胎兒健康狀態(tài)的無創(chuàng)性檢測的制作方法
【專利說明】
[0001] 交叉參考相關(guān)申請
[0002] 本發(fā)明要求2012年7月31日為申請日，中國專利申請?zhí)枮?01210271283. 4,發(fā)明 名稱為"用于確定胎兒健康狀態(tài)的方法"的權(quán)益，該申請的全部內(nèi)容為了所有目的通過引用 的方式并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及用于確定胎兒的健康狀態(tài)的無創(chuàng)性方法。具體地，本發(fā)明涉及通過在 來自懷孕女性的生物樣本中評估與外源性生物體相關(guān)的生物標志物而用于檢測胎兒健康 狀態(tài)的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 具有侵入性程序的常規(guī)產(chǎn)前診斷方法，如絨毛膜絨毛取樣和羊膜穿刺 術(shù)，對胎兒和母親均具有潛在風險?？梢圆捎迷袐D血清標志物和超聲波對胎兒 非整倍性進行無創(chuàng)性篩查，但其具有有限的靈敏度和特異性。Kagan等，Human R印roduction(2008)23:1968 - 1975;Malone 等，N Engl J Med(2005)353:2001 - 2011〇
[0005] 隨著DNA測序技術(shù)的發(fā)展，無創(chuàng)性檢測技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于某些疾病的臨床診 斷，從而提供一種新的并且有效的方法。無細胞胎兒DNA可以在孕婦外周血中被檢測到。Lo 等，Lancet 350:485487 (1997) ;Lo 等，Am. J. hum. Genet. 62:768-775 (1998)。盡管胎兒 DNA 的量在孕婦外周血中是低的，新一代的測序技術(shù)應(yīng)經(jīng)被成功地應(yīng)用于檢測針對胎兒疾病診 斷的基因異常。
[0006] 病毒、細菌、寄生蟲、真菌和其他病原體感染懷孕女性后可以對胎兒產(chǎn)生不良后 果，如流產(chǎn)、死產(chǎn)、和出生缺陷。馮&沈，婦產(chǎn)科學，（人民衛(wèi)生出版社，150-154頁）。懷孕 期間一些常見的臨床病原體感染為：HBV、HCV、HIV、TORCH(弓形蟲、風瘆病毒、巨細胞病毒、 和單純皰瘆病毒）、梅毒。
[0007] 目前，醫(yī)院里常用的用于檢測耶￥、!1(^、!11￥、1'(?01、和梅毒的方法主要是通過利用 基于酶聯(lián)免疫吸附（ELISA)的方法檢測懷孕女性的外周血中針對所述病原體的抗體而進 行評估的，從而間接反映所述懷孕女性的感染狀態(tài)。這些方法對檢測胎兒感染一般是無效 的。所述方法的一些局限性為：1)只有少數(shù)已知的病原體可以被檢測到；2)每一個病原體 需要相應(yīng)的抗體檢測試劑；3)所需要的血液量隨著所需檢測的病原體的數(shù)量而增加；4)這 些方法非常耗時；以及5)這些方法不利于批量測試。
[0008] 基于酶聯(lián)免疫吸附（ELISA)的方法最致命的缺陷在于其并不適合胎兒感染的判 斷。例如，TORCH檢測主要是通過以下而確定的：首先利用基于ELISA的方法評估孕婦外周 血中IgM和IgG，隨后確定所述懷孕女性的感染狀態(tài)并推斷對所述胎兒的可能影響。確定胎 兒感染有時需要進一步的測試，如針對IgM檢測的羊膜穿刺或胎兒核苷酸的PCR以確定所 述胎兒是否被所述病原體所感染。然而，羊膜穿刺具有1 %的流產(chǎn)風險，這是得其很難被懷 孕女性及其家庭成員所接受。由于IgM和IgG間接反映了機體的感染狀態(tài)，并且其抗體只 是在一定時間段內(nèi)產(chǎn)生于所述病原體，因此存在假陰性率。此外，由于不同的醫(yī)院使用不同 的檢測試劑盒，并且缺少統(tǒng)一的質(zhì)量控制標準，來自不同醫(yī)院的測試結(jié)果可能并不一致。測 試結(jié)果中的不一致降低了患者對于該檢測的信任度和接受度，這使得醫(yī)院不愿對懷孕婦女 使用基于ELISA的TORCH篩查方法。
