專利名稱：：胰腺癌相關(guān)基因cst6和gabrp的制作方法胰腺癌相關(guān)基因CST6和GABRP相關(guān)申請本申請要求2005年7月27日提交的、流水號為60/703,171的美國臨時申請的權(quán)益，將其內(nèi)容完整收入本文作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及胰腺癌的檢測和診斷方法，以及治療和預(yù)防胰腺癌的方法。發(fā)明背景胰管腺癌(PDAC)是西方世界癌癥死亡的第五位原因，而且在惡性腫瘤中顯示出最差的死亡率，5年存活率只有4%(DiMagnoEPetal.,Gastroenterology117:1464-84(1999);ZervosEEetal.，CancerControl11:23-31(2004))。美國有大約30，700名患者被診斷有胰腺癌，而且其中幾乎30,000人將死于此病(JemalAetal.,CACancerJClin53:5-26(2003))。由于大多數(shù)PDAC患者是在晚期得到診斷的，目前沒有有效的療法；只有手術(shù)切除術(shù)提供了很少的治愈可能，但80-90。/。接受手術(shù)的PDAC患者復(fù)發(fā)并死于此病(DiMagnoEPetal.,Gastroenterology117:1464-84(1999);ZervosEEetal.,CancerControl11:23-31(2004))。手術(shù)和化療的有些方法(包括5-FU或吉西他濱，伴隨或不伴隨放療)可提高患者的生活質(zhì)量(DiMagnoEPetal.,Gastroenterology117:1464-84(1999);ZervosEEetal"CancerControl11:23-31(2004)),但那些處理對PDAC患者長期存活的影響非常有限，因為它本質(zhì)上極具攻擊性且有化療耐受。因此，大多數(shù)患者的管理聚焦于姑息措施(DiMagnoEPetal"Gastroenterology117:1464-84(1999》。為了克服這個可怕情況，現(xiàn)在迫切需要通過鑒定分子靶為PDAC開發(fā)新的分子療法。先前，使用包含大約27,000種基因的基因組范圍cDNA微陣列聯(lián)合激光顯微解剖(用于獲得純的癌細胞群供測試之用)生成了PDAC的精確表達序型(NakamuraTetal.，Oncogene23:2385-400(2004》。在PDAC中過表達的基因中，作為此病的新分子靶調(diào)查了半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)E/M(CST6)(GenBank編號NM—001323,SEQIDNO:41,編碼SEQIDNO:42)和GABA受體兀(GABRP)(GenBank編號NMJ)14211,SEQIDNO:43,編碼SEQIDNO:44)。半胱氨酸蛋白酶抑制劑是溶酶體半胱氨酸蛋白酶(諸如組織蛋白酶(cathepsin)B、L、H和S)的特異性抑制劑，而且它們在細胞內(nèi)和細胞外都發(fā)揮功能(BarrettAJ，TrendsBiochemSci12:193-6(1987);KepplerD,CancerLetter2005)。它們通過形成可逆的高親和力復(fù)合物來控制靶蛋白酶的催化功能。半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族分為三個不同亞家族，以半胱氨酸蛋白酶抑制劑A(stefmA)和半胱氨酸蛋白酶抑制劑B(stefinB)為代表的家族l半胱氨酸蛋白酶抑制劑不糖基化，缺少二硫鍵，且只在細胞內(nèi)有功能。家族2半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、D、S、SA、SN、E/M和F主要是分泌型蛋白質(zhì)，由115-120個氨基酸構(gòu)成，有兩個鏈間二辟J建。家族3半胱氨酸蛋白酶抑制劑由L-和H-激肽原(kininogen)構(gòu)成，是具有兩個半胱氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域和緩激肽(bradykinin)模塊的復(fù)雜糖基化細胞質(zhì)蛋白質(zhì)(BarrettAJ,TrendsBiochemSci12:193-6(1987);KepplerD,CancerLetter2005May10)。半胱氨酸蛋白酶抑制劑E/M(CST6)屬于家族2，是20-22kDa的N-糖基化分泌型蛋白酶，而通過比較原發(fā)性與轉(zhuǎn)移性乳腺癌間的差異轉(zhuǎn)錄物，CST6被兩個小組獨立鑒定為在乳腺癌中下調(diào)的基因(SotiropoulouGetal.，JBiolChem272:903-10(1997);NiJetal.，JBiolChem272:10853-8(1997》，而且他們認為該分子通過調(diào)控細胞基質(zhì)的蛋白水解或其它機制而抑制乳腺癌的增殖、轉(zhuǎn)移或侵入(ShridharRetal"Oncogene23:2206-15(2004);ZhangJetal.,CancerRes64:6957-64(2004》。GABAA受體是介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最快抑制性突觸傳遞的多亞基氯化物通道(MacdonaldRLandOlsenRW,AnnuRevNeurosci17:569-602(1994);OwensDFandKriegsteinAR，NatureRevNeurosci3:715-27(2002))。它主要由a卩y單元組成，迄今為止報導(dǎo)了od-6亞基、pl-3亞基、和丫l-3亞基(MacdonaldRLandOlsenRW，AnnuRevNeurosci17:569-602(1994);OwensDFandKriegsteinAR，NatureRevNeurosci3:715-27(2002))。GABA受體兀(GABRP)亞基可以與這些已知GABAA受體亞基裝配，而且將該亞基摻入GABAA受體可改變GABA受體對GABA或調(diào)控劑的敏感性(HedblomEandKirknessEF，JBiolChem272:15346-50(1997);NeelandsTRandMacdonaldRL,MolPharmacol56:598-610(1999))。在成熟腦中，GABA主要發(fā)揮抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的功能，但它在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中也發(fā)揮營養(yǎng)因子的作用以影響神經(jīng)細胞及其它的增殖、遷移和分化(MacdonaldRLandOlsenRW，AnnuRevNeurosci17:569-602(1994);FiszmanML,BrainResDevBrainRes115:1-8(1999))。另一方面，GABA和GABA受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的其它外周組織中表達和發(fā)揮功能(MacdonaldRLandOlsenRW，AnnuRevNeurosci17:569-602(1994))，但它們在非神經(jīng)元細胞中的精確功能和分布目前還不太清扭疋。通過cDNA微陣列分析生成的基因表達序型可以比傳統(tǒng)組織病理學(xué)方法所能提供的信息提供顯著更多的關(guān)于個體癌癥本質(zhì)的細節(jié)。這種信息的前途在于其有可能改善治療腫瘤性疾病的臨床策略并開發(fā)新藥(Petricoin，E.F.etal.,NatGenet，32Suppl:474-479,2002.)。為此目的，本發(fā)明人通過cDNA微陣列分析了來自各種組織的腫瘤的表達序型(OkabeHetal.,CancerRes61:2129-2137(2001);HasegawaSetal.，CancerRes62:7012-7017(2002);KanetaYetal.,JpnJCancerRes93:849-856(2002);KanetaYetal.,IntJOncol23:681-691(2003);KitaharaOetal.,CancerRes61:3544-3549(2001);LinYMetal.,Oncogene21:4120-4128(2002);NagayamaSetal"CancerRes62:5859-5866(2002);OkutsuJetal"MolCancerTher1:1035-1042(2002);KikuchiTetal.，Oncogene22:2192-2205(2003))。關(guān)于胰腺癌中基因表達序型的研究導(dǎo)致了可充當(dāng)診斷標(biāo)志物或診斷序型候選物的基因的鑒定。然而，這些主要來自腫瘤塊的lt據(jù)不能充分反映胰腺癌發(fā)生過程中的表達變化，因為胰腺癌細胞作為具有高度炎性反應(yīng)且包含多種細胞成分的實體塊存在。因此，先前發(fā)表的微陣列數(shù)據(jù)有可能反映異質(zhì)的序型。設(shè)計用于揭示癌發(fā)生機制的研究促進了某些抗腫瘤劑的分子靶的鑒定。例如，起初被開發(fā)用于抑制與Ras有關(guān)的生長-信號傳導(dǎo)途徑、其活化依賴于翻譯后法尼基化的法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)已顯示出在動物模型中有效治療Ras依賴性腫瘤(SunJetal.,Oncogene16(11):1467-73(1998Mar))。類似的，使用抗癌藥物與抗HER2單克隆抗體trastuzumab的組合對人進行的、以拮抗原癌基因受體HER2/neu為目的的臨床試驗對乳腺癌患者獲得了改善的臨床響應(yīng)和整體存活(O'DwyerME&DrukerBJ,CurrOpinOncol12(6):594-7(2000Nov))。最后，已開發(fā)出能選擇性滅活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制劑STI-571來治療慢性髓性白血病，在該病中，bcr-abl酪氨酸激酶的組成性活化在白細胞轉(zhuǎn)化中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。此類藥劑被設(shè)計用于抑制特定基因產(chǎn)物的致癌活性(FangGetal.,Blood96:2246-2253(2000))。因此，在癌性細胞中一般上調(diào)的基因產(chǎn)物顯然可充當(dāng)潛在的靶，用于開發(fā)新的抗癌藥。另外已證明CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)識別MHCI類分子上呈遞的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)所衍生的表位肽并裂解腫瘤細胞。自從發(fā)現(xiàn)MAGE家族是第一例TAA,已使用免疫學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了許多其它TAA(Boon,IntJCancer54:177-80(1993);BoonandvanderBruggen，JExpMed183:725-9(1996);vanderBruggenetal.,Science254:1643-7(1991);Brichardetal"JExpMed178:489-95(1993);Kawakamietal.,JExpMed180:347-52(1994》。有些新發(fā)現(xiàn)的丁AA現(xiàn)在正在進行作為免疫療法靶的臨床開發(fā)。迄今為止所發(fā)現(xiàn)的TAA包括MAGE(vanderBruggenetal.，Science254:1643-7(1991》、gplOO(Kawakamietal.，JExpMed180:347-52(1994》、SART(Shichijoetal.，JExpMed187:277-88(1998))和NY-ESO畫l(Chenetal.,ProcNatlAcadSciUSA94:1914-8(1997))。另一方面，已證明在腫瘤細胞中特異性過表達的基因產(chǎn)物已顯示出作為誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答的靶受到識別。此類基因產(chǎn)物包括p53(Umanoetal.,BritJCancer84:1052-7(2001))、HER2/neu(Tanakaetal"BritJCancer84:94-9(2001))、CEA(Nukayaetal"IntJCancer80:92-7(1999))等。盡管已在與TAA有關(guān)的基礎(chǔ)和臨床研究中取得了顯著進步(Rosenbergetal"NatureMed4:321-7(1998);Mukherjietal"ProcNatlAcadSciUSA92:8078-82(1995);Huetal"CancerRes56:2479-83(1996))，目前可用于治療腺癌，包括結(jié)腸直腸癌的候選TAA的數(shù)目仍然很有限。在癌細胞中豐富表達且該表達局限于癌細胞的TAA可能是免疫療法靶的理想候選物。此外，能誘導(dǎo)有力且特異性的抗胂瘤免疫應(yīng)答的新TAA的鑒定預(yù)計會促進肽接種策略在多種類型癌癥中的臨床使用(BoonandvanderBruggen,JExpMed183:725-9(1996);vanderBruggenetal"Science254:1643-7(1991);Brichardetal"JExpMed178:489-95(1993);Kawakamietal.，JExpMed180:347-52(1994);Shichijoetal"JExpMed187:277-88(1998);Chenetal.，ProcNatlAcadSciUSA94:1914-8(1997);Harris,JNatlCancerInst88:1442-5(1996);Butterfieldetal.,CancerRes59:3134-42(1999);Vissersetal.,CancerRes59:5554-9(1999);vanderBurgetal.,JImmunol156:3308-14(1996);Tanakaetal.,CancerRes57:4465-8(1997);Fujieetal"IntJCancer80:169-72(1999);Kikuchietal.,IntJCancer81:459-66(1999);Oisoetal.,IntJCancer81:387-94(1999》。據(jù)反復(fù)報道，來自某些健康供體的經(jīng)肽刺激的外周血單個核細胞(PBMC)應(yīng)答肽而產(chǎn)生顯著水平的IFN-a，但在"Cr-釋放測定法中很少以局限于HLA-A24或-A0201的方式對腫瘤細胞發(fā)揮細胞毒性(Kawanoetal.，CancerRes60:3550-8(2000);Nishizakaetal"CancerRes60:4830-7(2000);Tamuraetal.,JpnJCancerRes92:762-7(2001》。然而，HLA-A24和HLA-A0201二者是曰本人和高加索人中常見的HLA等位基因(Dateetal.，TissueAntigens47:93-101(1996);Kondoetal.，JImmunol155:4307-12(1995);Kuboetal"JImmunol152:3913-24(1994);Imanishietal,,ProceedingoftheeleventhInternationalHistocompatibilityWorkshopandConferenceOxfordUniversityPress,Oxford,1065(1992);Williamsetal"TissueAntigen49:129(1997))。如此，由這些HLA呈遞的癌癥抗原性肽對于治療日本人和高加索人中的癌癥可能是特別有用的。另外，已知使用高濃度的肽通常在體外誘導(dǎo)低親和力的CTL,在抗原呈遞細胞(APC)上產(chǎn)生高水平的特定肽/MHC復(fù)合物，該復(fù)合物會有效激活這些CTL(Alexander-Milleretal.,ProcNatlAcadSciUSA93:4102-7(1996))。發(fā)明概述本發(fā)明基于CST6和GABRP基因表達樣式的發(fā)現(xiàn)。為了鑒定用于治療胰管腺癌(PDAC)的新的分子靶，在通過激光顯微解剖來純化肺瘤細胞群后，本發(fā)明人在基因組范圍cDNA微陣列上生成了PDAC的精確基因表達序型。通過在PDAC中反式激活的基因的功能分析，半胱氨酸蛋白酶抑制劑E/M(CST6)和GABA受體Ti(GABRP)被鑒定為開發(fā)用于在分子水平治療PDAC的藥物的候選物。通過RT-PCR和/或免疫組織化學(xué)分析證實CST6和GABRP的過表達，而Northem印跡分析揭示了CST6和GABRP表達局限于成人正常器官。siRNA對PDAC細胞系中內(nèi)源CST6和GABRP表達的敲減削弱了PDAC細胞的生長，說明它在維持PDAC細胞的生存力中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。半胱氨酸蛋白酶抑制劑E/M(CST6)屬于蛋白酶抑制劑的半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族，它們控制靶蛋白酶諸如組織蛋白酶M的催化功能，且在細胞內(nèi)和細胞外都發(fā)揮功能。CST6在無CST6細胞中的組成性表達在體外促進細胞生長，而且培養(yǎng)基中成熟重組CST6的存在也劑量依賴性的促進細胞增殖，說明所分泌的CST6有可能以自分泌/旁分泌方式涉及PDAC細胞增殖。GABA受體兀(GABRP)是GABAA受體復(fù)合物的亞基之一，而且它在GABAa受體中的摻入可調(diào)控對GABA的敏感性。觀察到GABA刺激促進表達GABRP的PDAC細胞增殖，而且GABAA受體拮抗劑消除此促進效應(yīng)。另一方面，GABA刺激不影響不表達GABRP的PDAC細胞增殖。這些發(fā)現(xiàn)暗示CST6、GABA和GABA受體兀(GABRP)是開發(fā)PDAC新治療策略的有希望的分子靶。在本發(fā)明中，與先前的報告相反，本本發(fā)明報告了一些比例的PDAC中的CST6過表達并證明了CST6以自分泌/旁分泌方式促進PDAC細胞生長，而且報告了一些比例的PDAC中的GABA受體兀(GABRP)過表達并證明了GABA和GABA受體7i亞基促進PDAC細胞生長，暗示它們是PDAC治療的有希望的靶。CST6和GABRP的核苷酸序列和氨基酸序列分別列于SEQIDNO:41和42、43和44。