從孕婦外周循環(huán)血中分離胎兒有核紅細胞用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的制作方法
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的方法，尤其涉及一種利用納米材料從孕婦外周血中捕獲胎兒有核紅細胞用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
產(chǎn)前診斷又稱出生前診斷或?qū)m內(nèi)診斷，是指在胎兒出生前應(yīng)用現(xiàn)代生物學、生物化學、免疫遺傳學、細胞遺傳學、分子遺傳學等技術(shù)通過母體檢測或?qū)ε咛?胎兒)直接檢測從而了解胎兒的外表結(jié)構(gòu)、對胎兒的染色體進行核型分析、檢測胎兒細胞的生化成分或?qū)ζ溥M行基因分析，從而對某些胎兒先天性畸形或遺傳性疾病及時做出診斷，防止具有嚴重遺傳病、智力障礙以及先天畸形胎兒的出生。因此，產(chǎn)前診斷是優(yōu)生優(yōu)育、預(yù)防缺陷兒出生的重要手段，產(chǎn)前診斷的方法是一個重要的研究話題。
[0003]目前產(chǎn)前診斷可分為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷和有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。無創(chuàng)性手段產(chǎn)前診斷技術(shù)主要為超聲影像診斷技術(shù)，采用特殊儀器檢查胎兒體表是否畸形，如用X線照片或體表造影、B型超聲掃描間接觀察或胎兒鏡下直接觀察。但是此類檢查屬于形態(tài)學水平，只能檢測出胎兒是否畸形，診斷范圍受限，且其診斷方法靈敏度和準確性較差。有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷主要羊膜腔穿刺技術(shù)，羊膜腔穿刺術(shù)需使用帶芯長針頭進入孕婦羊膜腔多次抽取羊水，該方法屬有創(chuàng)性操作，對胎兒和孕婦都有一定的危險性，特別易導(dǎo)致宮內(nèi)感染、流產(chǎn)、胎兒死亡等不良并發(fā)癥，不容易被孕婦及家人所接受。因此發(fā)展新的無創(chuàng)性方法來檢測胎兒基因和/或染色體異常具有重要的臨床意義，一直是當前國際醫(yī)學遺傳學和生殖醫(yī)學界關(guān)注的焦點之一。
[0004]有核紅細胞主要存在于胎兒的血液循環(huán)中，同時在孕婦妊娠期間，可以通過胎盤屏障進入母體外周血液。胎兒有核紅細胞具有多種特征:①正常人外周血中不存在有核紅細胞，若出現(xiàn)則屬于病理現(xiàn)象屬單個核細胞，含胎兒全部基因組；③表面具有較多的相對特異的抗原成份如CD71，CD36和血型糖蛋白(GPA)等；④妊娠婦女外周血中含量較少，在1:1O5?I: 19之間；⑤生命周期短，約90天產(chǎn)后在母血中很快消失，用于診斷時不受前次妊娠影響。目前研究證明，利用胎兒有核紅細胞可以檢測與胎兒有關(guān)的很多疾病，如胎兒性別、血型、第VID因子、21-三體、18-三體、13-三體綜合征、人類白細胞抗原(HLA)多態(tài)性、地中海貧血、杜氏型肌營養(yǎng)不良(DMD)以及胎兒非整倍體等。因此，產(chǎn)前利用母血中的胎兒有核紅細胞篩查胎兒遺傳性疾病，已經(jīng)成為近年新發(fā)展起來的一項無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
為此，本發(fā)明提出了一種可以解決上述問題的或至少能部分解決上述問題的一種利用胎兒有核紅細胞進行產(chǎn)前診斷的方法。這種方法可以實現(xiàn)從孕早期(10周左右)的孕婦外周血中分離出胎兒有核紅細胞，并且運用FISH技術(shù)對胎兒性別進行染色體層面上的分析。
[0006]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種從孕婦外周血中捕獲胎兒有核紅細胞用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的方法，該方法包括如下操作: 新鮮孕婦外周血預(yù)處理步驟:從醫(yī)院收取的孕婦靜脈血保存在加有m)TA的采血管中，在6小時內(nèi)，根據(jù)密度梯度離心法使用淋巴細胞分離液分離出含有胎兒有核紅細胞的單核細胞層細胞，并分散在Irnl PBS中制成細胞懸浮液待用。
[0007]細胞捕獲步驟:將細胞懸浮液加入到修飾好抗體的基底芯片上后，放置到37°C恒溫細胞培養(yǎng)箱中靜置I小時，待細胞自然沉降與芯片上抗體結(jié)合，同時保持細胞的活性，增強捕獲效果。
