結(jié)晶性3’,5’?環(huán)二鳥苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供不含有鈷或者鎂等金屬鹽的3’,5’?環(huán)二鳥苷酸的游離酸結(jié)晶。另外，探索可簡(jiǎn)便且大量地獲取該結(jié)晶的方法。通過(guò)包括在3’,5’?環(huán)二鳥苷酸水溶液中添加酸使pH降低至pH1～3的工序的制造方法，可以簡(jiǎn)便且大量地獲取3’,5’?環(huán)二鳥苷酸結(jié)晶。該結(jié)晶是不含有鈷或鎂等金屬鹽的游離酸結(jié)晶。
【專利說(shuō)明】結(jié)晶性3'，5'-環(huán)二鳥昔酸 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及作為輔助劑有用的物質(zhì)3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的結(jié)晶W及該結(jié)晶的制造 方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 3'，5'-環(huán)二鳥巧酸是參與細(xì)菌的生物膜形成的信號(hào)傳達(dá)物質(zhì)，近年來(lái)作為輔助 劑、抗病毒劑、抗癌劑的應(yīng)用被受期待(非專利文獻(xiàn)1)。至今，作為3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的制造 方法，例如已知利用來(lái)源于Geobacillus屬的二鳥甘酸環(huán)化酶的、基于酶的合成方法(專利 文獻(xiàn)1)。 另外，W往，3 '，5 環(huán)二鳥巧酸是作為冷凍干燥品或者與鉆或儀的金屬鹽的共晶而得 到的(非專利文獻(xiàn)2、3)。 【現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)】 【專利文獻(xiàn)】
[0003] 【專利文獻(xiàn)1】W02013-129427號(hào) 【非專利文獻(xiàn)】
[0004] 【非專利文獻(xiàn) 1】化 ccine，28,3080-3085(2010) 【非專利文獻(xiàn) 2】Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,87,3235-3239 (1990) 【非專利文獻(xiàn)3】陽(yáng)BS Letters，264，223-227(1990) 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】 【發(fā)明要解決的問(wèn)題】
[0005] 現(xiàn)有的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸是作為含有鉆等的金屬鹽的共晶而提供的，在將該結(jié)晶 應(yīng)用到醫(yī)藥品原料等領(lǐng)域時(shí)，有可能發(fā)生安全性等的問(wèn)題。但是，對(duì)于不含有運(yùn)些金屬鹽的 3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的游離酸結(jié)晶，包括其獲取方法在內(nèi)至今仍為未知。另外，現(xiàn)有的結(jié)晶獲 取方法都是利用蒸汽擴(kuò)散法，因此，不適合在短時(shí)間內(nèi)獲取大量的結(jié)晶，因此能簡(jiǎn)便且大量 獲取的方法的開發(fā)一直被人們所期待。 【用于解決問(wèn)題的方案】
[0006] 本發(fā)明人對(duì)3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的結(jié)晶化進(jìn)行了深入研究，首次得到了3'，5'-環(huán)二 鳥巧酸的游離酸結(jié)晶。
[0007] 另外，對(duì)于該結(jié)晶的制造方法，還發(fā)現(xiàn)了，能夠W在3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的水溶液中 添加酸使抑降低至pHl~3運(yùn)樣的、與現(xiàn)有的金屬鹽共晶的制造方法相比極其簡(jiǎn)便的工序進(jìn) 行制造。 【發(fā)明效果】
[000引通過(guò)本發(fā)明方法得到的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶顯示出不遜色于現(xiàn)有結(jié)晶的穩(wěn)定 性，且不含多余的金屬離子，因此在各種用途中容易操作，作為醫(yī)藥品原料等也很實(shí)用。 【【附圖說(shuō)明】】
