一種苯胺綠人工抗原的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種苯胺綠人工抗原的制備方法，第一步為半抗原的制備及檢測：以N,N?二甲基苯胺、苯甲醛衍生物為原料，Amberlyst 15 樹脂為催化劑，在一定條件下合成苯胺綠半抗原；第二步為人工抗原的制備與檢測：采用活潑酯和重氮化法分別將獲得的半抗原與牛γ球蛋白(BGG)偶聯(lián)，制備苯胺綠的人工抗原即苯胺綠?牛γ球蛋白形成相應(yīng)全抗原。所制備的苯胺綠人工抗原可進(jìn)行動(dòng)物免疫，取得相應(yīng)的苯胺綠抗體，可用于各種苯胺綠免疫分析法的研究，為苯胺綠的檢測提供更加方便快速準(zhǔn)確的途徑。
【專利說明】
一種苯胺綠人工抗原的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種苯胺綠人工抗原的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 苯胺綠在中文中又稱孔雀石綠；中國綠;堿性孔雀石綠；品綠;鹽基塊綠；英文名 稱:MalachiteGreen oxalate,苯胺綠是綠色有金屬光澤的晶體，易溶于水，溶于乙醇、甲醇 和戊醇，水溶液呈藍(lán)綠色，pHO.O以下呈黃色；最大吸收波長616.9nm.是有毒的三苯甲烷類 化學(xué)物，既是染料，也是殺菌劑，可致癌。其結(jié)構(gòu)式為：
[0004] 苯胺綠中的化學(xué)功能團(tuán)三苯甲烷可致癌，很多國家已經(jīng)禁用，但仍有漁民在防治 魚類感染真菌時(shí)使用。也有運(yùn)輸商用作消毒，以延長魚類在長途販運(yùn)中的存活時(shí)間。
[0005] 目前，對(duì)苯胺綠的檢測主要依靠高效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜(GC)，薄層色譜 (TLC)，質(zhì)樸(MS)等，但是存在儀器昂貴，檢測費(fèi)時(shí)，并且需要專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行操作，不能 達(dá)到現(xiàn)代檢測對(duì)快速，準(zhǔn)確的要求。而免疫分析法可以彌補(bǔ)以上所有缺點(diǎn)，免疫分析法是一 種利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)檢測各種物質(zhì)（藥物、激素、蛋白質(zhì)、微生物等）的分析方 法，該方法的前提就是需要提供特異性的抗原和抗體。因此有必要提供一種有效的苯胺綠 人工抗原的制備方法，制備的苯胺綠人工抗原可用于免疫制備具有特異性的苯胺綠抗體， 進(jìn)一步用于檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷與不足，提供一種苯胺綠人工抗原 的制備方法，所制備的苯胺綠人工抗原可進(jìn)行動(dòng)物免疫，取得相應(yīng)的苯胺綠抗體，可用于各 種苯胺綠類免疫分析法的研究，為苯胺綠的檢測提供更加方便快速準(zhǔn)確的途徑。
[0007] -種苯胺綠人工抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0008] (1)制備人工半抗原：
[0009] (a)將N，N_二甲基苯胺和4-羧基苯甲醛以摩爾比為2:1的比例加入圓底燒瓶中， 100°C下攪拌反應(yīng)6小時(shí);反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液用乙醚提取，轉(zhuǎn)干，經(jīng)重結(jié)晶得到白色固體產(chǎn)物 I;
[00?0] (b)稱取2g產(chǎn)物I，加入苯30ml以及5gAmberlyst 15樹脂催化劑，放入圓底燒瓶中， 在氮?dú)獗Ｗo(hù)、130°C下回流攪拌過夜;反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑減壓轉(zhuǎn)干，用乙醚提取得產(chǎn)物Π ;
[0011] (c)將產(chǎn)物Π 經(jīng)硅膠柱層析純化，提取得到苯胺綠半抗原4-(雙(4-二甲胺基）苯 基）甲基苯甲酸(4-MGC)白色固體；
[0012] (2)制備苯胺綠人工抗原：
[0013] (d)稱取0 · 425g半抗原和N-羥基琥拍酰亞胺0 · 225g，溶于10 · OmlN，N-二甲基甲酰 胺中，再慢慢滴加溶解有〇. 255g N，N-二環(huán)己基碳二亞胺的10.0 mlN，N-二甲基甲酰胺，邊滴 加邊磁力攪拌，結(jié)束后20 °C磁力攪拌過夜，得到A液；
