一株高抗氧化耐膽鹽耐酸植物乳桿菌jr4及其應用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株高抗氧化耐膽鹽耐酸植物乳桿菌JR14，該菌株的分類命名為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.11928，保藏時間為2015年12月24日。本發(fā)明還提供了該菌株在抗氧化方面和制備青貯飼料方面的應用。本發(fā)明菌株具有優(yōu)秀的抗氧化能力、耐膽鹽能力和耐酸能力。CGMCC No.1192820151224
【專利說明】
一株高抗氧化耐膽鹽耐酸植物乳桿菌JR4及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領域，具體涉及一株高抗氧化耐熱耐酸植物乳桿菌JR4及其應 用。
【背景技術】
[0002] 植物乳桿菌是一種革蘭氏陽性菌，兼性厭氧，可以定植于腸道并發(fā)揮益生作用，被 廣泛應用于乳制品和醫(yī)療保健領域。
[0003] 然而，在實際利用植物乳桿菌的過程中，由于現(xiàn)有很多植物乳桿菌的耐酸、耐膽鹽 能力不佳，限制了其有益作用的發(fā)揮。而一些具有較強耐酸、耐膽鹽能力的植物乳桿菌，卻 不具備較好的抗氧化性能，難以發(fā)揮較好的有益作用。如中國專利CN 105018379A公布的植 物乳桿菌對超氧自由基的清除率最高僅為53.99%，而最低甚至低至14.85%。
[0004] 因此，尋求一種既具有優(yōu)秀的耐酸、耐膽鹽能力，又同時具備高抗氧化性，特別具 有優(yōu)秀的超氧自由基清除能力的植物乳桿菌，成為本領域亟待解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一株高抗氧化耐膽鹽耐酸植物乳桿菌JR4,其具有優(yōu) 秀的抗氧化能力、耐膽鹽能力和耐酸能力。該菌株的分類命名為為植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京 市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 11928,保藏時間為2015年12月24日。
[0006] 如本發(fā)明的實施例所示，本發(fā)明所得菌株具有很好的耐酸能力，在pH=2.5的環(huán)境 下24小時之后的活率仍高達80.39%;本發(fā)明所得菌株還具有很好的耐膽鹽能力，在膽鹽濃 度為0.15 %時，活率高達1182.98 %，也即是說細菌在該濃度膽鹽下，還具備很好的生長能 力;本發(fā)明所得菌株同時還具有很好的抗氧化能力，其菌體本身、無細胞破碎液和發(fā)酵液對 羥自由基的抑制率分別為29.47 %、27.56%和42.74%，其發(fā)酵液對于超氧自由基的抑制率 尚達89 · 38%。
[0007] 本領域技術人員應該理解，同時具備上述多種性能的植物乳桿菌十分難得。本發(fā) 明的發(fā)明人經過大量實驗摸索，意外的分離出了該菌株。
[0008] 本發(fā)明的目的之二在于提供該菌株在抗氧化方面的應用。所述應用包括在清除羥 基自由基和在清除超氧自由基方面上的應用。
[0009] 具體的，在清除羥基自由基時，利用的是植物乳桿菌JR4菌體、植物乳桿菌JR4無細 胞破碎液、植物乳桿菌JR4發(fā)酵液中的至少一種。
[0010] 具體的，在清除超氧自由基時，利用的是植物乳桿菌JR4發(fā)酵液。
[0011] 優(yōu)選的，所述植物乳桿菌JR4無細胞破碎液的制備方法為:將細菌培養(yǎng)后，取菌體 利用生理鹽水沖洗，加入溶菌酶處理，然后進行超聲破碎處理，即得。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述菌株在制備青貯飼料、食品防腐劑、發(fā)酵乳制 品食品添加劑方面的應用。
[0013] 本發(fā)明的有益效果：
[0014] 1、本發(fā)明菌株同時具有很好的耐酸、耐膽鹽和抗氧化性能；
[0015] 2、本發(fā)明菌株具有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明菌株植物乳桿菌JR4的菌落形態(tài)圖；
[0017]圖2為本發(fā)明菌株植物乳桿菌JR4的革蘭氏染色圖；
[0018]圖3為本發(fā)明菌株植物乳桿菌JR14的PCR擴增電泳圖，其中"14"為JR14菌株，"M"為 蛋白標記物；
[0019] 圖4為本發(fā)明菌株對羥自由基的抑制率和抑制能力的測試結果圖，
[0020] 其中，"Γ為菌體、"2"為無細胞破碎液、"3"為發(fā)酵液；
[0021] 圖5為本發(fā)明菌株對超氧自由基清除能力的測試結果圖，其中"Γ為發(fā)酵液，"2"為 菌體，"3"為無細胞破碎液。
