甜菊糖苷的分離、離析和表征方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種對兩種或更多種來源于甜菊植物提取物的甜菊糖苷的組合進行分離、離析和表征的綜合性方法以及這些甜菊糖苷在甜味組合物中的用途。對兩種或更多種來源于甜菊的甜菊糖苷的組合進行表征。兩種或更多種甜菊糖苷的組合可用作食品、飲料、化妝品和藥物中的增甜劑、風(fēng)味增強劑和甜味劑。本發(fā)明還公開了一種對兩種或更多種甜菊糖苷的組合進行離析的方法。
【專利說明】甜菊糖昔的分離、離析和表征方法
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002 ]本申請要求2014年2月18提交的美國臨時申請系列號61 /941018的優(yōu)先權(quán)，其全部 內(nèi)容通過引用納入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及一種對來源于甜菊植物提取物的甜菊糖巧進行分離、離析和表征的綜 合性方法W及運些甜菊糖巧在甜味組合物中的用途。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 現(xiàn)今，糖替代物正受到越來越多的關(guān)注，因為人們意識到許多疾病與高糖食品和 飲料的消費有關(guān)。然而，例如甘素、環(huán)己基氨基橫酸鋼和糖精的許多人造甜味劑因?qū)ζ浒踩?性的擔憂而在一些國家被禁或受限。因此，天然來源的無熱量甜味劑正變得越來越受歡迎。
[0006] 甜菊是一種原產(chǎn)于南美某些地區(qū)的菊目（菊科)多年生灌木。運種植物的葉子含有 10%~20%的二祗巧，其甜度大約是糖的150倍~450倍。運些葉子在己拉圭和己西作為傳 統(tǒng)已使用了數(shù)百年來增加當?shù)夭枞~和藥品的甜度。
[0007] 典型的做法是在一年中溫暖的時段種植植物，然后在其開花前收割。David J.Midmore和An化ew H.Rank在（《一種替代進口化學(xué)甜味劑的新興鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)一甜菊一》"A new rural industry-Stevia-to replace imported chemical sweeteners''，《對鄉(xiāng)村產(chǎn) 業(yè)研發(fā)公司的調(diào)察報告》"A repo;rt for the Rural Industries Research and Development Co巧oration" ,2002年8月；RI畑C網(wǎng)絡(luò)公開號W02/022，RI畑C項目號UCQ-16A) 中報告了能夠在例如己西、己拉圭、印度或印度尼西亞的溫暖氣候中生長的復(fù)種作物。"籠 統(tǒng)地報告了商業(yè)產(chǎn)量數(shù)字，例如1600kg~2000kg干葉/公頃/年。實驗性的產(chǎn)量表明具有在 一年中進行多次收割的體系能夠給出更高的產(chǎn)量。"該產(chǎn)量是指干燥植物的質(zhì)量，并未最恰 當?shù)乇硎緸槊磕昝抗暤奶鹁仗乔闪?。借由改進的解析方法和為了改善每公頃甜菊糖巧產(chǎn) 量而選擇的植物的良好農(nóng)藝開發(fā)，W及通過使植物在給定地理區(qū)域中的成熟與交錯收割相 協(xié)調(diào)，能夠?qū)崿F(xiàn)每個收割季節(jié)的收割期后的甜菊糖巧的改善。
[000引 Mi血ore和Rank繼續(xù)報告道："通常的程序是收割整個綠色作物并將其輸送至干燥 設(shè)備：陽光干燥或(人造)干燥害。在低濕度下，切碎了的植物的薄層陽光干燥會進行得很快 (9小時~10小時），將植物含水量從大約80%降至10% [116]。害干燥可能需要兩天的時間 [37]?？焖俑稍锟赡芴峁?更好品質(zhì)的'干燥葉子。如果切碎了的植物材料未被快速干燥，貝U 葉子的品質(zhì)會因氧化而變差，甜菊巧含量在=天后減損為原來的=分之一 [116]。人工干燥 過程中的高溫也會導(dǎo)致含量的減損。綠色的干燥葉子的顏色是令人滿意的并且代表著良好 的品質(zhì)"。我們已經(jīng)通過交錯收割和定期對潮濕（即新鮮未干燥）的未經(jīng)過任何干燥處理的 葉子進行提取處理實現(xiàn)了對該做法的改進。該改進提供了雙重好處:降低干燥過程中糖巧 損失W及通過排除對干燥器的需要而節(jié)約了處理成本。
[0009]據(jù)報告，干燥的甜菊葉子大約含有5%~9%的水分、10%~20%的蛋白質(zhì)、35%~ 62 %的碳水化合物、3 %~5 %的脂肪(主要是棟桐酸、亞麻酸和亞油酸）、7 %~13 %的灰質(zhì) 和若干種揮發(fā)性組分，包括斯己醇、e-羨締、e-石竹締和石竹締氧化物。甜菊還是草酸的一 種豐富來源(參見W61wer-RieckU的《(伯托尼)甜菊的葉子，其成分和對成分的解析:綜述》 叮he Leaves of Stevi曰 reb曰udi曰n曰（Bertoni),Their Constituents and the An曰lysis Thereof: A Review"，J. Agric. Qiem. 2012,60,886~895)。如果運些成分未被除去或降至足 夠低的水平，則它們會影響甜味劑的風(fēng)味。結(jié)果是對單一的高純度甜菊甜味劑的離析必須 進行大量加工，包括用各種樹脂的處理、使用有機溶劑的分離和進行結(jié)晶，W使產(chǎn)品具有合 適的味道和質(zhì)量。
[0010] 現(xiàn)存超過230種具有明顯增甜性質(zhì)的甜菊品種。運種植物已在從其原生的亞熱帶 至寒冷的高締度的范圍廣泛的條件下成功種植。甜菊糖巧的組成可通過定向育種來改變。 鑒于原生的植物品種具有甜菊巧作為主要的甜菊糖巧，已為了提高萊鮑迪武A的含量而選 擇現(xiàn)代品種，所述萊鮑迪武A被認為是一種比甜菊巧品質(zhì)更好的甜味劑。甜菊會生成許多其 它甜菊糖巧，運些甜菊糖巧還具有W下特征:在一些情況中具有比許多其它天然形成的高 效能甜味劑更高甜度的甜味和感官性質(zhì)。甜菊糖巧不會在人的消化系統(tǒng)中被代謝成能量， 且可在任何添加糖的場合下用于在不增加熱量的條件下使食物變甜。它們適合糖尿病患者 和低熱量飲食。
[0011] 上述糖巧具有相同的巧元斯替維醇，而區(qū)別在于Ci3和Ci9位(分別為圖1中的R2和 R1)處糖殘基的數(shù)量和類型。甜菊葉能夠積聚不超過10%~20% (基于干重)的甜菊糖巧。天 然甜菊葉中的大部分糖巧是萊鮑迪武A(2%~10%)、甜菊巧(2%~10%)和萊鮑迪武C(l% ~2%)。例如萊鮑迪武B、D、E和F、甜菊雙巧和甜茶巧的其它糖巧也W低水平（低于1 % )存 在。最近，Ohta 等在 J.Appl.Glycosci.(2010)57:199 ~209 中報告了 另一些糖巧。