這些序列還可見Genbank編號NM—001323和NM—014211。因此，本發(fā)明提供了通過測定得自患者的生物學(xué)樣品諸如組織樣品中的CST6或GABRP表達水平來診斷或確定受試者中對胰腺癌的傾向性的方法。正常細胞是從胰腺組織得到的細胞。或者，例如基因表達水平與正常對照基因水平相比的升高表明受試者患有或有風(fēng)險發(fā)生PDAC。在用于本發(fā)明的上下文時，術(shù)語"對胰腺癌的傾向性"涵蓋受試者易患胰腺癌、趨向于胰腺癌、流行、趨向于胰腺癌或易感胰腺癌的狀態(tài)。此外，該術(shù)語還涵蓋受試者有風(fēng)險獲得胰腺癌的情況。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"對照水平"指在對照樣品中4企測到的蛋白質(zhì)表達水平，而且包括正常對照水平和胰腺癌對照水平二者。對照水平可以是來自單一參照群或來自眾多表達樣式的單一表達樣式。例如，對照水平可以是來自先前測試細胞的表達樣式數(shù)據(jù)庫。"正常對照水平"指在正常的、健康的個體中或在已知未患胰腺癌的個體群中檢測到的基因表達水平。正常個體指沒有胰腺癌的臨床癥狀的個體。另一方面，"PDAC對照水平"指在患有PDAC的人群中檢測到的CST6或GABRP表達序型。在測試樣品中檢測到的CST6或GABRP表達水平與正常對照水平相比的升高表明受試者(獲取樣品的受試者)患有或有風(fēng)險發(fā)生PDAC。或者，可以將樣品中一組CST6或GABRP的表達與同組基因的PDAC對照水平進行比較。樣品表達與PDAC對照表達之間的相似性表明受試者(獲:取樣品的受試者)患有或有風(fēng)險發(fā)生PDAC。根據(jù)本發(fā)明，若基因表達與對照水平相比升高或降低了10%、25%、50%,則認為基因表達水平有"改變"?；蛘撸艋虮磉_與對照水平相比升高或降低了至少0.1倍、至少0.2倍、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更多倍，則認為表達水平有"升高"或"降低"。表達通過檢測例如CST6或GABRP探針與來自患者的組織樣品中的基因轉(zhuǎn)錄物的雜交情況來測定。在本發(fā)明的上下文中，來自患者的組織樣品指從測試受試者，例如已知或懷疑患有PDAC的患者獲得的任何組織。例如，組織可以包括上皮細胞。更具體的說，組織可以是來自胰管腺癌的上皮細胞。通過使表達CST6或GABRP的測試細胞接觸測試化合物，并測定CST6或GABRP的表達水平或其基因產(chǎn)物的活性，本發(fā)明進一步提供了鑒定能抑制或增強CST6或GABRP的表達或活性的藥劑的方法。測試細胞可以是上皮細胞，諸如從胰管腺癌獲得的上皮細胞。CST6或GABRP的表達水平或其基因產(chǎn)物的活性與該基因或其基因產(chǎn)物的對照水平或活性相比的降低表明測試本發(fā)明還提供了試劑盒，其包含能與CST6或GABRP核酸或多肽結(jié)合的-險測劑。本發(fā)明的治療方法包括治療或預(yù)防受試者中的PDAC的方法，包括給受試者施用CST6或GABRP的拮抗劑或抑制劑的步驟，所述拮抗劑或抑制劑可以是例如反義組合物或抗體組合物。拮抗劑或抑制劑可以作用于核酸或蛋白質(zhì)水平，從而降低或抑制CST6或GABRP的表達或活性。在本發(fā)明的上下文中，反義組合物降低特定靶基因的表達。例如，反義組合物可以包含與CST6或GABRP序列互補的核香酸?；蛘?，本方法可以包括給受試者施用小干擾RNA(siRNA)組合物的步驟。在本發(fā)明的上下文中，siRNA組合物降低CST6或GABRP的表達。在有一種方法中，受試者中PDAC的治療或預(yù)防可以通過給受試者施用核酶組合物來進行。在本發(fā)明的上下文中，核酸特異性核酶組合物降低CST6或GABRP的表達。實際上，針對CST6或GABRP的siRNA的抑ii制效果得到了證實。例如，實施例部分中已經(jīng)清楚顯示了針對CST6或GABRP的siRNA抑制胰腺癌細胞的細胞增殖。如此，在本發(fā)明中，CST6或GABRP是胰腺癌的優(yōu)選治療靶。本發(fā)明還包括疫苗和疫苗接種方法。例如，治療或預(yù)防受試者中的PDAC的方法可以包括給受試者施用疫苗，該疫苗包含由CST6或GABRP的核酸編碼的多肽或其免疫學(xué)活性片段。在本發(fā)明的上下文中，免疫學(xué)活性片段指比全長的天然存在蛋白質(zhì)短但誘發(fā)與全長蛋白質(zhì)類似的免疫應(yīng)答的多肽。例如，免疫學(xué)活性片段的長度應(yīng)當(dāng)是至少8個殘基且能夠刺激免疫細胞諸如T細胞或B細胞。免疫細胞刺激可以通過檢測細胞增殖、細胞因子(例如IL-2)的生成、或抗體的生成來測量。除非另有限定，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均與本發(fā)明所屬4支術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員普遍理解的含義相同。盡管與本文所述類似或等同的方法和材料可用于實施或檢驗本發(fā)明，但下文描述了合適的方法和材料。本文中所引用的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻均完整收入本文作為參考。本文中任何文字都不可解釋為承認本發(fā)明沒有資格憑借在先發(fā)明而早于所述公開。若有沖突，以本說明書，包括定義為準。另外，本文中所提到的材料、方法和例子僅為例示而非意圖限制。本文所述方法的一個優(yōu)點在于在檢測到胰腺癌的明顯臨床癥狀前就能鑒定疾病。本發(fā)明的其它特定和優(yōu)點將通過以下詳述及通過權(quán)利要求而顯而易見。附圖簡述圖l顯示了半胱氨酸蛋白酶抑制劑E/M(CST6)在PDAC細胞中的過表達。A)通過顯微解剖得到的PDAC細胞(1_9)中CST6和TUBA的mRNA表達的RT-PCR,與同樣通過顯微解剖得到的正常胰管上皮細胞(N)進行比較。B)Northem印跡分析揭示了CST6表達局限于胎盤和曱狀腺組織。C)在使用所生成的抗CST6抗體進行的免疫組織化學(xué)研究中，在PDAC細胞中觀察到強烈染色(左圖的箭頭，最初放大倍數(shù)為x400)。在細胞質(zhì)中觀察到CST6陽性染色。在正常胰組織中，腺泡細胞和正常導(dǎo)管上皮細胞顯示出很弱的染色(右圖，最初;故大倍數(shù)為x400)。圖2顯示了CST6-siRNA對PDAC細胞生長的影響。A)PDAC細胞系PK-1和PK-59中siRNA對CST6的敲減效應(yīng)。使用經(jīng)過針對CST6的siRNA表達載體(#448)和陰性對照載體(#EGFP)轉(zhuǎn)染的細胞進行了半定量RT-PCR。使用卩2-MG來對RNA進行定量。B)經(jīng)過所示針對CST6的siRNA表達載體(糾48)和陰性對照載體(存EGFP)轉(zhuǎn)染的PK-1和PK-59細胞的集落形成測定法。與遺傳霉素一起溫育14天后通過0.1%結(jié)晶紫染色來顯現(xiàn)細胞。C)經(jīng)過所示針對CST6的siRNA表達載體(糾48)和陰性對照載體(粗GFP)轉(zhuǎn)染的PK-1和PK-59細胞的MTT測定。繪制了與遺傳霉素一起溫育14天后的平均值及表示SD(標(biāo)準偏差)的誤差范圍。Y軸上的ABS表示用微量板讀數(shù)儀測量得到的490nm吸光度，以630nm為參比。這些實驗以一式三份進行。"表示p值小于O.Ol(Students氏t檢驗)。圖3顯示了CST6的過表達促進細胞增殖。A)高水平表達外源CST6的KLM-1細胞或經(jīng)過模擬載體轉(zhuǎn)染的細胞的Western印跡分析。CST6表達的外源導(dǎo)入用抗myc標(biāo)簽單克隆抗體來驗證。P-肌動蛋白充當(dāng)上樣對照。B)表達高水平外源CST6的KLM-1克隆(克隆l-3)和經(jīng)過模擬載體轉(zhuǎn)染的克隆(克隆l-3)的體外生長速率。X軸代表播種后的天數(shù)，Y軸代表相對生長速率，其是與作為對照的第l天的吸光度值進行比較而計算得出的。繪制了平均值及表示SD的誤差范圍。這些實驗以一式三份進行。"表示p值小于O.Ol(Students氏t沖全'g全)。圖4顯示了由重組CST6蛋白刺激的細胞增殖。將C0S7細胞與系列濃度(0、0.02、0.2和2ng/ml)的成熟重組CST6—起溫育，補充有2。/oFBS。Y軸代表第6天的相對生長促進速率，其通過與作為對照的Ong/mlCST6的吸光度值進行比較而計算得出。繪制了平均值及表示SD的誤差范圍。這些實驗以一式三份進行。^表示p值小于0.01(Students氏t4企驗)。圖5顯示了GABA受體兀亞基(GABRP)和GAD1在PDAC細胞中的過表達。A)通過顯微解剖得到的PDAC細胞中GABRP和TUBA的mRNA表達的RT-PCR，與同樣通過顯微解剖得到的正常胰管上皮細胞(N.R)和正常重要器官進行比較。B)多種組織Northern印跡分析顯示出氣管、前列腺和胃有3.3kb弱帶，而其它正常成人器官不表達GABRP。PDAC細胞系KLM-1、PK-45P和PK-1高水平表達GABRP。C)通過顯微解剖得到的PDAC細胞中GAD1和TUBA的mRNA表達的RT-PCR，與通過顯微解剖得到的正常胰管上皮細胞(N.P.)、整個胰腺和腦進行比較。圖6顯示了GABRP-siRNA對PDAC細胞的生長的影響。A)KLM-1(左圖)和PK-45P細胞系(右圖)中siRNA對GABRP的敲減效應(yīng)。使用經(jīng)過針對GABRP的siRNA表達載體(si6、si7、si8和silO)和陰性對照載體(s正GFP)轉(zhuǎn)染的細胞進行了半定量RT-PCR,這證實了si6、si7、si8和silO的敲減效應(yīng)，但陰性對照s正GFP沒有。使用p2-MG來對RNA進行定量。B)經(jīng)過所示針對GABRP的siRNA表達載體(si6、si7、si8和silO)和陰性對照載體(s正GFP)轉(zhuǎn)染的KLM-1(左圖)和PK-45P(右圖)細胞的集落形成測定法。與遺傳霉素一起溫育2周后通過0.1%結(jié)晶紫染色來顯現(xiàn)細胞。C)經(jīng)過所示針對GABRP的siRNA表達載體(si6、si7、si8和silO)和陰性對照載體(siEGFP)轉(zhuǎn)染的KLM-l(左圖)和PK-45P(右圖)細胞的MTT測定。繪制了與遺傳霉素一起溫育2周后的平均值及表示SD(標(biāo)準偏差)的誤差范圍。Y軸上的ABS表示用微量板讀數(shù)儀測量得到的490nm吸光度，以630nm為參比。這些實驗以一式三份進行。圖7顯示了GABA刺激對PDAC細胞增殖的影響及GABA受體拮抗劑的調(diào)控作用。A)將GABRP陽性細胞系KLM-1和PK-45P(上圖)及GABRP陰性細胞系PK-59和KP-1N(下圖)與系列濃度(0、1、10、lOOiaM)的GABA一起溫育6天。Y軸代表第6天的相對生長促進速率，其通過與作為對照的Ong/mlGABA的吸光度值進行比較而計算得出。繪制了平均值及表示SD的誤差范圍。這些實驗以一式三份進行。"表示p值小于O.Ol(Students氏t檢驗)。B)將GABRP陽性細胞系KLM-1和PK-45P(上圖)及GABRP陰性細胞系PK-59和KP-1N(下圖)與250pM的GABAA受體拮抗劑BMI或lmM的GABAB受體拮抗劑CGP-35348在有或無100pMGABA的條件下一起溫育。細胞生存力在暴露于這些藥物6天后測量，而Y軸代表第6天的相對生長促進速率，其通過與作為對照的Ong/mlGABA和沒有藥物的吸光度值進行比較而計算得出。繪制了平均值及表示SD的誤差范圍。這些實驗以一式三份進行。**表示p值小于O.Ol(Students氏t檢驗)。發(fā)明詳述詞語"一個"、"一種"、"所述"和"該"在用于本文時指"至少一個/種"，除非另有明確說明。在整篇說明書和權(quán)利要求書中，除非上下文另有需要，詞語"包含"、"包括"和"含有"應(yīng)理解為包含所述一種或多種成分或者包括所述一個或多個步驟，但不排除任何別的一種或多種成分或者一個或多個步驟。胰腺癌細胞一般以具有高度炎性反應(yīng)且包含多種細胞成分的實體塊形式存在。因此，先前發(fā)表的微陣列數(shù)據(jù)有可能反映異質(zhì)序型(heterogenousprofile)。本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)來自胰腺癌患者的細胞中CST6或GABRP的表達升高。本文中所鑒定的CST6和GABRP作為PDAC標(biāo)志物和作為PDAC基因靶可具有診斷效用，可改變其表達來治療或緩解PDAC的癥狀。通過測量細胞樣品中CST6或GABRP的表達，可以診斷PDAC。類似的，測量CST6或GABRP應(yīng)答各種藥劑的表達，可以鑒定可用于治療PDAC的藥劑。本發(fā)明涉及測定(例如測量)CST6或GABRP的表達。使用GenBankTM數(shù)據(jù)庫條目關(guān)于已知序列提供的序列信息，可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)來檢測和測量CST6或GABRP。例如，可以使用對應(yīng)于CST6或GABRP的序列數(shù)據(jù)庫條目中的序列來構(gòu)建探針，用于在例如Northem印跡雜交分析中才企測對應(yīng)于CST6或GABRP的RNA序列。又例如，可以使用上述序列來構(gòu)建引物，用于在例如基于擴增的檢測方法，諸如基于逆轉(zhuǎn)錄的聚合酶鏈式反應(yīng)中特異性擴增PDAC核酸。然后，將測試細胞群，例如來自患者的組織樣品中的CST6或GABRP表達水平與參照群中的CST6或GABRP表達水平進行比較。參照細胞群包括所比較參數(shù)已知的一種或多種細胞，即胰管腺癌細胞(例如PDAC細胞)或正常胰管上皮細胞(例如非PDAC細胞)。與參照細胞群相比，測試細胞群中的基因表達樣式是否表明PDAC或其傾向性取決于參照細胞群的組成。例如，如果參照細胞群由非PDAC細胞構(gòu)成，那么測試細胞群與參照細胞群之間基因表達樣式的相似性表明測試細胞群是非PDAC。反之，如果參照細胞群由PDAC細胞構(gòu)成，那么測試細胞群與參照細胞群之間基因表達樣式的相似性表明測試細胞群包含PDAC細胞。如果測試細胞群中PDAC標(biāo)志基因的表達水平與參照細胞群中相應(yīng)PDAC標(biāo)志基因的表達水平相差大于1.1倍、大于1.5倍、大于2.0倍、大于5.0倍、大于10.0倍或更多，那么可認為它有"改變"。測試細胞群與參照細胞群之間的差異基因表達可以相對于對照核酸，例如持家基因進行標(biāo)準化。例如，對照核酸是已知在癌性或非癌性狀態(tài)的細胞中不存在差異的核酸。可以利用對照核酸的表達水平對測試群和參照群中的信號水平進行標(biāo)準化。例示性的對照基因包括但不限于例如P-肌動蛋白、甘油醛3-磷酸脫氬酶和核糖體蛋白Pl?？梢詫y試細胞群與多個參照細胞群進行比較。各個參照群的已知參數(shù)可以不同。如此，可以將測試細胞群與已知包含例如PDAC細胞的第一參照細胞群和已知包含例如非PDAC細胞(正常細胞)的第二參照細胞群進行比較。測試細胞可以包含在來自已知包含或懷疑包含PDAC細胞的受試者的組織類型或細胞樣品中。測試細胞得自身體組織或體液，例如生物學(xué)流體(諸如例如血液或痰)。例如，測試細胞可以純化自胰腺組織。優(yōu)選的是，測試細胞群包含上皮細胞。上皮細胞優(yōu)選來自已知或懷疑是胰管腺癌的組織。參照細胞群中的細胞應(yīng)衍生自類型與測試細胞類似的組織。任選的是，參照細胞群是細胞系，例如PDAC細胞系(即陽性對照)或正常非PDAC細胞系(即陰性對照)?；蛘撸瑢φ占毎嚎裳苌苑肿有畔?shù)據(jù)庫，該分子信息數(shù)據(jù)庫衍生自所測定參數(shù)或條件已知的細胞。受試者優(yōu)選是哺乳動物。例示性的哺乳動物包括但不限于例如人、非人靈長類動物、小鼠、大鼠、犬、貓、馬或牛?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知方法在蛋白質(zhì)或核酸水平測定本文中所公開的CST6或GABRP的表達。例如，可以使用特異性識別該序列的探針通過Northern雜交分析來測定基因表達?；蛘?，例如可以使用對CST6或GABRP序列特異性的引物通過基于逆轉(zhuǎn)錄的PCR測定法來測量基因表達。還可以在蛋白質(zhì)水平測定表達，即通過測量由本文所述基因編碼的多肽的水平或其生物學(xué)活性。此類方法是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于例如利用針對基因所編碼的蛋白質(zhì)的抗體進行的免疫測定法。由基因所編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性一般是公知的。胰腺癌的診斷在本發(fā)明的上下文中，通過測量測試細胞群(即得自患者的生物學(xué)樣品)中CST6或GABRP的表達水平來診斷PDAC。優(yōu)選的是，測試細胞群包含上皮細胞，例如由胰腺組織獲得的細胞。還可以由血液或其它體液諸如尿液來測量基因表達。可以使用其它生物學(xué)樣品來測量蛋白質(zhì)水平。例如，可以通過免疫測定法或其它常規(guī)生物學(xué)測定法來測量衍生自待診斷受試者的血液或血清中的蛋白質(zhì)水平。測定測試細胞或生物學(xué)樣品中CST6或GABRP的表達，并與所測定CST6或GABRP相關(guān)的正常對照表達水平進行比較。正常對照水平是通常在已知未患PDAC的人群中發(fā)現(xiàn)的CST6或GABRP表達序型。來自患者的組織樣品中CST6或GABRP表達水平的改變(例如升高)表明受試者患有或有風(fēng)險發(fā)生PDAC。例如，測試群中CST6或GABRP的表達與正常對照水平相比升高表明受試者患有或有風(fēng)險發(fā)生PDAC。測試群中CST6或GABRP與正常對照水平相比降低表明受試者患有或有風(fēng)險發(fā)生PDAC。通過對對應(yīng)于PDAC相關(guān)基因的mRNA或由PDAC相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)定量，可以評估生物學(xué)樣品中PDAC相關(guān)基因的表達水平。mRNA的定量方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，可以通過Northern印跡或RT-PCR來評估對應(yīng)于PDAC相關(guān)基因的mRNA的水平。既然PDAC相關(guān)基因的核苷酸序列針或引物的核苷S踏列。還可以基于由PDAC相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)的活性或數(shù)量來分析該基因的表達水平。用于測定由PDAC相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)的數(shù)量的方法顯示于下。