【具體實施方式】
[0022] 下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用 于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領域的技術熟練 人員根據(jù)上述
【發(fā)明內容】
所做出的一些非本質的改進和調整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。 [0023] 實施例1
[0024] 1、實驗原料及方法
[0025] 1.1菌株來源
[0026]自制的傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜。
[0027] 1.2培養(yǎng)基
[0028] MRS培養(yǎng)基：牛肉膏(粉）10g，蛋白胨10g，酵母膏(粉)5g，葡萄糖20g，吐溫-80 lmL， 檸檬酸銨2g，K2HP〇4 2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，蒸餾水1000mL(配制固體培 養(yǎng)基需加瓊脂粉18g)，加熱溶解，調節(jié)pH至6.0~6.4，121°C滅菌15min。
[0029] 1.3主要試劑
[0030]冰乙酸AR，成都市科龍化工試劑廠；
[0031]細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型），天根生化科技(北京)有限公司；
[0032] 2000DNA Marker，天根生化科技(北京)有限公司；
[0033] 羥自由基測試盒50T/48T，南京建成生物工程研究所；
[0034]抗超氧陰離子試劑盒50T/48T，南京建成生物工程研究所；
[0035] 總蛋白定量測定試劑盒(BCA法），南京建成生物工程研究所。
[0036] 1.4 16S rDNA的PCR擴增引物 [0037]細菌通用引物由華大科技提供：
[0038] 上游引物PI: 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '
[0039] 下游引物P2:5，-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3 '
[0040] 1.5儀器與設備
[0041] 電子天平，sartorius;
[0042] 高壓滅菌鍋，GI54DW;
[0043] 高速冷凍離心機，SorvallST 16R;
[0044] PCR 擴增儀；
[0045] 紫外可見分光光度計；
[0046] 超聲波破碎儀。
[0047] 1.6乳酸菌的分離純化
[0048] 采用10倍梯度稀釋法將泡菜水樣品稀釋到10-5、10-6、10- 7的稀釋度。每個稀釋度吸 取lmL菌液，并用含1.5 % Ca⑶3的MRS固體培養(yǎng)基傾注平板，37 °C培養(yǎng)48h，挑選有明顯溶鈣 圈的不同形態(tài)的菌落進行革蘭氏染色觀察，挑取革蘭氏陽性的菌落到另一個含有1.5% CaC03的MRS固體平板上劃線培養(yǎng)，并將固體培養(yǎng)基平板上得到的單個菌落接種在一個裝有 5mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，于37°C下培養(yǎng)24h，然后用接種環(huán)挑取菌液繼續(xù)劃線，重復2-3次，直至菌落鏡檢結果表現(xiàn)為菌體形態(tài)一致，即可保存菌株。
[0049] 1.7菌株的保存
[0050] 將得到的單一菌株在液體培養(yǎng)基中活化2-3次，劃線接種于MRS固體斜面中培養(yǎng) 48h后置于4°C冰箱內短期保存，或將液體培養(yǎng)物與40%的滅菌甘油按1:1的比例混合，在_ 20°C條件下進行長期保存。
[00511 1.8乳酸菌的鑒定
[0052] (1)乳酸菌的形態(tài)特征
[0053]將菌液劃線接種于固體培養(yǎng)基上，37 °C培養(yǎng)48h觀察并記錄菌落形態(tài)，同時進行革 蘭氏染色鏡檢，觀察并記錄其菌體形態(tài)特征。
[0054] (2)生理生化特征
[0055] 對初步分離篩選得到的耐受消化道環(huán)境的菌株進行產H2S試驗、硝酸鹽還原試驗、 明膠液化試驗、吲哚產生試驗、乳糖試驗、甘露糖試驗、棉籽糖試驗、海藻糖試驗、七葉苷試 驗、麥芽糖試驗、纖維二糖試驗、果糖試驗、鼠李糖試驗、木糖試驗、半乳糖試驗、阿拉伯糖試 驗、苦杏仁苷試驗，參照伯杰細菌鑒定手冊(第八版)對比生化反應結果，并對菌株進行初步 種群歸類。
[0056] (3)16S rDNA鑒定