[0012] 人們對兩種最主要的糖巧一甜菊巧和萊鮑迪武A進行了廣泛地研究并將其表征為 適合作為商業(yè)高甜度甜味劑。例如，對碳酸飲料的穩(wěn)定性研究證實了它們具有熱穩(wěn)定性和 pH穩(wěn)定性。Chang S.S.等（1983)的《碳酸飲料中甜菊巧和萊鮑迪武A的穩(wěn)定性研究》 ('Stability studies of Stevioside and Rebaudioside A in carbonated beverages'' (J.Agric .Food化em. 31:409~412)。即使在高純度的狀態(tài)下，運些甜菊糖巧仍然具有不希 望的味道屬性，例如苦味、甜味殘留、甘草風(fēng)味等。妨礙甜菊甜味劑成功商業(yè)化的主要阻礙 之一就是運些不希望的味道屬性。事實表明，隨著甜菊糖巧濃度的上升，運些風(fēng)味香調(diào)變得 更加明顯(Prakash等(2008)《一種天然的無熱量甜味劑一反舶aM?'的進展》"Deve lopment of Rebiana",曰 n曰tur曰 1 ,non-c曰loric sweetener''，F(xiàn)ood Chem.Toxicol. ,46,875~S82)。
[0013] 萊鮑迪武A展現(xiàn)出最低的澀味、最低的苦味和最低的回味殘留，因而相比于已知的 甜菊糖巧具有令人喜愛的感官屬性（（Tanaka 0.等（1987)《天然甜味劑味道的改善》 ('Improvement of taste of natural sweeteners''Pure Appl. Chem. 69 : 675~683 ; Phillips K.C. (1989)《甜菊:開發(fā)新甜味劑的步驟》"Stevia: steps in developing a new sweetener",載于Grenby T.H.等主編的《甜味劑的發(fā)展》"Developments in sweeteners", 第3卷,Elsevier Applied Science,London.,1~43)。
[0014] Wang在美國公開申請?zhí)?013347140中公開了一種培育萊鮑迪武A含量高的甜菊植 物的方法。
[0015] 美國專利號PP23164和PP23728公開了名為AKH L1和AKH L4的甜菊品種。運些品種 具有高含量的萊鮑迪武。
[0016] 例如美國專利號4361697、4082858、4892938、5972120、5962678、7838044和 7862845描述了使用水或有機溶劑對來源于甜菊植物的甜味糖巧進行提取和純化的方法。
[0017] Dobberstein 和 Ahmed(美國專利號 4361697)和 Morita 等（美國專利號 4082858)公 開了用于甜菊糖巧的硅膠色譜法。Giovenatto(美國專利號4892938)使用氨氧化巧使甜菊 甜味劑的粗提取物澄清，再進行過濾或離屯、。用強酸性離子交換樹脂并隨后再用弱堿性離 子交換樹脂對該沉淀物進行處理，進行過濾和干燥。Magomet等（美國專利號7862845)還指 出了通過用巧鹽對粗提取物進行處理、過濾粗漿料并隨后從甲醇-水混合物中使萊鮑迪武 結(jié)晶來對甜菊糖巧進行部分純化。Abelyan等(美國專利號7838044)指出了在存在果膠酶的 條件下從(伯托尼）甜菊中提取甜味糖巧，并且通過使提取物與環(huán)糊精、膨潤±和離子交換 樹脂接觸、隨后從乙醇中結(jié)晶和重結(jié)晶來進行純化。Kutowy等(美國專利號5972120)公開了 一種方法:在垂直提取柱中從(伯托尼）甜菊中提取甜味化合物，隨后利用作為預(yù)處理步驟 的微濾通過過濾來進行純化W使提取物澄清，然后進行超濾，隨后再進行納濾。Payzant等 (美國專利號5962678)使用兩根離子交換柱除去提取自甜菊的甜味糖巧中的雜質(zhì)，使用甲 醇對來源于第二柱的甜味糖巧進行洗脫，并且對溶液進行冷卻W使甜菊巧結(jié)晶。濾液被進 一步濃縮和冷卻W使萊鮑迪武A結(jié)晶出來。
[001引美國專利號4612942公開了包括萊鮑迪武D在內(nèi)的二祗巧W及它們在食品、醫(yī)藥組 合物、口腔衛(wèi)生組合物、巧嚼組合物和煙草組合物中的用途。
[0019] 已經(jīng)確定的是，當新的糖殘基在Cl3和Cl9位處與初始分子相連時，運些不希望的性 質(zhì)中的一些可通過對甜菊糖巧進行分子間轉(zhuǎn)糖反應(yīng)來緩解或消除。運些化合物味道的品質(zhì) 和效能會隨運些位置上糖殘基的數(shù)量而變化。表1例示了甜味的品質(zhì)和甜度是如何隨糖巧 數(shù)量和位置而變化的。葡萄糖基（表中W "Glue"或"G"表示)通過0-糖巧鍵相連。支鏈淀粉 酶、異麥芽糖酶化obov S.V.等（1911)《甜味甜菊巧衍生物的酶生產(chǎn):利用葡萄糖巧酶的轉(zhuǎn) 糖巧作用》('Enzymat i C production of sweet stevioside derivatives : transglycosylation by glucosidases" lAgric.Biol .Qiem. 55:2959~2965)、0-半乳糖巧 酶化itahata S.等（1989)《利用各種(6-半乳糖巧酶的轉(zhuǎn)糖巧作用生產(chǎn)甜茶巧衍生物》 ('Production of rubusoside derivatives by tr曰nsglycosyl曰tion of variousP- galactosidase"，Ag;ric . Biol.畑em. 53 : 2923~2928)和葡聚糖薦糖酶（Yamamoto K.等 (1994)《利用葡聚糖葡聚糖酶的a-l，6-轉(zhuǎn)糖巧作用有效生產(chǎn)葡萄糖基-甜菊巧；TEffective production of glucosyl-stevioside by曰-1,6-tr曰nsglucosy1曰tion of dextr曰n dextranase"，81〇3。1.81〇1日證.81〇油日111.58:1657~1661)分別與支鏈淀粉、麥芽糖、乳糖和 部分水解的淀粉一起被用作轉(zhuǎn)糖酶，作為糖巧殘基的提供者通過a連接的葡萄糖單元線性 地延長了甜菊糖巧上的糖部分。
[0020] 甜菊糖巧的轉(zhuǎn)糖巧作用還可通過利用嗜熱脂肪芽抱桿菌得到的環(huán)糊精葡萄糖基 轉(zhuǎn)移酶(CG化se)來進行(美國專利號4219571和7807206)。結(jié)果是形成了聚合度不超過10的 0-1,4-葡萄糖基衍生物。
[0021 ]事實表明，葡萄糖基衍生物的味道特征和甜度在很大程度上取決于附加的葡萄糖 基衍生物的數(shù)量，即0-1,4-葡萄糖基鏈的聚合度。a-1,4-葡萄糖殘基數(shù)量的增加改善了味 道品質(zhì)，但同時降低了甜味水平。（化naka，1987)
[0022]還應(yīng)當注意的是，許多具有葡萄糖基的甜菊產(chǎn)品含有不超過20%的殘余糊精，運 些殘余糊精不具有明顯的功能性質(zhì)，但降低了產(chǎn)品中甜菊糖巧的含量，進而降低了甜度。