例如，免疫測定法可用于測定生物學(xué)材料中的蛋白質(zhì)。只要標(biāo)志基因(PDAC相關(guān)基因)在胰腺癌患者的樣品中表達，可以將任何生物學(xué)材料用作測定蛋白質(zhì)或其活性的生物學(xué)樣品。然而，體液，諸如血液和尿液也可用于分析。另一方面，為了測定由PDAC相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)的活性，可以根據(jù)待分析蛋白質(zhì)的活性來選擇合適的方法。對生物學(xué)樣品中PDAC相關(guān)基因的表達水平進行評估，并與正常樣品(例如來自非患病受試者的樣品)中的水平進行比較。當(dāng)這樣的比較顯示基因的表達水平比正常樣品中的水平高時，則判定該受試者患有PDAC。可以同時測定來自正常受試者和待診斷受試者的生物學(xué)樣品中PDAC相關(guān)基因的表達水平?；蛘?，可以通過統(tǒng)計學(xué)方法，基于通過分析從對照組預(yù)先采集的樣品中基因表達水平獲得的結(jié)果，確定出表達水平的正常范圍。將受試者樣品獲得的結(jié)果與正常范圍進行比較，當(dāng)該結(jié)果未落入正常范圍時，則判定受試者患有或有風(fēng)險發(fā)生PDAC。在本發(fā)明中，還提供了用于診斷細胞增殖性疾病，諸如PDAC的診斷劑。本發(fā)明的診斷劑包括能與PDAC相關(guān)基因的多核苷酸或多肽結(jié)合的化合物。優(yōu)選的是，使用能與PDAC相關(guān)基因的多核苷酸發(fā)生雜交的寡核苷酸或能與由PDAC相關(guān)基因編碼的多肽結(jié)合的抗體作為這樣的化合物。此外，還可以使用適體，諸如RNA、DNA或肽適體作為這樣的化合物。抑制CST6或GABRP表達的藥劑的鑒定使表達CST6或GABRP的測試細胞群與測試藥劑接觸，然后測定CST6或GABRP的表達水平或其基因產(chǎn)物的活性，可以鑒定抑制CST6或GABRP的表達或其基因產(chǎn)物的活性的藥劑。存在藥劑的條件下CST6或GABRP的表達水平或其基因產(chǎn)物的活性水平與不存在測試藥劑的條件下的表達或活性水平相比降低，表明該藥劑是CST6或GABRP的抑制劑并可用于抑制PDAC。測試細胞群可以是表達CST6或GABRP的任何細胞。例如，測試細胞群可包含上皮細胞，諸如衍生自胰腺組織的細胞。而且，測試細胞可以是衍生自腺癌細胞的永生化細胞系?；蛘?，測試細胞可以是經(jīng)過CST6或GABRP轉(zhuǎn)染的細胞或經(jīng)過與報告基因可操作連接的、來自CST6或GABRP的調(diào)控序列(例如啟動子序列)轉(zhuǎn)染的細胞。受試者中的PDAC治療功效的評估本文中所鑒定的差異表達的CST6或GABRP還容許對PDAC的治療過程進行監(jiān)測。在該方法中，由接受PDAC治療的受試者提供測試細胞群。必要時，在治療前、治療中和/或治療后的多個時間點由受試者獲取測試細胞群。然后測定細胞群中的CST6或GABRP表達，并與包含PDAC狀態(tài)已知的細胞的參照細胞群進行比較。在本發(fā)明的上下文中，參照細胞應(yīng)當(dāng)尚未暴露于所述治療。如果參照細胞群不含PDAC細胞，那么測試細胞群與參照細胞群中CST6或GABRP表達的相似性表明所述治療是有效的。然而，測試細胞群中的CST6或GABRP表達與正常對照參照細胞群相比升高表明臨床效果或預(yù)后較不理想。類似的，如果參照細胞群包含PDAC細胞，那么測試細胞群中的CST6或GABRP表達與參照細胞群相比降低表明所述治療是有效的，而測試細胞群與癌癥對照參照細胞群中CST6或GABRP表達的相似性表明臨床效果或預(yù)后較不理想。另外，可以將治療后得到的得自受試者的生物學(xué)樣品中測定的CST6或GABRP表達水平(即治療后水平)與治療開始前得到的得自受試者的生物學(xué)樣品中測定的CST6或GABRP表達水平(即治療前水平)進行比較。治療后樣品中CST6或GABRP表達水平的降低表明所述治療是有效的，而治療后樣品中表達水平的升高或維持表明臨床效果或預(yù)后較不理想。在用于本文時，術(shù)語"有效的"表明治療引起受試者體內(nèi)病理性上調(diào)的基因的表達降低，病理性下調(diào)的基因的表達升高、或者胰管腺癌的大小、流行性(prevalence)或轉(zhuǎn)移潛力降低。在預(yù)防性施行所述治療時，術(shù)語"有效的，，指治療能延遲或防止胰腺腫瘤形成，或者能延遲、防止或減輕PDAC的臨床癥狀。胰腺腫瘤的評估可以使用標(biāo)準臨床規(guī)程來進行。此外，可以與任何已知的PDAC診斷或治療方法相結(jié)合來測定有效性。例如，可以通過鑒定癥狀異常例如體重減輕、腹痛、背痛、食欲減退、惡心、嘔吐和全身不適、虛弱和黃癥來診斷PDAC。對特定個體適宜的、用于治療PDAC的治療劑的選擇個體遺傳組成(geneticmakeup)的差異可導(dǎo)致其代謝各種藥物的相對能力出現(xiàn)差異。在受試者體內(nèi)代謝從而起到抗PDAC劑作用的藥劑，可通過在受試者的細胞中誘導(dǎo)癌性狀態(tài)特征性基因表達樣式向非癌性狀態(tài)特征性基因表達樣式的轉(zhuǎn)變而自我顯現(xiàn)出來。因此，本文中所公開的差異表達的CST6或GABRP容許在來自選定受試者的測試細胞群中測試推定的PDAC治療性或預(yù)防性抑制劑，從而確定該藥劑在該受試者中是否是合適的PDAC抑制劑。為了鑒定適于特定受試者的PDAC抑制劑，將來自受試者的測試細胞群暴露于治療劑，并測定CST6或GABRP的表達。在本發(fā)明方法的上下文中，測試細胞群包含表達CST6或GABRP的PDAC細胞。優(yōu)選的是，測試細胞是上皮細胞。例如，可以將測試細胞群在存在候選藥劑的條件下溫育，測量測試細胞群的基因表達樣式，并與一種或多種參照序型例如PDAC參照表達序型或非PDAC參照表達序型進行比較。測試細胞群中CST6或GABRP表達相對于包含PDAC的參照細胞群的降低表明該藥劑具有治療潛力。在本發(fā)明的上下文中，測試藥劑可以是任何化合物或組合物。例示性的測試藥劑包括但不限于免疫調(diào)節(jié)劑。用于鑒定治療劑的篩選測定法利用CST6或GABRP基因、由該基因編碼的蛋白質(zhì)、或該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，可以篩選能改變該基因的表達或由該基因編碼的多肽的生物學(xué)活性的化合物。此類化合物可作為藥物用于治療或預(yù)防PDAC。PDAC的化合物的方法。該篩選方法的一個實施方案包括以下步驟a)使測試化合物與由CST6或GABRP的多核苷酸編碼的多肽接觸；b)檢測多肽與測試化合物之間的結(jié)合活性；并c)選擇能與多肽結(jié)合的測試化合物。用于篩選的CST6或GABRP多肽可以是重組多肽或者衍生自天然的蛋白質(zhì)或其部分肽。與測試化合物接觸的多肽可以是例如純化的多肽、可溶性蛋白質(zhì)、與載體結(jié)合的形式、或與其它多肽融合的融合蛋白。作為例如使用CST6或GABRP多肽篩選能與CST6或GABRP多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的許多方法。這樣的篩選可以通過例如免疫沉淀法來進行，具體以下述方式。通過將編碼CST6或GABRP多肽的基因插入外來基因表達載體，諸如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3.1、pCAGGS和pCD8，使該基因在宿主(例如動物)細胞等中表達。用于表達的啟動子可以是常用的任何啟動子，包括例如SV40早期啟動子(RigbyinWilliamson(ed.),GeneticEngineering,vol.3.AcademicPress,London:83-141(1982))、EF-a啟動子(Kimetal.，Gene91:217-23(1990))、CAG啟動子(Niwaetal"Gene108:193(1991》、RSVLTR啟動子(Cullen,MethodsinEnzymology152:684-704(1987))、SRa啟動子(Takebeetal.，MolCellBiol8:466(1988))、CMV立即早期啟動子(SeedandAruffo，ProcNatlAcadSciUSA84:3365-9(1987》、SV40晚期啟動子(GheysenandFiers，JMolApplGenet1:385-94(1982))、腺病毒晚期啟動子(Kaufmanetal.，MolCellBiol9:946-58(1989))、HSVTK啟動子等?？梢砸勒杖魏畏椒▽⒒?qū)胗磉_外來基因的宿主細胞，例如電穿孔法(Chuetal.,NucleicAcidsRes15:1311-26(1987))、磷酸鈞法(ChenandOkayama,MolCellBiol7:2745-52(1987》、DEAE右旋糖香法(Lopataetal"NucleicAcidsRes12:5707-17(1984);SussmanandMilman,MolCellBiol4:1641-3(1984》、月旨轉(zhuǎn)染法(DerijardBetal"Cell76:1025-37(1994);Lambetal"NatureGenetics5:22-30(l朔)；Rabindranetal"Science259:230-4(1993))等。通過將特異性已知的單克隆抗體的表位導(dǎo)入多肽的N末端或C末端，可以以包含單克隆抗體識別位點(表位)的融合蛋白的形式表達由CST6或GABRP基因編碼的多肽。可以使用市售的表位-抗體系統(tǒng)(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。利用其多克隆位點來表達含例如卩-半乳糖苷酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、綠色熒光蛋白(GFP)等的融合蛋白的載體是可以通過商業(yè)途徑得到的。還報道了通過僅導(dǎo)入由幾個到十幾個氨基酸組成的小表位而制備的融合蛋白，使得CST6或GABRP多肽的特性不會因融合而改變。表位，諸如聚組氨酸(His標(biāo)簽)、流感聚集體HA、人c-myc、FLAG、水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7標(biāo)簽)、人單純皰滲病毒糖蛋白(HSV標(biāo)簽)、E標(biāo)簽(單克隆噬菌體上的表位)等，及識別它們的單克隆抗體都可以作為表位-抗體系統(tǒng)用于篩選能與CST6或GABRP多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)(ExperimentalMedicine13:85-90(1995》。在免疫沉淀中，通過向使用合適的洗滌劑制備的細胞裂解物中添加這些抗體，形成了免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合物由CST6或GABRP多肽、具有與該多肽結(jié)合能力的多肽和抗體組成。在使用針對上述表位的抗體外，還可以使用針對CST6或GABRP多肽的抗體來進行免疫沉淀，所述抗體可以如上所述制備。當(dāng)抗體是小鼠IgG抗體時，可以通過例如蛋白Asepharose或蛋白Gsepharose來沉淀免疫復(fù)合物。如杲將由CST6或GABRP基因編碼的多肽制備成帶有表位諸如GST的融合蛋白，那么可使用與這些表位特異性結(jié)合的物質(zhì)，諸如谷胱甘肽-Sepharose4B，按照與使用針對CST6或GABRP多肽的抗體相同的方式形成免疫復(fù)合物。免疫沉淀可以遵循或依照例如文獻(HarlowandLane,Antibodies,511-52，ColdSpringHarborLaboratorypublications,NewYork(1988))中的方法進行。通常使用SDS-PAGE對免疫沉淀的蛋白質(zhì)進行分析，可以使用合適濃度的凝膠通過蛋白質(zhì)的分子量來分析所結(jié)合的蛋白質(zhì)。由于與CST6或GABRP多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)難以通過常規(guī)染色法諸如考馬斯染色或銀染色來檢測，因而可以如下改進蛋白質(zhì)檢測靈敏度在含有放射性同位素"S-曱疏氨酸或"S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，標(biāo)記細胞中的蛋白質(zhì)，并檢測該蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)的分子量已知時，可以從SDS-聚丙蜂酰胺凝膠直接純化靶蛋白并測定其序列。作為使用多肽來篩選能與CST6或GABRP多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法，可以使用例如West-Western印跡分析(Skolniketal.,Cell65:83-90(1991))。具體的說?？梢匀缦芦@得能與CST6或GABRP多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)使用噬菌體載體(例如ZAP)由預(yù)計表達能與CST6或GABRP多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的細胞、組織、器官(例如組織諸如用于CST6的胎盤或曱狀腺或者用于GABRP的氣管、前列腺或胃)或培養(yǎng)的細胞(例如用于CST6的PK-59或PK-1或者用于GABRP的KLM-1或PK-45P)制備cDNA文庫，在LB-瓊脂糖上表達該蛋白質(zhì)，將所表達的蛋白質(zhì)固定在濾膜上，使經(jīng)過純化和標(biāo)記的CST6或GABRP多肽與上述濾膜反應(yīng)，并根據(jù)標(biāo)記物來檢測表達能與CST6或GABRP多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的噬菌斑。可以利用生物素與親合素之間的結(jié)合，或者利用能與CST6或GABRP多肽或者CST6或GABRP多肽所融合的肽或多肽(例如GST)特異性結(jié)合的抗體，來標(biāo)記本發(fā)明的多肽。也可以采用使用放射性同位素或熒光等的方法?；蛘撸诒景l(fā)明篩選方法的另一個實施方案中，可以使用利用細胞的雙雜交系統(tǒng)("MATCHMAKER雙雜交系統(tǒng)"、"哺乳動物MATCHMAKER雙雜交測定試劑盒"、"MATCHMAKER單雜交系統(tǒng)"(Clontech);"HybriZAP雙雜交載體系統(tǒng)，，(Stratagene);參見DaltonandTreisman,Cell68:597-612(1992);FieldsandSternglanz，TrendsGenet10:286-92(1994))。在雙雜交系統(tǒng)中，將本發(fā)明的多肽與SRF結(jié)合區(qū)或GAL4結(jié)合區(qū)融合，并在酵母細胞中表達。由預(yù)計表達能與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的細胞制備該cDNA文庫導(dǎo)入上述酵母細胞，并從檢測為陽性的克隆分離衍生自該文庫的cDNA(當(dāng)在酵母細胞中表達能與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)時，兩者的結(jié)合激活報告基因，使得陽性克隆可檢測出)。通過將上述分離的cDNA導(dǎo)入大腸桿菌并表達蛋白質(zhì)，可以制備由該cDNA編碼的蛋白質(zhì)。作為報告基因，在HIS3基因外，可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。還可以使用親和層析來篩選能與由CST6或GABRP基因編碼的多肽結(jié)合的化合物。例如，可以將本發(fā)明的多肽固定在親和柱的載體上，并將測試化合物施加至該柱，所述測試化合物包含能與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)。此處的測試化合物可以是例如細胞提取物、細胞裂解物等。在加載測試化合物后，對柱進行洗滌，并可制備出已與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。當(dāng)測試化合物是蛋白質(zhì)時，分析所得蛋白質(zhì)的氨基S拼列，基于該序列合成寡聚DNA,并使用該寡聚DNA作為探針來篩選cDNA文庫以獲得編碼該蛋白質(zhì)的DNA。在本發(fā)明中，可以將使用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器用作對所結(jié)合的化合物進行檢測或定量的手段。在使用此類生物傳感器時，只使用極少量的多肽且不需標(biāo)記(例如BIAcore,Pharmacia),可將本發(fā)明多肽與測試化合物之間的相互作用實時觀察為表面等離子體共振信號。因此，有可能使用生物傳感器諸如BIAcore來評估本發(fā)明多肽與測試化合物之間的結(jié)合。將固定化的CST6或GABRP多肽暴露于合成化學(xué)化合物、天然物質(zhì)庫或隨機噬菌體肽展示文庫后篩選與之結(jié)合的分子的方法，及基于組合化學(xué)技術(shù)使用高通量來分離與能與CST6或GABRP蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)和化學(xué)化合物(包括激動劑和拮抗劑)的篩選方法(Wrightonetal.，Science273:458-64(1996);Verdine,Nature384:11-13(19%);Hogan，Nature384:17-9(1996))是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的?；蛘?，本發(fā)明提供了使用由CST6或GABRP基因編碼的多肽篩選用于治療或預(yù)防PDAC的化合物的方法，其包括以下步驟(a)使測試化合物與由CST6或GABRP的多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測步驟(a)的多肽的生物學(xué)活性；并(c)選擇與不存在測試化合物的條件下檢測到的由CST6或GABRP的多核苷酸編碼的多肽生物學(xué)活性相比抑制該多肽生物學(xué)活性的測試化合物。既然CST6或GABRP蛋白具有促進PDAC細胞的細胞增殖的活性，因而可以使用該活性為指標(biāo)，篩選能抑制該蛋白質(zhì)的該活性的化合物。只要具有CST6或GABRP蛋白的生物學(xué)活性，任何多肽均可用于篩選。此類生物學(xué)活性包括人CST6或GABRP蛋白的細胞增殖活性。