[0014] (e)將牛γ球蛋白溶于PBS緩沖液中，得到濃度為5mg/ml的B液；
[0015] ⑴在常溫磁力攪拌條件下，將A液逐滴加入到10ml的B液中，得到人工抗原混合液 4°C冰箱內(nèi)磁力攪拌過夜；
[0016] (g)制備鈉離子濃度為0. lmol/L的PBS緩沖液，pH為7.2~7.4;
[0017] (h)將人工抗原混合液于PBS緩沖液中透析，4 °C攪拌透析，每4小時(shí)換一次緩沖液， 透析2天，紫外掃描透析液無小分子吸收峰時(shí)，將產(chǎn)物離心取上清，在無菌條件下通0.2μπι的 濾膜，即得到苯胺綠人工抗原:苯胺綠-牛γ球蛋白。
[0018] 由于苯胺綠的分子量較小，單獨(dú)作用時(shí)不具有免疫原性或免疫原性較弱，因此必 須將其與大分子載體比如牛γ球蛋白連接形成苯胺綠抗原后，才能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的苯 胺綠抗體。本發(fā)明在制備苯胺綠人工抗原過程中，所選的位點(diǎn)和交聯(lián)方法都沒有明顯改變 其結(jié)構(gòu)，保留了抗原決定簇。在苯胺綠半抗原和牛γ球蛋白之間引入橋結(jié)構(gòu)，暴露抗原決定 簇，所獲得的苯胺綠人工抗原保持了苯胺綠的結(jié)構(gòu)特異性，有利于相應(yīng)苯胺綠抗體的產(chǎn)生。
[0019] 本發(fā)明的技術(shù)方案分為兩步，第一步為半抗原的制備及檢測：以Ν，Ν-二甲基苯胺、 苯甲醛衍生物為原料，Amberlyst 15樹脂為催化劑，在一定條件下合成苯胺綠半抗原;第二 步為人工抗原的制備與檢測：采用活潑酯和重氮化法分別將獲得的半抗原與牛γ球蛋白 (BGG)偶聯(lián)，制備苯胺綠的人工抗原即苯胺綠-牛γ球蛋白形成相應(yīng)全抗原。
[0020] 本發(fā)明制備得到的苯胺綠人工抗原可通過以下方法進(jìn)行鑒定：
[0021] 偶聯(lián)比測定：估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率）的方法雖然很 多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對(duì)含量)的原理建立起來的。分 光光度法是利用物質(zhì)對(duì)光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的原理分別測定被偶聯(lián)的兩種分子 濃度。在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜 圖迭加的性質(zhì)。
[0022] 摩爾吸收系數(shù)ε :配制苯胺綠半抗原濃度為0，5，10，20，30，40ug/ml的roS溶液，通 過紫外掃面圖可知苯胺綠半抗原的最大吸收波長為288nm，在288nm處測吸光值，每個(gè)濃度 做平行樣。摩爾吸光系數(shù)計(jì)算為ε =吸光值/摩爾濃度。本發(fā)明計(jì)算得e = 5014.35L/mol
[0023] 偶聯(lián)物蛋白濃度的測定:配制濃度為0，10，20，30，40,60，80，100，120ug/ml的牛γ 球蛋白PBS溶液lml，加入3ml考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，30°C水浴溫?zé)?分鐘，每個(gè)濃度 做平行樣，在655nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比 例吸收，在655處測得抗原的吸光值，從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)蛋白濃度值。本發(fā)明計(jì) 算得苯胺綠抗原的蛋白濃度為3.183mg/ml。
[0024] 偶聯(lián)比測定:配制100ug/ml的牛γ球蛋白ros溶液，將偶聯(lián)物用ros稀釋到100ug/ ml，在276處測得吸光值，以PBS為空白，測得吸光值A(chǔ)1，A2，則偶聯(lián)比率γ為：γ = [ (Ai-A2)/ ε]/(100Χ 10-3/65000)，本發(fā)明計(jì)算得 γ ~17。
[0025] 其中ε為摩爾吸光系數(shù)(L/mol)，65000為牛γ球蛋白的分子量，100Χ 10-3為牛γ球 蛋白濃度(ug/ml)。