[0057] ①細菌總DNA的提取：利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取目的菌體DNA，并用 1.0%ΤΒΕ瓊脂糖凝膠電泳檢測提取結果。
[0058] ②16S rDNA基因的PCR擴增:將提取得到的DNA模板進行PCR擴增，26yLPCR反應體 系：上下游引物各 lyL(10ymol/L)，模板 DNA2yL，2xlong Taq PCR MasterMix 9.5yL， ddH2012.5yL〇
[0059] PCR擴增程序：94°C預變性4min; 94°C、lmin，60°C、lmin，72°C、2min，循環(huán)30次；72 °C延伸lOmin，用1.0 % TBE瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。PCR擴增產物4 °C保存，交由英濰 捷基(上海)貿易有限公司測序。
[0060] ③序列分析:登陸NCBI網站，進行同源性分析，并采用MEGA6.06軟件將測得序列與 GenBank中的模式菌株16S rDNA序列進行分析，制作系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0061 ] 1.9耐消化道環(huán)境的乳酸菌的初篩
[0062] (1)耐酸實驗
[0063] 37°C條件下，在試管中培養(yǎng)12h的菌液按1 %的接種量接種于lOOmLMRS液體培養(yǎng)基 中，37°C°C靜置培養(yǎng)24h。將菌液按1%的接種量（調整菌液濃度為10 7cfu/mL)分別接種至 ρΗ7.0，ρΗ2.0，pH2.5的MRS培養(yǎng)基中（鹽酸調節(jié)），37°C °C靜置培養(yǎng)24h，分別在Oh和24h測定 不同pH值培養(yǎng)基的4_，判斷菌株在酸性環(huán)境下的耐受情況。每組設2個重復。
[0064] (2)耐膽鹽實驗
[0065] 37°C條件下，將在試管中培養(yǎng)12h的菌液按1 %的接種量接種于lOOmLMRS液體培養(yǎng) 基中，37°C靜置培養(yǎng)24h。將菌液按1%的接種量(調整菌液濃度為107cfu/mL)分別接種至含 0% (空白），0.15%，0.3% (W/V)三號膽鹽的MRS培養(yǎng)基100mL中，搖勻，37°C靜置培養(yǎng)24h后 測A?，計算菌株對三號膽鹽的耐受能力的大小。每組設2個重復 [24'25]。
[0067] 1.10耐消化道環(huán)境的乳酸菌的復篩
[0068] (1)耐酸實驗
[0069] 37°C條件下，在試管中培養(yǎng)12h的菌液按1 %的接種量接種于lOOmLMRS液體培養(yǎng)基 中，37°C靜置培養(yǎng)24h。將菌液稀釋100倍后按1%的接種量（調整細胞濃度約為105cfu/mL) 分別接種至pH2.0，pH2.5的MRS培養(yǎng)基中（鹽酸調節(jié)），37°C靜置培養(yǎng)24h。在Oh和24h分別傾 注平板進行活菌計數(shù)，并計算存活率，以此來判斷菌株的耐酸能力。
[0070] (2)耐膽鹽實驗
[0071] 37°C條件下，將在試管中培養(yǎng)12h的菌液按1 %的接種量接種于lOOmLMRS液體培養(yǎng) 基中，37°C靜置培養(yǎng)24h。將菌液稀釋100倍后按1%的接種量（調整細胞濃度約為105cfu/ mL)分別接種至含0.15%，0.3%(1八)三號膽鹽的1?3培養(yǎng)基10011^中，搖勻，37°(：靜置培養(yǎng) 24h。在Oh和24h分別傾注平板進行活菌計數(shù)，并計算存活率，以此來判斷菌株的耐膽鹽能 力。
[0072] 1.11乳酸菌抗氧化的測定
[0073]種子液的制備:分別將保藏于4°C條件的菌種接種在MI?固體培養(yǎng)基上，37°C，培養(yǎng) 24h，待用。分別挑1-2環(huán)活化的菌株接種于SmLMRS液體培養(yǎng)基中，37°C，靜置培養(yǎng)12h，即為 種子液。
[0074]無細胞提取物的制備：將種子液按1 %的比例，接種在MRS液體中，37°C靜置培養(yǎng) 24h，在8000r/min，10min，4 °C條件下將發(fā)酵液離心，收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體3次，菌 體重懸于生理鹽水中，制成菌懸液，A6QQ為2.473。在菌懸液中加入10%的溶菌酶37°C處理 2.5h，將處理后的菌懸液置于冰浴中，在功率為800W條件下超聲破碎細胞，工作5s，間歇7s， 全程時間50min。然后在10000r/min，10min，4°C條件下將破碎后的液體離心，收集上清液， 上清液即為無細胞提取物 [21]。