例如，可以使用人CST6或GABRP蛋白，也可以使用與這些蛋白質(zhì)在功能上等同的多肽。23此類多肽可以是細胞內(nèi)源性或外源性表達的。通過這種篩選而分離的化合物是由CST6或GABRP基因編碼的多肽的激動劑或拮抗劑的候選物。術(shù)語"激動劑"指通過與多肽結(jié)合而活化其功能的分子。然而，該術(shù)語也指激活或增強編碼CST6或GABRP的基因表達的分子。同樣，術(shù)語"拮抗劑"指通過與多肽結(jié)合而抑制其功能的分子。但是，該術(shù)語也指降低或抑制編碼CST6或GABRP的基因表達的分子。而且，通過這種篩選分離出的化合物是抑制CST6或GABRP多肽與分子(包括DNA和蛋白質(zhì))在體內(nèi)相互作用的候選化合物。當(dāng)本發(fā)明方法中所檢測的生物學(xué)活性為細胞增殖時，可以如實施例所述如下檢測生物學(xué)活性制備表達CST6或GABRP多肽的細胞，在存在測試化合物的條件下培養(yǎng)該細胞，并測定細胞增殖速度、測量細胞周期等、以及測量集落形成活性。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了篩選用于治療或預(yù)防PDAC的化合物的方法。如上詳細描述，通過控制CST6或GABRP的表達水平，可以控制PDAC的發(fā)作和進展。因而，通過以CST6或GABRP的表達水平為指標(biāo)進行篩選，可以鑒定可用于治療或預(yù)防PDAC的化合物。在本發(fā)明的上下文中，這樣的篩選可包括例如以下步驟a)使候選化合物與表達CST6或GABRP的細胞接觸；并b)選擇與對照相比降低CST6或GABRP表達水平的候選化合物。表達CST6或GABRP的細胞包括例如由PDAC建立的細胞系；這樣的細胞可以用于本發(fā)明的上述篩選(例如用于CST6的PK-59或PK-1或者用于GABRP的KLM-1或PK-45P)。表達水平可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法來評估。在篩選方法中，可選擇降低CST6或GABRP表達水平的化合物作為用于治療或預(yù)防PDAC的候選藥劑。或者，本發(fā)明的篩選方法可包括以下步驟a)使候選化合物與導(dǎo)入了載體的細胞接觸，其中所述載體包含CST6或GABRP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的控制下表達的報告基因；b)測量所述報告基因的表達水平或活性；并c)選擇降低所述報告基因表達水平或活性的候選化合物。合適的報告基因和宿主細胞是本領(lǐng)域眾所周知的。使用標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，可以制備篩選所需的報告子構(gòu)建體。當(dāng)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)時，可以使用先前的序列信息來制備報告子構(gòu)建體。當(dāng)標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)仍未鑒定時，可以基于標(biāo)志基因的核苷酸序列信息從基因組文庫中分離包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的核苷酸區(qū)段?？捎糜诮Y(jié)合蛋白質(zhì)的支持物的實例包括不溶性多糖，諸如瓊脂糖、纖維素和右旋糖芬；及合成樹脂，諸如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；優(yōu)選使用由上述材料制備的市售的珠和板(例如多孔板、生物傳感器芯片等)。使用珠子時，可以將其填入柱子。蛋白質(zhì)與支持物的結(jié)合可依照常規(guī)方法進行，諸如化學(xué)鍵合和物理吸附?；蛘?，蛋白質(zhì)可通過特異性識別該蛋白質(zhì)的抗體而與支持物結(jié)合。此外，還可以利用親合素與生物素來進行蛋白質(zhì)與支持物的結(jié)合。蛋白質(zhì)之間的結(jié)合在緩沖液中進行；例如但不限于磷酸鹽緩沖液和Tris緩沖液，只要緩沖液不抑制蛋白之間的結(jié)合即可。在本發(fā)明中，利用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器可用作對所結(jié)合蛋白質(zhì)檢測或定量的手段。使用這樣的生物傳感器(例如BIAcore,Pharmacia)時，僅使用極少量的多肽且無需標(biāo)記，即可將蛋白質(zhì)之間的相互作用實時觀察為表面等離子體共振信號?；蛘撸梢詷?biāo)記CST6或GABRP多肽，所結(jié)合蛋白質(zhì)的標(biāo)記物可用于檢測或測量所結(jié)合的蛋白質(zhì)。具體的說，對一種蛋白質(zhì)進行預(yù)標(biāo)記之后，在存在測試化合物的條件下使經(jīng)過標(biāo)記的蛋白質(zhì)與另一種蛋白質(zhì)接觸，然后在洗滌之后根據(jù)標(biāo)記物來檢測或測量所結(jié)合的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的方法中，可以使用標(biāo)記物質(zhì)來標(biāo)記蛋白質(zhì)，諸如放射性同位素(例如3H、"C、32P、33P、35S、125I、131I)、酶(例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、(3-半乳糖苷酶、(3-葡糖苷酶)、熒光物質(zhì)(例如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明)、和生物素/親合素。在用放射性同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)時，可通過液體閃爍法進行檢測或測量?；蛘?，通過加入酶的底物，用吸收光度計(absorptiometer)檢測底物的酶促變化諸如顏色的產(chǎn)生，可以檢測或測量用酶標(biāo)記的蛋白質(zhì)。此外，在將熒光物質(zhì)用作標(biāo)記物的情況中，可使用熒光光度計來檢測或測量所結(jié)合的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的篩選中使用抗體的情況中，抗體優(yōu)選用上述標(biāo)記物質(zhì)之一進行標(biāo)記，并基于標(biāo)記物質(zhì)進行^^測或測量。或者，也可以將針對CST6或GABRP多肽的抗體用作第一抗體，使用以標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的第二抗體對其進行檢測。此外，本發(fā)明的篩選中與蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體可使用蛋白G或蛋白A柱進4于;險測或測量?；蛘撸诒景l(fā)明篩選方法的另一個實施方案中，可以使用利用細胞的雙雜交系統(tǒng)("MATCHMAKER雙雜交系統(tǒng)"、"哺乳動物MATCHMAKER雙雜交測定試劑盒"、"MATCHMAKER單雜交系統(tǒng)，，(Clontech);"HybriZAP雙雜交載體系統(tǒng)，，(Stratagene);參見DaltonandTreisman,Cell68:597-612(1992);FieldsandStemglanz，TrendsGenet10:286-92(1994))。在雙雜交系統(tǒng)中，將本發(fā)明的CST6或GABRP多肽與SRF結(jié)合區(qū)或GAL4結(jié)合區(qū)融合并在酵母細胞中表達。作為報告基因，在HIS3基因夕卜，可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。在本發(fā)明中，GABAa受體拮抗剤曱碘荷包牡丹堿(Bicucullinemethiodide，BMI)在GABRP陽性PDAC細胞系中抑制細胞增殖。因此，GABAa受體拮抗劑可用于治療和預(yù)防PDAC。因此，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防受試者中的胰腺癌的方法，所述方法包括使用制藥學(xué)有效量的GABAa受體(GABRA)拮抗劑的步驟?；蛘撸景l(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防胰腺癌的組合物，所述組合物包括包含作為活性成分的制藥學(xué)有效量的GABAA受體(GABRA)拮抗劑及制藥學(xué)可接受載體。在本發(fā)明中，優(yōu)選的GABAA受體(GABRA)拮抗劑是荷包牡丹堿或其制藥學(xué)可接受的季銨鹽。具體而言，荷包牡丹堿的制藥學(xué)可接受季銨鹽可以包括荷包牡丹堿的甲碘化物、曱溴化物、曱氯化物或曱醇鹽(methoxide)。荷包牡丹堿(CAS注冊號19730-80-4)是眾所周知的A型，氨基丁酸受體拮抗劑(KardosJetal.,EurJPharmacol337/1:83-86(1997，Oct.15))。然而，用荷包牡丹堿抑制PDAC的細胞增殖是新方法。此外，GABAA受體拮抗劑可用于治療或預(yù)防PDAC。因此，本發(fā)明提供了篩選可用于治療或預(yù)防PDAC的化合物的方法。此篩選方法的一個實施方案包括以下步驟(a)在存在測試化合物的條件下使GABA或其類似物與GABRP接觸，并檢測GABRP與GABA或其類似物的結(jié)合活性；(b)選擇與不存在測試化合物的條件下所檢測到的結(jié)果相比降低步驟(a)中檢測到的結(jié)合活性的化合物。在本發(fā)明中，術(shù)語GABA指神經(jīng)遞質(zhì)Y-氨基丁酸。GABA在成熟腦中主要發(fā)揮抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的功能。它在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中還可以發(fā)揮營養(yǎng)因子的作用以影響神經(jīng)細胞等的增殖、遷移和分化。"類似物"在本文中指配包括天然的和人工合成的這兩類化合物。GABRP不僅可作為天然蛋白來制備，還可以通過基因重組技術(shù)作為重組蛋白來制備。天然蛋白可通過例如親和層析來制備。另一方面，重組蛋白可如下制備，即培養(yǎng)經(jīng)過編碼GABRP的DNA轉(zhuǎn)化的細胞以表達該蛋白質(zhì)，然后回收之。GABRP與GABA或其類似物的結(jié)合活性可使用附著于GABA或其類似物的標(biāo)記物來檢測(例如所結(jié)合的量通過;^文射性或熒光強度來測定)?；蛘?，標(biāo)。在本發(fā)明的篩選方法中可以使用任何測試化合物，例如細胞4是取物、細胞培養(yǎng)物上清液、微生物發(fā)酵產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗制的蛋白質(zhì)、肽、非肽化合物、合成小分子化合物和天然化合物。在本發(fā)明中，測試化合物還可以使用本領(lǐng)域已知的組合文庫法的多種方法的任一種獲得，包括(l)生物學(xué)文庫，(2)空間定位平行固相或溶液相文庫(spatiallyaddressableparallelsolidphaseorsolutionphaselibraries),(3)需要重疊合法(deconvolution)的合成文庫法，(4)"一珠一化合物，，(onebeadonecompound)文庫法，和(5)使用親和層析選擇的合成文庫法。使用親和層析選擇的生物學(xué)文庫法限于肽文庫，而其它四種方法適用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文庫(Lam,AnticancerDrugDes12:145(1997))。合成分子文庫的方法的例子可在本領(lǐng)域找到(DeWittetal.,ProcNatlAcadSciUSA卯6909(1993);Erbetal.，ProcNatlAcadSciUSA91:11422(1994);Zucke謹nnetal.,JMedChem37:2678(1994);Choetal"Science261:1303(1993);Carelletal"AngewChemIntEdEngl33:2059(1994);Carelletal.,Angew.ChemIntEdEngl33:2061(1994);Gallopetal.,JMedChem37:1233(1994))?；衔镂膸炜纱嬖谟谌芤褐?參見Houghten，Bio/Techniques13:412(1992》、珠子上(Lam,Nature354:82(1991))、芯片上(Fodor,Nature364:555(1993))、細菌上(美國專利5，223,409)、孢子上(美國專利5,571,698;5,403,484和5，223，409)、質(zhì)粒上(Culletal"ProcNatlAcadSciUSA89:1865(1992))或噬菌體上(ScottandSmith,Science249:386(1990);Delvin，Science249:404(1990);Cwirlaetal"ProcNatlAcadSciUSA87:6378(1990);Felici,JMolBiol222:301(1991);美國專利申請20020103360)。通過本發(fā)明篩選方法分離的化合物是抑制CST6或GABRP多肽的活性、用于治療或預(yù)防可歸于例如細胞增殖性疾病的疾病、諸如PDAC的藥物候選用于治療或預(yù)防PDAC的藥物組合物本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防胰腺癌的組合物，其包含通過本發(fā)明的篩選方法選4奪出的任何化合物。在將通過本發(fā)明方法分離出的化合物作為藥物施用于人和其它哺乳動物諸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓、犬、綿羊、豬、牛、猴、狒狒和黑猩猩時，分離的化合物可以直接施用，或者可以使用已知的藥物制備方法配制成劑型。例如，根據(jù)需要，藥物可以作為糖衣片劑、膠嚢劑、酏劑和微膠嚢劑口服施用；或者用水或任何其它制藥學(xué)可接受液體配制成無菌溶液或懸浮液，以注射的形式非口服施用。例如，可以將化合物以普遍接受的藥物實施(implementation)所需的單位劑型與藥理學(xué)可接受載體或介質(zhì)混合，具體為無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、芳香劑、賦形劑、媒介物、防腐劑、粘合劑等。這些制劑中所包含的有效成分的量是可獲得的指定范圍內(nèi)的合適劑量?？梢曰旌系狡瑒┖湍z嚢中的添加劑的例子包括但不限于粘合劑，諸如明膠、玉米淀粉、黃蓍膠和阿拉伯膠；賦形劑，諸如結(jié)晶纖維素；溶脹劑，諸如玉米淀粉、明膠和褐藻酸；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂；增甜劑，諸如蔗糖、乳糖或糖精；和芳香劑，諸如薄荷、Gaultheriaadenothrix油和櫻桃。若單位劑量形式為膠嚢劑，則上述成分中還可以包括液體載體，諸如油。注射用無菌組合物可以使用媒介物諸如注射用蒸餾水，遵循正規(guī)藥物實施進行配制。生理鹽水、葡萄糖及包含佐劑諸如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉的其它等滲液體可用作注射用水溶液。這些可以與合適的增溶劑組合使用，諸如醇，例如乙醇；多元醇，諸如丙二醇和聚乙二醇；及非離子表面活性劑，諸如Polysorbate80tm和HCO-50。芝麻油或大豆油可用作油質(zhì)液體，它們可以與苯曱酸苯曱酯或苯甲醇組合使用作為增溶劑，而且可以與緩沖液，諸如磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩沖液；止痛藥，諸如鹽酸普魯卡因；穩(wěn)定劑，諸如苯曱醇和酚；和/或抗氧化劑配制在一起。所制備的注射劑可以裝入合適的安瓿?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法給患者施用本發(fā)明的藥物組合物，例如動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)或經(jīng)皮注射或者鼻內(nèi)、經(jīng)支氣管、月幾肉內(nèi)或口服施用。施用的劑量和方法根據(jù)患者的體重和年齡及施用方法而變化；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)選擇合適的施用方法。如果所述化合物可以由DNA編碼，那么可以將該DNA插入基因療法的載體，并給患者施用該載體以進行治療。施用的劑量和方法根據(jù)患者的體重、年齡和癥狀而變化，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以合適的選擇它們。舉例來說，雖然能與本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的化合物的劑量取決于癥狀，在給正常體重成人(60kg)口服施用時，其劑量為約0.1mg到約100mg每天，優(yōu)選為約1.0mg到約50mg每天，更優(yōu)選為約l.Omg到約20mg每天。在以注射形式給正常體重成人(體重60kg)腸胃外施用時，雖然才艮據(jù)患者、靶器官、癥狀和施用方法存在一些差異，靜脈內(nèi)注射約0.01mg到約30mg每天，優(yōu)選約0.1mg到約20mg每天，更優(yōu)選約0.1mg到約10mg每天的劑量是合適的。在其它動物的情況中，可以通過換算為60kg體重而常規(guī)計算適宜的劑量。對胰腺癌患者的預(yù)后的評估本發(fā)明還提供了評估患有PDAC的受試者的預(yù)后的方法，包括將測試細胞群中的CST6或GABRP表達與來自疾病階段譜中一系列疾病階段患者的參照細胞群中的CST6或GABRP表達進行比較的步驟。通過比較測試細胞群與一個或多個參照細胞群中的CST6或GABRP基因表達，或者通過比較來自受試者的測試細胞群中基因表達的時間樣式，可以評估受試者的預(yù)后。例如，CST6或GABRP的表達與正常對照相比升高表明預(yù)后不太理想。相反，CST6或GABRP的表達與正常對照相比的相似性表明受試者的預(yù)后更加理想。優(yōu)選的是，可以通過比較CST6或GABRP的表達序型來評估受試者的預(yù)后。試劑盒本發(fā)明還包括PDAC檢測劑，例如能特異性結(jié)合或鑒定CST6或GABRP核酸的核酸，諸如與CST6或GABRP核酸的一部分互補的寡核香酸序列，DNA、RNA或肽適體，或者能與由CST6或GABRP核酸編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。