[0026] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明合成了苯胺綠的人工抗原，合成工藝先進(jìn)，特異性強(qiáng)， 得到的苯胺綠人工抗原用于免疫新西蘭白兔，檢測結(jié)果表明，苯胺綠人工抗原的免疫血清 的效價(jià)為1:72000,完全可用于免疫分析中，為苯胺綠的檢測提供更加方便快速準(zhǔn)確的途 徑。
【附圖說明】
[0027] 圖1是苯胺綠人工半抗原的液相色譜圖。
[0028]圖2是苯胺綠人工半抗原的質(zhì)譜圖。
[0029]圖3是苯胺綠人工抗原制備前后的紫外掃描圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 苯胺綠人工抗原制備分為兩步，第一步為半抗原的制備及檢測：以N，N_二甲基苯 胺、苯甲醛衍生物為原料，Amberlyst 15樹脂為催化劑，在一定條件下合成苯胺綠半抗原； 第二步為人工抗原的制備與檢測:采用活潑酯和重氮化法分別將獲得的半抗原與牛γ球蛋 白（BGG)偶聯(lián)，制備苯胺綠的人工抗原即苯胺綠-牛γ球蛋白形成相應(yīng)全抗原。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] (1)制備人工半抗原半抗原4-MGC的合成：
[0033] (a)將Ν，Ν_二甲基苯胺（3g)和4-羧基苯甲醛以摩爾比為2:1加入圓底燒瓶中，100 °C下攪拌反應(yīng)6小時(shí);反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液用乙醚提取，轉(zhuǎn)干，經(jīng)重結(jié)晶得到白色固體產(chǎn)物I; [0034] (b)稱取2g產(chǎn)物I，加入苯30ml以及5gAmberlySt 15樹脂催化劑一起放入圓底燒瓶 中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，130°C下回流攪拌過夜;反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑減壓轉(zhuǎn)干，用乙醚提取得產(chǎn)物Π ; [0035] (c)將產(chǎn)物Π 經(jīng)硅膠柱層析純化，提取得到目標(biāo)半抗原4_(雙(4-二甲胺基)苯基） 甲基苯甲酸(4-MGC)白色固體；
[0036] (2)制備苯胺綠人工抗原苯胺綠-BGG的合成：
[0037] (d)稱取0.425g半抗原4-MGC和N-羥基琥珀酰亞胺0.225g溶于10.0mlN，N-二甲基 甲酰胺中，存放于燒杯中，再將溶解有〇.255g N，N-二環(huán)己基碳二亞胺的10.0mlN，N-二甲基 甲酰胺的溶液慢慢滴加，邊滴加邊磁力攪拌，結(jié)束后20°C磁力攪拌過夜，得到A液；
[0038] (e)將牛γ球蛋白溶于PBS緩沖液中，得到濃度為5mg/ml的B液；
[0039] (f)在常溫磁力攪拌條件下，將A液逐滴加入到10ml的B液中，得到人工抗原混合 液，4 °C冰箱內(nèi)磁力攪拌過夜；
[0040] (g)制備鈉離子濃度為0. lmol/L的PBS緩沖液，pH為7.2~7.4;
[0041 ] (h)將人工抗原混合液于PBS緩沖液中透析，4 °C攪拌透析，每4小時(shí)換一次緩沖液， 透析2天，紫外掃描透析液無小分子吸收峰時(shí)，將產(chǎn)物離心取上清，在無菌條件下通0.2μπι的 濾膜，即得到苯胺綠人工抗原:苯胺綠-牛γ球蛋白。
[0042] (3)苯胺綠人工抗原的鑒定：
[0043]偶聯(lián)比測定：估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率）的方法雖然很 多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對(duì)含量）的原理建立起來的。分 光光度法是利用物質(zhì)對(duì)光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的原理分別測定被偶聯(lián)的兩種分子 濃度。在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜 圖迭加的性質(zhì)。
[0044] 摩爾吸收系數(shù)ε :配制苯胺綠半抗原濃度為0，5，10，20，30，40ug/ml的roS溶液，通 過紫外掃面圖可知苯胺綠半抗原的最大吸收波長為288nm，在288nm處測吸光值，每個(gè)濃度 做平行樣。摩爾吸光系數(shù)計(jì)算為ε =吸光值/摩爾濃度。計(jì)算得e = 5014.35L/mol