[0009] 【圖1】圖1為3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶的結(jié)晶照片。 【圖2】圖2為3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的儀共晶的結(jié)晶照片。 【圖3】圖3為3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的鉆共晶的結(jié)晶照片。 【圖4】圖4為3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶的熱重測(cè)定/差示熱分析結(jié)果。 【圖5】圖5為3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的儀共晶的熱重測(cè)定/差示熱分析結(jié)果。 【圖6】圖6為3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的鉆共晶的熱重測(cè)定/差示熱分析結(jié)果。 【圖7】圖7為3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶的紅外線吸收光譜。 【圖8】圖8為3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的儀共晶的紅外線吸收光譜。 【圖9】圖9為3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的鉆共晶的紅外線吸收光譜。 【圖10】圖10為3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶的X射線衍射光譜。 【圖11】圖11為3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的儀共晶的X射線衍射光譜。 【圖12】圖12為3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的鉆共晶的X射線衍射光譜。 【【具體實(shí)施方式】】
[0010] 本發(fā)明提供由W下結(jié)構(gòu)式所示的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的結(jié)晶。
[00川【化學(xué)式1】
[0012] 本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶是在結(jié)晶化工序中完全不利用鉆或儀等金屬而 得到的不含金屬鹽的游離酸結(jié)晶。此外，在本發(fā)明中的"3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶"在沒(méi)有特 別限定的情況下，是指該不含金屬鹽的游離酸結(jié)晶。
[0013] 本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶在通過(guò)高效液相色譜法進(jìn)行純度測(cè)試時(shí)，具有 97% W上、更優(yōu)選99% W上的純度。
[0014] 針對(duì)本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶利用卡爾費(fèi)休法測(cè)定時(shí)的水分為9.3~ 13.9%。即，本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶中，相對(duì)于1分子的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸鍵合或 者附著有4~6分子、更詳細(xì)而言3.9~6.2分子的水分子。
[0015] 本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶在使用熱重測(cè)定/差示熱分析(TG/DTA)裝置(升 溫速度5 °C/分鐘）進(jìn)行分析時(shí)，在213~217 °C具有吸熱峰。該溫度比公知的與金屬的共晶 低。
[0016] 本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶作為立方體結(jié)晶而得到。相對(duì)于此，已知的與金 屬的共晶為六角板狀或者雙四角錐結(jié)晶，本發(fā)明的結(jié)晶和已知的與金屬的共晶在其結(jié)構(gòu)上 有差異。
[0017] 在對(duì)本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶測(cè)定紅外線吸收光譜時(shí)，在3136、1712、 1637、1601、1530、1470、1386、1339 (cnfi)附近具有特征峰。
[0018] 另外，在紅外線吸收光譜測(cè)定中，一般包含小于2(cm-i)的誤差范圍，因此，除了上 述數(shù)值與紅外線吸收光譜的峰位置完全一致的結(jié)晶W外，峰值在小于2cnfi的誤差內(nèi)一致的 結(jié)晶也包括在本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶中。例如，在測(cè)定紅外線吸收光譜時(shí)，在3163 ±1.9、1712±1.9、1637±1.9、1601±1.9、1530±1.9、1470±1.9、1386±1.9、1339±1.9 (cnfi)具有特征峰。
[0019] 本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶在粉末X射線分析中具有特征峰，例如對(duì)本發(fā)明 的結(jié)晶采用使用了 Cu-Ka射線的粉末X射線衍射裝置進(jìn)行分析時(shí)，如后述實(shí)施例所示，衍射 角（2 目）在8.1、8.3、10.8、11.8、16.9、19.1、19.5、22.4、25.0、26.7、27.0、27.7(°)附近顯示 特征峰(參照?qǐng)D10)。