[0009] 盡管最靈敏的直接檢測病原體存在的方法時病原體培養(yǎng)，但其非常耗時并具有較 高的失敗率。因此，還沒有看到病原體培養(yǎng)的大規(guī)模臨床應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供了用于胎兒健康狀態(tài)的無創(chuàng)性檢測方法，包含：在來自懷孕女性的生 物樣本中，評估至少一個來自外源性生物體的多核苷酸、多肽和/或小分子。
[0011] 因此，在一方面，本發(fā)明提供了一種用于確定胎兒的健康狀態(tài)的方法，所述方法包 含：a)在來自懷孕女性的生物樣本中，評估至少一個來自外源性生物體的多核苷酸、多肽 和/或小分子的同一"性和/或水平；b)分析所述外源性多核苷酸、多肽和/或小分子的所 述同一性和/或水平；以及c)確定所述胎兒的所述健康狀態(tài)，其中所述胎兒的所述健康狀 態(tài)為無 HBV感染。在一些實施方案中，一些胎兒的的健康狀況并非是外界生物的感染。在 一些實施方案中，所述小分子可以與宿主代謝相關(guān)。
[0012] 在一個實施方案中，所述胎兒是人類胎兒。在另一個實施方案中，所述分析是采用 至少1個正常對照進行的。在另一個實施方案中，所述生物樣本為選自由以下所組成的組： 血清、血液、積液、尿液、骨髓、腹水、盆腔沖洗液、胸腔積液、脊髓液、淋巴液、粘液、痰、唾液、 眼房水、鼻腔提取物、咽喉拭子、生殖道拭子、來自消化組織的細胞懸浮液、和糞便提取物。 在另一個實施方案中，所述外源性生物體為選自由以下所組成的組：病毒、細菌、真菌和寄 生蟲。在另一個實施方案中，所述健康狀態(tài)為選自由以下所組成的組：基因異常、和發(fā)育異 常。在一些實施方案中，所述生物樣本是從至少2、5、10、20、50、100、200、500或1000個懷 孕女性獲得的。
[0013] 在一個實施方案中，所述基因異常為胎兒非整倍性。在另一個實施方案中，所述胎 兒非整倍性為選自由13三體性、18三體性和21三體性所組成的組的常染色體異常。在一 些實施例中，所述胎兒非整倍性為選自由X0、XXX、XXY和XYY所組成的組的性染色體異常。
[0014] 在第二方面，本發(fā)明提供了一種用于鑒定胎兒的健康狀態(tài)的生物標志物的方法， 所述方法包含：a)在來自至少一個懷孕女性的生物樣本中，評估來自外源性生物體的多核 苷酸、多肽和/或小分子的同一性和/或水平；b)對所述外源性多核苷酸、多肽和/或小分 子的所述的同一性和/或水平進行統(tǒng)計學分析；以及c)如果統(tǒng)計學顯著相關(guān)性建立，則鑒 定所述非人類的多核苷酸、多肽或小分子作為針對所述健康狀態(tài)的生物標志物，其中，所述 胎兒的所述健康狀態(tài)為無 HBV感染，或所述生物樣本是從至少100個懷孕女性獲得的。在 一些實施方案中，所述胎兒的所述健康狀態(tài)為無所述外源性生物體感染。在一些實施方案 中，所述小分子可以與宿主代謝相關(guān)。