[0075] (1)清除輕自由基（· 0H)能力的測定
[0076]以羥自由基測試盒為參照（其中蛋白濃度用BCA法測定），測定原理為Fenton反應 是最常見的產生羥自由基的化學反應，H2〇2的量和Fenton反應產生的0H ·量成正比，當給予 電子受體后，用griess試劑顯色，形成紅色物質，其呈色與0H·的多少成正比關系。
[0077]具體操作方法如下(簡要過程見表1):
[0078]試劑組成與配制：
[0079] 試劑一 :3%H202標準品貯備液0.5mLX 1支，4°C保存3個月。
[0080] 0.03 %標準品應用液的配制：3 % H2〇2標準品貯備液:雙蒸水=1:99稀釋，現(xiàn)用現(xiàn) 配。
[0081 ]試劑二:底物貯備液lmL XI支，4°C保存3個月。
[0082]底物應用液的配制：
[0083]本樣品為抑制羥自由基，即測定管吸光度比對照管吸光度低，
[0084] 則底物應用液的配制:底物貯備液:雙蒸水=1:99稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0085]試劑三：甲液貯備液2mLX 1支，4°C保存3個月，用時加雙蒸水1:9稀釋成應用液。 [0086] 乙液:7mLX2支，4°C保存3個月。
[0087] 試劑三應用液的配制：甲液應用液與乙液等比例混合，按需配制，余下4°C保存。 [0088] 試劑四：液體1 OmL X 1瓶，4°C保存3個月。用時加雙蒸水稀釋至1 OOmL，制備應用液， 4°C
[0089] 保存。若有結晶，則放置37°C水浴至全部溶解后再稀釋。
[0090] 試劑五:液體30mLX 1瓶，避光4°C冰箱保存3個月。
[0091 ]試劑六:液體30mLX 1瓶，避光4°C冰箱保存3個月。
[0092]試劑七:分析純的冰乙酸(冰醋酸）自備。
[0093] 顯色劑的配制:試劑四應用液:試劑五:試劑六:冰乙酸=8:3:3:2,現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0094] 操作步驟：
[0095]以上配制好的應用液，先在37 °C水浴中預溫3分鐘，以下操作在37 °C水浴中進行。 混勻，室溫放置20分鐘，波長550nm，lcm光徑，雙蒸水調零，測定各管吸光度值。
[0096]當清除率在20%_50%之間可利用公式計算其抑制羥自由基能力，羥自由基清除 率計算公式如下：
[0098] MRS發(fā)酵液與上清液抑制羥自由基能力的計算公式如下：
[0100]菌體抑制羥自由基能力的計算公式如下：
[0102] (2)清除超氧陰離子自由基(02 ·)能力的測定
[0103]以抗超氧陰離子試劑盒為參照（其中蛋白濃度用BCA法測定），具體操作方法如下 (簡要過程見表2):
[0104]試劑組成與配制：
[0105] 試劑一:液體5mLXl瓶，（天冷時或放冰箱會有部分結晶析出，需熱水浴溶解后再 用）；
[0106] 試劑一應用液的配制：用時每瓶5mL|C備液加雙蒸水稀釋至50mL，4°C保存1年。 [0107]試劑二:液體5mL X 1瓶，4 °C保存1年。
[0108] 試劑三:液體5mL X 1瓶，4 °C保存1年。
[0109] 試劑四：1C備液350yLX 1支，4°C保存，不可冷凍;稀釋液5mLX 1瓶，4°C保存半年。 [0110] 試劑四應用液的配制：按貯備液:稀釋液= 1:14比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，4°C保存，不 可冷凍。
[0111] 試劑五:粉劑X 1支，用時加70~80°C熱雙蒸水37.5mL溶解。配好后4°C避光保存。
[0112] 試劑六:粉劑XI支，用時加雙蒸水37.5mL溶解后備用。配好后的試劑4°C避光保 存。
[0113] 顯色劑的配制:按照5號試劑:6號試劑:冰乙酸= 3:3:2的體積比配成顯色劑，4°C 避光保
[0114]存3個月（冰乙酸自備）。
[0115] 試劑七:Vc標準品X4支。
[0116] Vc標準品貯備液配制:將一支Vc標準品加雙蒸水定容至5mL(Vc標準配制后當天內 使用）
[0117] 0.15mg/mL Vc標準品應用液配制:取lmLlC備液加4mL雙蒸水，5倍稀釋現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0118] [注]:Vc標準品配制后見光極易分解，配制的0.15mg/mL Vc標準應用液需30分鐘 內檢測
[0119] 操作表：
[0120] 混勻，靜置10分鐘，雙蒸水調零，波長550nm，光徑lcm，測定各管吸光度0D值。
[0121 ]當清除率在10 % -60 %之間可利用公式計算其抗超氧陰離子活力單位，超氧陰離 子自由基清除率計算公式如下：