[0020] 此外，一般粉末X射線衍射的衍射角（20)有時(shí)包括小于5%的誤差范圍，因此，除了 粉末X射線衍射中的峰的衍射角完全一致的結(jié)晶W外，峰的衍射角在小于5%的誤差內(nèi)一致 的結(jié)晶也包括在本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶中。例如在粉末X射線衍射中，衍射角(20) 在 8.1±0.4、8.3±0.4、10.8±0.5、11.8±0.5、16.9±0.8、19.1±0.9、19.5±0.9、22.4± 0.1、25.0±1.2、26.7±1.3、27.0±1.3、27.7±0.3(°)具有特征峰。
[0021] 本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶在裝有飽和食鹽水的干燥器中，W50°C保存167 天時(shí)的高效液相色譜測(cè)定值的純度降低率低于1%，是穩(wěn)定性極高的結(jié)晶。
[0022] 本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶可通過(guò)在3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的水溶液中添加酸 使抑降低至抑1~3而得到。
[0023] 用于結(jié)晶化的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸通過(guò)酶合成法或者化學(xué)合成法等公知的方法合 成即可，但優(yōu)選通過(guò)酶合成法合成。進(jìn)行酶合成法時(shí)可W按照已知的方法進(jìn)行，例如可利用 專利文獻(xiàn)1記載的方法。反應(yīng)后，在反應(yīng)液中生成的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸可通過(guò)使用了活性炭 或者離子交換樹脂等的通常的色譜處理法進(jìn)行分離純化。
[0024] 結(jié)晶化時(shí)，在3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的水溶液中添加酸使P郵華低至P化~3,優(yōu)選降低 至pHl.5~2.0。作為使用的酸，可舉出鹽酸、硫酸、硝酸等。為了防止因急速加入酸而導(dǎo)致的 非結(jié)晶化或者結(jié)晶急劇析出，優(yōu)選緩慢添加。另外，結(jié)晶的獲得產(chǎn)量低時(shí)，可通過(guò)從上述結(jié) 晶的濾液實(shí)施上述析晶處理來(lái)回收第二晶體。
[0025] 另外，結(jié)晶化可按照由W下工序構(gòu)成的方法進(jìn)行：（1)將分離純化得到的3'，5'-環(huán) 二鳥巧酸的水溶液加熱至50~70°C的工序；（2)在該溶液中添加酸使P啡華低至P化~3，優(yōu)選 降低至抑1.5~2.0的工序；W及(3)將該溶液冷卻至1~10°C，優(yōu)選冷卻至4~8°C的工序。為 了更可靠地使結(jié)晶析出，優(yōu)選緩慢進(jìn)行（3)的冷卻工序。具體地，優(yōu)選W溫度梯度-3~-11 °C/虹進(jìn)行冷卻。此外，（1)和(2)工序、（2)和(3)工序可同時(shí)進(jìn)行。
[00%]由上述制造方法得到的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶可通過(guò)在過(guò)濾后^30~70°(：干燥1 ~10小時(shí)而得到產(chǎn)品。在干燥時(shí)，可適當(dāng)?shù)乩脺p壓干燥等方法。 【實(shí)施例】
[0027] W下通過(guò)實(shí)施例具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于此。 (實(shí)施例1)3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶的制造 按照公知方法(專利文獻(xiàn)1)，利用酶合成法來(lái)合成3'，5'-環(huán)二鳥巧酸，進(jìn)行純化。 將純化得到的59.9mM的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸溶液(191ml)在培養(yǎng)器中加溫至60°C，用2小 時(shí)邊攬拌邊添加1N的鹽酸溶液27.5ml，使抑達(dá)到抑1.9。
[00%]添加鹽酸溶液后，利用程控培養(yǎng)器在溫度梯度-7°C/hr下將溶度冷卻至5°C使結(jié)晶 析出。運(yùn)樣析出的結(jié)晶利用玻璃過(guò)濾器（17G3)過(guò)濾，得到濕結(jié)晶。濕結(jié)晶在30°C下干燥9小 時(shí)，得到干燥結(jié)晶8.095g。
[0029] (參考例)3'，5'-環(huán)二鳥巧酸金屬共晶的制造 參考非專利文獻(xiàn)2、3的記載，按如下方式得到了3'，5'-環(huán)二鳥巧酸與儀或者鉆的共晶。 (參考例1)3'，5'-環(huán)二鳥巧酸與儀的共晶 制備結(jié)晶化開始液(2mM3'，5'-環(huán)二鳥巧酸、20mMMgCl2、20mMglycine-HCl(p肥.l)、 7%(v/v)2-MPD)500mL〇 將該結(jié)晶化開始液在55°C下加熱，在蒸發(fā)器中濃縮，在觀察到白濁的時(shí)刻再次添加溶 劑至500mL，在55 °C加熱30分鐘使之完全溶解。對(duì)其進(jìn)行再濃縮，將凈化產(chǎn)物在25 °C靜置一 晚后，觀察到六角平板狀結(jié)晶的析出，利用蒸汽擴(kuò)散法充分培養(yǎng)結(jié)晶，得到與儀的共晶。