[0023] 因此，需要開發(fā)一種簡單而高效的制備高純度甜菊糖巧的方法。
[0024] 無錫金博甜菊國際貿(mào)易有限公司在中國公開申請?zhí)朇N103012516中公開了甜菊糖 巧的制備方法，其包括在水中浸泡甜菊葉的步驟;進行粗濾和超濾W得到超濾溶液的步驟； 將超濾溶液通入納米微保護柱的步驟;W及至少兩個在納米微保護柱中進行醇解的步驟。
[0025] 迂寧千千生物科技有限公司在中國公開申請?zhí)朇N102127129中公開了一種甜菊提 取物的制備方法，其包括對甜菊葉進行機械破碎的步驟;過濾甜菊葉的步驟;超聲提取的步 驟;絮凝步驟;吸附步驟;利用乙醇洗脫的解析步驟;脫鹽脫色步驟;濃縮步驟；W及噴霧干 燥步驟。
[00%]寧波綠之健藥業(yè)有限公司在中國公開申請?zhí)朇N102406113中公開了一種萊鮑迪武 A/萊鮑迪武D復(fù)配物的制備方法，其包括用水提取粉碎后的甜菊葉;使濾液通過大孔樹脂柱 的步驟；W及用醇類溶劑進行洗脫并使用HPLC色譜分析檢測萊鮑迪武A/萊鮑迪武D含量的 步驟。
[0027] E . P . C Plant 化armaceutical Technology Co Ltd在美國公開申請?zhí)?20130071537中公開了基于甜菊的甜味劑組合物，其包含萊鮑迪武B的一種鹽的形式。
[0028] 化rgill，Inco巧orated在美國公開申請?zhí)?0140243514中公開了一種富集組合物 的制備方法，該富集組合物包含萊鮑迪武B、萊鮑迪武D或它們的混合物中的至少一種，該方 法包括使用大孔中性多孔樹脂。
[00巧]化rgill，Inco巧orated在美國公開申請?zhí)?0130309389中公開了一種含有特定量 的萊鮑迪武D和萊鮑迪武B的組合物。
[0030] LGL Life Tech Corporation在美國公開申請?zhí)?0140004248中公開了一種天然 甜味劑組合物的制造方法，該組合物包含甜菊雙巧提取物、萊鮑迪武B提取物和萊鮑迪武D 提取物中的至少一種，該方法包括使用具有特定參數(shù)的多孔吸附柱。Markosyan在美國公開 申請?zhí)?0130071339中公開了高純度甜菊糖巧、特別是萊鮑迪武D的制備方法。
[0031] Markosyan在美國公開申請?zhí)?0150017284中公開了含有至少75 %的萊鮑迪武M的 萊鮑迪武M和萊鮑迪武D晶體組合物。
[0032] Markosyan在美國公開申請?zhí)?0130071339中公開了一種甜菊糖巧的提純方法，其 包括使用依序相連的填充有能夠吸附甜菊糖巧的吸附劑樹脂的柱。
[0033] 化reCircle Sdn Bhd在美國專利號8299224中公開了一種來源于甜菊提取物的萊 鮑迪武D的提純方法，其包括提供甜菊的提取物;將提取物溶于有機溶劑的第一水溶液中W 形成甜菊糖巧的第一混合物，其中，有機溶劑選自甲醇、乙醇、1-丙醇、異丙醇W及它們的化 合物，且有機溶劑為75體積％~99體積％;在第一混合物中引起結(jié)晶;過濾該混合物W得到 第一沉淀和第一濾液;將第一沉淀溶于有機溶劑的第二水溶液中W形成第二混合物，其中， 有機溶劑選自甲醇、乙醇、1-丙醇、異丙醇W及它們的混合物，且有機溶劑為70體積％~80 體積％;在第二混合物中引起結(jié)晶;過濾該混合物W得到第二沉淀和第二濾液;將第二沉淀 溶于有機溶劑的第=水溶液中W形成第=混合物，其中，有機溶劑選自甲醇、乙醇、1-丙醇、 異丙醇W及它們的混合物，且有機溶劑為10體積％~80體積％;在第=混合物中引起結(jié)晶； 過濾該混合物W得到第=沉淀和第=濾液;通過干燥第=沉淀來生產(chǎn)經(jīng)過純化的萊鮑迪武 D。
[0034] 伊比西北京植物藥物技術(shù)有限公司巧PC Beijing Na1:ural Products Co丄td)在 美國公開申請?zhí)?20140335253、20140335254、20140335264 和 20140335265 中公開了含有增 加量的經(jīng)過純化的萊鮑迪武D的非天然萊鮑迪武D組合物，其中，向組合物中加入增加量的 經(jīng)過純化的萊鮑迪武D作為經(jīng)過純化的萊鮑迪武D。
[OO%] Ingredients Americas LLC在美國公開申請?zhí)?0120269954中公開了 一種包含萊鮑迪武B的甜菊提取物。
[0036] Lee等在美國公開申請?zhí)?0110256588中公開了一種生產(chǎn)萊鮑迪武A的方法，其通 過對伯托尼甜菊葉生成萊鮑迪武A時所產(chǎn)生的副產(chǎn)物進行循環(huán)來得到高收率。
[0037] Morita等在美國公開申請?zhí)?0110183056中公開了經(jīng)過離析的具有該文獻中所公 開的結(jié)構(gòu)的甜菊糖巧。該文獻公開了具有W下結(jié)構(gòu)的甜菊糖巧可使甜菊甜味劑的味道產(chǎn)生 微妙的改善，即該結(jié)構(gòu)中存在比甜菊巧或萊鮑迪武A上更多的糖巧基。
[0038] 化reCircle Sdn Bhd在美國專利號8520527中公開了一種甜菊食品配料的生產(chǎn)方 法，其包括將甜菊生物質(zhì)浸泡在水中W除去可溶性成分的步驟;在堿性溶液中培育不溶于 水的甜菊生物質(zhì)W生成漿料的步驟；W及其它加工步驟W得到含有微晶纖維素的甜菊食品 配料。
[0039] Concenhate Manufacturing Company of Ireland在美國專利號8337928中公開 了一種包含至少一種甜菊糖巧甜味劑和茵香酸的飲料產(chǎn)品。
[0040] PureCircle USA在美國專利號8318459和8257948中公開了一種方法，其利用淀粉 作為葡萄糖殘基來源來制造高純度的具有葡萄糖基的甜菊組合物。
[0041 ] 化reCircle Sdn Bhd在美國專利號8299224中公開了一種來源于甜菊提取物的萊 鮑迪武D的純化方法。
[0042] Concenhate Manufacturing Company of Ireland在美國專利號8277862中公開 了一種包含萊鮑迪武A、赤薛糖醇和酸性成分的飲料產(chǎn)品。
[0043] Concenhate Manufacturing Company of Ireland在美國專利號8277862中公開 了一種包含甜菊糖巧和酸性成分的飲料產(chǎn)品。
[0044] 化psiCo，Inc.在美國專利號7964232中公開了甜菊糖巧異構(gòu)體，其中，式I的外環(huán) 雙鍵被移至五元環(huán)內(nèi)的內(nèi)環(huán)位置處。