檢測劑可以以試劑盒的形式包裝在一起。例如，可以將檢測劑包裝在不同的容器中，例如核酸或抗體(或與固體基質(zhì)結(jié)合，或與使其與基質(zhì)結(jié)合的試劑分開包裝)、對照試劑(陽性和/或陰性)、和/或可一全測標(biāo)記物。試劑盒中還可以包括實施測定的說明(例如書面說明書、磁帶、VCR、CD-ROM等)。試劑盒的測定方式可以是本領(lǐng)域已知的Northem雜交或夾心ELISA。例如，可以將PDAC檢測劑固定在固體基質(zhì)上，諸如多孔條(porousstrip),以形成至少一個PDAC檢測位點。多孔條的測量或檢測區(qū)可以包括多個位點，每個位點都含有核酸。測試條也可以包含陰性和/或陽性對照的位點?；蛘?，對照位點可以設(shè)置于與測試條不同的條上。任選的是，不同檢測位點可以包含不同量的固定化核酸，即第一個檢測位點的量較多，后續(xù)位點的量較少。添加測試樣品后，展現(xiàn)出可檢測信號的位點數(shù)目提供了樣品中存在的PDAC量的定量指標(biāo)(quantitativeindication)。4企測位點的形狀可以i殳置成任何合適的可檢測形狀，一般為跨越測試條寬度的條狀或點狀。抑制胰腺癌的方法本發(fā)明進一步提供了通過降低CST6或GABRP的表達(或其基因產(chǎn)物的活性)來治療或緩解受試者中的PDAC癥狀的方法?？梢詫⒑线m的治療化合物預(yù)防性或治療性的施用于患有或有風(fēng)險發(fā)生(或易感)PDAC的受試者。產(chǎn)物的異?；钚詠龛b定此類受試者。在本發(fā)明的上下文中，合適的治療劑包括例如細胞周期調(diào)控和細胞增殖的抑制劑?；蛘?，本發(fā)明的治療方法可以包括如下步驟降低在胰腺細胞中表達異常升高的CST6或GABRP基因("上調(diào)"或"過表達"的基因)產(chǎn)物的表達、功能或二者。可以按照本領(lǐng)域已知的數(shù)種方法中的任何一種來抑制表達。例如，可以通過給受試者施用能抑制或拮抗過表達基因的表達的核酸來抑制表達，所述核酸例如能破壞過表達基因的表達的反義寡核芬酸或小干擾RNA。當(dāng)然，本文所述治療或緩解方法的實施方案在必要改動后適用于使用本文所述能降低CST6或GABRP表達(或其基因產(chǎn)物的活性)的化合物來制備用于治療或緩解受試者中PDAC癥狀的藥物組合物。這樣的化合物可以是例如反義、siRNA、抗體、適體或核酶組合物。反義核酸和siRNA如上所述，與CST6或GABRP的核苷酸序列對應(yīng)的反義核酸可用于降低該基因的表達水平。與在胰腺癌中上調(diào)的CST6或GABRP對應(yīng)的反義核酸可用于治療胰腺癌。具體而言，本發(fā)明的反義核酸可如下發(fā)揮作用，即與CST6或GABRP的核苷酸序列或其相應(yīng)的mRNA結(jié)合，由此抑制基因的轉(zhuǎn)錄或反義，促進mRNA的降解，和/或抑制由CST6或GABRP編碼的蛋白質(zhì)的表達，由此抑制蛋白質(zhì)的功能。術(shù)語"反義核酸"在用于本文時涵蓋與靶序列完全互補的核苷酸和具有一個或多個核苷酸錯配的核普酸，只要反義核酸能與靶序列發(fā)生特異性雜交。例如，本發(fā)明的反義核酸包括這樣的多核苷酸，它們在至少15個連續(xù)核苷酸的跨度上具有至少70%或更高、優(yōu)選至少80%或更高、更優(yōu)選90%或更高、甚至更優(yōu)選95。/?；蚋叩耐葱浴？墒褂帽绢I(lǐng)域已知算法來確定同源性。本發(fā)明的反義核酸可如下作用于生成由CST6或GABRP編碼的蛋白質(zhì)的細胞，即與編碼蛋白質(zhì)的DNA或mRNA結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄或翻i奪，促進mRNA降解，并抑制蛋白質(zhì)表達，由此導(dǎo)致對蛋白質(zhì)功能的抑制。通過與對核酸無活性的合適基質(zhì)混合，可以將本發(fā)明的反義核酸制成外用制劑，諸如搽劑(liniment)或罨劑(poultice)。同樣，根據(jù)需要，通過添加賦形劑、等滲劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、止痛藥等，可以將本發(fā)明的反義核酸配制成片劑、粉劑、顆粒劑、膠嚢、脂質(zhì)體膠嚢、注射劑、溶液、滴鼻劑和冷凍干燥劑。這些可以依照已知方法來制備。通過直接施加到患處上或通過注射到血管中使其到達患處，可以將本發(fā)明的反義核酸給予患者。也可以使用反義-封固劑(mountingmedium)來提高持久性和膜通透性。例子包括脂質(zhì)體、聚-L-賴氨酸、脂質(zhì)、膽固醇、脂轉(zhuǎn)染劑、或它們的衍生物。本發(fā)明反義核酸衍生物的劑量可以根據(jù)患者的狀況進行調(diào)整并以所需量使用。例如，可使用的劑量范圍為0.1-100mg/kg,優(yōu)選為0.1-50mg/kg。本發(fā)明的反義核酸能抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達，因此可用于抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。另外，表達抑制劑，包括本發(fā)明的反義核酸，因其可抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性而是有用的。本發(fā)明的反義核酸包括經(jīng)過修飾的寡核香酸。例如，可以使用硫代磷酸酯(thioated)寡核苦酸賦予寡核苦酸以核酸酶抗性。同樣，針對CST6或GABRP的siRNA可用于降低CST6或GABRP的表達水平。在本文中，術(shù)語"siRNA"指能阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子?？梢允褂脴?biāo)準技術(shù)將siRNA導(dǎo)入細胞，包括那些其中使用DNA作為轉(zhuǎn)錄RNA的模板的。在本發(fā)明的上下文中，siRNA包含針對上調(diào)標(biāo)志基因，諸如CST6或GABRP的有義核酸序列及反義核酸序列。構(gòu)建siRNA使其單一轉(zhuǎn)錄物具有來自靶基因的有義序列及互補的反義序列二者，例如為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。CST6或GABRP的siRNA與靶mRNA發(fā)生雜交，通過與通常的單鏈mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，由此干擾翻譯，并由此干擾蛋白質(zhì)的表達，來降低或抑制由CST6或GABRP編碼的多肽的生成。如此，本發(fā)明的siRNA分子可以通過其在嚴格條件下與CST6或GABRP的mRNA發(fā)生特異性雜交的能力來限定。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語"雜交"或"特異性雜交"用于指兩個核酸分子在"嚴格雜交條件"下發(fā)生雜交的能力。術(shù)語"嚴格雜交條件"指核酸分子會與(通常是在復(fù)雜核酸混合物中的)其靶序列發(fā)生雜交，但檢測不到與其它序列發(fā)生雜交的條件。嚴格條件依賴于序列，并且在不同情況中是不同的。較長序列在較高溫度發(fā)生特異性雜交。關(guān)于核酸雜交的全面指導(dǎo)見于Tijssen,TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucleicProbes,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)。通常，選擇的嚴格條件比特定序列在限定離子強度、pH下的熱解鏈溫度(Tm)低約5-10。C。Tm是(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)過量時，在Tm,有50°/。的探針在平衡狀態(tài)下被占用)。通過添加去穩(wěn)定劑，諸如甲酰胺也可以實現(xiàn)嚴格條件。對選擇性或特異性雜交而言，陽性信號為背景的至少2倍，優(yōu)選背景雜交的10倍。例示性的嚴格雜交條件可以如下在50%甲酰胺、5xSSC和10/0SDS中于42。C溫育，或者在5xSSC、1%SDS中于65。C溫育，然后用0.2xSSC、0.1。/oSDS于50。C進行洗滌。在本發(fā)明的上下文中，siRNA的長度優(yōu)選小于500、200、100、50或25個核苷酸。更優(yōu)選的是，siRNA的長度為19-25個核苦酸。用于生成CST6或GABRPsiRNA的例示性核酸序列包含SEQIDNO:15、19、23、27或31的核苷酸序列作為靶序列。在RNA或其衍生物中，核普酸序列中的堿基"t"應(yīng)當(dāng)用"u"替換。因此，例如，本發(fā)明提供了包含以下核苦酸序列的雙鏈RNA分子5'-gugguucccuggcagaacu-3，(SEQIDNO:15)、5'-gaugggcaggauuguugau-3，(SEQIDNO:19)、5'-uaucaucaacagciuccauc-3,(SEQIDNO:23)、5'-ccccaguaauguugaucac-3'(SEQIDNO:27)或5'-aggaaguagaagaagucag-3，(SEQIDNO:31)。為了增強siRNA的抑制活性，可以將核苷酸"u"添加到靶序列反義鏈的3，端。待添加的"u"的數(shù)目為至少2個，一般為2-10個，優(yōu)選為2-5個。所添加的"u，，在siRNA反義鏈的3，端形成單鏈?？梢詫ST6或GABRPsiRNA以能夠與mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的形式直接導(dǎo)入細胞。在這些實施方案中，本發(fā)明的siRNA分子通常如上文關(guān)于反義分子所述進行^f奮飾。其它修飾也是可能的，例如偶聯(lián)有膽固醇的siRNA顯示出改善的藥理學(xué)特性(Songetal.NatureMed9:347-51(2003))。或者，編碼siRNA的DNA被攜帶于載體中?？梢匀缦律奢d體，例如通過將CST6或GABRP靶序列克隆入表達載體，其中所述表達載體具有可操作連接的、以容許兩條鏈均能表達(通過DNA分子的轉(zhuǎn)錄)的方式位于該序列側(cè)翼的調(diào)控序列(Lee，N.S.，etal.,(2002)NatureBiotechnology20:500-505)。其為CST6或GABRPmRNA的反義鏈的RNA分子由第一啟動子(例如所克隆DNA3，端的啟動子序列)轉(zhuǎn)錄，其為CST6或GABRPmRNA的有義鏈的RNA分子由第二啟動子(例如所克隆DNA5'端的啟動子序列)轉(zhuǎn)錄。所述有義鏈與反義鏈在體內(nèi)雜交，從而產(chǎn)生用于沉默CST6或GABRP的siRNA構(gòu)建物?；蛘撸衫脙蓚€構(gòu)建物來制備siRNA構(gòu)建物的有義鏈和反義鏈。所克隆的CST6或GABRP可編碼具有二級結(jié)構(gòu)例如發(fā)夾的構(gòu)建物，其中單一轉(zhuǎn)錄物具有來自靶基因的有義序列及互補的反義序列二者。為了形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，可以在有義序列與反義序列之間放置由任意核苷酸序列組成的環(huán)序列。如此，本發(fā)明還提供了具有通式5，-[A]-[BHA，]-3，的siRNA,其中[A]為核糖核苷酸序列，其對應(yīng)于能與CST6或GABRP的mRNA或cDNA發(fā)生特異性雜交的序列。在優(yōu)選的實施方案中，[A]為對應(yīng)于CST6或GABRP的序列的核糖核香酸序列，為由3-23個核苷酸組成的核糖核苷酸序列，且為由[A]的互補序列組成的核糖核苷酸序列。[A]區(qū)與[A，]區(qū)發(fā)生雜交，然后形成由[B]區(qū)組成的環(huán)。環(huán)序列的長度可以優(yōu)選是3-23個核芬酸。環(huán)序列可以選自例如如下序列(http:〃www.ambion.com/techlib/tb/tb—506.html)。此外，由23個核芬酸組成的環(huán)序列也提供活性siRNA(Jacque,JMetal.,Nature418:435-438(2002))。CCC、CCACC或CCACACC:Jacque,J,M.，etal"Nature418:435-438(2002);UUCG:Lee,N.S.，etal.，NatureBiotechnology20:500-505(2002);Fruscoloni，P.etal.，ProcNatlAcadSciUSA100(4):1639-1644(2003);和UUCAAGAGA:Dykxhoorn，D.M.etal"NatureReviewsMolecularCellBiology4:457-467(2003)。因此，環(huán)序列可以選自由CCC、UUCG、CCACC、CCACACC和UUCAAGAGA組成的組。優(yōu)選的環(huán)結(jié)構(gòu)是UUCAAGAGA(DNA中為"ttcaagaga")。適用于本發(fā)明上下文的例示性發(fā)夾siRNA包括用于CST6-siRNA的5'-gugguucccuggcagaacu-[b]-aguucugccagggaaccac-3，(SEQIDNO:15的輩巴序歹'J)用于GABRP-siRNA的5'-gaugggcaggauuguugau-[b]-aucaacaauccugcccauc墨3，(SEQIDNO:19的輩巴序歹'J)5，-uaucaucaacagcuccauc-[b]陽gauggagcuguugaugaua-3，(SEQIDNO:23的革巴序歹寸)5'-ccccaguaauguugaucac-[b]-gugaucaacauuacugggg-3'(SEQIDNO:27的革巴序歹寸)5'-aggaaguagaagaagucag-[b]-cugacuucuucuacuuccu-3，(SEQIDNO:31的輩巴序歹ll)合適siRNA的核苷酸序列可4吏用乂人Ambion網(wǎng)站(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA一finder.html)可4尋至)J的siRNAi殳計計算機程序來設(shè)計。所述計算機程序基于如下方案選擇用于合成siRNA的核苷酸序列siRNA耙位點的選擇1.從對象轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開始向下游掃描，尋找AA二核香S吏序位點。Tuschl等人不推薦針對5，和3，非翻譯區(qū)(UTR)和鄰近起始密碼子的區(qū)域(75個堿基之內(nèi))設(shè)計siRNA,因為上述區(qū)域可能富含調(diào)控蛋白結(jié)合位點。UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物可干擾siRNA內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的結(jié)合。2.將所迷潛在靶位點與人基因組數(shù)據(jù)庫進行比較，不考慮與其它編碼序列有顯著同源性的任何靶序列。可使用可在NCBI服務(wù)器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上找到的BLAST(AltschulSFetal.,JMolBiol1990Oct5;215(3):403-10;AltschulSFetal.,NucleicAcidsRes1997Sep1;25(17):3389-402)來進行同源性搜索。3.選擇合格的靶序列用于合成。在Ambion，可優(yōu)選沿待評估基因的長度選擇數(shù)個靶序列。CST6或GABRP基因序列側(cè)翼的調(diào)控序列可以是相同的或不同的，使得可以獨立的、或者以時間性或空間性方式調(diào)控它們的表達。如下在細胞外轉(zhuǎn)錄siRNA,通過將CST6或GABRP模板分別克隆入包含例如來自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄單元或人H1RNA啟動子的載體使siRNA進行細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。為了將載體導(dǎo)入細胞，可以使用轉(zhuǎn)染增強劑。FuGENE(Rochediagnostices)、Lipofectamin2000(Invitrogen)，Oligofectamine(Invitrogen)牙口Nucleofector("WakopureChemical)可以用4乍壽爭染增強劑。本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA能抑制本發(fā)明多肽的表達，因此可用于抑制本發(fā)明多肽的生物學(xué)活性。另外，表達抑制劑，包括本發(fā)明的反義寡核苦酸或siRNA，因其可抑制本發(fā)明多肽的生物學(xué)活性因而是有用的。因此，包含本發(fā)明反義寡核苷酸或siRNA的組合物可用于治療胰腺癌?？贵w或者，在PDAC中過表達的CST6或GABRP的基因產(chǎn)物的功能可以通過施用能與該基因產(chǎn)物結(jié)合或能以其它方式抑制其功能的化合物來抑制。例如，所述化合物是能與CST6或GABRP的基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。本發(fā)明涉及抗體的使用，特別是針對由CST6或GABRP編碼的蛋白質(zhì)的抗體或其片段。在用于本文時，術(shù)語"抗體"指具有特定結(jié)構(gòu)、只與用于生成該抗體的抗原(即上調(diào)標(biāo)志的基因產(chǎn)物)或其密切相關(guān)抗原相互作用(即結(jié)合)的免疫球蛋白分子。此外，抗體可以是抗體片段或經(jīng)過修飾的抗體，只要它能結(jié)合由CST6或GABRP編碼的蛋白質(zhì)。例如，抗體片段可以是Fab、F(ab，)2、Fv或?qū)碜訦鏈和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接而成的單鏈Fv(scFv)(HustonJSetal.,ProcNatlAcadSciUSA85:5879-5883(1988))。更具體的說，可以通過用酶諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體來生成抗體片段?；蛘?