[0030] (參考例2)3'，5'-環(huán)二鳥巧酸與鉆的共晶 制備結(jié)晶化開始液(2mM3'，5'-環(huán)二鳥巧酸、llmMCoCl2、20mMglycine-HCl(p肥.l)、 7%(v/v)2-MPD)500ml〇 將該結(jié)晶化開始液在55°C下加熱，在蒸發(fā)器中濃縮后，在25°C靜置一晚，觀察到雙四角 錐結(jié)晶的析出，利用蒸汽擴(kuò)散法進(jìn)行結(jié)晶培養(yǎng)。蒸汽擴(kuò)散法中，在密閉容器(TLC展開槽）中 添加800mL的50%的2-MPD(水:MPD = 1:1)，將兩個(gè)燒杯靜置6個(gè)月，得到與鉆的共晶。
[0031] (實(shí)施例2)3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶的物理性質(zhì) 針對(duì)上述實(shí)施例1中制備的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶實(shí)施的儀器分析結(jié)果如下所示。
[0032] (儀器分析） (A)純度檢驗(yàn) 采用高效液相色譜法分析實(shí)施例1中得到的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶的純度，結(jié)果為3'， 5'-環(huán)二鳥巧酸的純度為99.0%。另外，高效液相色譜法是在W下條件下進(jìn)行的。 (條件） 柱:Hy化OS曲ere C18(YMC社制） 洗脫液:0.1M TEA-P(p冊(cè).0) 檢測(cè)方法:在UV260nm下檢測(cè)
[0033] (B)結(jié)晶形狀 將實(shí)施例1中制備的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶，W及參考例中制備的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸 與儀的共晶和與鉆的共晶的代表性照片示于圖1~3。如圖1所示，本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧 酸的結(jié)晶為立方體結(jié)晶，而圖2和3所示的與儀的共晶為六角平板狀結(jié)晶，與鉆的共晶為雙 四角錐結(jié)晶，本發(fā)明的結(jié)晶顯示出與現(xiàn)有結(jié)晶完全不同的結(jié)晶形狀。
[0034] (C)水分 對(duì)實(shí)施例1中制備的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶，利用卡爾費(fèi)休法測(cè)定結(jié)晶的水分含量，結(jié) 果為水分含量為9.3~13.9%。即，明確了本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶中，相對(duì)于1分子 的3'，5環(huán)二鳥巧酸鍵合或者附著有約4~6分子、更具體而言3.9~6.2分子的水分子。
[0035] (D)差示掃描量熱分析 利用熱重測(cè)定/差示熱分析(TG/DTA)裝置(升溫速度f(wàn)TC/分鐘)進(jìn)行分析，結(jié)果為本發(fā) 明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶在213~217°C顯示特征吸熱峰（圖4)。相對(duì)于此，3'，5'-環(huán)二鳥 巧酸與儀的共晶在22rC附近、與鉆的共晶在239°C附近顯示特征吸熱峰(分別為圖5、6)。
[0036] (E)紅外線吸收光譜 對(duì)本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶，W及參考例的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸與儀的共晶和 3'，5'-環(huán)二鳥巧酸與鉆的共晶，利用傅立葉變換紅外分光光度計(jì)Spectrum One(Perkin Elmer)，采用ATR(Attenuated Total Ref lec1:ance，衰減全反射)法測(cè)定紅外線吸收光譜。
[0037] 將對(duì)各結(jié)晶觀察到的特征峰(cnfi)的值示于表1。另外，將本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥 巧酸結(jié)晶，W及參考例的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸儀共晶和3'，5'-環(huán)二鳥巧酸鉆共晶的紅外線吸 收光譜分別示于圖7、圖8、圖9。
[0038] 本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸的結(jié)晶在3163、1712、1637、1601、1530、1470、1386、 1339(cm-i)附近具有特征峰。相對(duì)于此，與儀的共晶在3226、1702、1634、1597、1531、1477、 1345km-i)附近具有特征峰，與鉆的共晶在3179、1638、1576、1534、1487、1383(cm-i)附近具 有特征峰。將其結(jié)果示于表1。