[0045] Vineland Research and Innovation Centre在美國專利號7927851 中公開了一 種植物或植物細胞中的甜菊糖巧的制造方法，其包括:a)選擇生成內(nèi)貝殼杉締酸的植物或 植物細胞;b)使具有對具有內(nèi)貝殼杉締酸13-氨化酶活性的多膚進行編碼的第一核巧酸序 列和至少一種對一種或多種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶進行編碼的其它核巧酸序列的植物或植物細 胞轉(zhuǎn)化，來對相甜菊或具有葡萄糖基的甜菊中加入葡萄糖分子進行催化；W及C)對細胞中 的具有內(nèi)貝殼杉締酸13-氨化酶的多膚和所述一種或多種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶進行表達，W將 內(nèi)貝殼杉締酸轉(zhuǎn)化為一種或多種甜菊糖巧。
[0046] 化ta等在《對來源于森田甜菊葉的新型甜菊糖巧的表征》"化aracterization of novel steviol glycosides from leaves of Stevia rebaudiana morita'' (J.Appl.Glycosci. ,57,199~209(2010))中公開了提取自森田甜菊葉的甜菊糖巧的結(jié)構(gòu)， 所述森田甜菊通過對伯托尼甜菊進行選擇和育種來生產(chǎn)。
[0047] Zimmerman在《具有結(jié)構(gòu)方案的已知和新型甜菊糖巧的串聯(lián)質(zhì)譜碎片圖譜》 ('Tandem mass spectrometric fragmentation patterns of known and new steviol glycosides with structure proposals''（Rapid Commun.Mass.Spectrom.2011,25,1575 ~1582)中公開了使用串聯(lián)質(zhì)譜來識別12種過去未知的甜菊糖巧。
[004引 Brandle等（2002^植物的分子生物學(xué)》"Plant Molecular Biology"50:613~ 622;Richman等（1999)《植物學(xué)雜志rilie Plant Journari9(4)，411 ~421 和Richman等 (2005)《植物學(xué)雜志Ml，55~67公開了用于甜菊的生產(chǎn)和甜菊向各種甜菊糖巧轉(zhuǎn)化的代謝 途徑。
[0049]從原始提取物離析和純化甜菊糖巧的現(xiàn)有方法并未單獨或共同展示對殘余溶液 的進一步處理或?qū)ξ⒘炕衔镞M行純化的方法。因此，仍然需要用于對甜菊植物所產(chǎn)生的 提取物進行綜合性處理的高效且經(jīng)濟的方法。
[(K)加]發(fā)明概述
[0051] 本發(fā)明設(shè)及一種對兩種或更多種來源于甜菊植物的微量甜菊糖巧(具體是那些天 然含量小于1%干燥葉子重量的甜菊糖巧)進行分離、離析、表征和使用的綜合性方法。
[0052] 根據(jù)一種實施方式，提供了一種對兩種或更多種來源于甜菊提取物的甜菊糖巧的 組合進行分離、離析和表征的高效方法，從而使浪費降到最少。
[0053] 兩種或更多種甜菊糖巧的組合單獨地或者與其它甜味劑和/或其它配料相結(jié)合地 適合用作例如飲料、糖果、面包、餅干、口香糖、藥物等可食用和可巧嚼組合物中的無熱量甜 味劑。
[0054] 根據(jù)一種實施方式，本方法包括：
[0055] 1.使用對兩種或更多種微量甜菊糖巧的組合(含量小于5%干燥葉子重量)進行識 別和定量的色譜法作為指導(dǎo)育種計劃的方法，W使現(xiàn)今未作為甜味劑商業(yè)使用的該規(guī)定甜 菊糖巧組的產(chǎn)物最優(yōu)化；
[0056] 2.提取方法，其包括對甜菊葉（新鮮葉子或為了保存而干燥的葉子)進行分步提 取，W使對兩種或更多種分子量大于大約900g/摩爾的微量甜菊糖巧的回收最優(yōu)化，并且使 對于后續(xù)加工步驟的需求最小化；
[0057] 3.使用色譜法對兩種或更多種分子量大于大約900g/摩爾的甜菊糖巧的組合、優(yōu) 選為萊鮑迪武D、I、0、M和/或N進行離析，它們各自都基于干燥葉子重量W小于5 %的水平存 在；
[0058] 4. 一種避免在甜菊糖巧D、I、0、M和/或N的離析中需要進行結(jié)晶的方法，其包括使 用兩種或更多種溶劑在恒定溫度下或利用洗脫溶劑在溫度梯度下進行梯度洗脫；
[0059] 5.兩種或更多種甜菊糖巧的組合、優(yōu)選為萊鮑迪武D、I、0、M和/或N作為甜味劑的 用途，它們各自都基于干燥葉子重量W小于5 %的水平存在；
[0060] 6.可單獨使用兩種或更多種甜菊糖巧或?qū)⑺鼈兣c更多種主要的甜菊糖巧組合起 來使用，所述主要的甜菊糖巧包括但不限于萊鮑迪武A、萊鮑迪武B、萊鮑迪武D，且所述兩種 或更多種甜菊糖巧的量小于主要的甜菊糖巧的大約25%、小于主要的甜菊糖巧的大約 15%、小于主要的甜菊糖巧的大約10%、小于主要的甜菊糖巧的大約5%。摘自O(shè)hta等 (2010)的表9提供了來源于森田甜菊和伯托尼甜菊的葉子的甜菊糖巧的相對量。
[0061] 例如Outotec公司（芬蘭，埃斯波）的SepTor技術(shù)的連續(xù)逆流離子交換和吸附是一 種可用于除去污染物的技術(shù)。連續(xù)色譜法與常規(guī)的（單柱或多柱）固體固定相色譜法的不同 之處在于連續(xù)色譜法中所使用的多柱就像單柱那樣工作，但在柱之間具有多個進料位置和 排出位置W允許用于混合物和洗脫溶劑的進料位置和用于更快或更慢地洗脫混合物中的 成分的洗脫位置逐步推進。運種運行模式使得各個組件柱區(qū)段在洗脫劑組成或流速方面能 夠自主運行。Johan Samuelsson在《連續(xù)色譜法的模擬》"Simulation of continuous chromatographic processes"中，W及Niklas Andersson在《連續(xù)制備色譜法的模擬：對 MCSGP的個案石開究》('Simulation of continuous preparative chromatography:A case s化dy in MCSGP" (2009)中對為了在多柱(MC)系統(tǒng)中使用溶劑梯度(SG)而進行的連續(xù)分離 方法的模擬進行了描述。"制備"（P)設(shè)及在比用于分析目的時更大的規(guī)模、直至商業(yè)生產(chǎn)規(guī) 模上對分離產(chǎn)生影響。連續(xù)色譜分離在糖上的應(yīng)用在甜菜糖精制工業(yè)上得到了良好的發(fā) 展，Bubnik和共同作者們在《連續(xù)色譜分離在糖加工中的應(yīng)用》"Application of continuous chromatographic separation in sugar processing''（Journal of Food 化gineering 61 (2004)509~513)中對此進行了描述。連續(xù)分離方法的應(yīng)用必須根據(jù)所進 行的分離類型而定制。例如，用于離析高純度萊鮑迪武A的分離策略會與用于形成其它甜菊 糖巧的定制混合物的系統(tǒng)操作有所不同。迄今為止，連續(xù)分離方法尚未被應(yīng)用于包含選自 萊鮑迪武A、D、I、0、M和N中的至少兩種甜菊糖巧的定制甜菊糖巧的離析中。