，可以構(gòu)建編碼抗體片段的基因，將其插入表達載體，并在合適的宿主細胞中表達(參見例如CoMSetal.,JImmunol152:2968-2976(1994);BetterMandHorwitzAH,MethodsEnzymol178:476-496(1989);PluckthunAandSkerraA，MethodsEnzymol178:497-515(1989);LamoyiE，MethodsEnzymol121:652-663(1986);RousseauxJetal.，MethodsEnzymol121:663-669(1986);BirdREandWalkerBW,TrendsBiotechnol9:132-137(1991))?？贵w可以通過與多種分子諸如聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)來修飾。本發(fā)明提供了經(jīng)過這樣修飾的抗體。可通過化學(xué)修飾抗體來獲得經(jīng)過修飾的抗體。這些修飾方法是本領(lǐng)域常規(guī)的。體的框架區(qū)(FR)及恒定區(qū)的人源化抗體。此類抗體可使用已知技術(shù)來制備。人源化可通過用嚙齒類的CDR或CDR序列替換人抗體的相應(yīng)序列來進行(參見例如Verhoeyenetal.,Science239:1534-1536(1988))。因而，此類人源化抗體是嵌合抗體，其中基本上小于整個人可變域已被來自非人物種的相應(yīng)序列所替換。也可以使用在人框架區(qū)和恒定區(qū)外還包含人可變區(qū)的完全人的抗體。此類抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來制備。例如，體外方法涉及使用展示在p盆菌體上的人抗體片段的重組文庫(例如Hoogenboom&Winter,J.Mol.Biol.227:381(1992))。類似的，可通過將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動物，例如內(nèi)源免疫球蛋白基因部分或完全滅活的小鼠，來生成人抗體。該方法記載于例如美國專利Nos.6,150,584;5,545,807;5，545，806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016。在本發(fā)明的上下文中用于治療或緩解PDAC癥狀的抗體還可以是單鏈抗體?？梢孕薷臑樯蓡捂溈贵w而記載的技術(shù)(見美國專利4,946,778等)以適應(yīng)生成本發(fā)明多肽或其部分的單鏈抗體。針對癌細胞中發(fā)生的特定分子變化的癌癥療法已經(jīng)通過下述抗癌藥的臨床開發(fā)和管理機構(gòu)的批準被認定為有效用于治療晚期乳腺癌的曲妥單抗(trastuzumab)(Herceptin)、用于治療慢性骨髓性白血病的曱磺酸伊馬替尼(imatinibmethylate)(Gleevec)、用于治療非小細胞肺癌(NSCLC)的gefitinib(Iressa)和用于B細胞淋巴瘤和套細胞淋巴瘤的利妥昔單抗(rituximab)(抗CD20mAb)(CiardielloFetal.,ClinCancerRes.2001Oct;7(10):2958-70.Review;SlamonDJetal.，NEnglJMed2001Mar15;344(11):783-92;RehwaldUetal.,Blood2003Jan15;101(2):420-424;FangGetal.,Blood96:2246-2253((2000)))。這些藥物臨床上是有效的，并且比傳統(tǒng)抗癌劑具有更好的耐受性，因為它們僅僅靶向轉(zhuǎn)化細胞。因此，這些藥物不僅改善了癌癥患者的存活率和生活質(zhì)量，而且驗證了分子靶向癌癥療法的理念。另外，靶向藥物在與標(biāo)準化療組合使用時可增強標(biāo)準化療的功效(GianniL,Oncology63Suppl1:47-56(2002);KlejmanAetal.，Oncogene21:5868-5876(2002》。因此，未來的癌癥治療將很可能涉及將常規(guī)藥物與針對腫瘤細胞不同特性諸如血管發(fā)生和侵入的靶特異性藥劑組合。這些調(diào)控方法可以離體、體外(例如通過在存在藥劑的條件下培養(yǎng)細胞)或體內(nèi)(例如通過給受試者施用藥劑)進行。所述方法涉及施用蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組合或者核酸分子或核酸分子組合，作為抵制(counteract)差異表達基因的異常表達或其基因產(chǎn)物的異?；钚缘寞煼ā？梢杂棉卓?即降低或抑制)一種或多種過表達基因的活性的治療劑來治療特征在于基因和基因產(chǎn)物的表達水平或生物學(xué)活性(相對于未患有疾病或病癥的受試者)升高的疾病和病癥?？梢灾委熜曰蝾A(yù)防性的施用拮抗活性的治療劑。因此，可以用于本發(fā)明上下文中的治療劑包括例如(i)過表達基因的多肽或其類似物、衍生物、片段或同系物；(ii)過表達基因或基因產(chǎn)物的抗體；(iii)編碼過表達基因的核酸；(iv)反義核酸或"功能障礙(dysfUnctional)"的核酸(即由于過表達基因的核酸內(nèi)的異源插入所致)；(v)小干擾RNA(siRNA);或(vi)調(diào)節(jié)劑(即改變過表達多肽與其結(jié)合配偶(bindingpartner)之間相互作用的抑制劑和拮抗劑)。將功能障礙的反義分子用于通過同源重組來"敲除"多肽的內(nèi)源功能(參見例如Capecchi,Science244:1288-1292(1989))。可以通過如下對肽和/或RNA進行定量而容易的沖僉測出水平的升高，即通過獲取患者組織樣品(例如來自從活檢組織)，并在體外測定其RNA或肽水平、所表達的肽(或表達有所改變的基因的mRNA)的結(jié)構(gòu)和/或活性。本37領(lǐng)域公知的方法包括但不限于免疫測定法(例如通過Westem印跡分析、免疫沉淀接著十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫細胞化學(xué)等)和/或檢測mRNA表達的雜交測定法(例如Northern測定法、點印跡、原位雜交等)。預(yù)防性施用在出現(xiàn)疾病的明顯臨床癥狀之前進行，從而阻止疾病或病癥的出現(xiàn)或者延遲其進程。本發(fā)明的治療方法可以包括使細胞與能調(diào)節(jié)差異表達基因的基因產(chǎn)物的一種或多種活性的藥劑接觸的步驟。調(diào)控蛋白質(zhì)活性的藥劑的例子包括但不限于核酸、蛋白質(zhì)、這些蛋白質(zhì)的天然存在關(guān)聯(lián)配體、肽、肽模擬物及其它小分子。針對胰腺癌的疫苗接種本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防受試者中胰腺癌的方法，包括對所述受試者施用疫苗的步驟，該疫苗包含由CST6或GABRP的核酸編碼的多肽、該多肽的免疫學(xué)活性片段、或者編碼該多肽或其片段的多核苷酸。當(dāng)然，本發(fā)明還涉及由CST6或GABRP的核酸編碼的多肽、該多肽的免疫學(xué)活性片段、或者編碼該多肽或其片段的多核苷酸在制備用于治療或預(yù)防受試者中胰腺癌的疫苗組合物中的用途。施用所述多肽在受試者中誘發(fā)抗腫瘤免疫力。為了誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力，給有所需要的受試者施用由CST6或GABRP的核酸編碼的多肽、該多肽的免疫學(xué)活性片段、或者編碼該多肽或其片段的多核苷酸。此外，由CST6或GABRP的核酸編碼的多肽可誘發(fā)針對胰腺癌侵入的抗腫瘤免疫力。該多肽或其免疫學(xué)活性片段可用作針對PDAC的疫苗。在有些情況中，可以以結(jié)合至T細胞受體(TCR)或由抗原呈遞細胞(APC)諸如巨噬細胞、樹突細胞(DC)或B細胞呈遞的形式施用蛋白質(zhì)或其片段。由于DC具有強抗原呈遞能力，在APC中使用DC是最優(yōu)選的。在本發(fā)明中，針對PDAC的疫苗指有能力在接種后的動物中誘發(fā)抗腫瘤免疫力的物質(zhì)。依照本發(fā)明，由CST6或GABRP編碼的多肽或其片段建議為HLA-A24或HLA-A+0201限制表位肽，它們可誘導(dǎo)針對表達CST6或GABRP的PDAC細胞的有力且特異性的免疫應(yīng)答。如此，本發(fā)明還涵蓋使用多肽來誘發(fā)抗腫瘤免疫力的方法。一般而言，抗腫瘤免疫力包括諸如以下的免疫應(yīng)谷-誘導(dǎo)針對肺瘤的細胞毒性淋巴細胞，-誘導(dǎo)識別腫瘤的抗體，和-誘導(dǎo)抗腫瘤細胞因子的產(chǎn)生。因此，若某種蛋白質(zhì)在接種后的動物中誘導(dǎo)任一種上述免疫應(yīng)答，則確定該蛋白質(zhì)具有抗胂瘤免疫力誘導(dǎo)效果。蛋白質(zhì)對抗腫瘤免疫力的誘導(dǎo)可以通過在體內(nèi)或在體外觀察宿主中的免疫系統(tǒng)針對蛋白質(zhì)的應(yīng)答來檢測。例如，用于檢測細胞毒性T淋巴細胞誘導(dǎo)的方法是眾所周知的。具體而5，細胞分化為細胞毒性T細胞(或細胞毒性T淋巴細胞；CTL)，然后增殖(這稱為丁細胞活化)。因此，某種肽的CTL誘導(dǎo)可以通過將該肽經(jīng)由APC呈遞給T細胞并檢測CTL的誘導(dǎo)來評估。此外，APC具有激活CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、嗜曙紅細胞和NK細胞的效果。由于CD4十T細胞和CD8十T細胞在抗胂瘤免疫力中也是重要的，可使用這些細胞的活化效果作為指標(biāo)來評估肽的抗腫瘤免疫力誘導(dǎo)作用。周知的。在APC中，DC是具有最強CTL誘導(dǎo)作用的代表性APC。在該方法中，首先使測試多肽與DC接觸，然后使該DC與T細胞接觸。在與DC接觸后檢測到具有針對目的細胞的細胞毒性效果的T細胞，則表示該測試多肽具有誘導(dǎo)細胞毒性T細胞的活性。針對腫瘤的CTL活性可以使用例如"Cr標(biāo)記的肺瘤細胞的溶解作為指標(biāo)來檢測?；蛘撸褂?H-胸苷攝取活性或LDH(乳糖脫氳酶)釋放作為指標(biāo)來評估肺瘤細胞破壞程度的方法也是眾所周知的。在DC外，外周血單個核細胞(PBMC)也可用作APC。已才艮道可通過在存在GM-CSF和IL-4的條件下培養(yǎng)PBMC來增強CTL的誘導(dǎo)。相似的，已顯示通過在存在鑰孔i戚血藍蛋白(KLH)和IL-7的條件下培養(yǎng)PBMC來誘導(dǎo)CTL。通過這些方法證實為具有CTL誘導(dǎo)活性的測試多肽就是具有DC活化效應(yīng)和隨后的CTL誘導(dǎo)活性的多肽。因此，誘導(dǎo)針對胂瘤細胞的CTL的多肽可用作針對肺瘤的疫苗。此外，通過與多肽接觸而獲得誘導(dǎo)針對腫瘤的CTL的能力的APC也可用作針對腫瘤的疫苗。此外，通過APC呈遞多肽抗原而獲得細胞毒性的CTL也可用作針對腫瘤的疫苗。利用由APC和CTL引起的抗肺瘤免疫力的這些腫瘤治療方法稱為細胞免疫療法。一^L來說，在將多肽用于細胞免疫療法時，已知通過組合多種具有不同結(jié)構(gòu)的多肽并使它們與DC接觸來增加CTL誘導(dǎo)的效率。因此，在用蛋白質(zhì)片段刺激DC時，使用多種類型的片段的混合物是有利的?；蛘?，多肽對抗腫瘤免疫力的誘導(dǎo)可通過觀察針對胂瘤的抗體的產(chǎn)生的誘導(dǎo)來證實。例如，在用多肽免疫的實驗動物中誘導(dǎo)了針對該多肽的抗體時及在這些抗體抑制腫瘤細胞的生長時，可確定該多肽具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的能力。通過施用本發(fā)明的疫苗來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力，而且該抗腫瘤免疫力的誘導(dǎo)能夠治療和預(yù)防PDAC。針對癌癥的治療或?qū)Π┌Y發(fā)作的預(yù)防包括任何下述步驟，諸如癌性細胞生長的抑制，癌癥的退化(involution)及癌發(fā)生的抑制。癌癥的治療或預(yù)防效果還包括患有癌癥的個體的死亡率和發(fā)病率的降j氐、血液中腫瘤標(biāo)記物水平的減少、癌癥伴發(fā)的可檢測癥狀的緩解等。此類治療和預(yù)防效果優(yōu)選是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。例如，將疫苗對細胞增殖性疾病的治療或預(yù)防效果與未施用疫苗的對照進行比較，觀察到的顯著性水平為5%或更低。例如，可以將Student氏t檢驗、Mann-WhitneyU檢驗或ANOVA用于統(tǒng)計學(xué)分析。上述具有免疫學(xué)活性的蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的載體可以與佐劑組合。佐劑指在與具有免疫學(xué)活性的蛋白質(zhì)一起(或相繼)施用后能增強針對該蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的化合物。佐劑的例子包括但不限于霍亂毒素、沙門氏菌毒素、明礬等。此外，本發(fā)明的疫苗可適當(dāng)?shù)呐c制藥學(xué)可接受載體組合。此類載體的例子有無菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)液等。此外，疫苗可以在必要時包含穩(wěn)定劑、懸浮劑、防腐劑、表面活性劑等。疫苗可全身或局部施用。疫苗施用可以通過單次施用進行，或者通過多次施用來強化。在使用APC或CTL作為本發(fā)明的疫苗時，可以通過例如離體方法來治療或預(yù)防腫瘤。更具體的說，收集接受治療或預(yù)防的受試者的PBMC,使該細胞與多肽在離體條件下接觸，并在誘導(dǎo)APC或CTL后將該細胞施用于受試者。也可通過將編碼多肽的載體在離體條件下導(dǎo)入PBMC來誘導(dǎo)APC?？梢栽谑┯们翱寺〗?jīng)過體外誘導(dǎo)的APC或CTL。通過克隆和培養(yǎng)對靶細胞具有高破壞活性的細胞，可以更有效的實施細胞免疫療法。此外，以該方式分離的APC和CTL不僅可用于針對提供細胞的受試者進行細胞免疫療法，還可以用于針對來自其他個體的相似類型腫瘤進行細胞免疫療法。此外，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防細胞增殖性疾病諸如癌癥的藥物組合物，其包含制藥學(xué)有效量的本發(fā)明多肽。該藥物組合物可用于引發(fā)抗腫瘤免疫力。用于抑制PDAC的藥物組合物在本發(fā)明的上下文中，合適的藥物制劑包括那些適于口服、直腸、鼻、局部(包括口腔或舌下)、陰道或腸胃夕卜(包括肌肉內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi))施用的制劑，或者適于通過吸入或吹入施用的制劑。優(yōu)選靜脈內(nèi)施用。制劑任選包裝在離散的劑量單位(dosageunit)中。適于口服施用的藥物制劑包括膠嚢劑、扁嚢劑或片劑，各自含有預(yù)定量的活性成分。合適的制劑還包括粉劑、顆粒劑、溶液、懸浮液和乳液?；钚猿煞秩芜x以大丸劑(bolus)、藥糖劑(electuary)或糊劑(paste)的形式施用。用于口服施用的片劑和膠嚢劑可含有常規(guī)賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、潤滑劑、崩解劑和/或濕潤劑。片劑可通過壓制或模制來制備，其中任選含有一種或多種配方成分。壓制片劑可如下制備在合適的機器中對自由流動形式(諸如粉末或顆粒)的活性成分進行壓制，任選與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、潤滑劑、表面活性劑和/或分散劑混合。模制片劑可如下制備在合適的機器中對用惰性液體稀釋劑濕潤的粉末化化合物的混合物進行模制。片劑可依照本領(lǐng)域已知方法進行包衣?？诜后w制備物可以是例如水性或油性的懸濁液、溶液、乳液、糖漿或酏劑的形式，或者也可以作為干燥產(chǎn)物提供，在使用前用水或其它適宜^某介物制成。所述液體制備物可含有常規(guī)添加劑，諸如懸浮劑、乳化劑、非水性媒介物(可包括食用油)和/或防腐劑。片劑可任選配制成提供其中活性成分的緩慢釋放或受控釋放。片劑的包裝中可以包含每月服用的一片藥物。適于腸胃外施用的制劑包括水性和非水性的無菌注射溶液，其中任選含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得制劑與目標(biāo)受體的血液等滲的溶質(zhì)；以及水性和非水性的無菌懸浮液，其中含有懸浮劑和/或增稠劑。所述制劑可以以單位劑量或多劑量容器提供，例如密封的安瓿和小瓶，還可以在冷凍-干燥(凍干)條件下保存，這樣僅需要臨使用前添加無菌液體載體例如鹽水、注射用水?；蛘?，可提供所述制劑用于連續(xù)輸注。即配即用的注射溶液和懸浮液可由前述的無菌粉劑、顆粒劑和片劑類型制備。適于直腸施用的制劑包括含標(biāo)準載體諸如可可脂或聚乙二醇的栓劑。適于口腔局部施用，例如口腔或舌下施用的制劑包括錠劑(lozenge)和軟錠劑(pastille),其中錠劑在調(diào)味基質(zhì)，諸如蔗糖和阿拉伯樹膠或黃蓍膠中包含活性成分，而軟錠劑在基質(zhì)，諸如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠中包含活性成分。鼻內(nèi)施用時，本發(fā)明的化合物可以用作液體噴霧劑、可分散粉劑、或以滴劑的形式。滴劑可用水性或非水性基質(zhì)配制，該基質(zhì)中也含有一種或多種分散劑、增溶劑和/或懸浮劑。吸入給藥時，可以由吹入器、霧化器、加壓包裝(pressurizedpack)或其它投遞氣溶膠噴霧的便利裝置方便地投遞化合物。加壓包裝可含有適宜的壓縮氣體推進劑(propdlant)，諸如二氯二氟甲烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適宜氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過提供投遞計量量(meteredamount)的閥門來確定劑量單4立?；蛘撸ㄟ^吸入或吹入施用時，化合物可以是干^^分組合物的形式，例如該化合物與合適粉末基質(zhì)(諸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末組合物可以以單位劑量形式提供，例如膠嚢、藥筒(cartridge),凝膠(gelatin)或泡罩包裝(blisterpack),借助吸入器或吹入器施用粉劑。其它的制劑包括能釋放治療劑的可植入裝置和粘性貼片。需要時，可以采用適于持續(xù)釋放活性成分的上述制劑。藥物組合物還可以含有其它活性成分，諸如抗;欽生物劑、免疫抑制劑和/或防腐劑。應(yīng)當(dāng)理解，在上述具體提及的成分外，本發(fā)明的制劑可含有本領(lǐng)域在所討論制劑類型方面常規(guī)的其它藥劑。例如，適于口服施用的制劑可含有芳香劑。優(yōu)選的單位劑量制劑如下所述含有有效劑量或其適當(dāng)部分的活性成分。