[0045] 偶聯(lián)物蛋白濃度的測定:配制濃度為0，10，20，30，40，60，80，100，120ug/ml的牛γ 球蛋白PBS溶液lml，加入3ml考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，30°C水浴溫?zé)?分鐘，每個(gè)濃度 做平行樣，在655nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比 例吸收，在655處測得抗原的吸光值，從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)蛋白濃度值。計(jì)算得苯 胺綠抗原的蛋白濃度為3.183mg/ml。
[0046] 偶聯(lián)比測定:配制100ug/ml的牛γ球蛋白ros溶液，將偶聯(lián)物用ros稀釋到100ug/ ml，在276處測得吸光值，以PBS為空白，測得吸光值A(chǔ)1，A2，則偶聯(lián)比率γ為：γ = [ (Ai-A2)/ ε]/(100 X10-3/65000)，計(jì)算得 γ ~17。
[0047] 其中ε為摩爾吸光系數(shù)(L/mol) ,65000為牛γ球蛋白的分子量，100Χ 10_3為牛γ球 蛋白濃度(ug/ml)。
[0048] 苯胺綠人工半抗原的液相色譜圖如圖1所示，苯胺綠人工半抗原的質(zhì)譜圖如圖2所 示，苯胺綠人工抗原制備前后的紫外掃描圖如圖3所示。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種苯胺綠人工抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 制備人工半抗原： (a) 將N，N-二甲基苯胺和4-羧基苯甲醛以摩爾比為2:1的比例加入圓底燒瓶中，100 °C下攪拌反應(yīng)6小時(shí);反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液用乙醚提取，轉(zhuǎn)干，經(jīng)重結(jié)晶得到白色固體產(chǎn)物I; (b) 稱取2g產(chǎn)物I，加入苯30ml以及5gAmberlyst 15樹脂催化劑的，放入圓底燒瓶中， 在氮?dú)獗Ｗo(hù)、130°C下回流攪拌過夜;反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑減壓轉(zhuǎn)干，用乙醚提取得產(chǎn)物Π ; (c) 將產(chǎn)物Π 經(jīng)硅膠柱層析純化，提取得到苯胺綠半抗原4-(雙(4-二甲胺基)苯基） 甲基苯甲酸(4-MGC)白色固體； (2) 制備苯胺綠人工抗原： (d) 稱取0.425g半抗原和N-羥基琥珀酰亞胺0.225g，溶于10.0mlN，N-二甲基甲酰 胺中，再慢慢滴加溶解有〇.2558~小-二環(huán)己基碳二亞胺的10.〇1111~少-二甲基甲酰胺， 邊滴加邊磁力攪拌，結(jié)束后20°C磁力攪拌過夜，得到A液； (e) 將牛γ球蛋白溶于PBS緩沖液中，得到濃度為5mg/ml的B液； (f) 在常溫磁力攪拌條件下，將A液逐滴加入到10ml的B液中，得到人工抗原混合液，4 °(：冰箱內(nèi)磁力攪拌過夜； (g) 制備鈉離子濃度為〇. lmol/L的PBS緩沖液，pH為7.2~7.4; (h) 將人工抗原混合液于PBS緩沖液中透析，4°C攪拌透析，每4小時(shí)換一次緩沖液，透 析2天，紫外掃描透析液無小分子吸收峰時(shí)，將產(chǎn)物離心取上清，在無菌條件下通0.2μπι的 濾膜，即得到苯胺綠人工抗原:苯胺綠-牛γ球蛋白。
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK106046143SQ201610594859
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月25日 公開號(hào)201610594859.9, CN 106046143 A, CN 106046143A, CN 201610594859, CN-A-106046143, CN106046143 A, CN106046143A, CN201610594859, CN201610594859.9
【發(fā)明人】葉肖俊
【申請(qǐng)人】杭州萊和生物技術(shù)有限公司