[0062] 連續(xù)色譜法的另一個重要區(qū)別在于利用將要被分離的材料的持續(xù)存留，該材料駐 留在多柱系統(tǒng)中并且在系統(tǒng)中不斷循環(huán)。采用運種存留能夠通過調(diào)整各個成分的存留量來 有利地輔助分離，從而得到所需的組成。例如，如果進料混合物具有低含量的所需成分組 (例如3%~5%的萊鮑迪武A、D、I、0、M和N)而W萊鮑迪武A為主要部分（>20%)，則最初可 運樣操作柱:在允許量較少的成分存留在柱中的同時，重點對主要成分進行洗脫。運會允許 進料中量較少的成分比其它成分更好地溶解于柱的填充物中，運使得能夠進行對富含所需 (較少量)組分的物料流的洗脫。
[0063] 對各個柱進行獨立操作的能力對于設(shè)及兩種或更多種分離系統(tǒng)進料(例如待處理 的進料、洗脫劑A、洗脫劑B)和兩種或更多種洗脫物流速各異的洗脫物(例如產(chǎn)物1、產(chǎn)物2、 產(chǎn)物3等)的分離而言是至關(guān)重要的。柱的流量平衡按照下式計算：
[0064] F進墜)+F進(繼斗)=F出(巧如+F出卸-tft)
[0065] 其中，F(xiàn)進(繼40可W是待處理的進料或洗脫溶劑，而1?爐物)是洗脫產(chǎn)物。
[0066] 模擬移動床
[0067] 在制造中，模擬移動床(SMB)工藝是一種用于實施色譜分離的經(jīng)過高度工程改造 的工藝。其用于將一個化合物或一類化合物與一個或更多個其它化合物分離，W在比使用 簡單的（批料)色譜法更低的成本下，提供大量經(jīng)過純化或富集的材料。其無法提供任何不 能通過簡單的柱純化進行的分離或純化。該方法相當復(fù)雜。該方法帶給色譜法純化的一個 益處在于其允許在低得多的成本下大量生產(chǎn)高純度的材料。成本的降低是由W下原因?qū)е?的:使用更少量的色譜法分離介質(zhì)固定相、連續(xù)的高速產(chǎn)出W及減少的溶劑和能量需求。運 種改善的經(jīng)濟表現(xiàn)是由閥-柱排布帶來的，所述閥-柱排布用于無限延長固定相并允許本方 法具有很高的溶質(zhì)負載。
[0068] 在生產(chǎn)用色譜法的常規(guī)移動床技術(shù)中，進料和分析物回收是同時且連續(xù)進行的， 但因為連續(xù)式移動床具有實際困難而提出了模擬移動床技術(shù)。在模擬移動床技術(shù)中，并非 使反應(yīng)床移動，而是使進料口、溶劑或洗脫劑的入口和所需產(chǎn)物的出口 W及不希望的產(chǎn)物 的出口的位置隨著固體顆粒的連續(xù)流動和液體沿著與固體顆粒相反方向的連續(xù)流動而不 斷移動，運使其給人W移動床的印象。
[0069] 連續(xù)色譜法分離的另一種形式是環(huán)狀色譜法。在一篇已公開的綜述中，F(xiàn)rank Hilbri 邑和 Ruth Freita 邑（《連續(xù)環(huán)狀色譜'法》''Continuous annular chromatography''， Journal of Chromatogra曲y B，790(2003)l~15)報告道："數(shù)十年前人們就已經(jīng)知道連續(xù) 環(huán)狀色譜(CAC)的原理了。CAC是一種連續(xù)式的色譜法模式，其適用于分離多成分混合物和 雙成分混合物。在CAC中，流動相和固定相W交叉流的方式移動，運允許將典型的一維間歇 式柱分離轉(zhuǎn)化為連續(xù)的二維分離。除了線性梯度洗脫W外，現(xiàn)今，所有色譜法模式都被用于 CAC中。"在更早的時候，Bart和共同作者們（《果糖、甘露醇和山梨醇的連續(xù)色譜法分離》 ('Continuous chromatographic separation of fructose .mannitol and sorbitol"）京尤 將該方法用于單糖的分離，但是該方法尚未被用于分離甜菊糖巧。
[0070] 附圖簡要說明
[0071] 圖1顯示了甜菊糖巧的巧元結(jié)構(gòu)，其中標出了糖基化的位置(R1和R2)。
[0072] 圖2顯示了甜菊糖巧的體系。
[0073] 圖3的圖表顯示了如何通過甜菊糖巧的分子大小來預(yù)測主觀的味道品質(zhì)和甜味。
[0074] 圖4顯示了所感興趣的甜菊糖巧的質(zhì)譜圖。
[0075] 圖5顯示了所感興趣的甜菊糖巧的質(zhì)譜圖。
[0076] 圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明可使用的提取和純化步驟。
[0077] 圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明的模擬移動床色譜法的使用。
[0078] 參考下文的附圖、詳述和實施例能夠更全面地理解本發(fā)明。
[0079] 發(fā)明詳述
[0080]
【申請人】相信，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可W根據(jù)本說明書的描述，利用本發(fā)明至其全部 的范圍。W下的【具體實施方式】應(yīng)理解為僅僅是示例，并不在任何方面限定余下的公開內(nèi)容。
[0081] 除非另有限定，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員的通常理解相一致。同時，本文提到的所有出版物、專利申請、專利或其它參考 文獻均通過引用而被納入本申請。如本文所用，所有的百分比除有特殊說明之外都指重量 百分比。此外，本文中提及的所有范圍指包括兩個端點間的值的任意組合。
[0082] 定義
[0083] 術(shù)語"風(fēng)味香調(diào)"是指經(jīng)由鼻子吸入后(鼻后嗅覺），經(jīng)驗豐富者的味覺或嗅覺通常 所感知到的微妙的感官體驗。
[0084] 術(shù)語"斯替維醇"是指二祗類化合物:徑基-內(nèi)貝殼杉-16-締-13-醇-19簇酸，其是 W術(shù)語"內(nèi)貝殼杉締酸"表示的化合物內(nèi)貝殼杉-16-締-19簇酸的徑基化形式。
[0085] 術(shù)語"甜菊糖巧"是指包括但不限于甜菊巧、萊鮑迪武A、萊鮑迪武B、萊鮑迪武C、萊 鮑迪武D、萊鮑迪武E、萊鮑迪武F、萊鮑迪武I、萊鮑迪武M、萊鮑迪武N、萊鮑迪武0、杜克武、甜 茶巧、甜菊單巧、甜菊雙巧和19-0-0-化喃葡萄糖基-斯替維醇的斯替維醇巧元的任何糖巧。
[0086] 合成甜味劑的例子包括=氯薦糖、乙酷橫胺酸鐘、阿司己甜、阿力甜、糖精、新澄皮 巧二氨査爾酬合成衍生物、甜蜜素、紐甜、甘素、e-4-硝基苯胺天口冬氨酸鋼（suosan)、N- [N-[3-(3-^基-4-甲氧基苯基)丙基]-ka-天口冬氨酷]苯基丙氨酸^甲醋(糖精）、N- [N-[3-(3-^基-4-甲氧基苯基)-3-甲基下基]-ka-天口冬氨酷]A-苯基丙氨酸1-甲醋、N-
[N-[3-(3-甲氧基-4-?苯基）丙基]-ka-天口冬氨酷]-心苯丙氨酸1-甲醋、W及它們的鹽 等。