對于前述的各種情況，可以以約0.1到約250mg/kg每天的劑量范圍口服或通過注射施用所述組合物，例如多肽和有機化合物。成人的劑量范圍通常為約5mg到約17.5g/天、優(yōu)選為約5mg到約10g/天、最優(yōu)選為約100mg到約3g/天。為方便起見，片劑或其它在離散單元中提供的單位劑量形式可含有在此種劑量時有效或在多個此種劑量時有效的量，例如含有約5mg到約500mg、通常為約1OOmg到約5OOmg。所采用的劑量將取決于多種因素，包括受試者的年齡和性別、所治療的確切病癥及其嚴重程度。同樣，施用途徑可隨著疾患及其嚴重程度而變化。無論任何，本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮上述因素后可常規(guī)計算適宜的和最佳的劑量。以下實施例描述了本發(fā)明的各方面，它們并非意圖限制權(quán)利要求中所述本發(fā)明范圍。以下實施例例示了PDAC細胞中差異表達基因的鑒定和表征。實施例材料和方法細胞系PDAC細胞系KLM隱1、SUIT畫2、KP-1N、PK-1、PK-45P和PK-59得自生物醫(yī)學(xué)研究細胞資源中心(CellResourceCenterforBiomedicalResearch,TohokuUniversity,Sendai,Japan),Cos7購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC,Rockville，MD)。MIAPaCa-2和Pane-l購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC,Rockville,MD)。將所有細胞系在補充有10。/。胎牛血清(CanseraInternational,Ontario,Canada)和1%抗生素/4元真菌〉容液(Sigma-Aldrich)的RPMI1640(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中進行培養(yǎng)。在含5%002的潮濕空氣中于37。C維持細胞。半定量RT-PCR自胰腺癌組織純化PDAC細胞和正常導(dǎo)管上皮細胞的規(guī)程如前所述(NakamuraTetal.，Oncogene23:2385-400(2004》。通過基于T7的體外轉(zhuǎn)錄(EpicentreTechnologies,Madison,WI)，將來自純化的PDAC細胞和正常胰管上皮細胞的RNA進行兩輪RNA擴增，并合成出單鏈cDNA。使用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad,CA)依照制造商推薦的規(guī)程自人胰腺癌細胞系提取總RNA。用DNA酶I(RocheDiagnostic,Mannheim,Germany)處理所提取的RNA,并用寡聚d(T)引物及SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。本發(fā)明人配制了適宜稀釋度的每份單鏈cDNA,用于后續(xù)PCR擴增，通過檢測oc-微管蛋白(TUBA)作為定量對照。所用引物序列如下5，-AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3，(SEQIDNO.l)和5，-CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3，(SEQIDNO.2)用于TUBA,5'畫GGCAGCAACAGCATCTACTACTT-3，(SEQIDNO,3)和5'扁ACAGTTGTGCTTTAGGAGCTGAG-3,(SEQIDNO,4)用于CST6,5'-CTCTCCAAATCCAGCCAGAG-3,(SEQIDNO,5)和5'畫ATGATTGGCTCATACAACCACA-3，(SEQIDNO.6)用于GABRP,及5,-TGCATTTGTGAGCCAAAGAG-3，(SEQIDNO,7)和5'陽CCTTAGGTTTCAGCTAAGCGAG-3，(SEQIDN0.8)用于GAD1。所有反應(yīng)包括94。C初始變性2分鐘，接著是23個循環(huán)(用于TUBA)、28個循環(huán)(用于CST6和GABRP)或30個循環(huán)(用于GAD1)的94。C30秒、58°C30秒及72。C1分鐘，在GeneAmpPCR系統(tǒng)9700(PEAppliedBiosystems,Foster,CA)上進行。Northern印跡分析將來自7種PDAC細胞系(KLM-1、PK-59、PK-45P、MIAPaCa-2、Panc-l、PK-l和SUIT-2)和數(shù)種成人正常組織(BDBioscience,PaloAlto，CA)的lpgpolyA+RNA印到膜上。將此癌細胞系膜和人多種組織Northern印跡(BDBioscience)與"P標(biāo)記的GABRP雜交16小時，其中"P標(biāo)記的GABRP是使用Mega標(biāo)記試劑盒(Amersham，Piscataway,NJ)標(biāo)記的。CST6的4罙針cDNA4吏用以下引物制備成255bp的PCR產(chǎn)物5'-GGCAGCAACAGCATCTACTACTT陽3，(SEQIDN0.9)和5，陽ACAGTTGTGCTTTAGGAGCTGAG-3，(SEQIDNO.IO)，而GABRP的探針cDNA使用以下引物制備成958bp的PCR產(chǎn)物5'-AAGGACTCTGAGGCTTTATTCCC-3，(SEQIDNO.11)和5，-ATGATTGGCTCATACAACCACA_3，(SEQIDN0.12)。預(yù)雜交、雜交、和洗滌依照制造商的說明書進行。將印跡于-80。C放射自顯影10天。CST6蛋白特異性抗體的生成使用包含BamHI和EcoRI限制性位點(分別用第一條和第二條下劃線標(biāo)示)的引物5，-CGCGGATCCGCCGCAGGAGCGCATGGTCGG-3，(SEQIDNO,13)和5，-CCGGAATTCTCACATCTGCACACAGTTGTG-3，(SEQIDNO,14)通過PCR擴增編碼缺少其信號肽的人CST6蛋白的cDNA片段。將產(chǎn)物克隆入pET28b載體(Novagen,Madison,WI)以生成攜帶N末端6-His標(biāo)簽的融合蛋白，依照供應(yīng)商的方案在天然條件下用TALONSuperflow金屬親和樹脂(BDBiosciences,FranklinLakes,NJ)進行純化。將此重組CST6-6His用于免疫家兔，并使用偶聯(lián)有六組氨酸與CST6蛋白的融合物的Affi-geI10(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)親和純化所得多克隆抗體。免疫組織化學(xué)染色自知情同意下切除的手術(shù)標(biāo)本制備PDAC的常規(guī)組織切片。將切片脫石蠟，并在pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液中于108。C高壓滅菌15分鐘。通過在過氧化物酶封閉試劑(DakoCytomation,Carpinteria，CA)中溫育30分鐘來淬滅內(nèi)源過氧化物酶活性。與胎牛血清一起溫育以進行封閉后，將切片與兔抗CST6多克隆抗體(l:5000稀釋)一起于室溫溫育l小時。用PBS洗滌后，用過氧化物酶標(biāo)記的抗兔免疫J求蛋白(Envisionkit,DakoCytomation)進4亍免疫4僉測。最后，用3，3，-二氨基聯(lián)苯胺(DakoCytomation)顯現(xiàn)反應(yīng)物。用蘇木精進行復(fù)染。對CST6或GABRP特異的小干擾RNA(siRNA)表達構(gòu)建物為了下調(diào)PDAC細胞中的內(nèi)源CST6和GABRP表達，使用psiU6BX3.0載體來表達針對靶基因的短發(fā)夾RNA,如前所述(TaniuchiKetal.,CancerRes65:105-12(2005))。將U6啟動子克隆到基因特異序列(來自靶轉(zhuǎn)錄物的19個以五個胸苷作為終止信號并將neo盒用于使用遺傳霉素(Invitrogen)進行的選擇。靶序列為5，-GTGGTTCCCTGGCAGAACT-3，(SEQIDN0.15)用于CST6-#448,5，-GATGGGCAGGATTGTTGAT匿3，(SEQIDNO.19)用于GABRP陽si6，5，-TATCATCAACAGCTCCATC-3，(SEQIDNO.23)用于GABRP-si7,5，-CCCCAGTAATGTTGATCAC-3，(SEQIDNO.27)用于GABRP-si8，5'-AGGAAGTAGAAGAAGTCAG陽3，(SEQIDN0.31)用于GABRP-silO,而5，-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3，(SEQIDNO,35)用于EGFP作為陰性對照。實驗中所使用的siRNA序列顯示如下<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>si7插入序列24cacctatcatcaacagctccatcttcaagagagatggagctgttgatgata位置25aaaatatcatcaacagctccatctctcttgaagatggagctgttgatgata1215-1233發(fā)夾siRNA26tatcatcaacagctccatcttcaagagagatggagctgttgatgataGABRP靶27ccccagtaatgttgatcacsi8插入序列28caccccccagtaatgttgatcac加aagagagtgatcaacattactgggg位置29aaaaccccagtaatgttgatcactctcttgaagtgatcaacattactgggg386-1404發(fā)夾siRNA30ccccagtaatgttgatcacttcaagagagtgatcaacattactggggGABRP靶31aggsagtagaagaagtcagsi10插入序列32caccaggaagtagaagaagtcagttcaagagactgacttcttctacttcct位置33aaaaaggaagtagaagaagtcagtctcttgaactgacttcttctacttcct1187-1205發(fā)夾siRNA34aggaagtagaagaagtcagttoaagagactgacttcttctacttcctEGFP靶35gaagcagcacgacttcttc對照插入序列36caccgaagcagcacgacttcttcttcaagagagaagaagtcgtgctgcttc37aaaagaagcagcacgacttcttctctcttgaagaagaagtcgtgctgcttc發(fā)夾siRNA38gaagcagcacgacttcttcttcaagagagaagaagtcgtgctgcttc將人PDAC細胞系(PK-l、PK-59、PK-45P和KLM-1細胞)涂布到10cm培養(yǎng)皿上，使用FuGene6(Roche)依照供應(yīng)商的說明書用CST6和GABRP的si認A及EGFPsiRNA表達載體進行轉(zhuǎn)染。用0.15mg/ml(PK-59)、0.2mg/ml(PK-1)或500嗎/ml(PK-45P,KLM-1)遺傳霉素對細胞選擇9天。初步的，自10cm培養(yǎng)皿收獲細胞，使用上述引物通過RT-PCR進行分析，其中培養(yǎng)3天的細胞用于分析對CST6的敲減效應(yīng)，培養(yǎng)7天的細胞用于分析對GABRP的敲減效應(yīng)。在含有遺傳霉素的適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天后，將細胞用100%曱醇固定，用0.1%結(jié)晶紫-1120染色，供集落形成測定法之用。在MTT測定法中，在轉(zhuǎn)染后14天使用細胞計數(shù)試劑盒-8(DOJINDO,Kumamoto，Japan)測量細胞生存力。4吏用樣i量板讀數(shù)儀550(Bio-Rad)測量490nm的吸光度，以630nm為參比。CST6過表達細胞的生成和生長測定法使用以下包含限制酶位點的引物對通過PCR擴增編碼CST6可讀框的cDNA:5，-GGGGTACCGAATGGCGCGTTCGAACCTCC-3，(SEQIDN0.39)和5，-CCGGAATTCCATCTGCACACAGTTGTGCT-3,(SEQIDNO.40)(以下和EcoRI位點)。將PCR擴增產(chǎn)物克隆入pcDNA3.1/myc-HisA(+)載體(Invitrogen)。使用FuGENE6(Roche)依照制造商推薦的規(guī)程將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入無CST6的PDAC細胞系KLM-1。用0.5mg/ml遺傳霉素(Invitrogen)選擇出一群細胞，并通過有限稀釋對克隆KLM-1細胞進行亞克隆。使用抗myc抗體(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)和抗卩-月幾動蛋白抗體(Sigma)通過Western印跡評估這些克隆細胞中帶myc標(biāo)簽的CST6的表達，并建立了三個組成性表達CST6的克隆(KLM1-CST6)。還建立了經(jīng)pcDNA3.1/myc-HisA(+)載體轉(zhuǎn)染的對照KLM-1細胞(KLMl-Mock)。使用細胞計^:試劑盒-8(DOJINDO)測量這些已建立克隆的生長曲線。CST6自分泌/旁分泌測定法成熟重組人CST6購自R&Dsystem(Minneapolis,MN)，它是在哺乳動物細胞中生產(chǎn)的。將成熟重組CST6以數(shù)個濃度(0、0.02、0.2和2ng/ml)添加至COS7細胞的培養(yǎng)基并補充2。/。FBS。使用細胞計數(shù)試劑盒-8(DOJINDO)測量存在各種濃度CST6時細胞的生長曲線。GABA刺激對PDAC細胞增殖的影響和GABA受體拮抗劑的調(diào)控將GABRP陽性細胞系KLM-1和PK-45P及GABRP陰性細胞系PK-59和KP-1N與一系列濃度(0、1、10、lOOjaM)的GABA(Sigma)—起溫育6天。此外，為了抑制GABA介導(dǎo)的途徑，還將它們與250^iMGABAa受體拮抗剤BMI(BicuculUnemethiodide(曱碘荷包牡丹堿)，Sigma)或lmMGABAb受體拮抗劑CGP-35348(Sigma)—起溫育。暴露于這些藥物6天后使用細胞計數(shù)試劑盒-8(DOJINDO)測量細胞生存力，并使用微量板讀數(shù)儀550(Bio-Rad)測量490nm的吸光度，以630nm為參比。結(jié)果PDAC細胞中CST6的過表達在通過基因組范圍cDNA微陣列分析中鑒定為在PDAC細胞中上調(diào)的數(shù)十種基因中(NakamuraTetal.,Oncogene23:2385-400(2004))，本發(fā)明人的這項研究聚焦于CST6。顯示CST6過表達的微陣列數(shù)據(jù)通過RT-PCR得到了9份顯微解剖的PDAC細胞群中8份的證實(圖1A)。使用CST6cDNA片段作為探針進行的Northern印跡分析鑒定出在胎盤和曱狀腺中表達的大約0.6kb的轉(zhuǎn)錄物；在任何其它重要器官中沒有觀察到表達，包括肺、心、肝和腎(圖1B)。使用所生成的對CST6特異的多克隆抗體進行的組織切片免疫組織化學(xué)分析揭示了所檢查的IO份PDAC案例中6份有CST6的強烈信號，而胰腺中的正常導(dǎo)管和腺泡細胞顯示出非常微弱的CST6染色(圖1C)。CST6-siRNA對PDAC細胞生長的影響本發(fā)明人構(gòu)建了數(shù)種對CST6mRNA序列特異的siRNA表達載體，并將它們轉(zhuǎn)染入內(nèi)源表達高水平CST6的PDAC細胞系PK-1和PK-59。在使用#448時(圖2A)，通過RT-PCR證實了敲減效應(yīng)。使用PK-59進行的集落形成測定(圖2B)和MTT測定(圖2C)揭示了經(jīng)#448轉(zhuǎn)染的細胞數(shù)與沒有明顯敲減效應(yīng)的陰性對照EGFP相比的顯著減少。使用PK-1細胞系得到了相似的效果(圖2A、B和C)。另一方面，有效的siRNA不影響不表達CST6的其它PDAC細胞系KLM-1的細胞生存力(數(shù)據(jù)未顯示)。CST6的過表達促進PDCA細胞的生長為了調(diào)查CST6過表達在PDAC細胞中的生物學(xué)功能，本發(fā)明人使用通過RT-PCR幾乎檢測不到CST6表達的KLM-1細胞建立穩(wěn)定且組成性表達野生型CST6的細胞系。如圖3A所示，通過使用抗myc抗體進4亍的Western印跡分析證實了三個KLM-1克隆(CST6-1、-2和-3)的高水平表達，但在三個KLMl-Mock克隆(Mock-l、-2和-3)中檢測不到表達。本發(fā)明人還證實了CST6蛋白在來自這些KLM1-CST6克隆每一個的培養(yǎng)液中含量豐富(數(shù)據(jù)未顯示)。MTT測定法證明了在體外這三個KLMl-CST6克隆比KLMl-Mock克隆生長更快速(圖3B)，說明在PDAC細胞中過表達的CST6促進細胞增殖且可以致癌方式發(fā)揮作用。所分泌的CST6促進細胞生長CST6是分泌型蛋白質(zhì)，且有可能主要在細胞外發(fā)揮功能。為了檢驗所分泌的CST6對細胞生長的效應(yīng)，在存在數(shù)種濃度(0.02-2ng/ml)的成熟人重組CST6時進行了細胞生長測定法。此重組CST6蛋白是在哺乳動物細胞中生成的，且證實是N-糖基化的。圖4顯示了培養(yǎng)基中CST6蛋白的存在以劑量依賴性方式明顯刺激細胞增殖，這也暗示了所分泌的CST6可能在細胞外且以自分泌/旁分泌方式發(fā)揮作用以促進細胞增殖。PDAC細胞中GABRP和GAD1的過表達在通過基因組范圍cDNA微陣列分析中筌定為在PDAC細胞中上調(diào)的數(shù)十種基因中(NakamuraTetal.,Oncogene23:2385-400(2004))，本發(fā)明人的這項研究聚焦于CST6。顯示GABRP過表達的微陣列數(shù)據(jù)得到了9份顯微解剖的PDAC細胞群中5份的RT-PCR的證實(圖5A)。使用GABRPcDNA片段作為探針進行的Northem印跡分析鑒定出在氣管、前列腺和胃中表達的大約3.3kb的轉(zhuǎn)錄物；在任何其它重要器官中沒有觀察到表達，包括肺、心、肝和腎(圖5B)。本發(fā)明人還分析了數(shù)種PDAC細胞系的GABRP表達，而圖5B顯示了GABRP在KLM-1、PK-45P和PK-1中明顯表達，但在重要器官中不表達，包括心、肺、肝、腎和腦。此外，為了調(diào)查胰腺癌組織中的局部GABA生成，還用RT-PCR分析了主要在神經(jīng)元中催化GABA生成的谷氨酸脫羧酶1(GAD1)在PDAC細胞、正常胰管細胞和正常胰腺的表達。