[0123] MRS發(fā)酵液與上清液抗超氧陰離子活力單位的計算公式如下：
[0125]菌體抗超氧陰離子活力單位的計算公式如下：
[0127]表1 ·清除輕自由基能力的測定
[0129]表2.清除超氧陰離子自由基的測定
[0131] 2實驗結果
[0132] 選出的JR14的菌落形態(tài)如圖1所示，革蘭氏染色結果如圖2所示。
[0133] 2.1植物乳酸菌JR14產酸定性結果
[0134] 植物乳酸菌JR14在pH值為7.0的條件下培養(yǎng)24h后，pH值下降到3.75，說明植物乳 酸菌JR14產酸良好。
[0135] 2.2植物乳酸菌JR14的耐酸結果
[0136] 植物乳酸菌JR14經24h培養(yǎng)后耐酸結果如表3所示。
[0137] 進行活菌計數(shù)后，植物乳酸菌JR14在pH2.5的條件下保持24h的存活率為80.39 %， 如表3所示。
[0138] 表3
[0140] 2.3植物乳酸菌JR14的耐膽鹽結果
[0141] 進行活菌計數(shù)后，植物乳酸菌JR14的耐膽鹽結果如表4所示。
[0142] 表4
[0143]
[0144] 2.4植物乳酸菌JR14的生理生化鑒定結果
[0145] 參考《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)可知菌株植物乳酸菌JR14為植物乳桿菌屬， 鑒定結果見表5。
[0146] 表5生化試驗及糖發(fā)酵試驗鑒定結果
[0148] 2.5 16S rDNA鑒定
[0149] 菌株PCR擴增后進行100V，30min電泳，圖3為電泳條帶圖，菌株分子量在2000bp到 lOOObp之間，將送檢結果經過16S rDNA基因序列比對分析，制作進化樹，可知JR14與植物 乳桿菌同源性達到了 89 %，可能為植物乳桿菌變種。
[0150] 2.6清除羥自由基（· 0H)能力的測定
[0151] 由圖5可知，JR14菌株的發(fā)酵液、上清液以及菌體對于羥自由基的抑制率分別為 29.47%、27.56%和42.74%。由于發(fā)酵液稀釋了 125倍，因此可知發(fā)酵液的抑制效果最好， 其次是菌體，上清液的抑制率最低，通過計算得知發(fā)酵液和上清液的抑制能力分別22.4U/ mL和20 · 95U/mL，菌體的抑制能力為11 · 75U/mgprot。即發(fā)酵液的抑制能力最強，上清液次 之，菌體最弱。
[0152] 2.7清除超氧自由基(〇2 ·)能力的測定
[0153] JR14菌株對超氧陰離子自由基的抑制能力，經過測定發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液的抑制率為 89.38%，而菌體及上清液幾乎無抑制效果。
[0154] 實施例2
[0155] 將植物乳酸菌JR14發(fā)酵液噴灑至青貯飼料原料中，攪拌均勻，控制青貯飼料的水 分為60 % (wt % )，密封常溫發(fā)酵3周，即得青貯飼料。
【主權項】
1. 一株高抗氧化耐膽鹽耐酸植物乳桿菌JR4，其特征在于，所述植物乳桿菌JR4的分類 命名為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心CGMCC，保藏號為CGMCC No. 11928，保藏時間為2015年12月24日。2. 權利要求1所述植物乳桿菌JR4在抗氧化方面的應用。3. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述應用包括在清除羥基自由基和在清除 超氧自由基方面上的應用。4. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，在清除羥基自由基時，利用的是植物乳桿 菌JR4菌體、植物乳桿菌JR4無細胞破碎液、植物乳桿菌JR4發(fā)酵液中的至少一種。5. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，在清除超氧自由基時，利用的是植物乳桿 菌JR4發(fā)酵液。6. 根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，所述植物乳桿菌JR4無細胞破碎液的制備 方法為:將細菌培養(yǎng)后，取菌體利用生理鹽水沖洗，加入溶菌酶處理，然后進行超聲破碎處 理，即得。7. 權利要求1所述植物乳桿菌在制備青貯飼料、食品防腐劑、發(fā)酵乳制品食品添加劑方 面的應用。
【文檔編號】A23C9/123GK105969681SQ201610188977
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年3月28日
【發(fā)明人】周康, 梁運改, 江然, 楊夢露, 王亮, 何利, 陳淑娟, 劉密
【申請人】四川農業(yè)大學