[0015] 在一些實施方案中，所述胎兒是人類胎兒。在一些實施方案中，所述統(tǒng)計分析是采 用至少1個正常對照進行的。在另一個實施方案中，所述生物樣本為選自由以下所組成的 組：血清、血液、積液、尿液、骨髓、腹水、盆腔沖洗液、胸腔積液、脊髓液、淋巴液、粘液、痰、唾 液、眼房水、鼻腔提取物、咽喉拭子、生殖道拭子、來自消化組織的細胞懸浮液、和糞便提取 物。在另一個實施方案中，所述外源性生物體為選自由以下所組成的組：病毒、細菌、真菌和 寄生蟲。在另一個實施方案中，述健康狀態(tài)為選自由以下所組成的組：基因異常、和發(fā)育異 常。
[0016] 在一個實施方案中，所述基因異常為胎兒非整倍性。在另一個實施方案中，所述胎 兒非整倍性為選自由13三體性、18三體性和21三體性所組成的組的常染色體異常。在一 些實施方案中，所述胎兒非整倍性為選自由XO、XXX、XXY和XYY所組成的組的性染色體異 常。
[0017] 在一些實施方案中，所述生物標志物為選自由以下所組成的組：小地老虎核型 多角體病毒（Agrotis ipsilon multiple nucleopolyhedrovirus)、假單胞桿菌菌體 FlO (Pseudomonas phage F10)、鼻疽菌體 Bcep22 (Burkholderia phage Bcep22)、腦心 肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus)、丙型肝炎病毒基因型 l(Hepatitis C virus genotype I)、腸桿菌菌體 M13 (Enterobacteria phage M13)、人類 1 型皰疼病毒（Human herpesvirus 1)、人類 7 型皰疼病毒（Human herpesvirus 7)、鯉皰疼病毒 3(Cyprinid herpesvirus)、葡萄球菌菌體37(Staphylococcus phage 37)、西縱色卷蛾顆粒體病 毒(Choristoneura occidentalis granulovirus)、棉鈴蟲裸病毒 2 (Helicoverpa zea nudivirus2)、和腸桿菌菌體Sf6〇
[0018] 在一些實施方案中，所述生物樣本是從至少2、5、10、20、50、100、200、500或1000 個懷孕女性獲得的。
[0019] 在第三方面，本發(fā)明提供了一種用于確定胎兒的健康狀態(tài)的方法，所述方法包含： a)評估利用本發(fā)明所公開的方法在來自懷孕女性的生物樣本中所鑒定出的至少一個生物 標志物的同一性和/或水平；b)分析所述生物標志物的所述同一性和/或水平；以及c)確 定所述胎兒的所述健康狀態(tài)。
[0020] 在一些實施方案中，所述胎兒是人類胎兒。在一些實施方案中，所述生物樣本為選 自由以下所組成的組：血清、血液、積液、尿液、骨髓、腹水、盆腔沖洗液、胸腔積液、脊髓液、 淋巴液、粘液、痰、唾液、眼房水、鼻腔提取物、咽喉拭子、生殖道拭子、來自消化組織的細胞 懸浮液、和糞便提取物。在一些實施方案中，所述生物標志物為多核苷酸。在一些實施方案 中，步驟a)包含對來自所述生物樣本的無細胞DNA進行純化。在一些實施方案中，對所述 DNA進行擴增。在一些實施方案中，對所述DNA建立文庫。在一些實施方案中，對所述DNA 進行測序。在一些實施方案中，采用高通量測序?qū)λ鯠NA進行測序。在一些實施方案中， 步驟b)包含：將從步驟a)獲得的所述序列與所述生物標志物的序列進行比較。在一些實 施方案中，在步驟b)之前，從步驟a)獲得的所述序列中去除與人類基因組序列相匹配的序 列。
[0021] 在第四方面，本發(fā)明提供了一組用于確定人類胎兒的21三體性的生物標志物， 其包含多個選自由以下所組成的組的生物體：切根蟲核型多角體病毒、假單胞桿菌噬菌體 F10、鼻疽噬菌體Bcep22、