圖5C顯示了GAD1表達在PDAC細胞中像GABRP—樣上調(diào)，表明PDAC細胞自身生成GABA。GABRP-siRNA對PDAC細胞生長的影響本發(fā)明人構(gòu)建了數(shù)種對GABRPmRNA序列特異的siRNA表達載體，并將它們轉(zhuǎn)染入內(nèi)源表達高水平GABRP的PDAC細胞系KLM-1和PK-45P。在轉(zhuǎn)染si6、si7、si8和silO時通過RT-PCR證實了敲減效應(yīng)，但陰性對照s正GFP則不然(圖6A)。使用KLM-1進行的集落形成測定(圖6B)和MTT測定(圖6C)揭示了經(jīng)si6、si7、si8和silO轉(zhuǎn)染的細胞數(shù)與沒有敲減效應(yīng)的陰性對照siEGFP相比明顯減少。在PK-45P細胞系中觀察到相似的效果(圖6A、6B和6C,右圖)。GABA刺激對PDAC細胞增殖的影響和GABA受體拮抗劑的調(diào)控為了調(diào)查GABA和GABRP表達對PDAC細胞的功能，將GABRP陽性或陰性PDAC細胞系與數(shù)種濃度的GABA—起溫育。如圖7A所示，培養(yǎng)基中的GABA以劑量依賴性方式促進GABRP陽性PDAC細胞系KLM-1和PK-45P的增殖(上圖)，對細胞增殖最多有大約50%的促進效應(yīng)，但對GABRP陰性PDAC細胞系PK-59和KP-1N則不然(下圖)。接著，分析了已知的GABA拮抗劑對GABA激發(fā)的GABRP陽性細胞系生長的影響。GABAA受體拮抗劑BMI抑制細胞生長的GABA激發(fā)，但GABAb受體拮抗劑不影響GABA激發(fā)的細胞增殖(圖7B,上圖)。另一方面，GABRP陰性細胞系不響應(yīng)GABA或GABA受體拮抗劑(圖7B，下圖)。在拮抗外源GABA外，羊獨用GABAa受體拮抗劑BMI進行的處理在KLM-l和PK-59細胞中抑制細胞生長(圖7B,上圖)，它們表達GAD1且預(yù)計自身生成內(nèi)源GABA(數(shù)據(jù)未顯示)，而且認為KLM-1和PK-59細胞中GABA-GABAA受體的這些內(nèi)源自分泌/旁分泌效應(yīng)受到BMI在通過先前的基因組范圍基因表達分析中鑒定為在PDAC細胞中上調(diào)的數(shù)十種基因中(NakamuraTetal.，Oncogene23:2385-400(2004))，本發(fā)明人聚焦于CST6基因。免疫組織化學(xué)分析顯示了CST6在PDAC的有些群中過表達(60%)，而RNA和蛋白質(zhì)水平的表達分析顯示了CST6在成人正常重要器官(肺、心、肝和腎)中表達水平很低。這些發(fā)現(xiàn)對于選擇最小副作用的新治療方法的分子靶是至關(guān)重要的，而CST6有可能因其表達樣式而成為PDAC治療的理想分子輩巴。本發(fā)明人還證明了分泌的CST6或過表達的CST6在體外促進細胞增殖，究證明了CST6在乳腺癌中下調(diào)且可抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移或侵入表型以及其生長(ShridharRetal.,Oncogene23:2206-15(2004);ZhangJetal.,CancerRes64:6957-64(2004)),這與本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)不一致。然而，另一項研究揭示了CST6在頭頸癌中上調(diào)，為癌細胞提供了抗凋亡特性并促進轉(zhuǎn)移(VigneswaranNetal.，OralOncology39:559-68(2003)),而且大鼠CST6的上調(diào)據(jù)說還涉及神經(jīng)細胞分化和發(fā)育(HongJetal.,JNeurochem81:922-34(2002))。在功能上，CST6是半胱氨酸蛋白酶的抑制劑，事實上，它有抑制組織蛋白酶B(NiJetal.，JBiolChem272:10853-8(1997);HongJetal.,JNeurochem81:922-34(2002))、與TNF所誘導(dǎo)的凋亡有關(guān)的溶酶體蛋白酶(GuicciardiMEetal.,JClinInvest106:1127-37(2000);FoghsgaardLetal.,JCellBiol153:999-1010(2001))的潛力，這意味著CST6具有潛在的抗凋亡能力。然而，與組織蛋白酶B有關(guān)的這種凋亡途徑存在于細胞內(nèi)，而且CST6對細胞生長的4足進效應(yīng)有可能涉及受體-配體相互作用，因為所分泌的CST6促進細胞生長，如圖4所示，而且這將需要鑒定CST6在癌細胞中功能的受體。表征最多的半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族成員半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(CST3)刺激細月包生長(TaveraCetal,,BiochemBiophysResCommun182:1082-8(1992))，且可發(fā)揮TGF-(3受體拮抗劑的作用(SokolJPetal.,MolCancerRes2:183-95(2004)),涉及細胞組織和癌侵入的TGF-J3途徑。作為FGF-2的自分泌/旁分泌輔因子，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C刺激神經(jīng)干細胞的增殖(TaupinPetal.，Neuron28:385-97(2000)),且其蛋白酶抑制劑活性對其對神經(jīng)干細胞的生長效應(yīng)不是至關(guān)重要的。這表明半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族在蛋白酶抑制劑以外的其它功能可能涉及細胞生長促進。/旁分泌方式促進癌細胞增殖。用小分子抑制CST6對癌細胞生存力的功能或者用抗體中和所分泌的CST6可以為致命PDAC的分子療法^是供理想的新方法。在通過基因組范圍基因表達分析中鑒定為在PDAC中上調(diào)的數(shù)十種基因中(NakamuraTetal.,Oncogene23:2385-400(2004))，本發(fā)明人聚焦于GABA受體兀(GABRP)。通過對顯微解剖細胞進行的RT-PCR在大約半數(shù)PDAC細胞中證實了GABA受體u(GABRP)表達，而Northern印跡分析顯示了GABRP的表達局限于成人正常器官，暗示GABRP可能因其表達樣式而成為最小副作用的PDAC治療的理想分子靶。在成熟腦中，GABA和GABA受體主要作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮功能，而且它還可在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮營養(yǎng)因子的作用以影響神經(jīng)干細胞等的增殖、遷移和分化(MacdonaldRLandOlsenRW，AnnuRevNeurosci17:569-602(1994);FiszmanML,BrainResDevBrainRes115:1-8(1999))。然而，顯然GABA和GABA受體在非神經(jīng)組織中表達，而且目前不知道它們在非神經(jīng)細胞中的確切功能(MacdonaldRLandOlsenRW.，AnnuRevNeurosci17:569-602(1994))。文獻中(AzumaH,CancerRes63:80卯-6(2003))報導(dǎo)了GABA和GABAB受體途徑可能通過調(diào)控MMP生成而涉及前列腺癌轉(zhuǎn)移或侵入。另一方面，其它報導(dǎo)顯示了GABA可抑制與去曱腎上腺素(nor-epinepherin)誘導(dǎo)的途徑有關(guān)的結(jié)腸癌遷移(JosephJetal.,CancerRes62:6467-9(2002))。如此，GABA途徑對癌細胞行為是發(fā)揮積極作用還是消極作用尚有爭議，但有發(fā)現(xiàn)清楚顯示了摻入有兀亞基的GABA和GABAA受體復(fù)合物應(yīng)促進PDAC細胞增殖。此外，生成GABA的酶GAD1在PDAC細胞中也上調(diào)，正如我們在此所顯示的，而且GABA的局部濃度預(yù)計在PDAC組織中處于高水平。GABA還有可能在胰腺癌增殖中以自分泌/旁分泌方式發(fā)揮促進癌細胞生長的功能。將這些發(fā)現(xiàn)綜合在一起，用小分子或特弄性抗體阻斷整合入GABAa的GABRP或GABA對PDAC細胞生存力的功能可以為致命PDAC的分子療法提供理想的新方法。在本發(fā)明中，我們證明了經(jīng)典的GABAA受體拮抗劑諸如BMI在體外抑制癌細胞生長。由于BMI阻斷GABAAf3亞基，其抑制活性可影響所有種類的常見GABAA受體(cx(3Y復(fù)合物)，對癌細胞沒有特異性。我們需要開發(fā)對GABA受體7i亞基(GABRP)特異的拮抗性藥物或抗體，使得靶向PDAC的GABA途徑的分子療法不會危及正常器官，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。工業(yè)應(yīng)用通過基因組范圍cDNA微陣列得到的本文所述胰腺癌基因表達分析鑒定出了可作為癌癥預(yù)防和治療的靶的特定基因。根據(jù)這些差異表達基因子集的表達，本發(fā)明提供了用于鑒定和檢測胰腺癌的分子診斷標(biāo)志物。本文所述方法還可用于鑒定預(yù)防、診斷和治療胰腺癌的別的分子靶。本文所報告的數(shù)據(jù)增加了對胰腺癌的全面了解，促進了新治療策略的開發(fā)，并提供了鑒定治療性藥物和預(yù)防性藥劑的分子靶的線索。這些信息有助于更深刻的了解胰腺腫瘤發(fā)生，并提供了開發(fā)用于診斷、腫瘤和最終預(yù)防胰腺癌的新策略的指標(biāo)。完整收入本文中所引用的所有專利、專利申請和出版物作為參考。此外，盡管本發(fā)明已經(jīng)進行了詳細描述并參考其具體實施方案，應(yīng)當(dāng)了解，上文描述本質(zhì)上是例示性和解釋性的，意圖例示本發(fā)明及其優(yōu)選實施方案。通過常規(guī)實驗，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到可以在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下對本發(fā)明進行多種改變和修飾。如此，本發(fā)明意圖以所附權(quán)利要求及其等同方案來進行限定，而非上文描述。權(quán)利要求1.診斷受試者中的胰腺癌或發(fā)生胰腺癌的傾向性的方法，包括測定得自患者的生物學(xué)樣品中的CST6或GABRP表達水平，其中所述基因在所述樣品中的表達水平與正常對照水平相比的升高表明所述受試者患有胰腺癌或有風(fēng)險發(fā)生胰腺癌。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述樣品中的表達水平比所述正常對照水平高至少10%。3.權(quán)利要求l的方法，其中基因表達水平是通過選自下組的方法測定的(a)4全測CST6或GABRP的mRNA;(b)4全測由CST6或GABRP編碼的蛋白質(zhì)；和(c)檢測CST6或GABRP的生物學(xué)活性。4.權(quán)利要求l的方法，其中所述得自患者的生物學(xué)樣品包括上皮細胞。5.權(quán)利要求l的方法，其中所述得自患者的生物學(xué)樣品包括胰腺癌細胞。6.權(quán)利要求l的方法，其中所述得自患者的生物學(xué)樣品包括來自胰腺癌細胞的上皮細胞。7.篩選用于治療或預(yù)防胰腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將測試化合物與由CST6或GABRP的多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測所述多肽與測試化合物之間的結(jié)合活性；并(c)選4奪與所述多肽結(jié)合的測試化合物。8.篩選用于治療或預(yù)防胰腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將候選化合物與表達CST6或GABRP的細胞接觸；并(b)選擇與不存在測試化合物時檢測到的CST6或GABRP表達水平相比降低所述肽表達水平的候選化合物。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述細胞包括胰腺癌細胞。10.篩選用于治療或預(yù)防胰腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)使測試化合物與由CST6或GABRP的多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)纟僉測步驟(a)的多肽的生物學(xué)活性；并(c)選擇與不存在測試化合物時檢測到的由CST6或GABRP的多核苦酸編碼的多肽的生物學(xué)活性相比抑制所述多肽的生物學(xué)活性的測試化合物。11.篩選用于治療或預(yù)防胰腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將候選化合物與細胞接觸，所述細胞中導(dǎo)入了載體，所述載體包含CST6或GABRP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)控制下表達的報導(dǎo)基因；(b)測量所述報導(dǎo)基因的表達或活性；并(c)選擇與對照相比降低所述報導(dǎo)基因的表達或活性水平的候選化合物。12.試劑盒，其包含能與(a)CST6或GABRP,或(b)由CST6或GABRP編碼的多肽結(jié)合的檢測劑。13.治療或預(yù)防受試者中的胰腺癌的方法，包括對所述受試者施用反義列。14.治療或預(yù)防受試者中的胰腺癌的方法，包括對所述受試者施用siRNA組合物，其中所述siRNA組合物能降低CST6或GABRP的表達。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述siRNA包含有義鏈，該有義鏈包含SEQIDNO:15、19、23、27或31的核香酸序列。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，，其中[A]是對應(yīng)于序列SEQIDNO:15、19、23、27或31的核糖核苷酸序列，[B]是由3-23個核苷酸組成的核糖核芬酸環(huán)序列，且[A，]是由[A]的互補序列組成的核糖核苦酸序列。17.治療或預(yù)防受試者中的胰腺癌的方法，包括對所迷受試者施用藥用有效量的能與CST6或GABRP的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體或其免疫活性片段。18.治療或預(yù)防受試者中的胰腺癌的方法，包括對所述受試者施用疫苗，該疫苗包含(a)由CST6或GABRP的核酸編碼的多肽，(b)所述多肽的免疫活性片段，或(c)編碼所述多肽的多核苷酸。19.誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的方法，所述方法包括使抗原呈遞細胞接觸多肽、編碼該多肽的多核苷酸、或包含該多核苷酸的載體的步驟，其中所述多肽是由CST6或GABRP編碼的多肽。20.權(quán)利要求19的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的方法，所述方法進一步包括對受試者施用所述抗原呈遞細胞的步驟。21.治療或預(yù)防受試者中的胰腺癌的方法，所述方法包括施用通過權(quán)利要求7-1l任一項的方法得到的化合物的步驟。22.用于治療或預(yù)防胰腺癌的組合物，所述組合物包含藥用有效量的針對CST6或GABRP多核苦酸的反義多核苷酸或siRNA。23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述siRNA包含有義鏈，該有義鏈包含SEQIDNO:15、19、23、27或31的核香酸序列。24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，，其中[A]是對應(yīng)于序列SEQIDNO:15、19、23、27或31的核糖核苷酸序列，[B]是由3-23個核苷酸組成的核糖核香酸環(huán)序列，且[A，]是由[A]的互補序列組成的核糖核香酸序列。25.用于治療或預(yù)防胰腺癌的組合物，所述組合物包含藥用有效量的抗體或其片段，所述抗體或其片段能與由CST6或GABRP編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合。26.用于治療或預(yù)防胰腺癌的組合物，所述組合物包含藥用有效量的通過權(quán)利要求7-ll任一項的方法選擇出的化合物作為活性成分并包含藥學(xué)可接受的載體。27.篩選用于治療或預(yù)防胰腺癌的方法，所述方法包括以下步驟(a)在存在測試化合物時使GABA或其類似物接觸GABRP,并檢測GABRP與GABA或其類似物結(jié)合的活性；(b)選擇與不存在測試化合物時檢測到的結(jié)果相比降低步驟(a)中檢測到的結(jié)合活性的化合物。28.治療或預(yù)防受試者中的胰腺癌的方法，所述方法包括施用通過權(quán)利要求27的方法得到的化合物的步驟。29.治療或預(yù)防受試者中的胰腺癌的方法，所述方法包括施用藥用有效量的GABAa受體(GABRA)拮抗刑的步驟。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述GABAa受體(GABRA)拮抗刑是Bicuculline或其在藥學(xué)上可接受的季4妄鹽。31.用于治療或預(yù)防胰腺癌的組合物，所述組合物包含藥用有效量的GABAA受體(GABRA)拮抗劑作為活性成分并包含藥學(xué)可接受的載體。32.權(quán)利要求31的組合物，其中所述GABAA受體(GABRA)拮抗劑是Bicuculline或其在藥學(xué)上可接受的季銨鹽。全文摘要本文描述了檢測和診斷胰腺癌(PDAC)的客觀方法。在一個實施方案中，診斷方法涉及測定CST6或GABRP的表達水平，該表達水平得以將PDAC細胞與正常細胞區(qū)別開。最后，本發(fā)明提供了篩選可用于治療胰腺癌的治療劑的方法、治療胰腺癌的方法、和給受試者針對胰腺癌進行疫苗接種的方法。文檔編號C12Q1/68GK101273131SQ200680035760公開日2008年9月24日申請日期2006年7月14日優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日發(fā)明者中川英刀,中村佑輔,中鶴修一申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司