[0039] 【表1】
[0040] (F)粉末X射線衍射 對(duì)本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶，W及參考例的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸與鉆的共晶和 3'，5'-環(huán)二鳥巧酸與儀的共晶，利用乂射線衍射裝置乂'？6刊？1?0 1?0(596(3*'18 0〇.， Ltd.)，在W下測(cè)定條件下測(cè)定X射線衍射光譜。
[0041] (測(cè)定條件） 革己:化 X射線管電流:40mA X射線管電壓:45kV 掃描范圍：20 = 4.0~40.0。 預(yù)處理:利用瑪瑤制研鉢粉碎
[0042] 如圖10和表2所示，本發(fā)明的3 '，5 環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶在衍射角（20)為8.1、8.3、 10.8、11.8、16.9、19.1、19.5、22.4、25.0、26.7、27.0.27.7(°)附近顯示特征峰。另外，作為 比較數(shù)據(jù)將3'，5'-環(huán)二鳥巧酸儀共晶的結(jié)果示于圖11和表3,將3'，5'-環(huán)二鳥巧酸鉆共晶 的結(jié)果示于圖12和表4。
[00創(chuàng)【表2】
[0044]【表3】
[00例【表4】
[0046] (G)穩(wěn)定性 將本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶，W及參考例的與鉆的共晶和與儀的共晶放入裝有 飽和食鹽水的干燥器中在50°C下保存，分別在保存開始后第0、7、31、84、167天后測(cè)定HPLC 純度。將HPLC純度（％)的測(cè)定結(jié)果示于下述表5,另外，將第0天測(cè)定的HPLC純度視為100% 時(shí)各測(cè)定日相對(duì)于開始保存時(shí)的殘存率（％ )示于表6。
[0047] 結(jié)果為本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸在50°C下保存167天時(shí)的HPLC純度降低率低于 1%，表明穩(wěn)定性極高。該值明確地說(shuō)明了本發(fā)明的3'，5'-環(huán)二鳥巧酸結(jié)晶不遜色于現(xiàn)有的 與金屬的共晶，可W實(shí)際應(yīng)用。
[004引【表5】
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種3'，5'_環(huán)二鳥苷酸結(jié)晶。2. 如權(quán)利要求1所述的結(jié)晶，其特征在于，利用高效液相色譜測(cè)定時(shí)具有97%以上的純 度。3. 如權(quán)利要求1或2所述的結(jié)晶，其特征在于，利用高效液相色譜測(cè)定時(shí)具有99%以上 的純度。4. 如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的結(jié)晶，其特征在于，相對(duì)于一分子的3'，5'_環(huán)二鳥 苷酸，鍵合或者附著有約4~6分子的水分子。5. 如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的結(jié)晶，其特征在于，利用熱重測(cè)定/差示熱分析裝 置，即TG/DTA裝置測(cè)定時(shí)，在213~217°C顯示吸熱峰。6. 如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的結(jié)晶，其特征在于，測(cè)定紅外線吸收光譜時(shí)，在 3136、1712、1637、16015 1530^470^3865 13390^1 附近具有特征峰。7. 如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的結(jié)晶，其特征在于，在粉末X射線分析中，在衍射角2 Θ 為8.1、8.3、10.8、11.8、16.9、19.1、19.5、22.4、25.0、26.7、27.0、27.7°附近具有特征峰。8. -種3'，5'_環(huán)二鳥苷酸結(jié)晶的制造方法，其特征在于，包括在3'，5'_環(huán)二鳥苷酸水 溶液中添加酸使pH降低至pHl~3的工序。9. 一種3'，5'_環(huán)二鳥苷酸結(jié)晶的制造方法，其特征在于，包括以下（1)~(3)的工序： (1) 將3 '，5 環(huán)二鳥苷酸水溶液加熱至50~70 °C的工序； (2) 在3'，5'_環(huán)二鳥苷酸溶液中添加酸使pH降低至pHl~3的工序；以及 (3) 將3 '，5 ' -環(huán)二鳥苷酸溶液冷卻至1~10°C的工序。
【文檔編號(hào)】C07H19/213GK106061988SQ201580010888
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2015年2月27日
【發(fā)明人】田中壽基, 石毛和也
【申請(qǐng)人】雅瑪山醬油株式會(huì)社