[0008]FISH鑒定胎兒性別步驟:針對捕獲在芯片上的細胞，使用固定劑(甲醇和冰醋酸按體積比3:1混合)固定1min ;然后在預(yù)熱至37°C的2*SSC溶液中浸泡30min ;接著分別使用70%、85%、100%的乙醇梯度脫水2min后自然干燥；再滴加上現(xiàn)配的FISH探針雜交混合液(每個芯片2ul CSP-X/Y +8ul雜交緩沖液，連續(xù)混勻)后，先在75°C下水浴5min，再在42°C下雜交過夜；小心去除芯片表面的雜交混合液后，放入2*SSC溶液中浸5min ;再放置到預(yù)熱至67 V的0.3*NP-40/0.4*SSC溶液中浸泡1.5min，然后放入0.1*NP_40/2*SSC溶液中浸泡0.5min ;接著在70%的乙醇溶液中脫水3min后自然干燥；然后在雜交區(qū)域滴加DAPI，在熒光顯微鏡下觀測細胞核。
[0009]根據(jù)本發(fā)明利用納米基底材料從孕婦外周血中捕獲到胎兒有核紅細胞的實現(xiàn)無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的方法能夠有效從外周全血分離和捕獲出胎兒有核紅細胞，并且在捕獲胎兒有核紅細胞后能夠直接對其進行免疫熒光蛋白染色鑒定和FISH分析。
[0010]可選地，根據(jù)本發(fā)明的方法，還包括:
基底芯片的修飾步驟:利用化學方法依次用MPTMS，GMBS和St^ptavidin處理后，滴加抗體修飾到基底芯片上。
[0011]可選地，根據(jù)本發(fā)明的方法，還包括:
觀測和記錄步驟:對芯片中的捕獲結(jié)果進行觀測和記錄。
[0012]可選地，根據(jù)本發(fā)明的方法，還包括:
儀器清洗和整理步驟，觀測完成后對實驗過程中所使用的器材使用醫(yī)用酒精消毒和去離子水清洗、烘干等。
[0013]可選地，根據(jù)本發(fā)明的方法，還包括:
FISH鑒定胎兒性別分析和記錄步驟:FISH探針處理細胞核后，在熒光顯微鏡下，觀察細胞核(blue)內(nèi)結(jié)果，如果觀察到細胞核內(nèi)出現(xiàn)CSP-X (green)和CSP-Y (red)，則為男嬰，且該細胞為胎兒細胞，出現(xiàn)I個或2個CSP-X (green)而沒有CSP-Y (red)的細胞為母體細胞；如果所有細胞核內(nèi)均未觀察到CSP-Y (red)，則可能為女嬰。
[0014]本發(fā)明利用納米基底材料從孕婦外周血中捕獲到胎兒有核紅細胞的實現(xiàn)無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的方法具有如下優(yōu)點，主要表現(xiàn)在:(1)納米基底芯片修飾上抗體可以實現(xiàn)對細胞的高效和高特異性捕獲；(2)能夠在孕早期(10周左右)，從孕婦外周全血中特異性的分離捕獲出胎兒有核紅細胞以實現(xiàn)后續(xù)無創(chuàng)產(chǎn)前診斷；(3)利用免疫熒光蛋白染色方法對芯片捕獲到的細胞進行分析和鑒定；(4)利用FISH技術(shù)對捕獲的細胞進行染色體層面上的分析以確定胎兒性別，同時驗證了對胎兒染色體遺傳病(包括21-三體綜合癥，18-三體綜合癥，13-三體綜合癥等)進行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的可能。
[0015]通過閱讀下文優(yōu)選實施方式的詳細描述，各種其他的優(yōu)點和益處對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得清楚明了。附圖僅用于示出優(yōu)選實施方式的目的，而并不認為是對本發(fā)明的限制。而且在整個附圖中，用相同的參考符號表示相同的部件。其中在附圖中，參考數(shù)字之后的字母標記指示多個相同的部件，當泛指這些部件時，將省略其最后的字母標記。在附圖中:
圖1示出了根據(jù)本發(fā)明方法一種實施方式的利用納米材料從孕婦外周血中捕獲胎兒有核紅細胞用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法放入操作流程圖；
圖2示出了根據(jù)本發(fā)明方法一種實施方式的利用納米材料從孕婦外周全血中捕獲胎兒有核紅細胞的示意圖；
圖3示出了根據(jù)本發(fā)明方法取自不同孕周的外周血樣本中捕獲和鑒定的胎兒有核紅細胞的數(shù)目；
圖4示出了根據(jù)本發(fā)明方法利用FISH技術(shù)鑒別男性胎兒細胞的熒光圖。
【具體實施方式】
[0016]本發(fā)明提供了許多可應(yīng)用的創(chuàng)造性概念，該創(chuàng)造性概念可大量的體現(xiàn)于具體的上下文中。在下述本發(fā)明實施方式中描述的實施例僅作為本發(fā)明的具體實現(xiàn)方式的示例性說明，而不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。下面結(jié)合附圖和具體的實施方式對本發(fā)明作進一步描述。
[0017]根據(jù)圖1示出的本發(fā)明一個實施方式利用納米材料從孕婦外周循環(huán)血中分離胎兒有核紅細胞用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的方法，用于捕獲有核紅細胞的基底為生物可兼容納米顆?；?，其中100為洗凈的玻璃襯底，200為燒結(jié)在