[0087] 天然的高甜度甜味劑的例子包括甜菊巧、萊鮑迪武A、萊鮑迪武B、萊鮑迪武C、萊鮑 迪武E、萊鮑迪武F、甜菊雙巧、杜克武A、甜茶巧、一些羅漢果武(例如羅漢果武V)、甜蛋白、新 澄皮巧二氨査爾酬（NHDC)、甘草酸及其鹽、奇異果甜蛋白、紫蘇糖、皮爾南甘素 (pernandulcin)、無患子倍半祗武、白元參武、糖蘇武-1、二甲基-六氨巧-二簇酸、相思子S 祗武、己西甘草甜素、肉質(zhì)雪膽皂巧、青錢柳武、蝶卡巧(pteroca巧oside)、聚波朵巧A、己西 木素、赫爾南甘素、葉甜素、費奠巧、根皮武、=葉巧、黃燒酬醇、3-乙酸二氨搬皮素、新落新 婦巧、順式肉桂醒、莫那甜及其鹽、修藤精A(selligueain A)、蘇木精、應(yīng)樂果甜蛋白、歐亞 水龍骨甜素、蝶卡巧A、蝶卡巧B、馬橫柳甜蛋白、潘塔亭、神秘果蛋白、仙茅甜蛋白、新庫靈 (neoculin)、綠原酸、洋劑酸、賽口巧W及其它物質(zhì)。
[0088] 合適的"具有熱穩(wěn)定性和高甜度的甜味劑"包括化合物或化合物的混合物，按照英 國專利號1543167中所描述測試方法進行測量，它們的甜味比薦糖至少甜五倍，該文獻通過 引入納入本文。通常，運些甜味劑于大約4(TC下加熱大約1小時后基本上不含降解產(chǎn)物。運 些合適的甜味劑的例子包括但不限于S氯薦糖、紐甜、糖精、安賽蜜-K、甜蜜素、新澄皮武 DC、甜菊糖巧、索馬甜、甜蛋白、阿斯己甜W及它們的混合物。
[0089] 甜菊是一種來源于甜菊植物的無熱量的天然甜味劑。運種植物能夠形成許多被統(tǒng) 稱為甜菊糖巧的甜味化合物，使得甜菊糖巧比薦糖甜不超過300倍。運些糖巧可利用水和本 領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它溶劑從植物中提取。它們對熱穩(wěn)定，pH穩(wěn)定，不會發(fā)酵并且不會 引起血糖反應(yīng)。
[0090] 甜菊巧巧時被稱為13-[(2-0-e-D-化喃葡萄糖基-a-D-化喃葡萄糖基)氧基]-貝 殼杉-16-締-18簇酸0-D-化喃葡萄糖基醋）和萊鮑迪武A是從甜菊(也被稱為澤蘭屬甜葉菊 化upatorium rebaudianum))葉中提取和精制的二祗衍生斯替維醇的示例性糖巧。運些糖 巧是高甜度的甜味劑，其甜度是薦糖的大約100倍~大約500倍，但具有一絲金屬味和苦味。 它們可被廣泛用于低熱量或熱量減少型食品和飲料中。
[0091] 還可從甜菊中提取出其它甜味糖巧。它們具有各種甜度。如本文所用，"甜菊提取 物"是指提取自甜菊植物的甜味糖巧。
[0092] 在甜菊提取物中發(fā)現(xiàn)的糖巧中，萊鮑迪武A通常被認為具有最少的回味。運種被許 多人描述為苦味和類似甘草味的回味存在于目前所有的甜菊增甜產(chǎn)品中。運種配方通常需 要大量稀釋或遮味技術(shù)。
[0093] 類似于所有含有高甜度甜味劑的甜味劑組合物，通常向含有甜菊的甜味劑組合物 提供膨脹劑W幫助測量和配送，W供用戶應(yīng)用。那些已公開或使用的膨脹劑包括低聚果糖 (F0S)及其它纖維、麥芽糖糊精和赤薛糖醇。赤薛糖醇尤其受歡迎，因為其能夠減輕一些苦 味。
[0094] 化tani等在美國專利申請?zhí)?0120201952和20120201940中公開了一種天然甜味 組合物的制造方法，其包括對包含至少一種基于植物的天然高甜度甜味化合物的粗混合物 進行汽提，W及對粗混合物進行過濾。
[00M] 化tani等在美國申請系列號20100285201中公開了一種協(xié)同增效甜味劑組合物， 其包含=氯薦糖和經(jīng)過純化的甜菊提取物，其中，經(jīng)過純化的甜菊提取物包含萊鮑迪武和 杜克武。
[0096] Catani等在美國專利申請?zhí)?0090017185中公開了一種熱量減少的甜味劑組合 物，其由甜菊提取物和單糖組成。該文獻公開了相對于所有的甜菊糖巧，甜菊提取物可具有 大約80重量％~大約99.5重量％的萊鮑迪武A，且單糖可W是薦糖、果糖或葡糖糖。
[0097] 化化ni在美國專利申請?zhí)?0090004355中公開了一種包含赤薛糖醇和甜菊提取物 的甜味劑組合物。
[0098] 本發(fā)明提供一種對兩種或更多種來源于甜菊植物提取物的甜味糖巧進行分離、離 析和表征的方法，所述甜菊植物提取物具有大約966g/摩爾~大約1436g/摩爾范圍內(nèi)的分 子量，且具有少于甜菊糖巧的25%的萊鮑迪武A，更優(yōu)選具有少于甜菊糖巧的15%的萊鮑迪 武A，更優(yōu)選具有少于甜菊糖巧的10%的萊鮑迪武A，更優(yōu)選具有少于甜菊糖巧的5%的萊鮑 迪武A。
[0099] 本發(fā)明的益處將通過在下文中給出的詳細描述而變得更加顯而易見。然而，應(yīng)當 理解的是，W下詳述和具體實施例W及本發(fā)明優(yōu)選實施方式僅僅是用于舉例說明，本領(lǐng)域 技術(shù)人員通過閱讀所述詳述，可W顯而易見地得知本發(fā)明精神和范圍之內(nèi)的各種變化和改 良。
[0100] 在存在于甜菊中的甜味糖巧中，只有甜菊巧、萊鮑迪武A和萊鮑迪武C能夠在適中 的成本下獲得<80 %的純度而在局成本下獲得〉80 %的純度。商業(yè)廣品的最局純度通常超 過97 %。在下文中，術(shù)語"高純度"是指包含基于干重至少大約90 %~大約100 %的甜菊糖巧 的甜菊糖巧組合物。在市場上沒有商業(yè)量的高純度萊鮑迪武B或萊鮑迪武D運兩種在甜味品 質(zhì)和甜度上與萊鮑迪武A相當?shù)奶鹁粘煞?。萊鮑迪武E和F(也是味道好的甜味劑)能夠W分 析純少量購得。分子質(zhì)量相當于或大于萊鮑迪武D的天然產(chǎn)生的甜菊糖巧還沒有被用于商 業(yè)用途。本發(fā)明致力于定義運種分子質(zhì)量大的成分的組合物，W及得到運種組合物的低成 本方法，通過將它們?nèi)坑米魈鹞秳﹣韽浹a運些成分在甜菊中的低濃度。
[0101] 需要一種對兩種或更多種來源于分子量大于大約900g/摩爾的甜菊提取物的甜味 糖巧進行分離、離析和/或表征的高效且經(jīng)濟的方法。為商業(yè)用途而開發(fā)的單一甜菊糖巧在 味道品質(zhì)和甜味經(jīng)時變化上存在局限。Grant E.DuBois和Indra Prakash在 (Annu. Rev. Food Sci.Technol. (2012) ,3:353~380)《無熱量甜味劑、甜味調(diào)節(jié)劑和甜味劑 增強劑》"Non-Caloric Sweeteners,Sweetness Modulators,and Sweetener Enhancer") 中對離析出的天然形成的和人造的甜味劑的特征和局限進行了描述。本發(fā)明避開了對單一 甜味成分進行離析的思路，著眼于對兩種或更多種來源于甜菊的分子的組合進行分離、離 析和/或表征。 實施例
[0102] 已知的甜菊糖巧可基于糖(糖巧)取代的方式來整理。運允許對其它缺失或尚未識 別的可能存在的甜菊糖巧進行預(yù)測，盡管運些物質(zhì)W很低的量存在于各種制備中。甜菊糖 巧的體系示于圖2。
