關。
[0254] 在多個時間點（5分鐘、10分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘)取樣100yL如上所述制備 的反應物，立即離心并取出上清液。通過RP-HPLC分析上清液，并與參考標準進行比較以確 定量和純度。該分析的結果在表7和8以及圖7中示出。還進行SDS-PAGE分析以提供比較產生 的蛋白質的純度的正交方法，結果示于圖8中。
[0255] 表7:在5分鐘、10分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘孵育后，乙酸濃度對從大腸桿菌細 胞提取重組蛋白質的影響
[0256]
[0257] 表8:在5分鐘、10分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘孵育后，乙酸濃度對從大腸桿菌細 胞提取的重組蛋白質之純度的影響
[0258]
[0259]實施例5:使用乙酸提取融合蛋白
[0260]培養(yǎng)、收獲并冷凍表達融合蛋白的細菌細胞，所述融合蛋白包含肽的三個拷貝且 pI為約4.6。然后裂解細胞或通過使細胞與25 %乙酸(體積/體積）的溶液接觸1小時來提取 融合蛋白，離心并收集上清液。所得組合物的SDS-PAGE分析在圖9中示出。這些數(shù)據(jù)表明，用 乙酸進行提取基本上降低了宿主細胞蛋白質的污染。這些數(shù)據(jù)還說明，本文所述的提取方 法適用于融合蛋白和/或具有酸性pi的蛋白質。
【主權項】
1. 用于從微生物群體提取可溶性蛋白質的方法，所述方法包括使表達所述可溶性蛋白 質的微生物群體與一定量的溶液接觸，所述溶液包含有效地從所述微生物群體提取所述可 溶性蛋白質的約1 % (體積/體積)至小于50 % (體積/體積)的羧酸。2. 權利要求1所述的方法，其中所述溶液包含約1% (體積/體積)至約40% (體積/體積） 的羧酸。3. 權利要求1所述的方法，其中所述溶液包含約25% (體積/體積)至約37.5% (體積/體 積)的羧酸。4. 權利要求1至3中任一項所述的方法，其中以約1:1(酸的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù)） 至約20:1 (酸的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù))的溶解比率添加所述羧酸。5. 權利要求1至3中任一項所述的方法，其中以約5:1(酸的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù)） 至約10:1 (酸的毫升數(shù):微生物(濕)的克數(shù))的溶解比率添加所述羧酸。6. 權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述羧酸的pKa為至少約3。7. 權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述羧酸是乙酸或甲酸。8. 權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述羧酸是乙酸。9. 權利要求1至8中任一項所述的方法，其包括使所述微生物群體與所述溶液接觸約5 小時或更少。10. 權利要求1至8中任一項所述的方法，其包括使所述微生物群體與所述溶液接觸約1 小時或更少。11. 權利要求1至10中任一項所述的方法，其還使所述微生物群體與洗滌劑接觸。12. 權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述可溶性蛋白質是由所述微生物群體 重組表達的。13. 權利要求1至12中任一項所述的方法，其中所述微生物群體是細菌、酵母或真菌。14. 權利要求1至12中任一項所述的方法，其中所述微生物群體是細菌。15. 權利要求1至12中任一項所述的方法，其中所述微生物群體是革蘭氏陰性細菌。16. 權利要求1至12中任一項所述的方法，其中所述微生物群體是大腸桿菌 (Escherichia coli)〇17. 權利要求1至16中任一項所述的方法，其中所述可溶性蛋白質具有當從所述微生物 群體中提取所述蛋白質時允許所述蛋白質在所述溶液中保持可溶的pi。18. 權利要求1至17中任一項所述的方法，其中所述可溶性蛋白質的pi為7.5或更大。19. 權利要求1至17中任一項所述的方法，其中所述可溶性蛋白質的pi為6或更小。20. 權利要求1至19中任一項所述的方法，其中所述蛋白質選自：硬蛋白、利尿鈉肽、伴 侶蛋白、熱休克蛋白、白細胞介素、干擾素、融合蛋白和包含抗體之可變結構域的蛋白。21. 用于從微生物群體純化可溶性蛋白質的方法，所述方法包括執(zhí)行權利要求1至20中 任一項所述的方法以及純化由所述方法提取的所述可溶性蛋白質。22. 權利要求的21所述的方法，其還包括將所述可溶性蛋白質與另一種化合物混合。23. 權利要求1至22中任一項所述的方法，其還包括修飾經(jīng)純化的或經(jīng)提取的蛋白質。24. 用于產生經(jīng)修飾的蛋白質的方法，所述方法包括獲得通過權利要求21至23中任一 項所述的方法純化的蛋白質和修飾所述蛋白質，或者獲得通過權利要求1至20中任一項所 述的方法提取的蛋白質和修飾所述蛋白質。25. 權利要求23或24所述的方法，其中修飾所述蛋白質包括使另一種化合物與所述蛋 白質綴合。26. 權利要求21至25中任一項所述的方法，其還包括將所述蛋白質配制成組合物。27. 權利要求21至25中任一項所述的方法，其還包括將所述蛋白質固定到固體支持物 或半固體支持物上或者固體支持物或半固體支持物中。28. 用于產生組合物的方法，所述方法包括獲得通過權利要求1至25中任一項所述的方 法提取、純化或產生的蛋白質以及將所述蛋白質配制成組合物。29. 用于產生固體或半固體支持物的方法，所述方法包括獲得通過權利要求1至25中任 一項所述的方法提取、純化或產生的蛋白質，以及將所述蛋白質固定到固體支持物或半固 體支持物上或者固體支持物或半固體支持物中。30. 權利要求26至29中任一項所述的方法，其中所述組合物、固體支持物或半固體支持 物是用于向人或非人動物施用或應用，或者在人或非人動物上施用或應用。31. 權利要求26至31中任一項所述的方法，其中所述組合物、固體支持物或半固體支持 物是用于制藥用途、化妝品用途、藥物化妝品用途、獸醫(yī)用途或用于植入。32. 通過執(zhí)行包括執(zhí)行權利要求1至31中任一項所述的方法的過程產生的蛋白質、組合 物、固體支持物或半固體支持物。33. 權利要求32所述的蛋白質、組合物、固體支持物或半固體支持物，其用于醫(yī)學。34. 權利要求32所述的蛋白質、組合物、固體支持物或半固體支持物，其用于藥物用途、 化妝品用途、藥物化妝品用途、獸醫(yī)用途或用于植入。35. 治療病癥的方法，所述方法包括向有此需要的對象施用權利要求32所述的蛋白質、 組合物、固體支持物或半固體支持物。36. 權利要求32所述的蛋白質、組合物、固體支持物或半固體支持物在制造用于治療病 癥的藥物中的用途。37. 裝置，其包含權利要求32所述的蛋白質、組合物、固體支持物或半固體支持物。38. 權利要求35所述的裝置，其是注射器、貼劑或植入物。
【文檔編號】A61K38/00GK106068272SQ201480060010
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2014年9月24日 公開號201480060010.2, CN 106068272 A, CN 106068272A, CN 201480060010, CN-A-106068272, CN106068272 A, CN106068272A, CN201480060010, CN201480060010.2, PCT/2014/932, PCT/AU/14/000932, PCT/AU/14/00932, PCT/AU/2014/000932, PCT/AU/2014/00932, PCT/AU14/000932, PCT/AU14/00932, PCT/AU14000932, PCT/AU1400932, PCT/AU2014/000932, PCT/AU2014/00932, PCT/AU2014000932, PCT/AU201400932
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