[0103] 發(fā)現(xiàn)甜菊糖巧的甜味品質(zhì)和甜度與甜菊巧元上糖基化的程度有關(guān)。接下來的圖3 顯示了如何通過分子大小來預(yù)測主觀的味道品質(zhì)和甜味，盡管存在例外，例如萊鮑迪武B。 該化合物可作為在定義甜味品質(zhì)和甜度的過程中，R2處具有特定糖巧結(jié)構(gòu)(甚至在R1處未 進行糖基化的場合下）的重要性的例子。
[0104] 甜味品質(zhì)和甜度還受到葡萄糖W外的單糖的存在的影響。因此，相比于只被葡萄 糖單糖取代的甜菊糖巧（例如甜菊巧或萊鮑迪武A)，分子中（例如在杜克武A或萊鮑迪武C 中）存在相同數(shù)量的鼠李糖(Rh)會導(dǎo)致甜度和品質(zhì)降低。
[0105] 表1.與甜味相關(guān)的甜菊糖巧的糖基化方式。
[0106]
[0107] 注：甜味品質(zhì)和甜度數(shù)據(jù)摘自O(shè)samu化naka的《天然甜味劑味道的改善》（化re& Appl.化em. 1997,69(4),675~683)。應(yīng)當理解的是，甜度是相對于相等重量的薦糖而言的。 甜味品質(zhì)是主觀的相對排名。
[0108] 甜菊糖巧之間的差異不僅在于分子結(jié)構(gòu)，還在于它們的味道性質(zhì)。發(fā)現(xiàn)甜菊巧通 常比薦糖甜大約110~大約270倍，萊鮑迪武A比薦糖甜大約150~大約320倍，而萊鮑迪武C 比薦糖甜大約40~大約60倍。杜克武A比薦糖甜大約30倍。已知甜度會隨著載體介質(zhì)的溫度 和粘度發(fā)生某些改變。
[0109] 盡管一些甜菊糖巧是已知的，但尚未對其甜味品質(zhì)和甜度進行評價。而且，盡管使 用了許多方法來離析和開發(fā)作為甜味劑的單一甜菊糖巧，但現(xiàn)有的知識無法對甜菊糖巧混 合物、尤其是除了天然形成的W外的部分的甜味特征進行預(yù)測，或者當與無論是有熱量還 是無熱量的具有高甜度的其它甜味劑或與相當于例如葡萄糖、果糖或薦糖的單糖和二糖的 其它甜味劑組合時對其味道特征進行預(yù)測。
[0110] 解析方法
[0111] 甜菊糖巧的常規(guī)解析方法需要兩個溶劑梯度W將甜菊糖巧與其它無甜味的植物 提取成分分離。所W，利用洗脫劑中折射率的變化的檢測器無法使用。通常，使用紫外線 (UV)檢測器來檢測含有弱UV發(fā)色團的甜菊糖巧。該方法在檢測粗提取物時具有局限，因為 具有更強發(fā)色團的成分的存在會阻礙對感興趣的組分的檢測，運是因為在所選擇的波長下 具有較高的摩爾消光系數(shù)的成分會比具有較低消光系數(shù)的成分(盡管它們基于質(zhì)量的濃度 更高）顯示得更加明顯，運會產(chǎn)生弱得多的信號。基于質(zhì)量的檢測中的折射率的其它替代方 法包括蒸發(fā)光散射化LS)和帶電氣溶膠檢測。T皿RM0 Scientific(《利用具備UV和化S檢測 器的HPLC對甜菊糖巧進行測定》"Determination of Steviol Glycosides by HPLC with UV and ELS Detections",A卵lication Note 241(2012))指出了E；LS在測量桌面甜味劑配 方中的萊鮑迪武A和甜菊巧的含量方面是如何優(yōu)于UV檢測的。然而，根據(jù)我們的經(jīng)驗，ELS在 存在另一種緊接著洗脫的主要成分的場合下對次要成分的濃度的測量時具有局限。 H.Y.Eom等（J.Chromatogr. A 1217(2010)4347~4354)指出利用CAD對衍生自銀柴胡（傘形 科植物）根的皂巧的檢測比利用ELS的檢測更加靈敏。我們發(fā)現(xiàn)使用帶電氣溶膠檢測器（ ESA憑:，Inc.，切姆斯福德，MA)能夠允許對甜菊粗提取物中的甜菊糖巧進行良好的定量，該 制備物富含蛋白質(zhì)和其它具有強UV吸收的植物成分，且還存在大量多糖或其它甜菊糖巧， 運些物質(zhì)會使檢測器"失明"，從而降低感興趣的成分的水平。
[0112] 確定一種有效的檢測器只是用于對粗制備物中感興趣的成分進行有效定量的系 統(tǒng)的一部分。該系統(tǒng)的另一部分是確定溶劑體系（流動相）和固體載體（固定相）W完成分 離。成功開發(fā)出一套合適的流動相和固定相的組合是試錯的經(jīng)驗過程，而并非可預(yù)測地通 過演繹得到。我們利用各種梯度系統(tǒng)試驗了流動相系統(tǒng)W發(fā)現(xiàn)一種能夠用于分離感興趣的 甜菊糖巧的溶劑梯度，從而使其能夠被質(zhì)譜識別，并且能夠通過CAD定量。一個例子如下所 示?？蓪μ荻冗M行調(diào)整，W允許在例如接近萊鮑迪武D的特定峰區(qū)域附近具有更大的分辨 率。
[0113] 用于解析的色譜法：
[0114] 固定相：PhenomenexKinetexC-18，150X4.6,2.6皿;柱溫：55°C;進樣量為10liL。
[0115] 流動相(MPA和MPB;流速:0.35mL/分鐘）：
[0116] MPA:0.1%的溶于水中的甲酸
[0117] MPB:0.1%的溶于乙臘中的甲酸 [011引表2 「01191 LUIZU」 衣J
[0121]
[0122] 再來參見圖4。
[0123] 眾所周知，可改變梯度W使分離加速(使用80%的MPA、20%的MPB時為0~2分鐘； 使用80%~0%的MPA、20%~100%的時為2~35分鐘；
[0124] , iRT-保留時間。
[01巧]使用80 %的MPA、20 %的時為35.01~40分鐘，流速為0.35mL/分鐘；進樣量:5y L)，W允許質(zhì)譜對甜菊糖巧進行識別。圖5中提供了一個例子。表4
[0126]
[0127] 農(nóng)業(yè)開發(fā)用解析方法的整合
[0128] 我們開發(fā)了一種基于甜菊糖巧含量的使對甜菊植物的特定育種的選擇最優(yōu)化的 策略。歷史上廣為人知的是，天然甜菊主要含有甜菊巧作為主要的甜菊糖巧，但是選擇性育 種有利于發(fā)展出W萊鮑迪武A作為主要成分的后代。我們已應(yīng)用我們的新型解析來對育種 進行鑒別，該育種還傾向于包含萊鮑迪武D或其它分子量(Mol.Wt.)等于或大于萊鮑迪武A (分子量為966g/摩爾）的所需甜菊糖巧，特別是萊鮑迪武I、0、M、N，W及在后續(xù)新育種中可 能發(fā)現(xiàn)的其它物質(zhì)。
[0129] 在不結(jié)晶的條件下對所需的甜菊糖巧進行分離
[0130] 我們將從對甜菊糖巧的解析分離上獲得的思路進一步發(fā)展成一種新的方法，其無 需通過結(jié)晶來對單一成分(通常為萊鮑迪武A)進行離析和純化。我們還開發(fā)了一種溶劑體 系，其使用食品級乙醇(酒精)和水來分離感興趣的甜菊糖巧而無需進行結(jié)晶。
[0131] 實施例；
[0132] 用熱水(3L)在95°C下對208.6g的干燥葉子進行2小時的提取W制備粗提取物。在 低于4(TC的溫度下在真空中對該提取物進行濃縮，并且利用離屯、來使其澄清，將其倒出，冷 卻，并用凍干法進行干燥W得到76.5g的干燥粗提取物。在制備級的反相柱(RediSep C18， 360g)上使用如下所示的水-乙醇梯度將該粗提取物的一部分(lOOg，大約含有1.7g的固體） 直接分離。
[0133] 表5 r〇134l
Luut3」 利用化~W分W化圍巧的來娜迪巧A和U具買巧扣爭先稱巧化脫點，開且仕j泛複 蓋該范圍的有規(guī)律的間隔處采集分離物，基于HPLC組分進行匯集和干燥?？偣不厥樟?628mg 的甜菊糖巧。18mg的該回收的試樣中包含大約23 %的萊鮑迪武D、21 %的萊鮑迪武N和M、 1.4%的未表征的甜菊糖巧、2%的萊鮑迪武A和大約16%的其它已知的甜菊糖巧。固體具有 灰白色至米黃色的外觀，且具有純正的甜味。該產(chǎn)物適合用作甜味劑而無需進行進一步的 加工或純化。
[0136] 實施例；
[0137] 用熱水(3L)在95°C下對208.6g的干燥葉子進行2小時的提取W制備粗提取物。在 低于4(TC的溫度下在真空中對該提取物進行濃縮，并且利用離屯、來使其澄清，將其倒出，冷 卻，并用凍干法進行干燥W得到76.5g的干燥粗提取物。在制備級的反相柱(RediSep C18， 360g)上使用如下所示的水-乙醇梯度將該粗提取物的一部分(lOOg，大約含有1.7g的固體） 直接分離。
[013引 表6
[0139]
[0140] 表7
[0141]
[0142] 利用大約25~30分鐘范圍內(nèi)的萊鮑迪武A和D真實樣品事先標注洗脫點，并且在廣 泛覆蓋該范圍的有規(guī)律的間隔處采集分離物，基于HPLC組分進行匯集和干燥?？偣不厥樟?628mg的甜菊糖巧。18mg的該回收的試樣中包含大約23%的萊鮑迪武D、21%的萊鮑迪武N和 M、1.4 %的未表征的甜菊糖巧、2 %的萊鮑迪武A和大約16 %的少量若干種其它已知的甜菊 糖巧。固體具有灰白色至淺棟色的外觀，且具有純正的甜味。該產(chǎn)物適合用作甜味劑而無需 進行進一步的加工或純化。
[0143] 根據(jù)本發(fā)明得到的甜菊糖巧可作為高甜度天然甜味劑結(jié)合入食物、飲料、藥物組 合物、化妝品、口香糖、桌面產(chǎn)品、谷類、乳制品、牙膏和其它口腔組合物等中。上文所示的實 施例展示了可使用的有代表性的部分。
[0144] 另外，甜菊糖巧不僅可用作飲料、食品和其它專供人消費的產(chǎn)品的甜味劑，還可用 于特性改善的動物飼料中。
[0145] 在食品、飲料、藥物、化妝品、桌面產(chǎn)品、口香糖的制造過程中，可使用例如混合、捏 合、溶解、酸洗、滲透、穿流、噴灑、霧化、灌輸?shù)某Ｒ?guī)方法和其它方法。
[0146] 本發(fā)明中所得到的甜味劑可W干燥或液體形式使用。其可在對食品進行熱處理之 前或之后加入。甜味劑的量取決于使用目的。其可單獨添加或與其它化合物組合添加。
[0147] 表8-顯示了存在于伯托尼甜菊葉中的甜菊巧和甜菊糖巧的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0148；
[0149] 表9
[0150] 提出的結(jié)構(gòu)W及它們來源于森田甜菊葉和伯托尼甜菊葉的甜菊糖巧的相對百分 比。
[0151]
[0152] *摘自化ta等（2010)。1相對量W總峰面積的百分比表示，總峰面積是利用Amide- S0/HPLC、基于它們在210皿處的UV吸收測得的。SG16-I與SG16-n的比例分別通過產(chǎn)物離子 在m/z 787和803處的相對強度得到，相對強度通過作為前體離子[M-Hr在m/z 1111處的 ESI-MS/MS解析中60V的CID電壓得到。2運些結(jié)構(gòu)是基于HPLC的流動和ESI-MS和MS/MS解析 的結(jié)果提出的。3未檢測。4名字在該研究中提出。
【主權(quán)項】
1. 一種制造兩種或更多種甜菊糖苷的組合的方法，其包括： a) 用熱水對甜菊葉進行提取， b) 使粗提取物澄清化，和 c) 用色譜法分離兩種或更多種甜菊糖苷的組合。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述甜菊葉未經(jīng)干燥。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述澄清化通過離心來完成。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述澄清化通過過濾來完成。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述過濾利用半透膜來進行。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分離通過連續(xù)色譜法來完成。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分離通過利用乙醇和水的梯度洗脫來完 成。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分離通過在不同溫度的梯度下利用水的 梯度洗脫來完成。9. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述分離通過在大約20°C~大約90°C的溫度 下利用水的梯度來完成。10. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述分離通過在大約30°C~大約60°C的溫 度下利用水的梯度洗脫來完成。11. 一種甜菊的提取物，其特征在于，所述提取物包含萊鮑迪甙41、10、1或0中的兩種 或更多種。12. -種甜菊的經(jīng)過匯集的色譜分離物，其特征在于，所述經(jīng)過匯集的色譜分離物包含 萊鮑迪甙六、]?、10、1或0中的兩種或更多種。13. -種食品的制造方法，其包括添加萊鮑迪甙A、M、N、I、0或D中的兩種或更多種。14. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，使用分形設(shè)計。15. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，使用多個洗脫閥組件。16. -種使對甜菊植物育種的選擇最優(yōu)化的方法，其包括對使兩種或更多種甜菊糖苷 的組合具有所需水平的育種進行識別。17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述兩種或更多種甜菊糖苷的組合包含選 自下組的甜菊糖苷:分子量等于或大于萊鮑迪甙A的分子量的甜菊糖苷。18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述兩種或更多種甜菊糖苷的組合包含選 自下組的甜菊糖苷:萊鮑迪甙D、I、Ο、Μ和N。
【文檔編號】A21D13/08GK106061987SQ201580009075
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年2月18日
【發(fā)明人】S·J·卡泰尼, J·納維亞
【申請人】麥克內(nèi)爾營養(yǎng)有限公司